專利名稱：通過空間構(gòu)象調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的制作方法
本申請要求了提交于2003年8月28日的美國專利申請No.60/498,449、提交于2003年8月28日的美國專利申請No.60/498,785和提交于2003年8月28日的美國專利申請No.60/498,923的優(yōu)先權(quán)。本申請同時要求了提交于2004年3月5日的印度專利申請No.279/MUM/2004和提交于2004年3月5日的印度專利申請No.280/MUM/2004的優(yōu)先權(quán)。以上申請的內(nèi)容全部被加入到本申請中作為參考。
在本申請中引用了各種參考文獻。將這些出版物全部加入本申請作為參考，其與本發(fā)明相結(jié)合有助于全面地描述與本發(fā)明有關(guān)的技術(shù)狀況。
背景技術(shù)：
目前人們已完成的人類基因組計劃已證實很多基因?qū)膊【哂兄委熥饔茫⑶乙巡捎没蛑亟M技術(shù)開發(fā)出一些具有治療作用的蛋白質(zhì)類藥物，但大部分具有治療作用的基因在采用基因重組技術(shù)翻譯成蛋白質(zhì)后往往不再具有該基因在體內(nèi)表現(xiàn)出的作用，或只具有部分作用。大量有治療作用的基因不能順利地利用基因重組技術(shù)獲得相應(yīng)的有治療作用的蛋白質(zhì)，這其中最大的障礙在于蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的影響，怎樣獲得有效的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象已成為一個充滿競爭的研究領(lǐng)域。
在一級結(jié)構(gòu)不變的情況下改變蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象可使蛋白質(zhì)的功能發(fā)生轉(zhuǎn)變，例如蛋白質(zhì)異常的三維空間結(jié)構(gòu)可以引發(fā)疾病，如瘋牛病(bovine spongiform encephalopathy)、老年性癡呆癥(Alzheimer’sDisease)、囊性纖維病變(cystic fibrosis)、家族性高膽固醇癥(familial hypercholestrolacemia)、家族性淀粉樣蛋白質(zhì)癥(familialamyloid disease)、某些腫瘤(carcinoma)或白內(nèi)障(cataract)。這些疾病也被叫做“折疊病”。造成瘋牛病的“朊(Prion)”蛋白質(zhì)可以感染正常蛋白質(zhì)并在蛋白質(zhì)之間傳染。
在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究中，大多數(shù)研究者認為，獲得有效的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象最主要在于重組蛋白質(zhì)變性和重折疊技術(shù)。有大量文獻報道各種分子伴侶、反向膠團(reverse micelles)等對重折疊有促進作用。雖然有種類繁多的使蛋白質(zhì)在較天然的環(huán)境下表達的分泌型表達載體已經(jīng)被研制出來，但它們都僅能對原有蛋白質(zhì)的療效產(chǎn)生量的提高而無質(zhì)的變化。


圖1.Infergen(干復(fù)津)的圓二色譜圖波長范圍250nm-190nm靈敏度2m°/cm光程0.20cm儀器圓二色譜儀J-500C樣品含30μg/ml的IFN-con1，5.9mg/ml的NaCl和3.8mg/ml的Na2PO4，pH7.0。
圖2.重組高效復(fù)合干擾素(rSIFN-co)的圓二色譜圖波長范圍250nm-190nm靈敏度2m°/cm光程0.20cm儀器圓二色譜儀J-500C樣品含30μg/ml的rSIFN-co，5.9mg/ml的NaCl和3.8mg/ml的Na2PO4，pH7.0。
圖3.不同干擾素對乙肝病毒基因表達抑制作用的比較圖4A-1.A組受試者體溫變化曲線(5位患者)此圖是A組5名受試者體溫變化的記錄圖4A-2.A組受試者體溫變化曲線(6位患者)
