專利名稱：篩選功能核苷酸分子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種篩選能有效地抑制基因表達(dá)的核酸的通用方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于該方法的核酸構(gòu)建體和載體，以及用于該方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
存在多種方式控制蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。例如，控制通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子從基因轉(zhuǎn)錄成mRNAs、從mRNAs翻譯成氨基酸序列以及穩(wěn)定mRNAs抵抗核酸酶的降解，使細(xì)胞總是維持期望的表達(dá)水平。
在mRNA水平人為地抑制蛋白質(zhì)表達(dá)的方法包括使用mRNA的反義RNA的抑制、使用核酶的mRNA的降解以及干擾RNA(RNAi)。已知這種方法的抑制效果視編碼蛋白質(zhì)的核酸序列中的區(qū)域或選作靶的核酸序列的周圍序列而顯著變化(例如，非專利文獻(xiàn)1)。作為測(cè)定蛋白質(zhì)表達(dá)水平的常規(guī)方法，合成靶蛋白質(zhì)和報(bào)告蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)，使用報(bào)告蛋白質(zhì)作為指標(biāo)估計(jì)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。在這種方法中，為了證實(shí)翻譯了靶蛋白質(zhì)和報(bào)告蛋白質(zhì)的全部融合蛋白質(zhì)，通常將報(bào)告蛋白質(zhì)融合到靶蛋白質(zhì)的下游。因此，由可翻譯的報(bào)告基因與相鄰的不可翻譯的、編碼靶蛋白質(zhì)的核酸序列相連形成的DNA是未知的。
例如，Nilsen，T.W.等人通過(guò)構(gòu)建用于表達(dá)靶蛋白質(zhì)和融合到靶蛋白質(zhì)下游的報(bào)告蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的DNA，以及檢查報(bào)告蛋白質(zhì)的表達(dá)，篩選了能夠有效抑制靶核酸序列表達(dá)的核酶等(例如，專利文獻(xiàn)1)。然而，不容易表達(dá)有功能的融合蛋白質(zhì)。在許多情況中，當(dāng)它們?nèi)诤蠒r(shí)，使蛋白質(zhì)的功能喪失。因此，如果沒(méi)有檢測(cè)到報(bào)告蛋白質(zhì)，需要進(jìn)一步詳細(xì)核實(shí)是否是由于降解導(dǎo)致mRNA的不穩(wěn)定、mRNA的構(gòu)象改變、翻譯機(jī)制的抑制或者喪失了作為報(bào)告蛋白質(zhì)的功能。篩選對(duì)來(lái)自靶基因的序列起作用而不產(chǎn)生這種融合蛋白質(zhì)或嵌合蛋白質(zhì)的分子的方法是未知的。
因此，一直期望可普遍應(yīng)用于許多核苷酸序列的，篩選通過(guò)改變mRNA的穩(wěn)定性來(lái)改變表達(dá)的功能核苷酸分子的方法。
專利文獻(xiàn)1美國(guó)專利公開(kāi)No.2002/0002278非專利文獻(xiàn)1Nature Medicine，Vol.9，No.3，pp.347(2003)發(fā)明內(nèi)容通過(guò)本發(fā)明將要解決的問(wèn)題本發(fā)明的主要目的是提供一種可普遍應(yīng)用于許多核苷酸序列的，篩選改變靶基因表達(dá)的功能核苷酸分子的方法。
技術(shù)方案考慮到上述情況，本發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究和探索。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了下列事實(shí)。構(gòu)建具有啟動(dòng)子序列、至少兩個(gè)基因序列和聚腺苷酸信號(hào)序列的核酸構(gòu)建體。該至少兩個(gè)基因序列轉(zhuǎn)錄成單一RNA分子?；蛐蛄兄械闹辽僖粋€(gè)處于可翻譯狀態(tài)，基因序列中的至少一個(gè)以基本上不可翻譯的編碼狀態(tài)。因此，可篩選一種分子，其能通過(guò)改變mRNA的穩(wěn)定性而改變由不可翻譯的基因序列編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)，并且該方法可普遍應(yīng)用于許多核酸序列。本發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)上述核酸構(gòu)建體可普遍應(yīng)用于許多核酸序列。由此，完成了本發(fā)明。
本發(fā)明概述如下。本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及具有啟動(dòng)子序列、至少一個(gè)以可翻譯的狀態(tài)與啟動(dòng)子序列連接的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，以及聚腺苷酸信號(hào)序列的核酸構(gòu)建體，其中核酸構(gòu)建體在啟動(dòng)子序列和聚腺苷酸信號(hào)序列之間進(jìn)一步含有，與上述編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列不同的不可翻譯的核苷酸序列，將以可翻譯的狀態(tài)與啟動(dòng)子序列連接的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列和與編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列不同的、不可翻譯的核苷酸序列連接起來(lái)，使得可將它們從核酸構(gòu)建體中轉(zhuǎn)錄成單一RNA分子，以及不可翻譯的核苷酸序列選自下組(A)編碼蛋白質(zhì)或部分蛋白質(zhì)的核苷酸序列；和(B)天然位于編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的5′或3′端非翻譯區(qū)的核苷酸序列。
在第一方面的核酸構(gòu)建體中，不可翻譯的核酸序列可位于以可翻譯的狀態(tài)與啟動(dòng)子序列相連的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的下游。不可翻譯的核苷酸序列也可位于以可翻譯的狀態(tài)與啟動(dòng)子序列相連的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的上游。此外，核酸構(gòu)建體中以可翻譯的狀態(tài)與啟動(dòng)子序列相連的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列可編碼報(bào)告蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的第二方面涉及含有第一方面的核酸構(gòu)建體的載體。
本發(fā)明的第三方面涉及RNA，其含有至少一種可翻譯狀態(tài)的、編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，以及與編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列不同的、不可翻譯的核苷酸序列，其中不可翻譯的核苷酸序列選自下組(A)與可翻譯狀態(tài)下的編碼蛋白質(zhì)核苷酸序列不同的、編碼蛋白質(zhì)或部分蛋白質(zhì)的核苷酸序列；和(B)天然位于與可翻譯狀態(tài)下的編碼蛋白質(zhì)核苷酸序列不同的、編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的5′或3′端非翻譯區(qū)的核苷酸序列。
本發(fā)明的第四方面涉及檢測(cè)通過(guò)功能核苷酸分子改變靶基因表達(dá)的活性的方法，該方法包括下列步驟(A)從第一方面的核酸構(gòu)建體或從第二方面的載體中轉(zhuǎn)錄RNA，其中該RNA具有，作為不可翻譯的核苷酸序列的選自在靶基因中編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列、該核苷酸序列的一部分、以及位于靶基因中編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的5′或3′端非翻譯區(qū)的核苷酸序列；(B)使核苷酸分子與步驟(A)中轉(zhuǎn)錄的RNA接觸；(C)檢測(cè)步驟(B)中的RNA或從RNA翻譯的翻譯產(chǎn)物；和(D)基于在步驟(C)中所檢測(cè)的RNA或從RNA翻譯的翻譯產(chǎn)物的量，檢測(cè)功能核苷酸分子改變靶基因表達(dá)的活性。
本發(fā)明的第五方面涉及檢測(cè)通過(guò)功能核苷酸分子改變靶基因表達(dá)的活性的方法，該方法包括下列步驟(A)使核苷酸分子與第三方面的RNA接觸，其中該RNA具有，作為不可翻譯的核苷酸序列的選自在靶基因中編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列、該核苷酸序列的一部分、以及位于靶基因中編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的5′或3′端非翻譯區(qū)的核苷酸序列；(B)檢測(cè)步驟(A)中的RNA或從RNA翻譯的翻譯產(chǎn)物；和(C)基于在步驟(B)中所檢測(cè)的RNA或從RNA翻譯的翻譯產(chǎn)物的量，檢測(cè)功能核苷酸分子改變靶基因表達(dá)的活性。
根據(jù)第四或第五方面，篩選改變靶基因表達(dá)的功能核苷酸分子的方法可包括檢測(cè)功能核苷酸分子改變靶基因表達(dá)的活性。根據(jù)第四或第五方面，在檢測(cè)功能核苷酸分子改變靶基因表達(dá)的活性的方法中，可將該核苷酸分子與細(xì)胞中或無(wú)細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的RNA接觸。
