專利名稱：來自內(nèi)皮抑素n－末端的抗血管生成肽的制作方法
權(quán)利聲明本發(fā)明是在政府支持下由國立衛(wèi)生研究所授予的R0 1CA064481撥款而進行的。政府在本發(fā)明中有相當?shù)臋?quán)利。
背景技術(shù)：
內(nèi)皮抑素(endostatin)，相應(yīng)于膠原蛋白18C末端的183氨基酸的蛋白水解裂解片段，因其不具毒副作用的抗腫瘤活性，已經(jīng)成為許多實驗室研究的主題。(O′Reilly et al.(1997)Cell，88277-285.；Kisker et al.(2001)Cancer Res，617669-7674；Dhanabal et al.(1999)Cancer Res，59189-197；Yoon et al.(1999)Cancer Res，596251-6256；Folkman and Kalluri，(2003)Cancer Medicine，6th edition，pp.161-194.HamiltonB.C.DeckerInc.)。關(guān)于這個蛋白質(zhì)已經(jīng)被報告了許多抗血管生成活性，例如對內(nèi)皮細胞增殖、遷移、以及形成血管的抑制作用。內(nèi)皮抑素還抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)誘導(dǎo)的血管通透性(Takahashi et al.(2003)Faseb J，17896-898)。然而，內(nèi)皮抑素的作用機理仍然是未知的。內(nèi)皮抑素通過結(jié)合α5β1整聯(lián)蛋白來抑制病灶粘連激酶的磷酸化作用從而抑制內(nèi)皮細胞遷移(Wickstromet al.(2002)Cancer Res，625580-5589)。還已經(jīng)表明細胞表面磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)是低親合力的內(nèi)皮抑素受體(Karumanchi et al.(2001)MolCell，7811-822)。內(nèi)皮抑素已經(jīng)涉及到一些信號傳輸途徑，例如c-myc(Shichiri and Hirata(2001)Faseb J，151044-1053)、細胞周期蛋白(cyciin)-D1(Hanai et al.(2002)J Biol Chem，27716464-16469)以及RhoA活性(Wickstrom et al.(2003)J Biol Chem，27837895-37901)的下調(diào)作用，VEGF信號傳輸?shù)淖钄嘧饔?Hajitou et al.(2002)Faseb J，161802-1804；Kimet al.(2002)J Biol Chem，27727872-27879)，以及wnt信號傳輸途徑的抑制作用(Hanai et al.(2002)J Cell Biol，158529-539)。此外，內(nèi)皮抑素還能夠結(jié)合和滅活金屬蛋白酶(Kim et al.(2000)Cancer Res，605410-5413；Nyberget al.(2003)J Biol Chem，27822404-22411；Lee et al.(2002)FEBS Lett，519147-152)，還能夠調(diào)節(jié)抑制血管生成的一系列基因(Abdollahi et al.(2004)Mol Cell，13649-663)。
鼠以及人的內(nèi)皮抑素晶體結(jié)構(gòu)都已經(jīng)得到了闡明(Hohenester et al.(1998)Embo J，171656-1664；Ding et al.(1998)Proc Natl Acad Sci USA，9510443-10448)，而且在結(jié)晶化所需要的高濃度下還顯現(xiàn)為一種非共價相結(jié)合的二聚物形式(Ding et al.(1998)Proc Natl Acad Sci USA，9510443-10448)。兩二硫鍵的存在導(dǎo)致高度折疊的構(gòu)造。每個內(nèi)皮抑素單體通過分子N末端中的三個組氨酸(組氨酸1，3，和11)以及天冬氨酸76來結(jié)合一個鋅原子。內(nèi)皮抑素的肝素結(jié)合性質(zhì)是由集聚在分子立體球狀表面之上的非鄰接精氨酸介導(dǎo)的(Sasaki et al.(1999)Embo J，186240-6248)。
內(nèi)皮抑素低聚物(NC1以及二聚物)主要與基底膜中的層粘連蛋白結(jié)合(Javaherian et al.(2002)J Biol Chem，27745211-45218)。這種結(jié)合對內(nèi)皮抑素發(fā)揮的一些生物學(xué)功能來說可能是重要的。另一方面，內(nèi)皮抑素的肝素結(jié)合性質(zhì)也在它與細胞表面的相互作用中顯示出來。很可能內(nèi)皮抑素有許多由蛋白質(zhì)不同區(qū)域介導(dǎo)的生物學(xué)功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于內(nèi)皮抑素N末端區(qū)域決定了它的抗血管生成活性這個令人吃驚的發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上的?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明描述了含有SEQ ID No.2或4的至少約12個氨基酸的抗血管生成肽。示例性的抗血管生成肽選自由SEQ ID No.6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124-131組成的組。
還描述了一種藥物組合物，其含有藥學(xué)上可接受的載體以及有效量的含有SEQ ID No.2或4的至少約12個氨基酸的抗血管生成肽。某些藥物由本文所述的抗血管生成蛋白和第二種肽組成。其它的藥物組合物還額外包括有效量的鋅。還描述了一種裝置，例如其中含有在此所述肽的注射器和支架。
更進一步地公開了編碼抗血管生成肽的核酸，其中含有SEQ ID No.2或4的至少約12個氨基酸，以及含有在適當載體中的所公開的核酸的藥物組合物，所述載體用于表達有效量的抗血管生成肽以給予患者。優(yōu)選的核酸含有SEQ ID No.1、3或5的至少約36、54或60個核苷酸。其它優(yōu)選的核酸選自由SEQ ID No.1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121以及123所組成的組。
還提供了使用所述肽治療或預(yù)防疾病或病癥的方法，所述疾病或病征由血管生成作用(血管生成相關(guān)疾病)例如癌或者腫瘤生長引起。
所述抗血管生成肽的其它特征和有益效果將可以根據(jù)對下列詳細說明和權(quán)利要求的理解而變得更為明顯。


圖1為顯示用人內(nèi)皮抑素肽治療人胰腺癌(BxPC3)的圖。
圖2A-C圖示內(nèi)皮抑素的N末端結(jié)構(gòu)域負責(zé)其抗腫瘤特性。圖2A為顯示用鼠Fc-內(nèi)皮抑素和鼠肽P1，P2，P5，以及P6(分別為mP1，mP2，mP5以及mP6)治療LLC的圖表；圖2B為LLC切片的圖像，顯示CD31染色；圖2C為顯示測定血管密度(*p＜0.015比對磷酸緩沖液(對照))的圖；而圖2D為顯示內(nèi)皮抑素晶體結(jié)構(gòu)的示意圖。
圖3A-E為顯示內(nèi)皮抑素的鋅結(jié)合位點對抗腫瘤活性很重要的圖。圖3A為mP1和mP1-H1/3A的示意圖；圖3B為顯示鋅結(jié)合mP1和mP1-H1/3A的圖；圖3C為顯示用mP1和mP1-H1/3A治療LLC的圖；圖3D顯示CD31染色的LLC腫瘤切片圖像；而圖3E為顯示測定血管密度的圖。
圖4為顯示用有或沒有鋅的mP1或者mP1-H每日兩次治療LLC時，在第4，7，10以及14天的老鼠腫瘤體積的圖。
圖5為顯示內(nèi)皮抑素肽對內(nèi)皮細胞遷移的抑制作用的圖。
圖6A和B顯示了內(nèi)皮抑素肽對VEGF誘導(dǎo)的通透性的抑制作用。圖6A圖示用甲酰胺在室溫保溫5天，在620nm測定的自皮膚伊文思蘭(Evan′sblue)染料的定量；而圖6B圖示了Miles試驗的代表性圖片(V是VEGF，P是PBS)。
圖7圖示給予mP1內(nèi)皮抑素，mP1，mP1-15，mP1-20或者PBS的小鼠中的腫瘤體積作為治療開始后天數(shù)的函數(shù)。
發(fā)明詳述定義如下所述，下列術(shù)語和短語應(yīng)具有如下闡明的意思。除非已經(jīng)定義，否則在此使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有如一個本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的通常了解相同的意思。
除非上下文明確地規(guī)定，否則單數(shù)形式“一個，”“一種，”以及“所述”包括復(fù)數(shù)個形式。
術(shù)語“生物可用的”當涉及化合物時是本領(lǐng)域已經(jīng)認定的，它涉及到化合物的某種形式，其允許給藥的化合物或其量的一部分通過摻入而被所給藥的患者或受試者吸收，或者換句話說對所給藥的受試者或者患者是生理學(xué)上可用的。
在此使用的術(shù)語“組合物”意圖包括一種產(chǎn)品，其含有具體量的規(guī)定的成分，同時任何產(chǎn)品都是直接或間接地從規(guī)定量的具體成分的組合而得到的。
“保守置換”意思是在有廣泛相似的分子性質(zhì)的氨基酸之間的變化。例如脂烴基丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸之間的置換都可以被認為是保守的。有時甘氨酸和其中之一進行置換也可以認為是保守的。其他的保守置換還包括脂烴基天冬氨酸和谷氨酸之間；酰胺基天冬酰胺和谷氨酰胺之間；羥基絲氨酸和蘇氨酸之間；芳香基苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸之間；堿性基團賴氨酸、精氨酸和組氨酸之間；以及含硫基團的甲硫氨酸和半胱氨酸之間的置換。有時甲硫氨酸和亮氨酸進行置換也可以認為是保守的。優(yōu)選的保守置換基團是天冬氨酸-谷氨酸；天冬酰胺-谷氨酰胺；纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸；丙氨酸-纈氨酸；苯丙氨酸-酪氨酸；以及賴氨酸-精氨酸。
術(shù)語“胃腸外給藥”以及“經(jīng)胃腸外給藥”是本領(lǐng)域已知的，它涉及到不同于腸道和局部給藥的給藥方式，通常通過注射，并且包括但不限于經(jīng)靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹腔內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、包囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、以及胸骨內(nèi)注射和輸注。
本發(fā)明目的方法治療的“患者”、“受試者”或“宿主”既可以是人類也可以是非人類的動物。
術(shù)語“同一性百分比”是指兩氨基酸序列或兩核酸序列之間的序列同一性。同一性可以由以比較為目的比對每個序列中的位置來確定。當一個等效位置在所比較的序列中被相同的堿基或氨基酸占據(jù)時，那么該分子在那個位置就是同一的；當該等效位置被相同或類似的氨基酸殘基(例如，空間排列和/或電荷性質(zhì)類似)占據(jù)時，那么該分子在那個位置就可以被認為是同源的(相似的)。同源性、相似性、或同一性百分比的表述是指被比較序列的共享位置的相同或相似氨基酸數(shù)目的函數(shù)?？梢允褂酶鞣N各樣的比對算法和/或程序，包括FASTA、BLAST、或ENTREZ。FASTA和BLAST作為GCG序列分析程序包(University of Wisconsin，Madison，Wis.)的一部分是可得的，而且能夠在例如設(shè)置默認值狀態(tài)下使用。ENTREZ可以通過國家生物技術(shù)情報中心、國立醫(yī)學(xué)圖書館使用、國家衛(wèi)生研究所、Bethesda、Md獲得。在一個具體實施方式
中，兩序列的同一性百分比可通過缺口加權(quán)值為1的GCG程序確定，例如，每個氨基酸缺口都被加權(quán)就好像它是兩序列之間的單個氨基酸或核苷酸的錯配。其他的比對技術(shù)在Methods inEnzymology，vol.266Computer Methods for Macromolecular SequenceAnalysis(1996)，ed.Doolittle，Academic Press，Inc.，a division of HarcourtBrace & Co.，San Diego，California，USA中有所描述。優(yōu)選地，使用一種允許在序列中有缺口的比對程序來進行序列比對。h-Waterman就是一種在序列對比中允許有缺口的算法。見Meth.Mol.Biol.70173-187(1997)。并且，GAP程序還可以使用Needleman和Wunsch比對方法進行序列比對。一種替代的檢索策略用到了在MASPAR電腦上運行的MPSRCH軟件。MPSRCH使用了一種Smith-Waterman算法在一個大規(guī)模并行計算機上對序列進行評分。這種方法改善了獲得較遠相關(guān)匹配的能力，而且尤其能夠容忍細小的缺口和核苷酸序列錯誤。核酸編碼的氨基酸序列既可以用于檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫也可以用于檢索DNA數(shù)據(jù)庫。含各獨立序列的數(shù)據(jù)庫在Methods inEnzymology，ed.Doolittle，supra中有所描述。數(shù)據(jù)庫包括Genbank，EMBL，以及DNA Database of Japan(DDBJ)。