此圖是A組其余6名受試者體溫變化的記錄圖4B-1.B組受試者體溫變化曲線(5位患者)此圖是B組5名受試者體溫變化的記錄圖4B-2.B組受試者體溫變化曲線(5位患者)此圖是B組其余5名受試者體溫變化的記錄圖5.rsIFN-co晶體I圖6.rsIFN-co晶體II圖7.rsIFN-co晶體的X-射線衍射圖譜發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一組調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的方法。首先，根據(jù)宿主密碼子的使用，選擇用于編碼目標蛋白質(zhì)的氨基酸密碼子。第二，從中選擇可能調(diào)節(jié)空間構(gòu)象改變的組合，并將其構(gòu)建入可轉(zhuǎn)染多種宿主的不同載體。這樣，可以選擇出一個適當(dāng)宿主的適當(dāng)載體。第三，在組合目標蛋白質(zhì)和啟動子的編碼序列后，通過監(jiān)測堿基對的組合來對載體的啟動子進行選擇。最后，選擇合適的表達宿主來表達目標蛋白質(zhì)，重折疊并純化，測定其活性和空間構(gòu)象。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在構(gòu)建蛋白質(zhì)的過程中，目標蛋白質(zhì)的氨基酸編碼密碼子的變化、所選載體的不同、啟動子的改變及宿主表達載體的選擇，甚至變性復(fù)性的條件及試劑等都是調(diào)節(jié)目標蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的可調(diào)因素。所以，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)空間構(gòu)象并獲取新的功能和提高活性是系統(tǒng)分析的結(jié)果。
本發(fā)明提供了一種不改變蛋白質(zhì)一級氨基酸序列而調(diào)節(jié)該蛋白質(zhì)功能的方法，其步驟包括a)改變所述蛋白質(zhì)的密碼子使用；b)通過改變的密碼子表達所述的蛋白以得到純化的蛋白質(zhì)；和c)對改變編碼密碼子表達的蛋白質(zhì)與原密碼子表達的蛋白質(zhì)進行比較，其中所獲得的蛋白質(zhì)的功能增強或表現(xiàn)出新功能即表明所述蛋白質(zhì)的功能已經(jīng)得到了調(diào)節(jié)。
在一個實施方案中，改變的密碼子的使用使得蛋白質(zhì)的表達量提高。
本發(fā)明還提供了一種用來制備具有增強的或者新的功能的蛋白質(zhì)而不改變所述蛋白質(zhì)一級氨基酸序列的方法，其包括以下步驟a.改變所述蛋白質(zhì)的密碼子的使用；b.使用改變的密碼子來表達所述蛋白質(zhì)以獲得純化的蛋白質(zhì)；和c.將用改變的密碼子所表達的蛋白質(zhì)與沒有使用改變的密碼子所表達的蛋白質(zhì)進行比較，其中功能出現(xiàn)增強或鑒定出新的功能表明已經(jīng)制備出了具有增強的或新的功能的蛋白質(zhì)。
在一個實施方案中，改變的密碼子的使用可使蛋白質(zhì)的表達量提高。本發(fā)明還提供了由以上所述方法制備的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，所述的蛋白質(zhì)具有獨特的二級或三級結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明還提供了一種帶有改變的密碼子的合成基因，當(dāng)其表達時，可產(chǎn)生增強的或新的功能。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含以上所述基因的載體。在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供了包含以上所述基因的表達系統(tǒng)。在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供了含有以上所述基因的宿主細胞。