本發(fā)明的第六方面涉及篩選其表達(dá)被核苷酸分子改變的基因的方法，該方面包括下列步驟(A)從第一方面的核酸構(gòu)建體或從第二方面的載體中轉(zhuǎn)錄RNA，其中該RNA具有，作為不可翻譯的核苷酸序列的選自在任意基因中編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列、該核苷酸序列的一部分、以及位于編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的5′或3′端非翻譯區(qū)的核苷酸序列；(B)使核苷酸分子與步驟(A)中轉(zhuǎn)錄的RNA接觸；(C)檢測(cè)步驟(B)中的RNA或從RNA翻譯的翻譯產(chǎn)物；和(D)基于在步驟(C)中所檢測(cè)的RNA或從RNA翻譯的翻譯產(chǎn)物的量，鑒定其表達(dá)被核苷酸分子改變的基因。
本發(fā)明的第七方面涉及篩選其表達(dá)被核苷酸分子改變的基因的方法，該方法包括下列步驟(A)使核苷酸分子與第三方面的RNA接觸，其中該RNA具有，作為不可翻譯的核苷酸序列的選自任意基因中編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列、該核苷酸序列的一部分、以及位于編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的5′或3′端非翻譯區(qū)的核苷酸序列；(B)檢測(cè)步驟(A)中的RNA或從RNA翻譯的翻譯產(chǎn)物；和(C)基于在步驟(B)中所檢測(cè)的RNA或從RNA翻譯的翻譯產(chǎn)物的量，鑒定改變靶基因表達(dá)的功能核苷酸分子。
根據(jù)第六或第七方面，在篩選其表達(dá)被核苷酸分子改變的基因的方法中，可使該核苷酸分子與細(xì)胞中的或無(wú)細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的RNA接觸。
發(fā)明效果本發(fā)明提供一種可普遍用于許多靶基因的，篩選通過(guò)使RNA不穩(wěn)定而抑制靶基因表達(dá)的核苷酸分子的方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1圖示根據(jù)篩選本發(fā)明的功能核苷酸分子的方法篩選的結(jié)果。
圖2圖示根據(jù)篩選本發(fā)明的功能核苷酸分子的方法篩選的結(jié)果。
圖3圖示根據(jù)篩選本發(fā)明的功能核苷酸分子的方法篩選的結(jié)果。
圖4圖示根據(jù)篩選本發(fā)明的功能核苷酸分子的方法篩選的結(jié)果。
完成發(fā)明的最佳方式在下文中，將詳細(xì)描述本發(fā)明。
根據(jù)本發(fā)明，核酸構(gòu)建體是由DNA和/或RNA構(gòu)成的構(gòu)建體。核酸構(gòu)建體可由，構(gòu)成或者含有DNA或RNA的類似物或修飾的化合物作為其一部分。
本申請(qǐng)所用的，靶基因指有待改變其表達(dá)的編碼靶蛋白質(zhì)的核酸序列和/或其在前或其后的核酸序列，其可從本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或載體中轉(zhuǎn)錄。此處也可指作為感興趣的核苷酸序列或者靶核酸序列。靶基因可能是編碼全部靶蛋白質(zhì)或其部分的核苷酸序列，或者是其前或其后的5′UTR(非翻譯區(qū))或3′UTR。在不限制本發(fā)明的前提下，例如，功能核苷酸分子如編碼期望通過(guò)RNAi活性抑制其表達(dá)的感興趣蛋白質(zhì)的核苷酸序列，或者其前或其后的序列(siRNA)，以及由核苷酸分子介導(dǎo)的序列特異性mRNA降解對(duì)象的核酸序列。而且，可優(yōu)選使用相當(dāng)于基因外顯子的序列，或者經(jīng)過(guò)修飾不含有起起始密碼子作用的序列的序列。靶基因可以是來(lái)自真核生物的序列、來(lái)自病毒的序列或者是來(lái)自原核生物的序列。來(lái)自病毒的靶基因可用于篩選涉及在病毒基因組的降解，或者抑制病毒復(fù)制或增殖的功能核苷酸分子。
本申請(qǐng)所用的，編碼區(qū)是指基因中由直接定義蛋白質(zhì)的氨基酸序列的遺傳密碼子構(gòu)成的區(qū)。
本申請(qǐng)所用的，mRNA的不穩(wěn)定是指mRNA降解反應(yīng)增加。累積的mRNA的量取決于兩個(gè)反應(yīng)，即，合成和降解。當(dāng)合成反應(yīng)和降解反應(yīng)之間的平衡傾向于降解反應(yīng)時(shí)mRNA不穩(wěn)定。關(guān)于mRNA的降解沒(méi)有特別的限制，只要其是含有來(lái)自靶基因的核酸序列的mRNA的降解即可。其可以是內(nèi)型(endo-type)或外型(exo-type)降解。
本申請(qǐng)所用的，核苷酸分子指核苷的磷酸酯化合物。核苷酸分子可由核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸構(gòu)成，或者其可以是由它們構(gòu)成的嵌合分子。核苷酸分子也可包括核苷酸類似物或修飾的核苷酸。其可與蛋白質(zhì)、糖等形成復(fù)合物。
本申請(qǐng)所用的，功能核苷酸分子指改變蛋白質(zhì)表達(dá)的核苷酸分子。功能核苷酸分子包括抑制靶蛋白質(zhì)表達(dá)的分子、以序列特異性方式對(duì)本發(fā)明RNA中不可翻譯的核苷酸序列起作用，以最終使整個(gè)RNA不穩(wěn)定的分子、以及以序列特異性方式降解RNA中不可翻譯的核苷酸序列以最終使整個(gè)RNA不穩(wěn)定的分子。功能核苷酸分子可與蛋白質(zhì)、糖等形成復(fù)合物。
本申請(qǐng)所用的，可翻譯狀態(tài)的核苷酸序列是置于在適當(dāng)條件或環(huán)境下能合成蛋白質(zhì)的位置的核苷酸序列。盡管許多因子協(xié)同參與翻譯，但是根據(jù)本發(fā)明，可翻譯狀態(tài)是指核苷酸序列含有翻譯必需的最少因子，如翻譯起始信號(hào)(翻譯激活劑)、翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子。
根據(jù)本發(fā)明，不可翻譯的核苷酸序列是指核苷酸序列是理論上被設(shè)計(jì)成不被翻譯的或以可忽略的痕量水平被翻譯的形式，換句話說(shuō)，核苷酸序列基本上不被翻譯。作為痕量水平的翻譯，基本上等同于不翻譯，如果可消除由于形成融合蛋白質(zhì)的影響的本發(fā)明的特征在該水平不被破壞。即，由不可翻譯的核苷酸序列編碼的氨基酸序列不能被翻譯成與由可翻譯狀態(tài)的核苷酸序列編碼的氨基酸序列相融合的蛋白質(zhì)。不可翻譯的核苷酸序列是由于缺乏翻譯必需的最少因子而不被翻譯的序列。
本申請(qǐng)所用的，上游和下游代表相對(duì)于RNA從本發(fā)明核酸構(gòu)建體中的啟動(dòng)子開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄方向的位置。在本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中，鄰近啟動(dòng)子序列的位置是上游，而鄰近聚腺苷酸信號(hào)序列的位置是下游。
(1)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體本發(fā)明的核酸構(gòu)建體是具有啟動(dòng)子序列、至少一個(gè)與啟動(dòng)子序列相連的可翻譯狀態(tài)的、編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列、以及聚腺苷酸信號(hào)序列的核酸構(gòu)建體，其中核酸構(gòu)建體進(jìn)一步在啟動(dòng)子序列和聚腺苷酸信號(hào)序列之間含有，與編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列不同的、不可翻譯的核苷酸序列，將與啟動(dòng)子序列相連的可翻譯狀態(tài)的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸和與編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列不同的、不可翻譯的核苷酸序列連接起來(lái)，使得它們從核酸構(gòu)建體中轉(zhuǎn)錄成單一RNA分子，和不可翻譯的核苷酸序列選自
(A)編碼蛋白質(zhì)或部分蛋白質(zhì)的核苷酸序列；和(B)天然位于編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的5′或3′端非翻譯區(qū)的核苷酸序列。
本發(fā)明核苷酸構(gòu)建體的示范性的實(shí)施方案是具有啟動(dòng)子序列、聚腺苷酸信號(hào)序列、以及在啟動(dòng)子序列和聚腺苷酸信號(hào)序列之間插入的DNA序列的核酸構(gòu)建體，其通過(guò)啟動(dòng)子的作用轉(zhuǎn)錄成單一RNA分子，其中DNA序列選自(A)具有與報(bào)告基因序列相連的不可翻譯的核苷酸序列的DNA序列，其中從DNA轉(zhuǎn)錄的RNA編碼可翻譯狀態(tài)的報(bào)告基因的產(chǎn)物和不能翻譯狀態(tài)的核苷酸序列；和(B)具有報(bào)告基因序列和與其相鄰的限制性酶識(shí)別/切割位點(diǎn)的DNA序列，其中，如果在限制性酶識(shí)別/切割位點(diǎn)插入核苷酸序列，那么從DNA轉(zhuǎn)錄的RNA編碼可翻譯狀態(tài)的報(bào)告基因的產(chǎn)物和不能翻譯狀態(tài)的核苷酸序列。
在不限制本發(fā)明的前提下，但是不可翻譯的核苷酸序列通常來(lái)自與可翻譯狀態(tài)的核苷酸序列不同的基因。在不限制本發(fā)明的前提下，但是例如，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可以是一種核酸構(gòu)建體，其中按啟動(dòng)子序列、報(bào)告基因序列、起終止密碼子功能的序列、不可翻譯的核苷酸序列和聚腺苷酸信號(hào)序列的順序排列。可選擇地，其可以是一種核酸構(gòu)建體，其中按啟動(dòng)子序列、不可翻譯的核苷酸序列、起起始密碼子功能的序列、報(bào)告基因序列和聚腺苷酸信號(hào)序列的順序排列。
本發(fā)明核酸構(gòu)建體中的不可翻譯的核苷酸序列(例如，來(lái)自靶基因的序列)在從核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的RNA中作為UTR存在，并且不被翻譯。因此，不產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)，并且從以可翻譯狀態(tài)連接的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列(例如，編碼報(bào)告蛋白質(zhì)的基因序列)中表達(dá)保持其功能的蛋白質(zhì)。當(dāng)存在降解RNA中編碼不可翻譯的核苷酸序列區(qū)域的核苷酸分子(例如，核酶或siRNA)時(shí)，整個(gè)RNA不穩(wěn)定，導(dǎo)致由以可翻譯狀態(tài)連接的核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)降低。接著，通過(guò)追蹤從本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的RNA或RNA翻譯產(chǎn)物的改變，能普遍地和很容易地篩選能有效抑制不可翻譯的核苷酸序列表達(dá)的分子。