術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”是本領(lǐng)域已經(jīng)認定的，它是指一種藥學(xué)上-可接受的材料、組合物或者媒介物，例如液體或固體填充物、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包封材料，其參與攜帶或者運輸任何目的的組合物或組分，將它從一個器官或者身體的一部分帶到另一個器官或者身體的另一部分。每個載體必須都是“可接受的”其意義是指要適合目的組合物以及它的各組分而且不能對患者有害。一些可以充當藥學(xué)上可接受的載體材料的例子包括(1)糖類，例如乳糖、葡萄糖以及蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素，及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素以及醋酸纖維素；(4)黃芪膠粉末；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石粉；(8)賦形劑，例如可可脂以及栓劑蠟；(9)油類，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油以及大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇以及聚乙二醇；(12)酯類，例如油酸乙酯以及十二烷酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，例如氫氧化鎂以及氫氧化鋁；(15)海藻酸；(16)無熱原的水；(17)等滲鹽水；(18)Ringer’s溶液；(19)乙醇；(20)磷酸鹽緩沖液；以及(21)在醫(yī)藥制品組成中使用的其他無毒的相容物質(zhì)。
術(shù)語“多核苷酸”、以及“核酸”可以交換地使用。它們是指一種任意長度的多聚體形式的核苷酸、脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或者它的類似物。下列為多核苷酸的非限定性的例子基因或基因片段的編碼或非編碼區(qū)域、由連接分析確定的基因座、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運RNA、核糖體RNA、核糖酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列中的分離DNA、任何序列中的分離RNA、核酸探針、以及引物。多核苷酸可以包含經(jīng)修飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸以及核苷酸類似物。如果存在，對核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可能出現(xiàn)在多聚物裝配之前或之后。核苷酸的序列有可能被非核苷酸成分中斷。多核苷酸有可能在聚合作用之后更進一步地被修飾，例如結(jié)合標記組分。術(shù)語“重組”多核苷酸是指一種源于基因組、cDNA、半合成、或者合成的多核苷酸，其不存在于自然界而且還以一種非自然的方式與另一個多核苷酸連接。術(shù)語″寡聚核苷酸″是指具有少于約100個核苷酸的多核苷酸，例如少于約75、50、25、或者10個核苷酸。
術(shù)語“多肽”，“肽”以及“蛋白質(zhì)”(如果為單鏈)在此是可以交換使用的，它是指一種氨基酸的多聚體。該多聚體可能是直線型或者分枝型的，它可以含有修飾的氨基酸，而且還可能被非氨基酸中斷。該術(shù)語同時還包括了一種經(jīng)修飾的氨基酸多聚體；所述修飾如，二硫鍵的形成、糖基化作用、脂化作用、乙?；⒘姿峄饔?，或者任何其他的處理，例如結(jié)合標記組分。此處所使用的術(shù)語“氨基酸”既涉及天然的和/或非天然的氨基酸也涉及合成的氨基酸，包括甘氨酸及其兩個D或L旋光異構(gòu)體，和氨基酸類似物以及肽模擬物。
術(shù)語“預(yù)防性的”或“治療性的”治療是本領(lǐng)域已經(jīng)認定的，它是指將藥物施用于宿主。如果是在不希望有的臨床表現(xiàn)(例如，宿主動物的疾病或者其他不希望有的狀態(tài))出現(xiàn)之前給藥，那么該治療就是預(yù)防性的，也就是說，它保護宿主克服發(fā)展成不希望有的情況，反之如果是在不希望有的情況顯現(xiàn)以后給藥，該治療就是治療性的(也就是說，它是用來減少、改善或者維持現(xiàn)存的不希望有的情況或者由此產(chǎn)生的副作用)。
術(shù)語“合成的”是本領(lǐng)域已經(jīng)認定的，它是指在體外的化學(xué)或酶促合成。
術(shù)語“全身性給藥”、“系統(tǒng)地給藥”、“系統(tǒng)地給藥”以及“經(jīng)外周給藥”都是本領(lǐng)域已經(jīng)認定的，它是指對受試者施用不會直接進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)之內(nèi)的組合物、治療劑或其它材料，使它得以進入患者的系統(tǒng)內(nèi)并且因而參與到新陳代謝以及其它類似的過程中。
術(shù)語“治療劑”是本領(lǐng)域已經(jīng)認定的，它是指局部或系統(tǒng)地作用于受試者的具有生物、生理或藥理學(xué)活性的化學(xué)組分。因此該術(shù)語的意思是指任何意圖用于診斷、治愈、調(diào)理、治療或預(yù)防疾病或是增強動物或人體內(nèi)理想的身體或心理發(fā)育和/或狀態(tài)的物質(zhì)。
術(shù)語“治療效果”是本領(lǐng)域已經(jīng)認定的，它是指由藥理學(xué)活性物質(zhì)而引起的在動物，具體是哺乳動物，而且更具體是人類體內(nèi)產(chǎn)生的局部或全身性的作用。術(shù)語“治療有效量”是指所述物質(zhì)的量，其以在適于任何治療的合理效益/風(fēng)險比所產(chǎn)生的一些理想的局部或全身性作用。所述物質(zhì)治療有效量的改變?nèi)Q于被治療的受試者以及疾病的狀況、受試者的體重和年齡、疾病的嚴重度、給藥的方式等，其可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定。例如，所述組合物以能夠產(chǎn)生一種適于所述治療的合理效益/風(fēng)險比來進行給藥。
術(shù)語“治療”是本領(lǐng)域已經(jīng)認定的，它是指治愈以及改善至少一種癥狀或疾病，或者防止癥狀或者疾病的惡化。
術(shù)語“載體”是指核酸，其能夠轉(zhuǎn)運與其相連的另一核酸。游離體(episome)是符合本發(fā)明的一種載體，其為一種能夠在染色體外復(fù)制的核酸。其它載體還包括那些能夠自主復(fù)制和表達到它們所連接的核酸的載體。能夠引導(dǎo)與其可操作連接的基因表達的載體在此叫做“表達載體”。一般說來，在DNA重組技術(shù)中有用的表達載體經(jīng)常是“質(zhì)?！钡男问剑侵腑h(huán)狀雙鏈DNA分子，其載體形式?jīng)]有結(jié)合染色體。由于質(zhì)粒是最常用的載體形式，所以在目前的規(guī)格標準中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”是能夠交換使用的。然而，本發(fā)明還意圖包括了提供同樣功能的其它形式的表達載體，其將隨后為本領(lǐng)域所知。
示例性組合物肽在此提供了抑制血管生成進而抑制腫瘤生長和/或形成的肽。人和鼠的這種肽的氨基酸序列分別為HSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIR(SEQID NO2)和HTHQDFQPVLHLVALNTPLSGGMRGIR(mP1；SEQ ID NO4)。SEQ ID NO2由下列核酸序列編碼cacagccaccgcgacttccagccggtgctccacctggttgcgctcaacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatccgc(SEQ ID NO1)。SEQ ID NO4由下列核酸序列編碼catactcatcaggactttcagccagtgctccacctggtggcactgaacacccccctgtctggaggcatgcgtggtatccgt(SEQ ID NO3)。
與SEQ ID NO1稍有不同的肽也顯示出保持著抗血管生成活性。一種這樣的肽為HSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRG(hP1；SEQ ID NO6)，其由以下核酸序列編碼catactcatcaggactttcagccagtgctccacctggtggcactgaacacccccctgtctggaggcatgcgtggt(SEQ ID NO5)。SEQ ID NO6并不包含SEQ ID NO2中C末端最后的兩個氨基酸殘基。更多的抗血管生成肽有可能在SEQ ID No2或4的N或C末端缺失一個或多個氨基酸。作為示例的抗血管生成肽如下所述SHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO8)；HRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO10)；RDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO12)；DFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO14)；FQPVLHLVALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO16)；SPLSGGMRGIR(SEQ ID NO18)；PVLHLVALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO20)；
VLHLVALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO22)；LHLVALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO24)；HLVALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO26)；LVALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO28)；VALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO30)；ALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO32)；LNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO34)；NSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO36)；HSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGI(SEQ ID NO38)；HSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMR(SEQ ID NO40)；HSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGM(SEQ ID NO42)；HSHRDFQPVLHLVALNSPLSGG(SEQ ID NO44)；HSHRDFQPVLHLVALNSPLSG(SEQ ID NO46)；HSHRDFQPVLHLVALNSPLS(SEQ ID NO48)；HSHRDFQPVLHLVALNSPL(SEQ ID NO50)；HSHRDFQPVLHLVALNSP(SEQ ID NO52)；HSHRDFQPVLHLVALNS(SEQ ID NO54)；HSHRDFQPVLHLVALN(SEQ ID NO56)；HSHRDFQPVLHLVAL(SEQ ID NO58)；HSHRDFQPVLHLVA(SEQ ID NO60)；HSHRDFQPVLHLV(SEQ ID NO62)；HSHRDFQPVLHL(SEQ ID NO64)；THQDFQPVLHLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO66)；HQDFQPVLHLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO68)；QDFQPVLHLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO70)；DFQPVLHLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO72)；FQPVLHLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO74)；QPVLHLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO76)；PVLHLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO78)；VLHLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO80)；LHLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO82)；
HLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO84)；LVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO86)；VALNTPLSGGMRGIR(SEQID NO88)；ALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO90)；LNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO92)；NTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO94)；HTHQDFQPVLHLVALNTPLSGGMRGI(SEQ ID NO96)；HTHQDFQPVLHLVALNTPLSGGMRG(SEQ ID NO98)；HTHQDFQPVLHLVALNTPLSGGMR(SEQ ID NO100)；HTHQDFQPVLHLVALNTPLSGGM(SEQ ID NO102)；HTHQDFQPVLHLVALNTPLSGG(SEQ ID NO104)；HTHQDFQPVLHLVALNTPLSG(SEQ ID NO106)；HTHQDFQPVLHLVALNTPLS(mP1-20；SEQ ID NO108)；HTHQDFQPVLHLVALNTPL(SEQ ID NO110)；HTHQDFQPVLHLVALNTP(SEQ ID NO112)；HTHQDFQPVLHLVALNT(SEQ ID NO114)；HTHQDFQPVLHLVALN(SEQ ID NO116)；HTHQDFQPVLHLVAL(mP1-15；SEQ ID NO118)；HTHQDFQPVLHLVA(SEQ ID NO120)；HTHQDFQPVLHLV(SEQ ID NO122)；HTHQDFQPVLHL(SEQ ID NO124)；HSHRDFVALNSPLSGGMRGIR(SEQ ID NO125)；HSHRDFQPVLHLLSGGMRGIR(SEQ ID NO126)；QPVLHLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO127)；HTHQDFVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO128)；以及HTHQDFQPVLHLLSGGMRGIR(SEQ ID NO129)。