本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)具有增強的或者新的功能的蛋白質(zhì)的方法，其包括將含有優(yōu)選密碼子的人工基因引入適當(dāng)?shù)乃拗骷毎?，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)所述的宿主細胞以使所述的蛋白質(zhì)表達，和收獲所表達的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明提供的上述方法中，所述的人工基因序列被有效地與載體連接。在一個實施方案中，該方法還包括從發(fā)酵液中提取所述蛋白質(zhì)，或收集包函體，并對收獲的蛋白質(zhì)進行變性及復(fù)性。
本發(fā)明還提供了通過以上任何方法所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明提供了一種含有任何以上所述蛋白質(zhì)及適當(dāng)載體的組合物。本發(fā)明還提供了一種含有任何以上所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)及適當(dāng)藥用載體的藥用組合物。
本發(fā)明的意義在于將具有治療作用的基因翻譯成蛋白質(zhì)的過程中，對蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象進行調(diào)控，從而使該蛋白質(zhì)具有來源自該基因的功能，或具有傳統(tǒng)技術(shù)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)所不具有的功能，或者甚至具有與那些存在的蛋白質(zhì)相比較而言增強的活性。
以干擾素為例，將人IFN-α構(gòu)建入逆轉(zhuǎn)錄表達載體得到PDOR-IFN-α表達載體，轉(zhuǎn)染2.2.15細胞，測定細胞培養(yǎng)上清液中的HBsAg，HBeAg。結(jié)果顯示，rSIFN-co對HBsAg，HBeAg的抑制率分別達到62％和67.7％。但如通過基因重組技術(shù)獲得的重組干擾素蛋白質(zhì)在體外就不具有抑制HBsAg，HBeAg分泌的作用。另外，用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建了人IFN-α2的表達載體并轉(zhuǎn)染至HIV細胞株-A3.01細胞內(nèi)表達，證實IFN-α2能完全抑制HIV-DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。但直接用干擾素對HIV感染進行治療，效果有限。
以下實施例可以有助于更好地理解本發(fā)明。然而，具備專業(yè)技術(shù)的人員應(yīng)當(dāng)知道，討論的具體的方法和結(jié)果只是對本文后所附的權(quán)利要求中所指的發(fā)明的例證。
實施例1對IFN-con1的構(gòu)象改造rSIFN-co是一種根據(jù)人INF-α亞型中的保守性氨基酸，用遺傳工程的方法建構(gòu)而成的一種新干擾素分子。該干擾素分子在美國專利4,695,263和4,897,471中已經(jīng)有所描述，而且rSIFN-co已在一些文獻和專利中被證明具有廣譜的干擾素活性，較強的抗病毒和抗腫瘤及天然殺傷細胞活性。
本發(fā)明根據(jù)大腸桿菌密碼子使用對其DNA編碼序列重新進行了設(shè)計將插入體首先構(gòu)建入PHY-4載體，用PBAD啟動子介導(dǎo)下游表達，而后將大腸桿菌選擇為宿主為。產(chǎn)物通過6mol/L鹽酸胍變性→4mol/L精氨酸復(fù)性→POROS HS/M-陽離子交換層析→Cu2+螯合親和層析純化，得到高純度的目標蛋白質(zhì)。
通過與IFN-con1進行抑制乙肝病毒DNA，及抑制HBsAg與HBeAg分泌的比較試驗，結(jié)果表明rSIFN-co具有IFN-con1所不具備的對HBsAg、HBeAg分泌的抑制作用。在另一試驗中，將HBV核心/前基因組(C/P)啟動子與相關(guān)的順式作用元件放置于熒光素酶編碼質(zhì)粒的上游。將該報告構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入HepG2細胞。然后，用不同干擾素處理該細胞，并測量熒光素酶報道基因的表達量。結(jié)果顯示rSIFN-co對熒光素酶報道基因的表達抑制率是68％；而作為對照的IFN-con1及IFN-α2b僅有35％和27％。因此，rSIFN-co對HBVAg的抑制作用明顯提高。