不可翻譯的核苷酸序列可位于以可翻譯狀態(tài)連接的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的上游或下游，只要其是基本上不被翻譯的序列即可。此外，不可翻譯的核苷酸序列可來(lái)自與以可翻譯狀態(tài)連接的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列不同的基因。
如果不可翻譯的核苷酸序列位于以可翻譯狀態(tài)連接的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的上游，那么關(guān)于本發(fā)明的核苷酸構(gòu)建體沒(méi)有特殊限制，只要將不可翻譯的核苷酸序列置于不被翻譯的位置即可。例如，可選擇某個(gè)區(qū)域不含有翻譯起始密碼子(例如，ATG)以制備不能翻譯狀態(tài)的序列。如果有具有可能作為起始密碼子的序列，那么可通過(guò)取代、添加、缺失或插入核苷酸修飾該密碼子以制備不可翻譯的序列。
如果不可翻譯的核苷酸序列位于以可翻譯狀態(tài)連接的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的下游，那么關(guān)于本發(fā)明的核苷酸構(gòu)建體沒(méi)有特殊限制，只要將不可翻譯的核苷酸序列置于不被翻譯的位置即可。例如，可將起終止密碼子(TAA、TAG、TGA)作用的序列置于可翻譯狀態(tài)連接的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列和不可翻譯的核苷酸序列之間。在這種情況中，以可翻譯狀態(tài)連接的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列中起始密碼子開(kāi)始的3個(gè)連續(xù)核苷酸的閱讀框(密碼子)定義了終止密碼子，終止密碼子在可翻譯狀態(tài)連接的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的末端終止RNA的翻譯，則下游不可翻譯的核苷酸序列不被翻譯。因此，預(yù)計(jì)不產(chǎn)生由可翻譯狀態(tài)連接的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)和由不可翻譯的核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)，當(dāng)反映mRNA穩(wěn)定時(shí)表達(dá)可翻譯狀態(tài)連接的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的翻譯產(chǎn)物。
可將本發(fā)明的核酸構(gòu)建體用于檢測(cè)通過(guò)功能核苷酸分子改變基因表達(dá)的方法。
可在本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中含有任何啟動(dòng)子序列，只要其是具有在真核細(xì)胞或其類似的環(huán)境(例如，無(wú)細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng))中參與RNA轉(zhuǎn)錄起始反應(yīng)活性的序列即可?？墒褂脕?lái)自真核生物的啟動(dòng)子序列(例如，β-肌動(dòng)蛋白質(zhì)啟動(dòng)子、U6啟動(dòng)子)或來(lái)自在真核細(xì)胞中具有啟動(dòng)子活性的病毒的啟動(dòng)子序列(例如，CMV(巨細(xì)胞病毒)啟動(dòng)子)。此外，可選擇適于進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的環(huán)境(生物個(gè)體、培養(yǎng)的細(xì)胞、無(wú)細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)等)的啟動(dòng)子。例如，在無(wú)細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的情況中，可選擇使用相應(yīng)于RNA聚合酶的啟動(dòng)子。除了上述來(lái)自真核生物或病毒的啟動(dòng)子序列，可選擇來(lái)自噬菌體如T7噬菌體的啟動(dòng)子序列。在不限制本發(fā)明的前提下，但是在篩選抑制蛋白質(zhì)表達(dá)的功能核苷酸分子的情況中，可優(yōu)先使用組成型和強(qiáng)烈表達(dá)的啟動(dòng)子，以便可清楚判斷抑制的程度。
通過(guò)報(bào)告基因序列舉例說(shuō)明本發(fā)明核酸構(gòu)建體中包含的可翻譯狀態(tài)連接的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列。關(guān)于報(bào)告基因序列沒(méi)有特殊限制，只要其是編碼可直接和/或間接檢測(cè)到的任意蛋白質(zhì)的基因的核酸序列即可。關(guān)于報(bào)告基因編碼的蛋白質(zhì)(報(bào)告蛋白質(zhì))沒(méi)有特殊限制。其實(shí)例包括產(chǎn)生可特異性檢測(cè)到的底物的酶(β-半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷酸酶等)和可直接檢測(cè)到的蛋白質(zhì)。也可以僅選擇報(bào)告基因的一部分并使用，只要保留有用的特性即可。可聯(lián)合使用兩個(gè)以上的報(bào)告基因。直接檢測(cè)蛋白質(zhì)方法的實(shí)例包括通過(guò)使用識(shí)別報(bào)告蛋白質(zhì)的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)的方法、檢測(cè)來(lái)自發(fā)射熒光信號(hào)的報(bào)告蛋白質(zhì)(例如，綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP))熒光的方法，以及使用可選擇的標(biāo)記蛋白質(zhì)如賦予抗藥性質(zhì)的標(biāo)記蛋白質(zhì)?？墒褂眠@種報(bào)告蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類。例如，發(fā)射熒光信號(hào)的報(bào)告蛋白質(zhì)是有用的，因?yàn)榭墒褂肍ACS(熒光激活細(xì)胞分類術(shù))法選擇表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞。
本發(fā)明核酸構(gòu)建體中含有的不可翻譯的核苷酸序列可以是感興趣(或期望改變其表達(dá))的靶基因的任何區(qū)域的核苷酸序列?？蛇x擇靶蛋白質(zhì)的編碼區(qū)、部分編碼區(qū)、3′UTR或5′UTR作為不可翻譯的核苷酸序列。此外，可將來(lái)自多個(gè)基因的序列安排在不可翻譯的核苷酸序列中。另外，可使用從來(lái)自感興趣生物的基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)、代表在特異性器官或在特殊階段表達(dá)的cDNA文庫(kù)等中制備的核酸(群)作為不可翻譯的核苷酸序列。
本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在轉(zhuǎn)如了該構(gòu)建體的宿主細(xì)胞中或在轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物中轉(zhuǎn)錄成單一RNA分子?？捎霉δ芎塑账岱肿邮筊NA不穩(wěn)定。通過(guò)識(shí)別和作用于RNA中不可翻譯的核苷酸序列區(qū)域的核苷酸序列，使整個(gè)RNA不穩(wěn)定的分子，舉例說(shuō)明功能核苷酸分子。例如，可使用本發(fā)明的方法檢查下列物質(zhì)的活性dsRNA、siRNA、shRNA和RNAi機(jī)制中的核酸酶復(fù)合體(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC))、被認(rèn)為參與生物體發(fā)育階段的stRNA(小的暫時(shí)RNA)、被認(rèn)為參與各種各樣生物學(xué)事件的miRNA(微RNA)、含有miRNA的蛋白質(zhì)復(fù)合體miRNP、核酶、大核酶(maxizyme)、錘頭狀核酶、反義RNA、EGS(外部指導(dǎo)序列)和含有這種核苷酸分子的蛋白質(zhì)復(fù)合體。
從本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄出的RNA穩(wěn)定地表達(dá)由以可翻譯狀態(tài)連接的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)(例如，報(bào)告蛋白質(zhì))，作為單一蛋白質(zhì)，以幾乎天然的狀態(tài)，不形成融合蛋白質(zhì)。例如，如果報(bào)告蛋白質(zhì)的表達(dá)受到抑制，那么這種現(xiàn)象可能是由于形成靶基因編碼的蛋白質(zhì)和報(bào)告蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)，結(jié)果使報(bào)告蛋白質(zhì)的固有功能發(fā)生改變所致。可根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)基因表達(dá)的方法消除這種可能性。也可消除由于功能核苷酸分子作用于不可翻譯的核苷酸序列抑制翻譯機(jī)制，結(jié)果使報(bào)告蛋白質(zhì)的固有功能發(fā)生改變所致現(xiàn)象的可能性。
另外，由于不必將不可翻譯的核苷酸序列翻譯成蛋白質(zhì)，因此不必符合不可翻譯的核苷酸序列的閱讀框架(密碼子；與每種氨基酸對(duì)應(yīng)的3個(gè)核苷酸的鏈)。因此，因?yàn)椴槐剡x擇適當(dāng)?shù)南拗菩悦缸R(shí)別位點(diǎn)或者符合閱讀框架，例如，通過(guò)插入或缺失核苷酸，所以可很容易地將不可翻譯的核苷酸序列與本發(fā)明核酸構(gòu)建體中以可翻譯狀態(tài)連接的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列相連。