其它抗血管生成肽是基于下列共有序列的HXaaHXaaDFQPVLHLVALNXaaPLSGGMRGIR(SEQ ID NO130)或HXaaHXaaDFQPVLHLVALNXaaPLSG(SEQ ID NO131)，其中Xaa為任意氨基酸。
其它具有抗血管生成活性的肽可能含有、由或者基本上由如上所述的任何氨基酸序列組成。而其它肽還可以含有、由或者基本上由與N末端內(nèi)皮抑素肽具有至少約70％、80％、90％、95％、98％或者99％同一性或同源性的氨基酸序列組成。例如，預(yù)期與自然存在的內(nèi)皮抑素蛋白有大約1、2、3、4、5或更多個不同氨基酸的肽保持抗血管生成活性。與如上所述序列相似的肽可能含有取代例如保守性替換、缺失或添加。那些差異最好是存在于在不同種間保守性不明顯的區(qū)域。此類區(qū)域可以通過各種動物物種間內(nèi)皮抑素蛋白氨基酸序列的比對來確定。例如，對SEQ ID NO2、4、或6的2、4、和17位氨基酸以及在如SEQ ID NO8、10、12、30、32、或34中的突出顯示(黑體)的氨基酸的取代就不會對抗血管生成活性造成負面的影響，這是因為這些氨基酸在人類和老鼠序列之間是不同的。這些氨基酸可以被如在另一個物種中發(fā)現(xiàn)的那些氨基酸所取代。由于和原雞(Gallusgallus)物種中不同，第9位的氨基酸也可以被取代?？稍谶@些或者其它位置被取代、插入或缺失的其它氨基酸可以通過誘變研究與生物學(xué)分析來確定。
在此還包括融合與異源肽的內(nèi)皮抑素肽，例如可以用來檢出、純化、穩(wěn)定、或增溶內(nèi)皮抑素肽的異源肽。
肽可以連接于免疫球蛋白(Ig)恒定區(qū)重鏈或輕鏈區(qū)域或其部分。例如，肽可能連接于重鏈CH1、CH2和/或CH3區(qū)域。如果恒定區(qū)來自于輕鏈，它可能來自于κ或入輕鏈。如果恒定區(qū)來自于重鏈，它可能來自于下列抗體種類的任何一種中的一種抗體IgG、IgA、IgE、IgD、以及IgM。IgG可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。恒定區(qū)可以是Fc片段。恒定區(qū)可能是來自于哺乳動物的抗體，例如，人類抗體。可溶性受體-IgG融合蛋白是常用的免疫試劑而且它們的構(gòu)建方法也是本領(lǐng)域公知的(見例如，美國專利No.5,225,538、5,726,044、5,707,632、5750,375、5,925，351、6,406,697以及Bergers et al.Science 1999 284808-12)。優(yōu)選的免疫球蛋白是人類IgG具體是IgG1的重鏈恒定區(qū)部分，其中兩重鏈間的二聚體形成就發(fā)生在絞鏈區(qū)。已經(jīng)認定那些作為融合多肽一部分的Fc區(qū)的CH2和CH3區(qū)域能夠增加含有Fc區(qū)多肽以及含有所述多肽的寡聚物或二聚物的體內(nèi)循環(huán)半衰期。
包括絞鏈區(qū)以及CH2和CH3區(qū)域的人類IgG1Fc部分具有如下核苷酸序列5’gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctcctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cggacc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aactgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tacaac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aaggag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaagcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cea tcc cgg gat gag ctgacc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtggag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gactcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag gggaac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctctcc ctg tct ccg ggt aaa tga 3’(SEQ ID NO132)，其編碼的肽具有如下氨基酸序列Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro GluLeu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu MetIle Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp ProGlu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr LysPro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val LeuHis Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala LeuPro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln ValTyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr CysLeu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly GlnPro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe PheLeu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe SerCys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser LeuSer Pro Gly Lys(SEQ ID NO133)。
恒定的Ig區(qū)域還可以含有用來減少或消除一種或多種效應(yīng)物功能的一個或多個突變，所述效應(yīng)物功能例如，F(xiàn)c受體的結(jié)合以及補體激活作用(見see，e.g.，S.Morrison，Annu.Rev.Immunol.，10，pp.239-65(1992)；Duncan andWinter(1988)Nature 332738-740；和Xu et al.(1994)J Biol.Chem.2693469-3474)。舉例來說，對應(yīng)人類IgGI Leu 235和Pro 331的氨基酸分別變突變?yōu)镚lu和Ser。在美國專利No.6,656,728中進一步地描述了上述構(gòu)建體。
恒定的Ig區(qū)域可以與肽的N末端或C末端相連。
所述肽還可以與具有凝血酶裂解位點的連接序列相連，例如在肽和免疫球蛋白區(qū)域之間。編碼上述位點的示例性核苷酸序列具有下列核苷酸序列5′tct aga ggt ggt cta gtg ccg cgc ggc agc ggt tcc ccc ggg ttg cag 3′(SEQ IDNO134)，其編碼的肽具有如下氨基酸序列Ser Arg Gly Gly Leu VAl Pro ArgGly Ser Gly Ser Pro Gly Leu Gln(SEQ ID NO135)。
所述肽還可以融合于信號序列。例如，當制備重組體時，編碼所述肽的核酸可能在它的5′末端連接信號序列，從而使所述肽能夠從細胞中分泌。
所述肽可以用作為基本純的制劑，例如，在所述制劑的肽中至少有約90％是所需的肽。還可以使用組合物，其含有至少約50％、60％、70％、或80％的所需的肽。
所述肽可以是變性或非變性的而且由此還可以是聚集或非聚集的。所述肽可以按照本領(lǐng)域公知的方法來變性。
所述肽可以與鋅結(jié)合。因而，所述肽可能處于含有Zn2+的組合物中，例如，在足量的情況下大部分所述肽都與一個或多個Zn2+分子結(jié)合。將Zn2+結(jié)合于肽可以由下列試驗來證明。將鋅和肽溶液混合，選擇性地共同保溫，然后透析除去未結(jié)合在所述肽上的鋅。接著可以通過進行原子吸收來檢測在所述肽溶液中的鋅。
而此處包含的其它肽是含有被修飾的氨基酸的那些肽。示例的肽是衍生化的肽，其通過糖基化作用、聚乙二醇化、磷酸化作用或者任何類似過程，修飾，并保留了其所來源的肽的至少一種生物學(xué)功能。
所述肽還可能含有一個或多個非天然存在的氨基酸。例如，非常見氨基酸或者化學(xué)氨基酸類似物可以取代或添加到肽內(nèi)。非常見氨基酸總體上包括但不限于，常見氨基酸的D型異構(gòu)體、2，4-二氨基丁酸、α-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸(citrulline)、同型瓜氨酸、磺基丙氨酸(cysteic acid)、t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、設(shè)計物(designer)的氨基酸例如β-甲基氨基酸、C alpha-甲基氨基酸、Nalpha-甲基氨基酸、以及氨基酸類似物。此外，所述氨基酸可以是D型(右旋)或L型(左旋)的。
在其它
具體實施例方式
中，提供了所述肽的分支類型，例如，通過由具有能夠形成與一個或多個氨基酸的肽鍵的自由側(cè)鏈的氨基酸或者氨基酸類似物取代所述序列內(nèi)一個或多個氨基酸而形成(而因此能夠形成一種“分枝類型”)。也涉及環(huán)狀的肽。
還包括一種在合成期間或之后進行了差異修飾的衍生化的肽，例如，修飾通過芐基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、聚乙二醇化、通過公知的保護/封端基團的衍生作用、蛋白水解裂解、結(jié)合抗體分子或其它細胞配體，等等。在具體的實施方式中，所述肽在N末端乙?；?或在C末端酰胺化。
還提供了內(nèi)皮抑素肽的衍生物，例如化學(xué)修飾的肽和肽模擬物。肽模擬物是基于或來源于肽和蛋白質(zhì)的化合物。肽模擬物可以通過利用非天然氨基酸、構(gòu)象限制、電子等排置換諸如此類的方式對已知肽進行結(jié)構(gòu)修飾而獲得。目的肽模擬物構(gòu)成了在肽和非肽合成結(jié)構(gòu)之間的結(jié)構(gòu)空間的連續(xù)統(tǒng)一體(continum)；所以，肽模擬物可能在劃定藥效基團以及促進肽翻譯為具有親本肽活性的非肽化合物中是有益的。
此外，還提供了目的肽的模擬物(mimetopes)。該肽模擬物具有以下性質(zhì)不可水解(例如，升高的穩(wěn)定性以抵抗蛋白酶水解或其它降解相應(yīng)的肽的生理情況)、升高的特異性和/或刺激細胞分化的效應(yīng)。作為例證，肽模擬物使用例如，苯二氮(benzodiazepines)(例如，見Freidinger等PeptidesChemistry and Biology，GR.Marshall ed.，ESCOM PublisherLeiden，Netherlands，1988)，取代的gama乳胺環(huán)(lactam)(Garvey等PeptidesChemistry and Biology，GR.Marshall ed.，ESCOM PublisherLeiden，Netherlands，1988，p123)，C-7模擬物(Huffman等PeptidesChemistry andBiologyy，GR.Marshall ed.，ESCOM PublisherLeiden，Netherlands，1988，p.105)，酮-亞甲基偽肽(keto-methylene pseudopeptide)(Ewenson等(1986)JMed Chem 29295；以及Ewenson等PeptidesStructure and Function(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium)Pierce Chemical Co.Rockland，IL，1985)，β-轉(zhuǎn)角二肽核心(Nagai等(1985)Tetrahedron Lett26647；以及Sato等(1986)J Chem Soc Perkin Trans 11231)，β-氨基醇(Gordon等(1985)Biochem Biophys Res Commun126419；以及Dann等(1986)Biochem Biophys Res Commun 13471)，二氨基酮(diaminoketone)(Natarajan等(1984)Biochem Biophys Res Commun124141)，以及亞甲基氨基修飾的(Roark等PeptidesChemistry and Biology，G.R.Marshall ed.，ESCOM PublisherLeiden，Netherlands，1988，p 134)來產(chǎn)生。通常還可以見Session IIIAnalytic and synthetic methods，in in PeptidesChemistry and Biology，G.R.Marshall ed.，ESCOM PublisherLeiden，Netherlands，1988)。
除了各種能夠進行肽模擬物形成的側(cè)鏈取代之外，說明書中還明確涉及了肽二級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象限制模擬物的使用。許多肽的酰胺鍵的代用物已經(jīng)開發(fā)出來。酰胺鍵的開發(fā)代用物常常包括下列基團(i)反式烯烴(transolefin)，(ii)氟代烯烴(fluoroalkene)，(iii)亞甲基氨基(methyleneamino)，(iv)磷酰胺(phosphonamide)，以及(v)磺酰胺(sulfonamide)。