同時，圓二色譜圖也證明rSIFN-co與IFN-con1的二級結(jié)構(gòu)不同。
以下是具體比較實驗1)圓二色譜圖比較實驗地點四川大學(xué)分析測試中心儀器圓二色譜儀J-500C(波長范圍250-190nm，靈敏度2m°/cm，光程0.20cm，見附圖1、2)2)rSIFN-co抑制HBV-DNA的復(fù)制及HBsAg和HbeAg的分泌材料溶劑及配制方法每支瓶內(nèi)加入1ml生理鹽水，溶解后，再根據(jù)所設(shè)不同濃度用MEM培養(yǎng)液調(diào)配?，F(xiàn)用現(xiàn)配。
對照藥品IFN-α2b(Intron A)為凍干粉劑，購自先靈葆雅公司。每支3×106U，用培養(yǎng)液配成3×106IU/ml溶液。干復(fù)津(液體溶液)，購自安進公司，每支9μg，0.3ml，相當(dāng)于9×106IU，用培養(yǎng)液配成9×106IU/ml溶液，4℃保存；2.2.15細胞HBV DNA轉(zhuǎn)染并克隆的人肝癌細胞(Hep G2)2.2.15細胞株，美國MountSinai醫(yī)學(xué)中心構(gòu)建。
試劑MEM干粉，美國Gibco公司產(chǎn)品。胎牛血清，美國HycloneLab公司產(chǎn)品。G-418(Geneticin)；MEM調(diào)劑，美國Gibco公司產(chǎn)品；L-谷氨酰胺，京科化學(xué)試劑公司進口分裝；HBsAg，HBeAg固相放射免疫測定盒，購自中國同位素公司北方免疫試劑研究所；卡那霉素，華北制藥廠產(chǎn)品；Lipofectin，美國Gibco公司產(chǎn)品。
實驗用品及儀器培養(yǎng)瓶，丹麥TunclonTM；24孔和96孔培養(yǎng)板，美國Corning公司產(chǎn)品二氧化碳孵箱，美國Shel-Lab產(chǎn)品；MEM培養(yǎng)液100ml含胎牛血清10％，谷氨酰胺0.03％，G418 380μg/ml，卡那毒素50U/ml。
試驗方法2.2.15細胞培養(yǎng)在長滿2.2.15細胞的培養(yǎng)瓶內(nèi)加0.25％胰酶，37℃消化3分鐘，加培養(yǎng)液終止消化并使細胞分散。以1∶3傳代，10天長滿。
毒性試驗實驗分無藥物細胞對照組和不同藥物濃度給藥組。細胞消化，配制成每毫升10萬個細胞的溶液，接種96孔培養(yǎng)板，每孔200μl，37℃5％CO2培養(yǎng)24小時，細胞長成單層后進行實驗。
將rSIFN-co配制成1.8×107IU/ml的溶液，而后2倍梯度稀釋以制備一系列溶液。將其加入96孔細胞培養(yǎng)板，每濃度3孔，每4天換液.8天后顯微鏡下觀察細胞病變.完全破壞為4；75％為3；50％為2；25％為1；無病變?yōu)?。計算不同濃度藥液平均細胞病變程度和抑制率。按ReedMuench法計算半數(shù)有毒濃度(TC50)和最大無毒濃度(TC0)。
TC50=Antilog(B+50-BA-B×C)]]>A＝log＞50％藥物濃度 B＝log＜50％藥物濃度 C＝log稀釋倍數(shù)(dilution power)對HBeAg、HBsAg抑制試驗試驗設(shè)HBeAg、HBsAg陽性對照組，陰性對照組，細胞對照組及不同藥物濃度給藥組。每毫升70萬個2.2.15細胞接種6孔細胞培養(yǎng)板，每孔3ml，37℃5％CO2培養(yǎng)24小時，3倍稀釋試驗藥液以制備5個梯度稀釋溶液(制備5個溶液，每個有不同的蛋白質(zhì)濃度.溶液2比溶液1濃度低3倍，溶液3比溶液2濃度低3倍，等等)，分別為4.5×106IU/ml、1.5×106IU/ml、0.5×106IU/ml、0.17×106IU/ml、和0.056×106IU/ml，每濃度1孔，37℃5％CO2培養(yǎng)24小時，每4天用相同溶液換液。第8天時收獲所有培養(yǎng)液，-20□保存。試驗重復(fù)三批，分別用固相放射免疫測定盒(中國同位素公司北方免疫試劑研究所產(chǎn)品)測定HBsAg和HBeAg。用γ-計數(shù)儀測定每孔cpm值。
藥物效果計算計算細胞對照組及每個濃度組的cpm均值及其標準差，P/N值如抑制百分率，半數(shù)有效濃度(IC50)及選擇指數(shù)(SI)。