本發(fā)明的核酸構(gòu)建體包括具有以可翻譯狀態(tài)連接的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列和相鄰的限制酶識(shí)別/切割位點(diǎn)的核酸構(gòu)建體，其中如果將不能轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列插入到限制性酶識(shí)別/切割位點(diǎn)，那么從核酸構(gòu)建體中轉(zhuǎn)錄的RNA編碼以可翻譯狀態(tài)連接的可被翻譯的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，并且編碼基本上不被翻譯的不可翻譯的核苷酸序列。這種核苷酸構(gòu)建體很有用，因?yàn)橐暷康牡牟煌?，可插入靶基因序列?？墒褂萌魏蜗拗泼缸R(shí)別/切割位點(diǎn)，只要其是便于插入感興趣的靶基因序列的序列即可。在不限制本發(fā)明的前提下，但是例如，可使用稱作克隆位點(diǎn)或多克隆位點(diǎn)的序列，其中排列一個(gè)或多個(gè)限制酶位點(diǎn)?？蓛?yōu)選使用可買到的載體或接頭中廣泛和通常使用的序列。
本發(fā)明核酸構(gòu)建體中的聚腺苷酸信號(hào)序列是在mRNA的3′末端產(chǎn)生添加聚腺苷酸反應(yīng)的序列。關(guān)于聚腺苷酸信號(hào)序列沒(méi)有特殊限制，只要其是導(dǎo)致添加聚腺苷酸反應(yīng)的序列即可。例如，可使用核苷酸序列AAUAAA，其在高級(jí)真核生物的mRNAs中高度保守并且通常代表聚腺苷酸添加位點(diǎn)上游11到30個(gè)核苷酸。
可將終止子序列置于本發(fā)明核酸構(gòu)建體中聚腺苷酸信號(hào)序列的下游?？墒褂萌魏谓K止序列，只要其是具有終止RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄mRNA功能的序列即可。在不限制本發(fā)明的前提下，但是在真核生物中RNA聚合酶在終止序列內(nèi)的多個(gè)位點(diǎn)終止RNA合成。
可根據(jù)進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的環(huán)境，適當(dāng)?shù)剡x擇本發(fā)明核酸構(gòu)建體中的含有的聚腺苷酸信號(hào)序列和終止子序列。可買到許多適應(yīng)宿主的蛋白質(zhì)表達(dá)載體?？苫诨蚪Y(jié)合這些載體制備本發(fā)明的核酸構(gòu)建體。在不限制本發(fā)明的前提下，但是例如，可使用牛來(lái)源的BGH聚腺苷酸信號(hào)序列和終止子序列。
(2)本發(fā)明的載體本發(fā)明的載體是含有本發(fā)明核酸構(gòu)建體的載體。其可以是任何載體，在適當(dāng)宿主細(xì)胞或與宿主細(xì)胞的環(huán)境相似的反應(yīng)混合物中，從其轉(zhuǎn)錄的RNA，在同一分子中，含有可翻譯狀態(tài)連接的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列(例如，報(bào)告基因序列)、不可翻譯的核苷酸序列(例如，靶基因序列)以及聚腺苷酸信號(hào)序列。本發(fā)明的載體包括用于構(gòu)建本發(fā)明載體的載體，只要其含有本發(fā)明的核酸構(gòu)建體即可。本發(fā)明的載體可以是質(zhì)粒載體、噬菌體載體、可自主復(fù)制的載體、病毒載體、整合到宿主染色體中的載體、或者用于暫時(shí)或瞬間表達(dá)的載體。視本發(fā)明核酸構(gòu)建體中的含有的啟動(dòng)子序列、基因序列和功能核苷酸分子，優(yōu)選選擇用于相容物種的載體，或宿主。可選擇適于許多當(dāng)前可買到的宿主-載體系統(tǒng)目的的載體。
(3)本發(fā)明的RNA本發(fā)明的RNA是含有至少一種可翻譯狀態(tài)的、編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列和與編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列不同的、不可翻譯的核苷酸序列的RNA，其中不可翻譯的核苷酸序列選自(A)與可翻譯狀態(tài)的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列不同的、編碼蛋白質(zhì)或部分蛋白質(zhì)的核苷酸序列；和(B)天然位于與可翻譯狀態(tài)的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列不同的、編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列5′或3′端非翻譯區(qū)的核苷酸序列。
可通過(guò)本發(fā)明核酸構(gòu)建體的體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄制備本發(fā)明的RNA。可選擇地，其可通過(guò)連接作為構(gòu)成本發(fā)明RNA的組分的RNAs來(lái)制備。
本發(fā)明的RNA可用于篩選改變靶基因表達(dá)的功能核苷酸分子的方法或者篩選其表達(dá)被根據(jù)本發(fā)明的核苷酸分子改變的基因的方法。
(4)檢測(cè)本發(fā)明的功能核苷酸分子改變靶基因表達(dá)的活性的方法檢測(cè)本發(fā)明的功能核苷酸分子改變靶基因表達(dá)的活性的方法包括下列步驟(A)從如在(1)中所述的核酸構(gòu)建體或如在(2)中所述的載體中轉(zhuǎn)錄RNA，該RNA具有，作為不可翻譯的核苷酸序列的選自靶基因中編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列、該核苷酸序列的一部分、以及位于靶基因中編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的5′或3′端非翻譯區(qū)的核苷酸序列；(B)使核苷酸分子與步驟(A)中轉(zhuǎn)錄的RNA接觸；(C)檢測(cè)步驟(B)中的RNA或從RNA翻譯的翻譯產(chǎn)物；和(D)基于步驟(C)中所檢測(cè)的RNA或從RNA翻譯的翻譯產(chǎn)物的量，檢測(cè)功能核苷酸分子改變靶基因表達(dá)的活性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，篩選本發(fā)明功能核苷酸分子的方法包括下列步驟(A)制備本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或載體，即，具有啟動(dòng)子序列、聚腺苷酸信號(hào)序列、和在啟動(dòng)子序列和聚腺苷酸信號(hào)序列之間插入的DNA序列的核酸構(gòu)建體或者含有核酸構(gòu)建體的載體，其中所述的DNA序列可通過(guò)啟動(dòng)子的作用轉(zhuǎn)錄成單一RNA分子。上述DNA序列是具有連接于報(bào)告基因的不可翻譯的核苷酸序列的DNA序列，其中從該DNA轉(zhuǎn)錄的RNA編碼可翻譯狀態(tài)的報(bào)告基因的產(chǎn)物和不能翻譯狀態(tài)的核苷酸序列；(B)從步驟(A)中的核酸構(gòu)建體或載體中轉(zhuǎn)錄RNA；(C)使核苷酸分子與步驟(B)中的RNA接觸；和(D)檢測(cè)RNA中的報(bào)告基因的區(qū)域或者報(bào)告蛋白質(zhì)。
可通過(guò)下列步驟檢測(cè)功能核苷酸分子改變靶基因表達(dá)的活性使用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或含有核酸構(gòu)建體的載體，轉(zhuǎn)錄含有包括以可翻譯狀態(tài)連接的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列、不可翻譯的核苷酸序列和聚腺苷酸信號(hào)序列在內(nèi)的一系列序列的RNA，或者制備本發(fā)明的RNA；使核苷酸分子與RNA接觸；以及檢測(cè)并比較與可翻譯狀態(tài)連接的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列對(duì)應(yīng)的RNA部分或者翻譯的蛋白質(zhì)。由上述檢測(cè)的結(jié)果，可判斷導(dǎo)致所述改變的核苷酸是否是功能核苷酸。此外，根據(jù)本發(fā)明，可使用上述檢測(cè)方法篩選多個(gè)核苷酸分子以選擇改變靶基因表達(dá)的功能核苷酸分子?？善叫械鼗蜻B續(xù)地在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外進(jìn)行RNA的轉(zhuǎn)錄、與核苷酸分子接觸以及蛋白質(zhì)的表達(dá)。關(guān)于篩選功能核苷酸分子的方法沒(méi)有特殊限制。例如，將本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或本發(fā)明的載體和功能核苷酸分子轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)，檢查可翻譯狀態(tài)連接的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的表達(dá)。
功能核苷酸分子可根據(jù)靶核酸序列或其部分由化學(xué)方法合成，或者通過(guò)生物合成方法生產(chǎn)?？蛇x擇地，其可以是在轉(zhuǎn)入了經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)移載體的宿主細(xì)胞中表達(dá)的產(chǎn)物，結(jié)果其在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生。此外，可以使用多種功能核苷酸分子，如來(lái)自基因組文庫(kù)、cDNA文庫(kù)或器官/階段特異性cDNA文庫(kù)的多個(gè)核苷酸。可通過(guò)使用這樣的文庫(kù)篩選改變靶基因表達(dá)的功能核苷酸分子。