代用物的例子有 另外，還可以應(yīng)用基于對肽主鏈更多的實質(zhì)上修飾的肽模擬物。屬于這中類型的肽模擬物包括(i)逆倒轉(zhuǎn)類似物(retro-inverso analogues)，(ii)N-烷基甘氨酸類似物(所謂的類肽(opeptoid))。
類似物的例子有 逆倒轉(zhuǎn)類似物N-烷基甘氨酸類似物此外，在新的肽模擬物開發(fā)過程中還運用了組合化學(xué)(combinatorialchemistry)的方法。例如，所謂“肽變型(morphing)”策略的一個具體實施方式
的焦點在于隨機生成包含大范圍肽鍵取代的肽模擬物的文庫。
在一個示范性的具體實施方式
中，肽模擬物可以衍生為肽的逆倒轉(zhuǎn)類似物。所述逆倒轉(zhuǎn)類似物可以按照本領(lǐng)域公知的方法制備，例如Sisto等的美國專利4,522,752中所描述的方法。逆倒轉(zhuǎn)類似物還能夠如WO 00/01720中的描述制備。將理解可以產(chǎn)生例如包括一些正常肽鍵合的混合肽。作為一般的指導(dǎo)，對于蛋白水解作用最為敏感的位點通常被改變，較不敏感的酰胺鍵對于模擬物轉(zhuǎn)變(mimetic switching)而言是可選的。其最終產(chǎn)品或中間產(chǎn)物可以由HPLC進行純化。
所述肽可以包含至少一個D型立體異構(gòu)體氨基酸或者每個氨基酸都是D型立體異構(gòu)體。其他肽可以包含至少一個反轉(zhuǎn)的氨基酸。所述的反轉(zhuǎn)的氨基酸也可能是D型立體異構(gòu)體。所述肽的每個氨基酸都可能是反轉(zhuǎn)的和/或每個氨基酸都可能是D型立體異構(gòu)體。
在另一個說明性的具體實施方式
中，肽模擬物可以衍生為肽的逆鏡像類似物(retio-enantio analog)。如WO 00/01720中所述，此類逆鏡像類似物可以用市售的D型氨基酸(或其類似物)以及標準固相或液相肽合成方法進行合成。其最終產(chǎn)品可以由HPLC進行純化，產(chǎn)生純的逆鏡像類似物。
在又一個說明性的具體實施方式
中，目的肽被制成了反式-烯烴衍生物。反式-烯烴類似物可以按照Y.K.Shue et al.(1987)Tetrahedron Letters 283225以及WO 00/01720中描述的方法進行合成。它還可能更進一步將通過上述的方法合成的偽二肽，連接于其他偽二肽，從而產(chǎn)生具有一些烯烴功能而非酰胺功能的肽模擬物。
還有另一類包括膦酸酯(phosphonate)衍生物的肽模擬物衍生物。上述膦酸酯衍生物的合成可以采用已知的合成方案。見，例如，Loots等PeptidesChemistry and Biology，(Escom Science Publishers，Leiden，1988，p.118)；Petrillo等PeptidesStructure and Function(Proceedings of the 9th AmericanPeptide Symposium，Pierce Chemical Co.Rockland，IL，1985)。
許多其他的肽模擬物結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域已知的，而且可以很容易的適用于本發(fā)明的目的肽模擬物。舉例說明，肽模擬物可以包括1-氮雜二環(huán)(azabicyclo)[4.3.0]壬烷(nonane)替代物(見Kim et al.(1997)J.Org.Chem.622847)，或者N-?；哙核?piperazine acid)(見Xi等(1998)J.Am.Chem.Soc.12080)，或2-取代的哌嗪組分作為限制的氨基酸模擬(見Williams et al.(1996)J.Med.Chem.391345-1348)。在又一個具體實施方式
中，一些氨基酸殘基可以用芳基以及二芳基部分取代，例如，單環(huán)或二環(huán)的芳香(aromatic)或雜環(huán)(heteroaromatic)核，或者二芳香核(biaromatic)、芳香-雜環(huán)(aromatic-heteroaromatic)核、或二雜環(huán)(biheteroaromatic)核。
目的肽模擬物可以通過例如組合合成技術(shù)聯(lián)合高通量篩選的來進行優(yōu)化。
此外，其他模擬物(mimetope)的例子還包括但不限于，基于蛋白質(zhì)的化合物、基于碳水化合物的化合物、基于脂質(zhì)的化合物、基于核酸的化合物、天然有機化合物、合成衍生的有機化合物、抗獨特型抗體和/或催化抗體、或其片段。模擬物(mimetope)可以通過例如篩選天然以及合成化合物的庫中能夠抑制血管生成和/或腫瘤生長的化合物進行來獲得。模擬物(mimetope)還可以從例如天然以及合成化合物的庫，具體是化學(xué)或組合物文庫(即，那些在序列或大小方面不同但具有同樣的結(jié)構(gòu)區(qū)塊的化合物的文庫)中獲得。模擬物(mimetope)還可以通過例如合理的藥物設(shè)計來獲得。在合理的藥物設(shè)計步驟中，本發(fā)明化合物的三維空間結(jié)構(gòu)可以通過例如核磁共振(NMR)或X-射線晶體衍射(crystallography)來進行分析。進而可以利用其三維結(jié)構(gòu)通過例如電腦模型來預(yù)知潛在模擬物的結(jié)構(gòu)。預(yù)知的模擬物結(jié)構(gòu)可以進而通過例如化學(xué)合成、重組DNA技術(shù)、或通過從天然來源(例如，植物、動物、細菌以及真菌)中分離模擬物來產(chǎn)生。
“肽，其變體及衍生物”或“肽及其類似物”包含于“肽治療劑”，而且意圖包括在此所述的任何肽或其修飾型例如肽模擬物。優(yōu)選的肽治療劑具有抗血管生成活性。例如，它們可以減少或抑制血管生成至少約50％、2倍、5倍、10倍、30倍或100倍，如由例如在此描述的試驗分析中確定的那樣。
檢測候選肽的抗血管生成及腫瘤生長或形成抑制的分析試驗是本領(lǐng)域已知的，而本發(fā)明在此將更進一步地描述一個示范的例子。
核酸還公開了編碼抗血管生成肽的核酸。優(yōu)選的核酸如下cacagccaccgcgacttccagccggtgctccacctggttgcgctcaacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatccgc(SEQ lD NO1)。
catactcatcaggactttcagccagtgctccacctggtggcactgaacacccccctgtctggaggcatgcgtggtatccgt(SEQ ID NO3)。
catactcatcaggactttcagccagtgctccacctggtggcactgaacacccccctgtctggaggcatgcgtggt(SEQ ID NO5)。
agccaccgcgacttccagccggtgctccacctggttgcgctcaacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatccgc(SEQ ID NO7)；caccgcgacttccagccggtgctccacctggttgcgctcaacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatccgc(SEQ ID NO9)；cgcgacttccagccggtgctccacctggttgcgctcaacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatccgc(SEQ ID NO11)；gacttccagccggtgctccacctggttgcgctcaacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatccgc(SEQ ID NO13)；ttccagccggtgctccacctggttgcgctcaacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatccgc(SEQ ID NO15)；cagccggtgctccacctggttgcgctcaacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatccgc(SEQ ID NO17)；
ccggtgctccacctggttgcgctcaacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatccgc(SEQ ID NO19)；gtgctccacctggttgcgctcaacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatccgc(SEQ ID NO21)；ctccacctggttgcgctcaacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatccgc(SEQ ID NO23)；cacctggttgcgctcaacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatccgc(SEQ ID NO25)；ctggttgcgctcaacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatccgc(SEQ ID NO27)；gttgcgctcaacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatccgc(SEQ ID NO29)；gcgctcaacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatccgc(SEQ ID NO31)；ctcaacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatccgc(SEQ ID NO33)；aacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatccgc(SEQID NO35)；cacagccaccgcgacttccagccggtgctccacctggttgcgctcaacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatc(SEQ ID NO37)；cacagccaccgcgacttccagccggtgctccacctggttgcgctcaacagccccctgtcaggcggcatgcgg(SEQ ID NO39)；cacagccaccgcgacttccagccggtgctccacctggttgcgctcaacagccccctgtcaggcggcatg(SEQ ID NO41)；cacagccaccgcgacttccagccggtgctccacctggttgcgctcaacagccccctgtcaggcggc(SEQ ID NO43)；cacagccaccgcgacttccagccggtgctccacctggttgcgctcaacagccccctgtcaggc(SEQ ID NO45)；cacagccaccgcgacttccagccggtgctccacctggttgcgctcaacagccccctgtca(SEQ ID NO47)；cacagccaccgcgacttccagccggtgctccacctggttgcgctcaacagccccctg(SEQ ID NO49)；cacagccaccgcgacttccagccggtgctccacctggttgcgctcaacagcccc(SEQ ID NO51)；cacagccaccgcgacttccagccggtgctccacctggttgcgctcaacagc(SEQ ID NO53)；cacagccaccgcgacttccagccggtgctccacctggttgcgctcaac(SEQ ID NO55)；cacagccaccgcgacttccagccggtgctccacctggttgcgctc(SEQ ID NO57)；cacagccaccgcgacttccagccggtgctccacctggttgcg(SEQ ID NO59)；cacagccaccgcgacttccagccggtgctccacctggtt(SEQ ID NO61)；cacagccaccgcgacttccagccggtgctccacctg(SEQID NO63)；actcatcaggactttcagccagtgctccacctggtggcactgaacacccccctgtctggaggcatgcgtggtatccgt(SEQ ID NO65)；catcaggactttcagccagtgctccacctggtggcactgaacacccccctgtctggaggcatgcgtggtatccgt(SEQ ID NO67)；caggactttcagccagtgctccacctggtggcactgaacacccccctgtctggaggcatgcgtggtatccgt(SEQ ID NO69)；gactttcagccagtgctccacctggtggcactgaacacccccctgtctggaggcatgcgtggtatccgt(SEQ ID NO71)；atttcagccagtgctccacctggtggcactgaacacccccctgtctggaggcatgcgtggtatccgt(SEQ ID NO73)；cagccagtgctccacctggtggcactgaacacccccctgtctggaggcatgcgtggtatccgt(SEQ ID NO75)；ccagtgctccacctggtggcactgaacacccccctgtctggaggcatgcgtggtatccgt(SEQ ID NO77)；gtgctccacctggtggcactgaacacccccctgtctggaggcatgcgtggtatccgt(SEQ ID NO79)；
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核酸包括載體，例如用于產(chǎn)生肽的表達載體，舉例來說如，病毒載體。在此還提供了一種含有編碼所述肽的核酸的細胞以及用于產(chǎn)生所述肽的方法，包括培養(yǎng)所述細胞。上述方法可以用來制備重組肽或用來在細胞中表達肽，例如，在目的細胞中。
可以通過眾所周知的技術(shù)諸如傳染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)位(transrection)、電穿孔以及轉(zhuǎn)化將適當?shù)妮d體引入宿主細胞。所述載體可能是例如，噬菌體、質(zhì)粒、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可為有復(fù)制能力的或復(fù)制缺陷的。在后者的情況下，病毒繁殖通常會僅僅發(fā)生在互補型(complementing)宿主細胞中。