A＝細胞對照組cpm； B＝給藥組cpm；2)計算藥物抑制抗原半數(shù)有效濃度(IC50) A＝log＞50％藥物濃度 B＝log＜50□藥物濃度 C＝log稀釋倍數(shù)3)改變了空間構(gòu)象的rSIFN-Co在2.2.15細胞培養(yǎng)內(nèi)對HBsAg和HBeAg的選擇指數(shù)(SI)SI=TC50IC50]]>4)以t檢驗法(student t test)計算各稀釋度和對照組間cpm的差別DNA印跡(1)2.2.15細胞內(nèi)HBV-DNA提取細胞培養(yǎng)8天，吸除培養(yǎng)液(通過移除培養(yǎng)液將細胞從培養(yǎng)液中分離出)。加入細胞裂解液以裂解細胞，而后用苯酚、氯仿、異戊醇混合物(1∶1∶1)抽提2次，高速10,000g離心。取上清，加無水乙醇沉淀核酸，真空抽干，重溶于20μl TE緩沖液中。(2)電泳加入6X DNA上樣緩沖液，將樣品加于1.5％瓊脂糖膠上電泳，IV/cm，恒壓，14-18小時。(3)變性和雜交將膠分別浸于HCl、變性液、中和液中。(4)轉(zhuǎn)膜按程序?qū)NA轉(zhuǎn)至Hybond-N膜上。同斑點雜交一同進行烤膜、雜交、曝光。掃描光片，以gel-pro凝膠分析軟件分析相對密度，計算抑制率及IC50。
結(jié)果表1、表2、表3中的結(jié)果表明樣品以最大無毒濃度指數(shù)加入2.2.15細胞培養(yǎng)8天，最大無毒濃度rSIFN-Co 9.0±0×106IU/ml對HBeAg的平均抑制率為46.0±5.25％(P＜0□001)，IC50為4.54±1.32×106IU/ml，選擇指數(shù)SI為3.96；對HBsAg的平均抑制率為44.8±6.6％，IC506.49±0.42×106IU/ml，選擇指數(shù)SI為2.77。因此，重組rSIFN-Co能明顯的抑制HBeAg和HBsAg的活性，而對照組干擾素和干復(fù)津則不具該功能。在臨床上也證實了rSIFN-Co能使HBeAg和HBsAg降低或恢復(fù)到正常水平。
表1測定rSIFN-co對乙型肝炎表面抗原和e抗原抑制率的實驗結(jié)果第一批實驗(rSIFN-co)

第二批實驗(rSIFN-co)

第三批實驗(rSIFN-co)

e抗原IC50均值 450.2434 標準差 132315479表面抗原IC50均值 649.1894 標準差 42.29580
表2Intron A(IFN-α2b)對乙型肝炎表面抗原和e抗原抑制率的實驗結(jié)果

表3干復(fù)津?qū)σ倚透窝妆砻婵乖蚭抗原抑制率的實驗結(jié)果第一批實驗(干復(fù)津)

第二批實驗(干復(fù)津)

第三批實驗(干復(fù)津)

e抗原IC50均值0 標準差0表面抗原IC50均值 0 標準差0
實施例2不同干擾素對乙肝病毒基因表達的抑制作用的比較乙型肝炎病毒(HBV)DNA包含反式激活蛋白的共有元件，這種蛋白質(zhì)的結(jié)合活性是受干擾素調(diào)控的。用干擾素處理HBV轉(zhuǎn)染的肝細胞導(dǎo)致HBV基因表達的抑制。本研究的目的是研究不同的干擾素對HBV轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。用含HBV增強子(EnH)I、EnH II和核心啟動子控制下的螢火蟲熒光素酶基因的報道質(zhì)粒(reporter plasmid)來瞬時轉(zhuǎn)染人類肝癌細胞，申請人研究了三種不同干擾素對轉(zhuǎn)錄的生物活性影響。
材料和方法1.干擾素IFN-con1(干復(fù)津)、IFN-Hui-Yang(γSIFN-co)及IFN-β1b。
2.報道質(zhì)粒用PCR制備包含HBV-增強子(EnH)I、EnH II和核心啟動子的DNA片段，將其末端切平克隆入無增強子且無啟動子的螢火蟲熒光素酶基因報告質(zhì)粒pGL3-Basic(Promega，WI，USA)的Smal I位點。所得到的報告質(zhì)粒命名為pGL3-HBV-Luc。