根據(jù)本發(fā)明的方法，將核苷酸分子與從本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或載體中轉(zhuǎn)錄的RNA，或本發(fā)明的RNA接觸后，可直接檢測(cè)RNA或檢測(cè)RNA的翻譯產(chǎn)物?？墒褂靡褕?bào)道的許多直接檢測(cè)RNA方法中的任何一種，只要其能定性或定量檢測(cè)RNA即可。其實(shí)例包括，但不限于，濃度測(cè)量、凝膠電泳法、PCR(聚合酶鏈反應(yīng))法、實(shí)時(shí)PT-PCR法、TAS(基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng))法、3SR(自動(dòng)維持序列擴(kuò)增)、NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增)法、Qβ復(fù)制酶法和TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增)法。
可選擇將本發(fā)明的核酸構(gòu)建體、本發(fā)明的載體、功能核苷酸分子或能產(chǎn)生有功能的寡核苷酸分子的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞的方法，可選擇對(duì)應(yīng)于核酸構(gòu)建體或載體的方法。在不限制本發(fā)明的前提下，可使用使用物理或化學(xué)方法直接轉(zhuǎn)移，或者通過(guò)感染轉(zhuǎn)移。
(5)篩選其表達(dá)被本發(fā)明的核苷酸分子改變的基因的方法篩選其表達(dá)被本發(fā)明的核苷酸分子改變的基因的方法包括下列步驟(A)從第一方面的核酸構(gòu)建體或第二方面的載體中轉(zhuǎn)錄RNA，該RNA具有，作為不可翻譯的核苷酸序列的選自在任意基因中編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列、該核苷酸序列的一部分、以及位于編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的5′或3′端非翻譯區(qū)的核苷酸序列；(B)使核苷酸分子與步驟(A)中轉(zhuǎn)錄的RNA接觸；(C)檢測(cè)步驟(B)中的RNA或從RNA翻譯的翻譯產(chǎn)物；和
(D)基于在步驟(C)中檢測(cè)到的RNA或從RNA翻譯的翻譯產(chǎn)物的量，鑒定其表達(dá)被核苷酸分子改變的基因。
篩選其表達(dá)被本發(fā)明的核苷酸分子改變的基因的方法中，通過(guò)下列步驟可篩選其表達(dá)被功能核苷酸分子改變的基因，或者篩選這種功能核苷酸分子的活性即用來(lái)自基因組文庫(kù)、cDNA文庫(kù)或器官/階段特異性cDNA文庫(kù)中的多個(gè)靶序列作為不可翻譯的核苷酸序列，制備的本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或載體；用轉(zhuǎn)錄含有多個(gè)不可翻譯的核苷酸序列的多個(gè)RNAs，或者多種本發(fā)明的RNAs；使功能核苷酸分子與RNAs接觸；以及檢測(cè)與可翻譯狀態(tài)連接的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列對(duì)應(yīng)的RNA部分或者翻譯的蛋白質(zhì)?？蓛?yōu)選使用具有啟動(dòng)子序列、聚腺苷酸信號(hào)序列、以及在啟動(dòng)子序列和聚腺苷酸信號(hào)序列之間插入的DNA序列的核酸構(gòu)建體用于該方法，所述DNA序列通過(guò)啟動(dòng)子的作用轉(zhuǎn)錄成單一RNA分子。DNA序列是具有報(bào)告基因和其相鄰的限制酶識(shí)別/切割位點(diǎn)的DNA序列，其中如果在限制酶識(shí)別/切割位點(diǎn)插入靶基因序列，那么從該DNA序列中轉(zhuǎn)錄的RNA可編碼產(chǎn)物可被翻譯的報(bào)告基因，以及產(chǎn)物不能被翻譯的靶基因序列。
(6)本發(fā)明的試劑盒本發(fā)明提供用于根據(jù)本發(fā)明如在上述(4)或(5)中所闡述的篩選功能核苷酸分子的方法或者篩選其表達(dá)被核苷酸分子改變的基因的方法的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒包括其以包裝形式并且含有如在上述(1)中所闡述的本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或者在上述核酸構(gòu)建體中的不可翻譯的基因序列位置上含有克隆位點(diǎn)的核酸構(gòu)建體的試劑盒，使用者可將來(lái)自感興趣靶基因的序列插入其中。本發(fā)明的試劑盒可含有說(shuō)明書(shū)。
“說(shuō)明書(shū)”印有描述使用該試劑盒的方法，例如，制備反應(yīng)溶液的方法、建議的反應(yīng)條件等。說(shuō)明書(shū)包括小冊(cè)子或散頁(yè)形式的說(shuō)明手冊(cè)、貼在試劑盒上的標(biāo)簽、以及在含有試劑盒的包裝表面上的說(shuō)明。說(shuō)明書(shū)也包括通過(guò)電子宣傳工具如因特網(wǎng)公開(kāi)的或提供的信息。
此外，本發(fā)明的試劑盒包括含有如在(2)中所闡述的載體或如在(3)中所闡述的RNA的試劑盒。
實(shí)施例下列實(shí)施例更詳細(xì)地闡述了本發(fā)明，但不應(yīng)當(dāng)被解釋為限制其范圍。在這里所描述的方法中，根據(jù)在Molecular CloningA LaboratoryManual，2nd ed中所描述的方法進(jìn)行包括制備質(zhì)粒DNAs和限制酶消化的基本方法。除非有其它說(shuō)明，使用大腸桿菌JM109作為宿主用于構(gòu)建使用大腸桿菌的質(zhì)粒。在37℃需氧培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞，使用含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(1％胰蛋白質(zhì)胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉，pH 7.O)或通過(guò)向上述培養(yǎng)基中添加1.5％濃度的瓊脂并使所得混合物凝固而制備的LB-氨芐青霉素平板。在細(xì)胞培養(yǎng)皿中(Iwaki Glass)使用，作為培養(yǎng)基，補(bǔ)充了10％胎牛血清(BioWhittaker)的Dulbecco′s修飾的Eagle′s培養(yǎng)基(Bio Whittaker)，在37℃，含有5％CO2的潮濕的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。根據(jù)附帶的說(shuō)明書(shū)使用試劑盒和操作各種儀器。
實(shí)施例1構(gòu)建具有小鼠Fas基因序列的靶質(zhì)粒質(zhì)粒pQBI25(Wako Chemicals USA)具有CMV啟動(dòng)子、rsGFP(紅移型綠色熒光蛋白質(zhì))基因和BGH聚腺苷酸，并且在細(xì)胞中有效地表達(dá)rsGFP。在rsGFP基因和BGH聚腺苷酸之間存在限制酶BamHI和EcoRI的位點(diǎn)。將具有從小鼠Fas基因(GenBank登記號(hào)M83649)起始密碼子下游75個(gè)核苷酸開(kāi)始到終止密碼子的序列，并在末端具有添加的限制酶BamHI和EcoRI的粘性末端的dsDNA(SEQ ID NO1)插入到pQBI25的BamHI和EcoRI位點(diǎn)之間以構(gòu)建靶質(zhì)粒pTargetFas。靶質(zhì)粒在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄具有rsGFP基因序列和Fas基因的部分序列的RNA。
實(shí)施例2篩選有效抑制Fas基因表達(dá)的siRNA制備5個(gè)21-bp dsRNAs，每個(gè)具有小鼠Fas基因的部分序列。通過(guò)分別將RNA2-1(SEQ ID NO2)與RNA2-2(SEQ ID NO3)、RNA3-1(SEQ ID NO4)與RNA3-2(SEQ ID NO5)、RNA4-1(SEQ ID NO6)與RNA4-2(SEQ ID NO7)、RNA5-1(SEQ ID NO8)與RNA5-2(SEQ IDNO9)、以及RNA6-1(SEQ ID NO10)與RNA6-2(SEQ ID NO11)退火制備RNA2、RNA3、RNA4、RNA5和RNA6。將每個(gè)dsRNA連同pTargetFas一起轉(zhuǎn)移到293細(xì)胞(ATCC No.CRL-1573)內(nèi)。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)和Ribojuice(Takara Bio)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。將細(xì)胞培養(yǎng)兩天并使用胰蛋白質(zhì)酶從平皿中分離，使用MoFlo(Takara Bio)測(cè)量細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示于圖1中。圖1顯示將無(wú)RNA轉(zhuǎn)移的對(duì)照細(xì)胞的熒光密度定義為100的相對(duì)值。觀察到轉(zhuǎn)移RNA2和pTargetFas的細(xì)胞的熒光密度最弱。因此，判斷RNA2是有效抑制Fas基因表達(dá)的siRNA。
實(shí)施例3進(jìn)一步證實(shí)實(shí)施例2的結(jié)果通過(guò)下列方法進(jìn)一步證實(shí)在實(shí)施例2中獲得的siRNA的效果。使用Ribojuice(Takara Bio)將RNA2、RNA3、RNA4、RNA5或RNA6轉(zhuǎn)移到表達(dá)Fas的NIH3T3細(xì)胞(ATCC No.CRL-1658)。兩天后，從細(xì)胞中提取RNAs，并使用實(shí)時(shí)RT-PCR定量Fas mRNAs。使用無(wú)RNA轉(zhuǎn)移的細(xì)胞作為對(duì)照，使用管家基因GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行修正。使用實(shí)時(shí)RT-PCR Core試劑盒(Takara Bio)和Smart循環(huán)儀系統(tǒng)(Takara Bio)以及SEQ ID NOS12和13的寡DNAs作為Fas的引物，或者實(shí)時(shí)RT-PCR引物(Takara Bio)的引物作為GAPDH的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR。結(jié)果顯示于圖2中。圖2顯示將無(wú)RNA轉(zhuǎn)移的對(duì)照細(xì)胞的mRNA量定義為100的相對(duì)值。Fas mRNA量的降低與實(shí)施例2中所觀察到的rsGFP熒光強(qiáng)度的降低一致。因此，進(jìn)一步證實(shí)該篩選方法很有用。