所述載體可能含用于在宿主中增殖的選擇性標記。一般來說，將質(zhì)粒載體引入一個沉淀物例如磷酸鈣沉淀物中，或是引入具有帶電脂質(zhì)的復(fù)合物中。如果所述載體是病毒，那么它可能先在體外利用適當?shù)陌b細胞系進行包裝然后再轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主細胞中。
優(yōu)選的載體含有對于目的多核苷酸的順式作用控制區(qū)域。適當?shù)姆词阶饔靡蜃涌梢杂伤拗魈峁?、由互補型載體提供或是由引入到宿主時所述載體本身提供。
在某些實施方式中，提供特異性表達的載體，它們可以是可誘導(dǎo)的和/或細胞類型特異性的。在所述載體之中尤其優(yōu)選的是那些可通過便于操作的、環(huán)境因素例如溫度以及營養(yǎng)添加劑可誘導(dǎo)的載體。
在本發(fā)明中有益的表達載體包括染色體-、游離體-以及病毒-衍生的載體，例如，來源于細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母游離體、酵母染色體元件、病毒如桿狀病毒(baculo virus)、乳多泡病毒(papova virus)、痘苗病毒(vacciniavirus)、腺病毒、禽痘病毒(fowlpox virus)、偽狂犬病病毒(pseudorabjes virus)和逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體，以及來源于上述的組合的載體，諸如粘粒和噬粒。DNA嵌入物應(yīng)有效地連接適當?shù)膯幼樱缡删wλPL啟動子、大腸桿菌lac、trp和tac啟動子、SV40早期和晚期啟動子以及逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs啟動子等。其它適當?shù)膯幼右矊⑹潜绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的。表達構(gòu)建體還將進一步含有轉(zhuǎn)錄開始、終止位點以及在經(jīng)轉(zhuǎn)錄的區(qū)中的、用于翻譯的核糖體結(jié)合位點。通過構(gòu)建體表達的成熟轉(zhuǎn)錄物的編碼部分將優(yōu)選地包括在開始處的翻譯起始位點以及適當?shù)卦O(shè)置在待翻譯多肽末端的終止密碼子(UAA、UGA或UAG)。
應(yīng)指出的是，表達載體將優(yōu)選包括至少一個選擇性標記。所述標記包括用于真核細胞培養(yǎng)基的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性基因，以及用于培養(yǎng)大腸桿菌及其他細菌中的四環(huán)素、卡那霉素、或氨芐青霉素抗性基因。適宜的宿主的代表性例子包括但不限于，細菌細胞，例如大腸桿菌、鏈霉菌(Streptomyces)和鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)細胞；真菌細胞，例如酵母細胞；昆蟲細胞例如果蠅(Drosophila)S2和Sf9細胞；動物細胞例如CHO、COS和Bowes黑素瘤細胞；以及植物細胞。適當?shù)呐囵B(yǎng)基和上述宿主細胞的培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域公知的。
其中應(yīng)用于細菌的載體優(yōu)選包括Qiagen公司市售的pQE70、pQE60和pQE9、pQE10；Stratagene公司市售的pBS載體、Phagescript載體、Blueseript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；Novagen公司市售的pET系列載體；以及Pharmacia公司市售的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。其中優(yōu)選的真核載體為Stratagene公司市售的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；以及Pharmacia公司市售的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其他適當?shù)妮d體對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說也將是顯而易見的。
其中適用于本發(fā)明的已知細菌啟動子包括大腸桿菌lacI和lacZ啟動子，T3、T5和T7啟動子，gpt啟動子，入PR和PL啟動子，trp啟動子以及xyI/tet嵌合啟動子。適當?shù)恼婧藛幼影–MV即刻早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs例如勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子、以及金屬硫因(metallothionein)啟動子，例如鼠金屬硫因-I啟動子。
將構(gòu)建體引入宿主細胞可以通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-右旋糖酐介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽離子脂類介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其他的方法而完成。所述方法在許多標準實驗手冊(例如，Davis等，Basic Methods In MolecularBiology(1986))中均有描述。
由高等真核生物轉(zhuǎn)錄編碼本發(fā)明多肽的DNA是通過在載體中插入增強子序列來提高的。增強子是DNA的順式作用元件，通常由大約10到300個核苷酸組成，用來提高所給宿主細胞類型中啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。增強子的例子包括SV40增強子，它是位于復(fù)制起點晚期側(cè)(late side)的100到270個核苷酸，巨細胞病毒早期啟動子增強子，在復(fù)制起點晚期側(cè)的多瘤病毒增強子，以及腺病毒增強子。
還可以制備本發(fā)明多肽的重組可溶性形式，舉例來說，通過刪除至少一部分跨膜結(jié)構(gòu)域，從而使所述蛋白質(zhì)不能將其自身定位到細胞膜。同樣在本發(fā)明范疇內(nèi)的還有編碼拼接變體的核酸或代表從可選擇的轉(zhuǎn)錄啟動位點的轉(zhuǎn)錄物合成的核酸，諸如那些其轉(zhuǎn)錄起始于內(nèi)含子中的位點的那些核酸。上述同系物可以使用本領(lǐng)域公知的標準方法通過雜交或PCR進行克隆。
所述多核苷酸序列還可能編碼前導(dǎo)序列，例如，天然的前導(dǎo)順序或者異源的前導(dǎo)順序?？蛇x，核苷酸可以被改造從而刪除天然的前導(dǎo)順序并在它的位置插入異源的前導(dǎo)序列。術(shù)語“前導(dǎo)序列”在此可以與術(shù)語“信號肽”互換地使用。例如，理想的DNA序列可能融合在與和幫助多肽從宿主細胞中表達和分泌的DNA序列相同的閱讀框中，例如，起分泌序列作用的用于控制多肽從細胞中轉(zhuǎn)運的前導(dǎo)序列。具有前導(dǎo)序列的蛋白質(zhì)是前原蛋白質(zhì)，并可具有可由宿主細胞切割的前導(dǎo)序列，從而形式所述蛋白質(zhì)的成熟形式。
為了將所述翻譯的多肽分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細胞腔、漿膜外周間隙或者胞外環(huán)境中，可將適宜的分泌信號摻入所表達的多肽，例如，氨基酸序列KDEL。所述信號可能是多肽內(nèi)源的或者它們也可能是異源的信號。
所述多肽還可以以經(jīng)修飾的形式進行表達，諸如融合蛋白質(zhì)，它不但可以包括分泌信號，而且還可以包括其他的異源功能性區(qū)域。例如，其他的氨基酸具體是帶電的氨基酸的區(qū)域，可能被加到所述多肽的N末端或C末端用來改善在純化或后續(xù)處理以及貯藏期間其在宿主細胞中的穩(wěn)定性和持久性。也可將肽部分加入多肽用來促進純化。上述區(qū)域可能在多肽最終制備好之前被除去。將肽部分添加于多肽用來促進分泌或排出、改善穩(wěn)定性和促進純化及其他作用是本領(lǐng)域常規(guī)和熟知的技術(shù)。上述融合蛋白的一個例子可以包含用于使蛋白質(zhì)增溶的來自免疫球蛋白的異源區(qū)域。
示例性的方法抗血管生成肽或編碼抗血管生成肽的核酸載體可以對需要它的受試者給藥來預(yù)防或降低血管生成和/或細胞增殖，例如，腫瘤生長，或與其相關(guān)的任何疾病或異常。受試者可以是人類或動物，例如哺乳動物。
不受控制的血管生成存在于許多疾病、腫瘤轉(zhuǎn)移和內(nèi)皮細胞異常生長狀態(tài)中，而且在此類情況下可以見到它維持著病理性的破壞。不受控制的血管生成引起的種種病理狀態(tài)可以歸類為血管生成依賴或血管生成相關(guān)的疾病。旨在控制血管生成的治療方法可以導(dǎo)致此類疾病的康復(fù)或緩和。因此，無論關(guān)系到正常狀況或疾病，血管生成都與任何新的組織生長有關(guān)。于是相應(yīng)的，無論關(guān)系到正常狀況或疾病，在此描述的治療劑都可用于抑制與任何新的組織生長有關(guān)的血管生成。
治療劑可能與組織相接觸來預(yù)防血管生成和/或細胞增殖，例如，腫瘤生長，或相關(guān)的任何疾病或病癥。由血管生成介導(dǎo)的疾病和過程包括血管瘤(hemangioma)、實體腫瘤(solidtumors)、白血病、轉(zhuǎn)移(metastasis)、毛細血管擴張牛皮癬硬皮病(telangiectasia psoriasis scleroderma)、膿性肉芽腫(pyogenic granuloma)、心肌血管生成、動脈粥樣斑新血管化(plaqueneovascularization)、冠狀動脈側(cè)支形成(coronary collaterals)、大腦側(cè)支形成(cerebral collaterals)、動靜脈畸形(arteriovenous malformation)、缺血性四肢血管生成(ischemic limbangiogenesis)、角膜疾病(corneal disease)、虹膜潮紅(rubeosis)、新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)、糖尿病性視網(wǎng)膜病、晶狀體后纖維組織形成(retrolental fibroplasia)、關(guān)節(jié)炎、糖尿病性新血管化、黃斑變性(macular degeneration)、傷口愈合、胃潰瘍、骨折、瘢痕瘤(keloid)、類天皰瘡(phemphigoid)、沙眼(trachoma)、血管發(fā)生、造血作用、排卵、月經(jīng)(menstruation)、以及胎盤形成(placentation)。在此所述的治療劑還可以用于治療或抑制癌癥的生長或者降低腫瘤質(zhì)量。
血管生成在實體腫瘤形成和轉(zhuǎn)移瘤中是較為顯著的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與一些實體腫瘤例如橫紋肌肉瘤、成視網(wǎng)膜細胞瘤、尤文(Ewing)肉瘤、成神經(jīng)細胞瘤和骨肉瘤相關(guān)的血管生成因子。如果沒有血液供給來提供營養(yǎng)以及帶走細胞的廢物，腫瘤是無法擴張的。血管生成對于腫瘤包括實體腫瘤以及良性瘤例如聽神經(jīng)瘤(acousticneuroma)、纖維神經(jīng)瘤(neurofibroma)、沙眼和膿性肉芽腫都很重要。防止血管生成可以阻止這些腫瘤生長和由于腫瘤存在而導(dǎo)致的動物的組織損害。
血管生成對瘤轉(zhuǎn)移的兩個階段都十分重要。血管生成刺激作用十分重要的第一階段是在腫瘤的血管化階段，它能夠讓腫瘤細胞進入血流而通過循環(huán)遍及全身。在腫瘤細胞離開了最初的位點之后，然后就安置在次級的轉(zhuǎn)移瘤位點，血管生成必須存在于新的腫瘤能夠生長和擴張之前。所以，防止血管生成可以預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移以及可能防止最初位點的贅生物生長。
值得注意的是血管生成與生血(blood-born)腫瘤例如白血病、骨髓的任何多樣的急性或慢性贅生物疾病有關(guān)，其中存在著白血球的無限制增殖，還通常伴隨著貧血、凝血障礙、以及淋巴結(jié)、肝和脾的腫大?？梢韵嘈叛苌蓪σ鸢籽?樣腫瘤的骨髓中的異常狀態(tài)起一定的作用。
在此描述的組合物可以用來治療動脈粥樣硬化。相應(yīng)地，含有在此描述的所述肽的組合物可以用來預(yù)防或消退動脈粥樣硬化生長或動脈粥樣斑形成。
一般來說，在此描述的組合物可以被用來治療炎癥性的病癥，例如免疫性和非免疫性的炎癥、慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病、伴隨著不合宜或不合時機的脈管侵入的牛皮癬病癥、例如糖尿病性視網(wǎng)膜病、新生血管性青光眼、再狹窄(restenosis)、動脈粥樣硬化斑中的毛細管增殖以及骨質(zhì)疏松癥。還可以治療的癌癥相關(guān)的病癥包括實體腫瘤、實體腫瘤轉(zhuǎn)移瘤、血管纖維瘤、晶狀體后纖維組織形成、血管瘤、以及卡波奇(Kaposi)肉瘤。
血管生成介導(dǎo)疾病的一個例子是眼新生血管疾病。這種疾病的特點在于新生血管侵入到眼睛例如視網(wǎng)膜或角膜結(jié)構(gòu)中。它是最常見的導(dǎo)致失明的原因而且還涉及到近二十種眼疾。在年齡相關(guān)的黃斑變性中，伴隨的視覺問題起因于脈絡(luò)膜毛細管的向內(nèi)生長穿過布魯赫(Bruch’s)膜中的缺陷以及視網(wǎng)膜色素上皮細胞之下纖維脈管組織的增生。血管生成損害還與糖尿病性視網(wǎng)膜病、幼年視網(wǎng)膜病(retinopathy of prematurity)、角膜移植物排斥、新生血管性青光眼和晶狀體后纖維組織形成有關(guān)。