3.細胞培養(yǎng)和DNA轉(zhuǎn)染將HepG2細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基補加10％FBS，100U/ml的青霉素和100μg/ml鏈霉素。將細胞放置于溫度30℃，含5％的CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。使用Boehringer的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒用pGL3-HBV-Luc報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞。經(jīng)過18小時，移走含有轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基，注入含有或不含有干擾素的新鮮培養(yǎng)基，將細胞繼續(xù)培養(yǎng)48小時。
4.熒光素酶測定注入干擾素48小時后，收集并裂解細胞。該細胞溶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)濃度由Bio-Rad蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測。熒光素酶活性測定使用Promega的熒光素酶報告檢測系統(tǒng)，按照制造商提供的指南進行。
實驗結(jié)果不同干擾素處理的細胞溶解物中熒光素酶活性的表達

以上結(jié)果顯示γSIFN-co對HBV基因表達的抑制最有效。
實施例3使用γSIFN-co的副作用及體溫變化現(xiàn)有干擾素類藥的副反應(yīng)較多。副反應(yīng)包括惡心、肌肉酸痛、食欲不振、脫發(fā)、白細胞減少(hypoleukmia；hypoleukocytosis；hypoleukia)及血小板減少等。
方法所有受試者分為兩組。A組11名受試者注射9μg干復(fù)津，B組10名受試者注射9μg γSIFN-co。注射后，兩組受試者臨床觀察48小時。注射1小時后進行第一次觀察記錄，此后每隔2小時觀察記錄一次。表4列出的是9μg γSIFN-co與9μg干復(fù)津注射后患者的副反應(yīng)對比。
表4 副反應(yīng)


結(jié)論注射γSIFN-co受試者的副反應(yīng)比較小。其副反應(yīng)為一般流感樣癥狀，如頭痛，乏力，畏寒，肌肉疼痛，出汗，關(guān)節(jié)痛(關(guān)節(jié)疼痛，關(guān)節(jié)疼)。注射干復(fù)津受試者的副反應(yīng)明顯比注射γSIFN-co受試者的副反應(yīng)大。
由附圖4A-1、4A-2、4B-1和4B-2，可以觀察到A組受試者的體溫明顯高于B組受試者。這些結(jié)果還反映出γSIFN-co比干復(fù)津具有更好的耐受性。
實施例4γSIFN-co晶體生長及晶體學(xué)參數(shù)測定γSIFN-co的晶體研究。經(jīng)過系統(tǒng)的摸索與實驗，目前已獲得兩種晶體。(見附圖5-7)1、晶體生長用純水(H2O)溶解γSIFN-co蛋白質(zhì)至濃度3mg/ml。結(jié)晶條件搜索使用Hampton公司的Hampton Research Crystal Screen I and II。采用氣象懸滴擴散法(Drop Suspension Diffusion Method)，池液500μl，液滴1μl蛋白質(zhì)+1μl池液，溫度為293K。最初搜索得到兩種不同類型的小晶體，見表5。
表5γSIFN-co晶體蛋白篩選

2、數(shù)據(jù)采集及處理晶體I已用于X-射線衍射數(shù)據(jù)收集和初步晶體學(xué)分析，并完成晶體學(xué)參數(shù)測定。衍射數(shù)據(jù)收集在常溫進行.將晶體I(條件I)封入薄壁石英管中。使用BrukerAXS Smart CCD探測器，光源采用Nonius FR591旋轉(zhuǎn)陽極靶X光發(fā)生器產(chǎn)生的CuKα射線(λ＝1.5418)。光源功率2000kw(40kv×50mA)，波長1.00，曝光時間60秒，Δφ＝2°，晶體到探測器之間的距離為50mm。數(shù)據(jù)處理使用Bruker公司的Proteum程序包。晶體的衍射圖譜(局部)見附圖7。處理結(jié)果見表6。
表6 晶體學(xué)參數(shù)測定結(jié)果參數(shù)a() 82.67b() 108.04c() 135.01α(°)90.00β(°)90.00γ(°)98.35空間群P2或P21分辨率5不對稱分子# 10溶出(dissolution) 57.6％另外，按照已發(fā)表文獻，γSIFN-co未有晶體長出。與γSIFN-co最為相近的結(jié)果是huIFN-α2b，但是其篩選條件非常復(fù)雜。經(jīng)過三次接種晶體長到0.5×0.5×0.3mm，其分辨率為2.9，空間群為P21，晶胞也很大，不對稱分子有數(shù)為6，溶出為約60％。