實(shí)施例4構(gòu)建具有rsGFP(紅移型綠色熒光蛋白質(zhì))基因序列的靶質(zhì)粒使用rsGFP-1(SEQ ID NO14)和rsGFP-2(SEQ ID NO15)作為引物以及pQBI25作為模板，通過(guò)PCR制備含有rsGFP基因中從起始密碼子到終止密碼子周圍部分的區(qū)域并且在末端具有限制酶XbaI和NheI位點(diǎn)的DNA片段。用限制酶XbaI和NheI處理該DNA片段獲得約720-bp DNA片段。在質(zhì)粒pGL3control(Promega)中螢火蟲(chóng)熒光素酶基因和SV40聚腺苷酸之間的限制酶XbaI位點(diǎn)插入約720-bp DNA片段，構(gòu)建靶質(zhì)粒pGL3-3′(GFP)。
實(shí)施例5篩選有效抑制rsGFP基因表達(dá)的siRNA制備5個(gè)21-bp dsRNAs，每個(gè)具有rsGFP基因的部分序列。通過(guò)分別將RNA7-1(SEQ ID NO17)與RNA7-2(SEQ ID NO18)、RNA8-1(SEQ ID NO19)與RNA8-2(SEQ ID NO20)、RNA9-1(SEQ ID NO21)與RNA9-2(SEQ ID NO22)、以及RNA10-1(SEQ ID NO23)與RNA10-2(SEQ ID NO24)退火制備RNA7、RNA8、RNA9和RNA10。將每個(gè)dsRNA連同pGL3-3′(GFP)和作為內(nèi)對(duì)照表達(dá)Renilla熒光素酶的pRL-TK(Promega)一起轉(zhuǎn)移到293細(xì)胞(ATCC No.CRL-1573)中。使用TransIT293(Takara Bio)和TransIT-TKO(Takara Bio)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。調(diào)整siRNA濃度使終濃度為1.25到160nM。將細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)。除去培養(yǎng)上清后，將細(xì)胞用PBS沖洗一次，并用在去離子水中5倍稀釋的5×Passive裂解緩沖液(Promega)裂解。根據(jù)雙熒光素酶分析系統(tǒng)(Promega)的方案，使用發(fā)光平板閱讀器Mithras 940(Berthold)測(cè)量10μl裂解液中螢火蟲(chóng)熒光素酶和Renilla熒光素酶的發(fā)光值?；谶@樣獲得的發(fā)光值計(jì)算相對(duì)的發(fā)光強(qiáng)度(＝螢火蟲(chóng)熒光素酶的發(fā)光值/Renilla熒光素酶的發(fā)光值)。結(jié)果顯示于圖3中。在圖3中，水平軸代表轉(zhuǎn)移的siRNA濃度，縱軸代表將無(wú)RNA轉(zhuǎn)移的對(duì)照細(xì)胞的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度定義為100％時(shí)，各自標(biāo)本的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的相對(duì)值。從圖3看到，其顯示觀察到RNA8、RNA10、RNA9和RNA7的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的相對(duì)值以這個(gè)順序依次增加。因此，可斷定以siRNAs、RNA8、RNA10、RNA9和RNA7這個(gè)順序更有效地抑制rsGFP基因的表達(dá)。
實(shí)施例6使用實(shí)時(shí)RT-PCR比較RNAi效果使用TransIT293和TransIT-TKO將每個(gè)siRNAs(RNA7-10)和rsGFP表達(dá)質(zhì)粒(pQBI25)轉(zhuǎn)移到293細(xì)胞中。兩天后，從細(xì)胞中提取RNAs，使用實(shí)時(shí)RT-PCR對(duì)rsGFP mRNAs進(jìn)行定量。使用僅轉(zhuǎn)移pQBI25的細(xì)胞作為對(duì)照，使用pQBI25中的新霉素抗性基因?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行修正。使用實(shí)時(shí)RT-PCR Core試劑盒(Takara Bio)和Smart循環(huán)儀系統(tǒng)(Takara Bio)以及GFP-B-F(SEQ ID NO25)和GFP-B-R(SEQ IDNO26)作為rsGFP的引物或者寡DNAs Neo-F(SEQ ID NO27)和Neo-R(SEQ ID NO28)作為新霉素抗性基因的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR。結(jié)果顯示于圖4中。在圖4中，水平軸代表所用siRNAs的名稱，縱軸代表將僅轉(zhuǎn)移pQBI25的對(duì)照細(xì)胞mRNA的量定義為100時(shí)的相對(duì)值。如圖4中所示rsGFP mRNA的降低與實(shí)施例5中所觀察到的螢火蟲(chóng)熒光素酶的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的相對(duì)值的降低一致。因此，進(jìn)一步證實(shí)如在實(shí)施例4和5中所述的siRNA篩選方法很有用。
工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明提供可普遍用于許多靶基因的，篩選通過(guò)使RNA不穩(wěn)定，抑制靶基因表達(dá)的核苷酸分子的方法。
序列表文本SEQ ID NO2設(shè)計(jì)為RNA2-1的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO3設(shè)計(jì)為RNA2-2的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO4設(shè)計(jì)為RNA3-1的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO5設(shè)計(jì)為RNA3-2的嵌合寡核苷酸。“核苷酸1到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO6設(shè)計(jì)為RNA4-1的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO7設(shè)計(jì)為RNA4-2的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO8設(shè)計(jì)為RNA5-1的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO9設(shè)計(jì)為RNA5-2的嵌合寡核苷酸。“核苷酸1到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO10設(shè)計(jì)為RNA6-1的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO11設(shè)計(jì)為RNA6-2的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO12設(shè)計(jì)的用于擴(kuò)增部分小鼠Fas基因的PCR引物。
SEQ ID NO13設(shè)計(jì)的用于擴(kuò)增部分小鼠Fas基因的PCR引物。
SEQ ID NO14設(shè)計(jì)的用于擴(kuò)增部分rsGFP基因的PCR引物rsGFP-1。
SEQ ID NO15設(shè)計(jì)的用于擴(kuò)增部分rsGFP基因的PCR引物rsGFP-2。
SEQ ID NO16rsGFP基因SEQ ID NO17設(shè)計(jì)為RNA7-1的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO18設(shè)計(jì)為RNA7-2的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO19設(shè)計(jì)為RNA8-1的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO20設(shè)計(jì)為RNA8-2的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO21設(shè)計(jì)為RNA9-1的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO22設(shè)計(jì)為RNA9-2的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO23設(shè)計(jì)為RNA10-1的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO24設(shè)計(jì)為RNA10-2的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO25設(shè)計(jì)的用于擴(kuò)增部分rsGFP基因的PCR引物GFP-B-F。
SEQ ID NO26設(shè)計(jì)的用于擴(kuò)增部分rsGFP基因的PCR引物GFP-B-R。
SEQ ID NO27設(shè)計(jì)的用于擴(kuò)增部分新霉素抗性基因的PCR引物Neo-F。
SEQ ID NO28設(shè)計(jì)的用于擴(kuò)增部分新霉素抗性基因的PCR引物Neo-R。
序列表<110>TAKARA BIO INC.