可以認為，在此描述的可被治療的、與角膜新血管化相關(guān)的疾病包括但不限于，糖尿病性視網(wǎng)膜病、幼年視網(wǎng)膜病、角膜移植物排斥、新生血管性青光眼和晶狀體后纖維組織形成、流行性角膜結(jié)膜炎(epidemickeratoconjunctivitis)、維生素A缺乏癥、隱形眼鏡過度磨損(contact lensoverwear)、特異反應(yīng)性的角膜炎(atopic keratitis)、上邊緣角膜炎(superiorlimbic keratitis)、翼狀胬肉角膜炎sicca(pterygium keratitis sicca)、干燥(sjogrens)、紅斑痤瘡(acenrosacea)、phylectenulosis、梅毒(syphilis)、分枝桿菌感染、脂質(zhì)變性(lipid degeneration)、化學(xué)灼傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、單純性皰疹感染、帶狀皰疹感染、原生動物感染、卡波奇肉瘤、Mooren潰瘍、Terrien氏邊緣變性(Terrien’s marginal degeneration)、邊緣角膜溶解(marginal keratolysis)、外傷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性狼瘡(systemic lupus)、多發(fā)性動脈炎(polyarteritis)、韋格納(Wegener’s)結(jié)節(jié)病、鞏膜炎(Scieritis)、Steven′s Johnson病、以及類天皰瘡(periphigoid)放射狀角膜切開術(shù)。
可以認為，在此描述的與視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜的新血管化相關(guān)的疾病包括但不限于，糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑變性、鐮刀形紅細胞貧血病、類肉瘤(sarcoid)、梅毒、彈性假黃瘤(pseudoxanthoma elasticum)、Pagets病、靜脈閉塞、動脈閉塞、頸動脈梗阻性疾病、慢性葡萄膜炎/玻璃體炎、分枝桿菌感染、萊姆氏病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、幼年視網(wǎng)膜病、Eales病、白塞病、導(dǎo)致視網(wǎng)膜炎或脈絡(luò)膜炎的感染、推定的眼睛組織胞漿菌病(presumed ocularhistoplasmosis)、Bests病、近視、眼凹(opticpits)、Stargarts病、睫狀體平坦部炎(pars planitis)、慢性視網(wǎng)膜剝離、高粘稠度綜合征(hyperviscositysyndrome)、弓形體病(toxoplasmosis)、外傷以及激光后并發(fā)癥(post-lasarcomplication)。其它疾病包括但不限于，與虹膜潮紅(rubeosis)(角部(angle)的新血管形成化)相關(guān)的疾病以及由纖維脈管組織或纖維組織的異常增生所引起的疾病，包括不論是否與糖尿病相關(guān)的所有形式的增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變。
另一個被認為涉及血管生成的疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在關(guān)節(jié)滑液內(nèi)層的血管經(jīng)歷了血管生成。除形成新的血管網(wǎng)絡(luò)以外，內(nèi)皮細胞釋放因子以及氧反應(yīng)性物質(zhì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)面血管翳的生長和軟骨的破壞。涉及血管生成的因子可以積極地促進和幫助維持類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的長期發(fā)炎狀態(tài)。
血管生成相關(guān)的因子還可以在骨關(guān)節(jié)炎中具有一定作用。由血管生成相關(guān)因子對軟骨細胞的活化作用加劇了關(guān)節(jié)破壞。在后期階段，血管生成因子將促進新骨的形成。預(yù)防骨組織破壞的治療劑的引入能夠中斷該疾病的發(fā)展并且減輕患者由關(guān)節(jié)炎帶來的痛苦。
慢性炎癥也可能涉及到病理性血管生成。所述疾病狀態(tài)如潰瘍性結(jié)腸炎和克隆氏病顯示了新血管向內(nèi)生長到發(fā)炎組織中的組織學(xué)變化。一種發(fā)現(xiàn)于南美洲的細菌感染——巴爾通氏體病(Bartonellosis)能夠?qū)е乱环N以血管內(nèi)皮細胞增生為特征的慢性階段。另一與血管生成相關(guān)的病理性作用發(fā)現(xiàn)于動脈粥樣硬化癥。形成于血管內(nèi)腔中的動脈粥樣斑顯示了血管生成刺激活性。
小兒最常見的血管生成疾病之一是血管瘤。大多數(shù)情況下，腫瘤是良性的且無需干預(yù)即可退化。在更嚴重的病例中，腫瘤發(fā)展為大的多孔和滲透性的形式并且引起臨床并發(fā)癥。血管瘤的全身性形式，多發(fā)性血管瘤(hemangiomatoses)，具有很高的死亡率。治療耐受性血管瘤目前還沒有可以用于治療的治療劑。
血管生成還是造成遺傳病例如Osler-Weber-Rendu病或遺傳出血性毛細管擴張中的損害的原因。這是一種以許多的小型血管瘤、血管或淋巴管腫瘤為特征的遺傳性疾病。血管瘤發(fā)現(xiàn)于皮膚和粘膜中，時常伴有鼻衄(鼻出血)或胃腸道出血以及有時帶有肺或肝的動靜脈瘺。
另一個能夠按照本發(fā)明治療的疾病是獲得性免疫缺損綜合癥。
所述治療性的肽還可以用于減少正常、血管化細胞組織的過度增生，所述組織例如脂肪組織、良性息肉、肥大的心臟組織、肥大的腎臟組織、肥大的前列腺組織、含有淀粉狀蛋白沉淀的組織、以及子宮纖維瘤。所述治療劑可以以減少對組織的血管供應(yīng)，或縮小血管化的組織的大小或減弱其生長的有效量進行給藥，所述組織例如脂肪組織、息肉(例如，腸或鼻息肉)、以及肌肉(包括心肌)組織。所以，可以治療的患者包括患有息肉、以及增大的前列腺、心臟或腎臟肥大或者肥胖或超重的患者。所述肽治療劑可以以導(dǎo)致可調(diào)節(jié)待治療的血管化的組織的大小和/或生長的血液水平的量和持續(xù)時期給藥。
所述能夠降低體重的治療既適用于正常的超重個體，也適用于有遺傳性缺陷的個體。所述方法還可以用于大多數(shù)涉及由于激素或代謝缺陷癥或藥物副作用引起的重量增加的情況中。除了能夠促進體脂損失同時維持纖瘦體質(zhì)以及在慢性給藥的過程中能夠持續(xù)重量減輕之外，所述治療的其它有益效果還包括對糖尿病相關(guān)肥胖的血糖水平的正?；?。
另外，作為由按照所述方法可以治療的血管生成相關(guān)疾病引起的任何疾病或繼發(fā)狀況的發(fā)展也是可以治療的。例如，任何由超重或肥胖引起的狀況是可以如上所述進行治療或預(yù)防的。常見的疾病包括高脂血癥(hyperlipidemia)、脂質(zhì)生成障礙(dyslipogenesis)、高膽固醇血癥(hypercholesterolemia)、葡萄糖耐量障礙(impaired glucose tolerance)、高血糖水平(high blood glucose sugar level)、X綜合癥(syndrome X)、高血壓(hypertension)、動脈粥樣硬化癥和脂肪代謝障礙(atherosclerosis and lipodystrophy)、高血壓(hypertension)、高血液膽固醇(highblood cholesterol)、血脂紊亂(dyslipidemia)、2型糖尿病(type 2diabetes)、胰島素抵抗(insulin resistance)、葡萄糖不耐(glucose intolerance)、高胰島素血癥(hyperinsulinemia)、冠心病(coronary heart disease)、心絞痛(angina pectoris)、充血性心力衰竭(congestive heart failure)、中風(fēng)(stroke)、膽結(jié)石(gallstones)、膽囊炎以及膽石癥(cholescystitis and cholelithiasis)、痛風(fēng)(gout)、骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis)、梗阻性睡眠呼吸暫停和呼吸作用問題(obstructive sleep apneaand respiratory problems)、一些類型的癌癥(some types of cancer)(例如子宮內(nèi)膜(such as endometrial)、胸部(breast)、前列腺(prostate)、以及結(jié)腸(and colon))、妊娠并發(fā)癥(complications of pregnancy)、不良的雌性生殖健康狀態(tài)(poor femalereproductive health)(例如月經(jīng)不調(diào)(menstrual irregularities)、不育(infertility)、排卵不規(guī)則(irregular ovulation))、膀胱控制問題(bladder control problems)(例如壓迫性尿失禁(stress incontinence))；尿酸腎石病(uric acid nephrolithiasis)；以及心理學(xué)的病癥(and psychological disorders)(例如憂郁癥(such as depression)、進食紊亂(eating disorders)、身體映象扭曲(distorted body image)，以及自卑(andlow self esteem))。
血管生成也涉及正常的生理學(xué)過程例如生殖(reproduction)以及傷口愈合。血管生成是排卵中的重要階段并且對受精后囊胚(blastula)的著床也十分重要。血管生成的阻止可用于引起閉經(jīng)、阻斷排卵或防止囊胚的著床。
在傷口愈合中，過度的修補或纖維組織形成是外科操作的有害副作用并且可能引起或加劇血管生成。粘連是一種外科手術(shù)的常見并發(fā)癥，它會導(dǎo)致例如小腸梗阻的問題。所以在這類以及其它情況下，利用在此所述的治療性的肽防止傷口愈合可能是合乎需要的。
所述肽可以以藥物組合物提供以及向需要的它的患者給藥。所述肽還可以在體外與組織或細胞接觸。
治療方法一般來說含有向患者，例如，需要的它的患者，施予治療有效量的治療劑，例如，在此所述的肽或其變體或衍生物或其編碼核酸。患者可以是哺乳動物，例如人類、非人類靈長類、犬、貓、馬、豬、綿羊、牛、羊、小鼠以及大鼠。在此所述方法具體能被用于獸醫(yī)學(xué)用途。所述方法可以首先包含診斷帶有將給藥所述肽有益的疾病或病癥例如惡性或良性的腫瘤生長的患者。所述方法還可以包含確定在給藥之后的某一時間的治療效果。例如，測定從治療開始后約一周、一月或兩個月的腫瘤生長大小。測定還可以含有組織樣品例如腫瘤的獲得以及血管生成水平的確定。
所述治療劑可以以“生長抑制量”即，對于抑制或縮小細胞或組織增生具有治療有效性的量給藥。所述治療劑還可以以“抗血管生成量”即，對于抑制或縮小血管生成具有治療有效性的量給藥。所述治療劑可以施用于，優(yōu)選是人類，既可以單獨給藥，也可以聯(lián)合藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑，按照標準藥學(xué)常規(guī)形成藥物組合物給藥。治療劑可以直接向希望抑制血管生成或腫瘤生長的組織中給藥。所述治療劑也可以口服或胃腸外給藥，包括經(jīng)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、經(jīng)直腸以及局部地給藥。一種或多種治療劑可以直接注射到要治療患者的腫瘤之內(nèi)。
可以將鋅與所述肽或其變體或衍生物共同給藥。例如可以將治療有效劑量的治療劑組合物(見下文)和治療有效劑量的Zn2+(見下文)一起給藥。所述肽或其變體或衍生物可以在給藥之前或在給藥的同時與鋅溶液混合，從而使鋅與所述肽相互作用。可選，所述肽或其變體或衍生物在將鋅給藥之前或之后獨立地給藥，條件是兩者都在至少有一段的時期共同存在于循環(huán)當中。例如，在肽給藥之前或之后約幾分鐘到幾小時可以進行鋅溶液的給藥。然而在其它一些實施方式中，卻沒有向施予所述肽的患者進行鋅的給藥。但是當患者血液循環(huán)中具有鋅時，施予的肽依然可以結(jié)合鋅。
所述治療劑的毒性和治療效力可以由在細胞培養(yǎng)或?qū)嶒瀯游镏械臉藴仕帉W(xué)方法確定，例如用于確定LD50(對于50％的群體致命的劑量)和ED50(在50％的群體中治療有效的劑量)。毒性和治療性效果之間的劑量比就是治療指數(shù)，它可以用LD50/ED50的比率來表示。優(yōu)選顯示出較大治療指數(shù)的藥劑。同時為了例如使對于正常細胞的潛在損害變成最小，使用顯示毒副作用的試劑時，可以設(shè)計將所述試劑靶向受影響組織的位點的遞送系統(tǒng)，從而降低副作用。
從細胞培養(yǎng)試驗和動物研究中獲得的數(shù)據(jù)可被用于制定適用于人類使用的劑量范圍。所述治療劑的劑量優(yōu)選地落在包括ED50而幾乎沒有或沒有毒性的循環(huán)濃度范圍中。所述劑量在此范圍中的變化取決于采用的劑型和使用的給藥途徑。對于任何治療劑的應(yīng)用，治療有效劑量可以從細胞培養(yǎng)試驗中進行最初估計。動物模型中的劑量可以達到這樣的循環(huán)血漿濃度，其包括細胞培養(yǎng)中測定的IC50(即，達到對癥狀最大抑制作用的一半的試驗治療劑濃度)。上述信息可以更為精確地確定用于人類的劑量。
所述治療劑的劑量將取決于疾病狀況或治療情況及其他臨床因素，例如人或動物的體重和病情以及化合物的給藥途徑。對于治療人類或動物，可以施予大約0.5毫克/千克到500毫克/千克范圍內(nèi)的治療劑。更優(yōu)選的范圍是大約1毫克/千克到100毫克/千克或從約2毫克/千克到50毫克/千克，最優(yōu)選的范圍是從2毫克/千克到10毫克/千克。取決于所述治療劑在各個具體的動物或人類體內(nèi)的半衰期，所述治療劑可以在每天若干次到每周一次的范圍之間給藥。可以理解，此申請的方法是既適用于人類也可以作為獸醫(yī)學(xué)用途的。本發(fā)明的方法涵蓋了單獨給藥也包括了多次給藥，既可以同時給藥也可以持續(xù)的時段之內(nèi)進行。
當所述肽或其變體或衍生物和鋅一起給藥時，包括在含有所述肽或其變體或衍生物的治療劑組合物中的鋅的濃度在從約0.1到約100毫克/千克/天；約1到約10毫克/千克/天；或約2-5毫克/千克/天。鋅可以以Zn2+或其鹽類的形式給藥。鋅的量的改變?nèi)Q于患者循環(huán)(例如，血液)中鋅的量以及患者的肽給藥量。鋅的必需的量可以通過例如取接受單獨的具體量的肽或連同接受了鋅的患者血樣來確定，然后確定例如如上所述的復(fù)合了鋅的肽的量。