權(quán)利要求
1.一種用于調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能而不改變所述蛋白質(zhì)一級氨基酸序列的方法，其包括以下步驟1)改變所述蛋白質(zhì)的密碼子的使用；2)使用改變的密碼子來表達所述蛋白質(zhì)以獲得純化的蛋白質(zhì)；和3)將用改變的密碼子所表達的蛋白質(zhì)與沒有使用改變的密碼子所表達的蛋白質(zhì)進行比較，其中功能出現(xiàn)增強或鑒定出新的功能表明蛋白質(zhì)的功能已經(jīng)得到了調(diào)節(jié)。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于改變的密碼子的使用引起所述蛋白質(zhì)的高表達。
3.一種用來制備具有增強的或者新的功能的蛋白質(zhì)而不改變所述蛋白質(zhì)一級氨基酸序列的方法，其包括以下步驟1)改變所述蛋白質(zhì)的密碼子的使用；2)使用改變的密碼子來表達所述蛋白質(zhì)以獲得純化的蛋白質(zhì)；和3)將用改變的密碼子所表達的蛋白質(zhì)與沒有使用改變的密碼子所表達的蛋白質(zhì)進行比較，其中功能出現(xiàn)增強或鑒定出新的功能表明已經(jīng)制備出了具有增強的或新的功能的蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于改變的密碼子的使用引起所述蛋白質(zhì)的高表達。
5.由權(quán)利要求3或4所述的方法制備的蛋白質(zhì)。
6.權(quán)利要求5所述的蛋白質(zhì)，其具有獨特的二級或三級結(jié)構(gòu)。
7.一種帶有改變的密碼子的合成基因，其特征是當(dāng)其表達時，
8.一種含有權(quán)利要求7中所述基因的載體。
9.一種含有權(quán)利要求7中所述基因的表達系統(tǒng)。
10.一種含有權(quán)利要求7中所述基因的宿主細胞。
11.一種生產(chǎn)具有增強的或者新的功能的蛋白質(zhì)的方法，其包括將含有優(yōu)選密碼子的人工基因引入適當(dāng)?shù)乃拗骷毎谶m當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)所述的宿主細胞以使所述的蛋白質(zhì)表達，和收獲所表達的蛋白質(zhì)。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的人工基因被有效連接到載體。
13.權(quán)利要求11所述的方法，其包括從發(fā)酵液中提取所述蛋白質(zhì)，或收集包函體，和變性及復(fù)性收獲的蛋白質(zhì)。
14.由權(quán)利要求11-13所述的任一方法生產(chǎn)的所述蛋白質(zhì)。
15.一種含有權(quán)利要求5、6或14所述的蛋白質(zhì)以及適當(dāng)載體的組合物。
16.一種含有權(quán)利要求5、6或14所述的蛋白質(zhì)以及適當(dāng)藥用載體的藥用組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一組調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的方法。首先，根據(jù)宿主密碼子的使用，選擇用于編碼目標蛋白質(zhì)的氨基酸密碼子。第二，從中選擇可能調(diào)節(jié)空間構(gòu)象的組合，并將其構(gòu)建入可轉(zhuǎn)染多種宿主的不同載體。第三，在組合目標蛋白質(zhì)和啟動子的編碼序列后，通過監(jiān)測堿基對的組合來對載體的啟動子進行選擇。最后，選擇合適的表達宿主來表達目標蛋白質(zhì)，重折疊并純化，測定其活性和空間構(gòu)象。
文檔編號C12N15/11GK1910195SQ200480031909
公開日2007年2月7日 申請日期2004年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月28日
發(fā)明者魏光文 申請人:輝陽科技美國公司