<120>篩選功能核酸分子的方法<130>664687<150>JP 2003-307624<151>2003-08-29<160>28<210>1<211>907<212>DNA<213>家鼠(Mus musculus)<400>1tagcatctcc gagagtttaa agctgaggag gcgggttcat gaaactgata aaaactgctc 60agaaggatta tatcaaggag gcccattttg ctgtcaacca tgccaacctg gtaaaaaaaa 120agttgaggac tgcaaaatga atgggggtac accaacctgt gccccatgca cagaagggaa 180ggagtacatg gacaagaacc attatgctga taaatgcaga agatgcacac tctgcgatga 240agagcatggt ttagaagtgg aaacaaactg caccctgacc cagaatacca agtgcaagtg 300caaaccagac ttctactgcg attctcctgg ctgtgaacac tgtgttcgct gcgcctcgtg 360tgaacatgga acccttgagc catgcacagc aaccagcaat acaaactgca ggaaacaaag 420tcccagaaat cgcctatggt tgttgaccat ccttgttttg ttaattccac ttgtatttat 480atatcgaaag taccggaaaa gaaagtgctg gaaaaggaga caggatgacc ctgaatctag 540aacctccagt cgtgaaacca taccaatgaa tgcctcaaat cttagcttga gtaaatacat 600cccgagaatt gctgaagaca tgacaatcca ggaagctaaa aaatttgctc gagaaaataa 660catcaaggag ggcaagatag atgagatcat gcatgacagc atccaagaca cagctgagca 720gaaagtccag ctgctcctgt gctggtacca atctcatggg aagagtgatg catatcaaga 780tttaatcaag ggtctcaaaa aagccgaatg tcgcagaacc ttagataaat ttcaggacat 840ggtccagaag gaccttggaa aatcaacccc agacactgga aatgaaaatg aaggacaatg 900tctggag907<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)為RNA2-1的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”
<400>2gugcaagugc aaaccagact t 21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)為RNA2-2的嵌合寡核苷酸。“核苷酸1到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>3gucugguuug cacuugcact t 21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)為RNA3-1的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>4agccgaaugu cgcagaacct t 21<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)為RNA3-2的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>5gguucugcga cauucggcut t 21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>設(shè)計(jì)為RNA4-1的嵌合寡核苷酸。“核苷酸1到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>6aagccgaaug ucgcagaact t 21<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)為RNA4-2的嵌合寡核苷酸。“核苷酸1到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>7guucugcgac auucggcuut t 21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)為RNA5-1的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>8ggauuauauc aaggaggcct t 21<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)為RNA5-2的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>9ggccuccuug auauaaucct t 21
<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)為RNA6-1的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>10aucgccuaug guuguugact t21<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)為RNA6-2的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>11gucaacaacc auaggcgaut t21<210>12<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)的用于擴(kuò)增部分小鼠Fas基因的PCR引物<400>12cacagttaag agttcatac 19<210>13<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)的用于擴(kuò)增部分小鼠Fas基因的PCR引物<400>13
tggttgctgt gcatggctc 19<210>14<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)的用于擴(kuò)增部分rsGFP基因的PCR引物rsGFP-1<400>14cagtcacgac tctagaaaag gagaagaact cttcac36<210>15<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)的用于擴(kuò)增部分rsGFP基因的PCR引物rsGFP-2<400>15cagtcacgac gctagcagtt gtacagttca tccatgcc 38<210>16<211>741<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>rsGFP基因<400>16cagtcacgac tctagaaaag gagaagaact cttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga 60attagatggt gatgttaacg gccacaagtt ctctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc 120aacatacgga aaacttaccc tgaagttcat ctgcactact ggcaaactgc ctgttccatg 180gccaacacta gtcactactc tgtgctatgg tgttcaatgc ttttcaagat acccggatca 240tatgaaacgg catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaaaggac 300catcttcttc aaagatgacg gcaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga 360tacccttgtt aatagaatcg agttaaaagg tattgacttc aaggaagatg gcaacattct 420gggacacaaa ttggaataca actataactc acacaatgta tacatcatgg cagacaaaca 480aaagaatgga atcaaagtga acttcaagac ccgccacaac attgaagatg gaagcgttca 540actagcagac cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga 600caaccattac ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca 660
catggtcctt cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactgta 720caactgctag cgtcgtgact g741<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)為RNA7-1的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>17aagagagacc acauggucct t21<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)為RNA7-2的嵌合寡核苷酸。“核苷酸1到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>18ggaccaugug gucucucuut t21<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)為RNA8-1的嵌合寡核苷酸。“核苷酸1到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>19gcguucaacu agcagaccat t21<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>設(shè)計(jì)為RNA8-2的嵌合寡核苷酸。“核苷酸1到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>20uggucugcua guugaacgct t21<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)為RNA9-1的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>21agagagacca caugguccut t21<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)為RNA9-2的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>22aggaccaugu ggucucucut t21<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)為RNA10-1的嵌合寡核苷酸?！昂塑账?到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>23guucucuguc aguggagagt t21<210>24