含有治療劑藥物組合物可以是適合于口服用途的形式，例如，藥片、錠劑、菱形錠劑、水狀或油狀的懸浮液、可分散性粉劑或顆粒劑、乳劑、硬質(zhì)或軟質(zhì)膠囊、或糖漿或酏劑。設(shè)計為口服用途組合物可以按照本領(lǐng)域公知的任何生產(chǎn)藥物組合物的方法制備，而且為了提供藥學(xué)上精致可口的制劑，所述組合物還可以含有選自由甜味劑、調(diào)味劑、著色劑以及防腐劑構(gòu)成的組中的一種或多種附加劑。藥片還可以含有活性成分(即，治療劑)與適于藥片生產(chǎn)的無毒的藥學(xué)上可接受的賦形劑的混合物。這些賦形劑可以是例如，惰性稀釋劑，如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；粒化以及崩解劑，如，微晶纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、玉米淀粉、或藻酸；粘合劑，如淀粉、白明膠、聚乙烯吡咯烷酮或阿拉伯膠，以及潤滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。所述藥片可以是不加涂覆的或它們也可以是由公知技術(shù)包衣，用來掩蓋藥物不良味或延遲崩解以及為了有助于胃腸道吸收，從而提供一種更久期限的持續(xù)作用。例如，可以使用水溶性的味道遮蔽材料如羥丙基甲基纖維素或羥丙基纖維素，或者時間延遲材料如乙基纖維素、乙酸-丁酸纖維素。
口服用途的劑型還可以以硬膠囊的形式存在，其中的活性成分混合了惰性固相稀釋劑，例如，碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土，或以軟膠膠囊的形式存在，其中的活性成分混合了水溶性的載體，如，聚乙二醇或油介質(zhì)，例如花生油、液體石蠟、或者橄欖油。
含有活性材料的水懸浮液可以混合適于水懸浮液生產(chǎn)的賦形劑。所述賦形劑是助懸劑，如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍樹膠和阿拉伯樹膠；分散或濕潤劑可以是天然存在的磷脂酰(phosphatide)，例如卵磷脂，或脂肪酸與烯基氧化物的縮合產(chǎn)物，例如聚氧化乙烯硬脂酸鹽，或長鏈脂族醇環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，例如heptadecaethylene-oxycetanol，或來源于脂肪酸和己糖醇的偏酯(partialester)與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物如聚氧化乙烯山梨糖醇一油酸，或來源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，例如聚乙烯單油酸山梨醇酐酯。所述水中懸浮體還可以含有一種或多種防腐劑，例如乙基，或正丙基對羥基苯酸鹽，一種或多種著色劑，一種或多種調(diào)味劑，以及一種或多種甜味劑，如蔗糖、糖精或阿斯巴甜。
油狀懸浮液的配制可以通過將活性成分懸浮在植物油中，例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油，或者懸浮在礦物油中如液體石蠟中進行。所述油狀懸浮液可以含有稠化劑，例如蜂蠟、固體石蠟或鯨蠟醇。還可以加入如上所述的甜味劑以及調(diào)味劑以提供可口的口服制劑。這類組合物可以通過加入抗氧化劑如丁化羥基苯甲醚(butylated hydroxyanisol)或α-生育酚(tocopherol)來進行保存。
適于通過加入水調(diào)制成水懸浮液的可分散性粉劑和顆粒劑提供了活性成分與分散或潤濕劑、助懸劑以及一種或多種防腐劑的混合物。適當?shù)姆稚⒒驖櫇駝┮约爸鷳覄┮呀?jīng)通過如上所述舉例說明。還可以存在其他的賦形劑，例如甜味劑、調(diào)味品以及著色劑。這類組合物可以通過加入抗氧化劑如抗壞血酸來進行保存。
藥物組合物還可以是水包油乳化劑的形式。油相可以是植物油，例如橄欖油或花生油，或者礦物油，例如液體石蠟或者上述的混合物。適當?shù)娜榛瘎┛梢允翘烊淮嬖诘牧字?，例如黃豆卵磷脂，以及來源于脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如單油酸山梨醇酐酯，以及所述偏酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，例如聚氧化乙烯單油酸山梨醇酐酯(polyoxyethylene sorbitanmonooleate)。所述乳劑還可以含有甜味劑、調(diào)味劑、防腐劑和抗氧化劑。
糖漿和酏劑的配制可以利用甜味劑，例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或者蔗糖。所述劑型可以同時含有鎮(zhèn)痛劑、防腐劑、調(diào)味品和著色劑以及抗氧化劑。
藥物組合物還可以是無菌注射水溶液的形式。對于可接受的媒介物(vehicle)和溶劑，可以采用水、林格(Ringer)氏溶液和等滲氯化鈉溶液。
無菌注射制劑還可以是將活性成分溶于油相的無菌注射水包油微乳劑。例如，活性成分可以先溶于豆油和卵磷脂的混合物。然后將油溶液引入水和甘油的混合物中然后加工成微乳化的形式。
注射溶液或者微乳劑可以通過局部的藥團(bolus)注射引入患者的血流當中?？蛇x，為了便于給藥，溶液或微乳劑可以按維持本化合物的恒定循環(huán)濃度的方法給藥。為了維持所述的恒定濃度，可以使用連續(xù)的靜脈注射遞送裝置。所述裝置的一個例子是Deltec CADD-PLUSTM 5400型靜脈注射泵。舉例來說，它可以產(chǎn)生在約100到500納克/毫升、或約200到400納克/毫升或約250-300納克/毫升范圍內(nèi)的治療性肽的血液水平。
所述藥物組合物還可以是經(jīng)肌肉內(nèi)和皮下給藥的無菌注射水狀或油狀懸浮液的形式。這種懸浮液可以按照本領(lǐng)域公知技術(shù)使用如上所述的適當?shù)姆稚┗驖櫇駝┮约爸鷳覄﹣磉M行配制。所述無菌注射制劑還可以是無毒的、位于胃腸外可接受稀釋劑或溶劑例如1，3-丁烷-二醇中的無菌注射溶液或懸浮液。另外，無菌的非揮發(fā)性油也通常作為溶劑或懸浮介質(zhì)。為了這個目的，任何刺激性少的非揮發(fā)性油包括合成的一或二脂酸甘油酯都可以采用。此外，脂肪酸如油酸在所述注射制劑中也可應(yīng)用。
在某些實施方式中，優(yōu)選以局部治療的方法給藥，如通過局部注射給藥。例如，直接注射治療劑到希望抑制血管生成的、顯示過度增生的組織中。在一個實施方式中，治療劑被局部地施予腫瘤床(bed)中。
在一個實施方式中，將治療性肽摻入局部制劑之中。例如，廣泛適用于局部藥物給藥，并且含有本領(lǐng)域公知的任意所述材料的局部載體。所述局部載體可以進行選擇以提供期望形式的組合物，例如，作為軟膏、洗液、乳油、微乳劑、凝膠、油、溶液等等，而且既可以由天然存在的材料組成也可以由合成來源的材料組成。優(yōu)選選出的載體應(yīng)對局部制劑的活性劑或其他的成分均無不利的作用。在此可以使用作為適當局部載體的例子包括水、酒精及其他無毒有機溶劑、甘油、礦物油、硅酮、礦脂(petroleum jelly)、羊毛脂、脂肪酸、植物油、對羥苯甲酸、石蠟等等。劑型可以是無色、無味的軟膏、洗液、乳油、微乳劑以及凝膠劑。
可以將本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種添加劑包括在制劑如局部制劑之內(nèi)。添加劑的例子包括但不限于，增溶劑、皮膚透過增強劑、不透明劑、防腐劑(例如，抗氧化劑)、膠凝(gelling)劑、緩沖劑、表面活性劑(尤其是非電離和兩性表面活性劑)、乳化劑、軟化劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、著色劑、芬芳劑等等。具體優(yōu)選包含增溶劑和/或皮膚透過增強劑，伴有乳化劑、軟化劑和防腐劑。最適宜的局部制劑含有大約2wt％到60wt％，優(yōu)選2wt％到50wt％的增溶劑和/或皮膚透過增強劑；2wt％到50wt％，優(yōu)選2wt％到20wt％的乳化劑；2wt％到20wt％的軟化劑；以及0.01wt％到0.2wt％的防腐劑，活性劑以及載體(例如，水)構(gòu)成為所述制劑的其余部分。
制劑中還可以包括其它活性劑，例如，其它消炎劑、止痛劑、抗微生物劑、抗真菌劑、抗生素、維生素、抗氧化劑、以及防曬劑，它通常發(fā)現(xiàn)于遮光劑成分中，其包括但不限于氨基苯甲酸鹽、二苯甲酮(具體是二苯甲酮-3)、樟腦(camphor)衍生物、肉桂酸鹽(cinnamates)(如，辛基甲氧基肉桂酸鹽(octyl methoxycinnamate))、二苯甲酰甲烷(如，丁基甲氧基二苯甲酰甲烷(butyl methoxydibenzoyl methane))、對氨基苯甲酸(PABA)及其衍生物、以及水楊酸鹽(例如，辛基水楊酸鹽)。
局部制劑還可以被用作預(yù)防性，例如，化學(xué)預(yù)防性組合物。當被用于化學(xué)預(yù)防性的方法時，敏感皮膚在具體個體顯現(xiàn)任何狀況之前進行處理進行治療。
治療劑還可能以經(jīng)直腸施予所述藥物的栓劑形式給藥。這種組合物可以通過將藥物和適當?shù)臒o刺激性賦形劑混合來制備，所述賦形劑在常溫為固體但是在直腸溫度是液態(tài)的，從而在直腸中融化來釋放藥物。這樣的材料包括可可脂、甘油明膠、氫化植物油、各種分子量的聚乙二醇混合物以及聚乙二醇的脂肪酸酯。
對于局部用途，可以使用含有所述治療劑的乳油、軟膏、膠狀物、溶液或懸浮液等等。對本申請來說，局部施用應(yīng)該包括漱口藥以及含漱劑(gargle)。
治療劑可以以通過局部使用適當?shù)谋莾?nèi)媒介物和輸送裝置的方式進行鼻內(nèi)給藥，或通過透皮方法使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的透皮貼片形式給藥。對于以透皮輸送系統(tǒng)形式的給藥，給藥劑量在給藥方案的自始至終將毫無疑問的是持續(xù)而非間斷的。
所述治療性肽可以以維持循環(huán)中恒定濃度的劑量安排進行給藥。它們也可以以治療被周期性中斷例如每日一次藥團注射的劑量安排進行給藥。
可以單獨施予治療性肽或其變體或衍生物?？蛇x，還可以共同施予兩種或更多不同的肽。例如，只施用治療性肽或者還可以共同施予其它血管生成抑制劑，例如美國專利No.5,290,807所述的TNP-470、美國專利No.5,639,725所述的血管抑素(Angiostatin)，內(nèi)皮抑素以及Thalidomide。其它血管生成抑制劑在Genetic Engineering News，Oct.1，1998和美國專利No.6,306,819中都有所描述。
在其它實施方式中，治療劑與所選其它眾所周知的對被治療狀況特別有用的治療劑共同給藥。例如，本治療劑聯(lián)合已知的抗腫瘤和細胞毒素試劑就是十分有用的。類似地，本治療劑聯(lián)合在治療和預(yù)防良性或惡性腫瘤中有效的試劑也是十分有益的。所述治療性試劑可以加入化學(xué)療法、放射療法或者與聯(lián)合免疫療法或疫苗療法聯(lián)用。
能夠與在此所述治療劑共同給藥的藥物包括選自長春花生物堿、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)、蒽環(huán)霉素(anthracycline)、放線菌素D、普卡霉素(plicamycin)、嘌呤霉素、短桿菌肽D、紅豆杉醇(taxd)、秋水仙堿、細胞分裂抑素(cytochalasin)B、吐根堿(emetine)、美登素、或安吖啶(amsacrine)的抗腫瘤藥。
能被用于化療劑(抗腫瘤藥試劑)的化合物種類包括烷化劑，抗代謝物、天然產(chǎn)物和它們的衍生物、激素和類固醇(包括合成的類似物)，以及合成物質(zhì)。這些種類的化合物的例子給出如下。烷化劑(包括氮芥類、氮丙啶衍生物、烷基磺酸鹽、亞硝基脲和三氮烯)尿嘧啶氮芥、氮芥、環(huán)磷酰胺(癌得星CytoxanTM)、異環(huán)磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、雙溴丙基哌嗪、三乙烯三聚氰胺、三乙烯硫代磷胺、白消安、亞硝脲氮芥、環(huán)己亞硝脲、鏈脲霉素、氮烯唑胺，以及替莫唑胺(temozolomide)。抗代謝物(mnetabolite)(包括葉酸對抗劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物和腺苷脫氨酶抑制劑)氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、5-氟脫氧尿苷、阿糖胞苷、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、氟達拉濱磷酸酯、戊糖苷，以及吉西他汀(Gemcitabine)。天然產(chǎn)物和它們的衍生物(包括長春花生物堿、抗腫瘤抗生素、酶、淋巴激活素和表鬼臼毒素)長春花堿、長春新堿、去乙酰長春酰胺、爭光霉素、放線菌素、道諾紅菌素、阿霉素、表柔比星、黃膽素、太平洋紫杉醇(Paclitaxel)(太平洋紫杉醇是市售的紅豆杉醇而且在下文小標題為“微管作用試劑”的分段中會有更詳細地所述)、光神霉素、脫氧柯福霉素、絲裂霉素-C、左旋天冬醯胺、干擾素(具體是干擾素-α)、依托泊甙(etoposide)，以及替尼泊甙(Teniposide)。激素和類固醇(包括合成的類似物)在內(nèi)17.α.-乙炔雌二醇、己烯雌酚、睪丸激素、強的松、氟烴甲基睪丸素、甲雄烷醇酮丙酸鹽、睪內(nèi)酯、甲地孕酮、三苯氧胺、甲基強的松龍、甲基睪甾酮、氫化潑尼松、氟羥脫氫皮醇、氯三芳乙烯、羥孕酮、氨基苯乙哌啶酮、雌氮芥、6α-甲-17-羥孕酮醋酸酯、柳菩林、拂劼璐錠、托瑞米芬、諾雷德。合成物質(zhì)(包括無機復(fù)合體例如鉑配位絡(luò)合物)順氯氨鉑、卡鉑(Carboplatin)、羥基脲、安吖啶、甲基芐肼、米托坦、米托蒽醌、左旋四咪唑，以及六甲三聚氰胺。
大部分這類化療劑的安全而有效的給藥方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。而且，它們的給藥方法在標準文獻中也有所描述。例如，許多化療劑的給藥方法在“Physicians′Desk Reference”(PDR)，e.g.，2004 edition(ThomsonPDR，Montvale，N.J.07645-1742，USA)之中描述。
如果配方作為固定的劑量，所述聯(lián)用產(chǎn)品使用在所述劑量范圍內(nèi)的所述組合以及批準劑量范圍內(nèi)的其他藥學(xué)活化劑。當多重組合配方不恰當時，本發(fā)明的組合還可以與已知的藥學(xué)上可接受的試劑序貫使用。
放射療法也可以用于與在此所述的治療劑進行組合用來治療癌癥，其包括從外部施加的波束或通過植入微小的放射源釋放X射線或γ射線。
當給人類患者施予治療劑時，每日的劑量將通常取決于醫(yī)師根據(jù)年齡、體重、和個體患者的反應(yīng)以及患者癥狀的嚴重程度的不同所規(guī)定的劑量。