<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)為RNA10-2的嵌合寡核苷酸。“核苷酸1到19是核糖核苷酸-其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>24cucuccacug acagagaact t21<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)的用于擴(kuò)增部分rsGFP基因的PCR引物GFP-B-F<400>25gccacaacat tgaagatgga 20<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)的用于擴(kuò)增部分rsGFP基因的PCR引物GFP-B-R<400>26gaaagggcag attgtgtgga 20<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)的用于擴(kuò)增部分新霉素抗性基因的PCR引物Neo-F<400>27atagcgttgg ctacccgtga 20
<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計(jì)的用于擴(kuò)增部分新霉素抗性基因的PCR引物Neo-R<400>28gaaggcgata gaaggcgatg 20
權(quán)利要求
1.一種具有啟動(dòng)子序列，至少一個(gè)以可翻譯狀態(tài)與啟動(dòng)子序列相連的、編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，以及聚腺苷酸信號(hào)序列的核酸構(gòu)建體，其中核酸構(gòu)建體在啟動(dòng)子序列和聚腺苷酸信號(hào)序列之間進(jìn)一步含有與編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列不同的、不可翻譯的核苷酸序列，將以可翻譯狀態(tài)連于啟動(dòng)子序列的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列和與編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列不同的、不可翻譯的核苷酸序列連接在一起，結(jié)果它們從核酸構(gòu)建體中轉(zhuǎn)錄出單一RNA分子，所述不可翻譯的核苷酸序列選自(1)編碼蛋白質(zhì)或部分蛋白質(zhì)的核苷酸序列；和(2)天然位于編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的5′或3′端非翻譯區(qū)的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中不可翻譯的核苷酸序列位于以可翻譯狀態(tài)與啟動(dòng)子序列相連的、編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的下游。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中不可翻譯的核苷酸序列位于以可翻譯狀態(tài)與啟動(dòng)子序列相連的、編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的上游。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，以可翻譯狀態(tài)與啟動(dòng)子序列相連的、編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列編碼報(bào)告蛋白質(zhì)。
5.含有權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體的載體。
6.含有至少一種可翻譯狀態(tài)的、編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，以及不同于編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的、不可翻譯的核苷酸序列的RNA，其中不可翻譯的核苷酸序列選自(1)與可翻譯狀態(tài)的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列不同的、編碼蛋白質(zhì)或部分蛋白質(zhì)的核苷酸序列；和(2)天然位于與可翻譯狀態(tài)的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列不同的、編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的5′或3′端非翻譯區(qū)的核苷酸序列。
7.檢測(cè)功能核苷酸分子改變靶基因表達(dá)的活性的方法，該方法包括下列步驟(1)從權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求5的載體中轉(zhuǎn)錄RNA，該RNA具有，作為不可翻譯的核苷酸序列的選自靶基因中編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列、該核苷酸的一部分、以及位于靶基因中編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的5′或3′端非編碼區(qū)的核苷酸序列；(2)使核苷酸分子與步驟(1)中轉(zhuǎn)錄的RNA接觸；(3)檢測(cè)步驟(2)中的RNA或從RNA翻譯的翻譯產(chǎn)物；和(4)基于步驟(3)中所檢測(cè)到的RNA或從RNA翻譯的翻譯產(chǎn)物的量，檢測(cè)功能核苷酸分子改變靶基因表達(dá)的活性。
8.檢測(cè)功能核苷酸分子改變靶基因表達(dá)的活性的方法，該方法包括下列步驟(1)使核苷酸分子與權(quán)利要求6的RNA接觸，該RNA具有，作為不可翻譯的核苷酸序列的選自靶基因中編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列、該核苷酸序列的一部分、以及位于靶基因中編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的5′或3′端非翻譯區(qū)的核苷酸序列；(2)檢測(cè)步驟(1)中的RNA或從RNA翻譯的翻譯產(chǎn)物；和(3)基于步驟(2)中所檢測(cè)到的RNA或從RNA翻譯的翻譯產(chǎn)物的量，檢測(cè)功能核苷酸分子改變靶基因表達(dá)的活性。
9.篩選改變靶基因表達(dá)的功能核苷酸分子的方法，該方法包括根據(jù)權(quán)利要求7或8的方法檢測(cè)功能核苷酸分子改變靶基因表達(dá)的活性。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8檢測(cè)功能核苷酸分子改變靶基因表達(dá)的活性的方法，其中使核苷酸分子與細(xì)胞內(nèi)或無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的RNA接觸。
11.篩選其表達(dá)被功能核苷酸分子改變的基因的方法，該方法包括下列步驟(1)從權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求8的載體中轉(zhuǎn)錄RNA，該RNA具有，作為不可翻譯的核苷酸序列的選自任意基因中編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列、該核苷酸序列的一部分、以及位于編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的5′或3′端非翻譯區(qū)的核苷酸序列；(2)使核苷酸分子與步驟(1)中轉(zhuǎn)錄的RNA接觸；(3)檢測(cè)步驟(2)中的RNA或從RNA翻譯的翻譯產(chǎn)物； 和(4)基于步驟(3)中所檢測(cè)到的RNA或從RNA翻譯的翻譯產(chǎn)物的量，鑒定其表達(dá)被核苷酸分子改變的基因。
12.篩選其表達(dá)被核苷酸分子改變的基因的方法，該方法包括下列步驟(1)使核苷酸分子與權(quán)利要求6的RNA接觸，該RNA具有，作為不可翻譯的核苷酸序列的選自任意基因中編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列、該核苷酸序列的一部分、以及位于編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的5′或3′端非翻譯區(qū)的核苷酸序列；(2)檢測(cè)步驟(1)中的RNA或從RNA翻譯的翻譯產(chǎn)物；和(3)基于步驟(2)中所檢測(cè)到的RNA或從RNA翻譯的翻譯產(chǎn)物的量，鑒定改變靶基因表達(dá)的功能核苷酸分子。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12篩選其表達(dá)被核苷酸分子改變的基因的方法，其中使核苷酸分子與細(xì)胞內(nèi)或無(wú)細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的RNA接觸。
全文摘要
一種篩選能有效抑制基因表達(dá)的核酸的通用方法，在該方法中使用的核酸構(gòu)建體、載體；以及上述方法的試劑盒。該方法的特征是構(gòu)建一種核酸構(gòu)建體，其是具有啟動(dòng)子序列、至少兩個(gè)基因序列和聚腺苷酸信號(hào)序列的核酸構(gòu)建體，其中上述至少兩個(gè)基因序列轉(zhuǎn)錄成單一RNA分子，并且至少一個(gè)基因序列是可翻譯狀態(tài)，且至少一個(gè)基因序列為基本上不可翻譯的編碼狀態(tài)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1875103SQ200480032070
公開(kāi)日2006年12月6日 申請(qǐng)日期2004年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月29日
發(fā)明者上野高嗣, 田邊雅茂, 住岡理早, 小林英二, 小山信人, 佐川裕章, 峰野純一, 加藤郁之進(jìn) 申請(qǐng)人:寶生物工程株式會(huì)社