在此所述的治療性肽或其類似物可以是同位素標記的或者具有其他用于檢測和顯現(xiàn)內(nèi)皮抑制素結(jié)合部位的分子或蛋白質(zhì)，檢測和顯現(xiàn)內(nèi)皮抑制素結(jié)合部位的現(xiàn)有技術(shù)包括但不限于，正電子發(fā)射斷層掃描(positionemission tomography)、自動射線照相術(shù)(autoradiography)、流式細胞術(shù)、輻射感受器結(jié)合試驗(radioreceptor binding assay)、以及免疫組織化學(xué)。標記的肽或其類似物可以用來探測和定量在體液中的內(nèi)皮抑制素特異性抗體的存在。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將可以理解編碼內(nèi)皮抑制素肽的核酸可以被用于替代在此所述的大多數(shù)具體實施方式
中的肽。例如，可以通過向組織中引入在此所述的編碼肽的核酸來抑制血管生成。核酸可以連接或包含轉(zhuǎn)錄控制元件，例如啟動子或增強子。核酸可以更進一步地包含于載體例如表達載體中。示范性的表達載體包括病毒載體，例如腺病毒以及腺伴隨病毒(AAV)載體。當使用一種非病毒載體時，許多方法都能用于促使核酸進入細胞，例如脂質(zhì)體。
示范性的試劑盒在此還提供了一種試劑盒，例如，治療劑試劑盒。試劑盒可以包括在此所述的治療性的肽以及選擇性地含有所述治療性的肽的給藥裝置。試劑盒還可以包括凍干形式的治療性的肽以及用來溶解所述治療性肽的溶液或緩沖液。試劑盒還可以包含使用說明書。
除非另有陳述，本發(fā)明的實施將使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的細胞生物學(xué)、細胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA以及免疫學(xué)的常見方法。上述的技術(shù)在文獻中均已得到充分的解釋。見，例如，Molecular Cloning A Laboratory Manua1，2nd Ed.，ed.by Sambrook，F(xiàn)ritsch andManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press1989)；DNA Cloning，Volumes Iand II(D.N.Glover ed.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.，1984)；Mullis等美國專利No4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames& S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，APractical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods InEnzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.，1987，Cold Spring HarborLaboratory)；Methods In EnzymologY，Vols.154 and 155(Wu et al.eds.)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；Manipulating theMouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
具體實施例方式在本發(fā)明作了一般性描述的基礎(chǔ)上，現(xiàn)在為了更容易地理解，將通過參考下列實施例來說明，所述實施例僅僅是為了說明本發(fā)明的某些方面和具體實施方式
，并不是為了限定本發(fā)明。
實施例1產(chǎn)生抗腫瘤活性的27氨基酸內(nèi)皮抑制素肽的鑒定合成了來源于小鼠內(nèi)皮抑制素和人內(nèi)皮抑制素兩者的24-27氨基酸的重疊肽(表1)。
表1.重疊的小鼠和人內(nèi)皮抑制素肽名字 序列小鼠肽mP1HTHQDFQPVLHLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO4)；mP2MRGIRGADFQAFQQARAVGLSGTFR(SEQ ID NO136)；mP3TFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRGSV(SEQ ID NO137)；mP4GSVPIVNLKDEVLSPSWDSLFSGSQ(SEQ ID NO138)；mP5GSQGQVQPGARIFSFDGRDVLRHPA(SEQ ID NO139)；mP6HPAWPQKSVWHGSDPSGRRLMESY(SEQ ID NO140)；mP7ETWRTETTGATGQASSLLSGRLLEQ(SEQ ID NO141)；mP8KAASAHNSYIVLAIENSFMTSFSKKK(SEQ ID NO142)。
人肽hP1 1 HSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRG 25(SEQ ID NO6)hP2 23 MRGIRGADFQAFQQARAVGLAGTFR 47(SEQ ID NO143)hP3 45 TFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAV 69(SEQ ID NO144)hP4 67 AAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSE 91(SEQ ID NO145)hP5 89 GSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRttPT 113(SEQ ID NO146)hP6 111 HPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESY 134(SEQ ID NO147)hP7 136 ETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQ 160(SEQ ID NO148)hP8 158 LGQSAASAHHAYIVLAIENSFMTASK 183(SEQ ID NO149)所述肽是內(nèi)皮抑制素全長的大約1/7-1/8的長度。三個半胱氨酸，33，165，173被丙氨酸取代(表1中的下劃線部分)，而且半胱氨酸135被缺失用來防止二硫鍵的形成。兩個額外的賴氨酸被添加在hP8的C末端用來提高它的可溶性(雙下劃線)。除hP2為高濃度(＞2.5mg/ml)時之外，大多數(shù)肽都是水溶性的。并且所有的肽都是大約70％純的。然而，當使用純度超過95％的所述肽時，也并沒有觀察到在腫瘤抑制存在差異。
使用植入SCID小鼠背部皮下的人類胰腺腫瘤細胞BxPC-3細胞進行了這些肽抗腫瘤活性的最初測試。由于自小鼠循環(huán)中的高清除率，對于全身治療，將人類內(nèi)皮抑制素肽P1-P8以7毫克/千克/天、每天兩次的量進行皮下(s.c.)給藥。全長的Fc-內(nèi)皮抑制素hFcES，僅以20毫克/千克/天、每天一次的量進行皮下給藥。PBS則用于作為一組對照。每三天測量腫瘤并且在第28天時進行最終測量，結(jié)果顯示在圖1中(標明了每個條的T/C而且每一組的樣本量n為3)。
內(nèi)皮抑制素N末端hP1肽抑制BxPC-339％(p＝0.077)，而全長的內(nèi)皮抑制素為44％(p＝0.0057)(圖1)。其他兩個肽，hP2和hP5，也顯示了一些較小的抗腫瘤活性，其中hP2抑制BxPC-319％(p＝0.48)，而hP5為29％(p＝0.15)。其他的肽沒有產(chǎn)生效果(圖1)。與全長的內(nèi)皮抑制素相比，大部分抗腫瘤活性都是與N末端hP1肽有關(guān)的。雖然由于每一組中的小鼠樣本量很少(n＝3)，hP1、hP2和hP5的腫瘤抑制并不是呈現(xiàn)統(tǒng)計顯著性，但是這些肽抑制腫瘤的趨勢促進在鼠LLC模型中進一步研究所述肽抑制腫瘤的作用。而且，所述肽和全長的內(nèi)皮抑制素并不是等摩爾濃度的。然而，這些數(shù)據(jù)顯示出內(nèi)皮抑制素的抗腫瘤性質(zhì)可能位于它的N末端區(qū)域中。
內(nèi)皮抑制素N末端27個氨基酸的肽導(dǎo)致了它的抗腫瘤性質(zhì)使用鼠LLC腫瘤模型(O′Reilly et al.(1994)Cell，79315-328)進一步表征這些肽的特性，因為這類腫瘤比BxPC-3細胞生長得更快，從而允許更短的治療周期。合成了內(nèi)皮抑制素肽的鼠類似物。在人肽和鼠肽之間僅有的差異就是鼠P1肽包含27個氨基酸而人P1是25個氨基酸。在上述的實驗中我們僅測試那些顯示抗腫瘤活性的肽(見圖1)。
不同于對BxPC-3的處理，LLC腫瘤是用等摩爾濃度的鼠內(nèi)皮抑制素和鼠肽(mP1、mP2、mP5、和mP6)進行處理的。mP6被用作一種常用的對照肽，因為它沒有抗腫瘤活性(參見圖1)。對照小鼠用PBS進行處理。在這些實驗中，LLC細胞被植入到C5781/6J小鼠背部皮下，然后進行全身治療。肽(mP1、mP2、mP5、和mP6)以2.8/毫克/千克/天、每天兩次的劑量注射(皮下)，而內(nèi)皮抑制素和磷酸緩沖液以20/毫克/千克/天、每天一次的劑量給藥。內(nèi)皮抑制素N末端的mP1肽抑制LLC 44％(p＜0.035)這與全長的內(nèi)皮抑制素的作用相當(53％，p＜0.01)(圖2A；圖中還給出了T/C的值)。使用與mP1肽濃度的相同mP2、mP5和mP6檢測到無或不明顯的活性(圖2A)。因此，這一結(jié)果說明27個氨基酸的mP1肽包含了所有內(nèi)皮抑制素相關(guān)的所有抗腫瘤活性。
為了確定mP1處理之后對血管生成的影響，還分析了經(jīng)過等摩爾濃度的mP1、mP2和內(nèi)皮抑制素處理的LLC腫瘤的血管密度(CD31)。圖2B顯示了經(jīng)過PBS(對照)、Fc-內(nèi)皮抑制素(20/毫克/千克/天)、mP1(2.8/毫克/千克/天)以及mP2(2.8/毫克/千克/天)處理后的小鼠LLC切片的CD31染色。在所有情況下，所述肽以每天兩次皮下進行給藥，然后將從第13天開始，對LLC腫瘤切片進行福爾馬林-固定與石蠟-包埋，然后用CD31(PECAM)染色。圖2C顯示了血管密度的測定，Y軸表示為％CD31/高倍視野(hpf)。經(jīng)mP1和內(nèi)皮抑制素處理的LLC血管密度顯著地降低(大約65％，p＜0.015)，而mP2和PBS沒有效果。mP5和mP6的處理顯示了與mp2處理相似的結(jié)果。這些結(jié)果說明mP1可以以與全長內(nèi)皮抑制素相似的方式通過降低血管密度來抑制LLC腫瘤生長。
在內(nèi)皮抑制素位置1和3的組氨酸對于鋅結(jié)合是重要的內(nèi)皮抑制素的晶體結(jié)構(gòu)顯示出高度折疊的分子(圖2D)。但是，N末端區(qū)域是類似無規(guī)卷曲的結(jié)構(gòu)，這符合我們關(guān)于對應(yīng)這個區(qū)域的合成肽可模擬天然分子的分析(圖2D)。
由于內(nèi)皮抑制素N末端區(qū)域?qū)е滤目鼓[瘤活性，于是我們想進一步研究mP1肽。鋅原子與每個內(nèi)皮抑制素分子都有關(guān)(Ding et al.(1998)ProcNatl Acad Sci USA，9510443-10448)?；谖覀兊木w結(jié)構(gòu)分析，處于位置1、3和11的三個組氨酸加上處于位置76的丁氨二酸為鋅原子構(gòu)成了四個配位物(coordinate)(Ding et al.(1998)Proc Natl Acad Sci USA，9510443-10448)。mP1包含了如上所述的三個組氨酸。這產(chǎn)生了所述肽能夠通過由一個水分子占領(lǐng)第四個配位物而結(jié)合鋅的可能性(圖3A，左圖)。過去已經(jīng)顯示了組氨酸1和3的突變破壞內(nèi)皮抑制素與鋅的結(jié)合(Boehm et al.(1998)Biochem Biophys Res Commun，252190-194)。因此，合成了將mP1肽位置1和3的組氨酸突變?yōu)楸彼岬耐蛔凅w。這種突變肽叫做mP1-H1/3A(也可以叫做mP1-H)，并具有下列氨基酸序列ATAQDFQPVIHLVALNTPLSGGMRGIR(SEQ ID NO150)。mP1和mP1-H1/3A的序列在圖3A中也表明。
為了確定mP1和mP1-H1/3A的鋅結(jié)合力，進行了燃燒原子吸收實驗(flame atomic absorption)。將兩種肽溶于20mM，pH為8.0的Tris溶液，其濃度為0.5mg/ml，混合過量的氯化鋅(1mM)，然后在透析溶液中用上述緩沖液進行72小時的透析，其間換液三次(截留分子量(MWCO)＝1000kDa；所述肽的分子量認為是3000kDa)。最終確定終鋅濃度的原子吸收讀數(shù)(μg/ml)，mP1和mP1-H1/3A分別為9.63和1.05。這些數(shù)據(jù)顯示鋅的比率對于每分子mP1-H1/3A為0.1而對于每分子mP1為0.9(圖3B)。因此，在位置1和3的組氨酸突變?yōu)楸彼嵯虽\的結(jié)合(圖3A，右圖)。
內(nèi)皮抑制素的鋅結(jié)合區(qū)域?qū)λ目鼓[瘤活性是重要的利用LLC腫瘤模型檢測mP1和mP1-H1/3A，確定鋅結(jié)合對于內(nèi)皮抑制素的抗腫瘤性質(zhì)是否同樣重要。肽以2.8/毫克/千克/天、每天兩次的劑量進行給藥(皮下)。肽mP1對LLC的抑制為42％(p＝0.031)，而mP1-H1/3A則沒有效果(圖3C)。在經(jīng)過mP1和mP1-H1/3A處理之后分析LLC腫瘤的血管密度(CD31)，確定血管生成是否存在差異。在mP1處理之后血管密度出現(xiàn)了相當大的降低(降低67％，p＜0.01)，而mP1-H1/3A的結(jié)果與PBS的結(jié)果類似(圖3D和3E)。這些數(shù)據(jù)說明鋅的結(jié)合對于內(nèi)皮抑制素的抗腫瘤性質(zhì)是重要的。統(tǒng)計分析中應(yīng)用了不成對的Student t檢驗。
其他處理包括皮下注射mP1-H肽和1mM的Zn2+；皮下單獨注射mP1肽或同時還注射1mM的Zn2+；或者皮下注射PBS(圖4)。圖3和4顯現(xiàn)的結(jié)果表明給藥其中組氨酸1和3轉(zhuǎn)換為丙氨酸的mP1-H1/3A基本上沒有影響腫瘤體積，因為其腫瘤質(zhì)量與注射PBS(陰性對照)獲得的結(jié)果相似。
因此，這些結(jié)果表明處于內(nèi)皮抑制素肽N末端位置1和3的組氨酸不能被丙氨酸取代，而且它們與另一個氨基酸的置換也可能會降低或消除所述肽的抗腫瘤作用。這個結(jié)果進一步表明含有所述肽的組合物中包括鋅也許是有益的，除非循環(huán)中已經(jīng)有鋅存在。
內(nèi)皮抑制素的N末端片段保留它抑制內(nèi)皮細胞遷移的能力檢測了內(nèi)皮抑制素肽的抗內(nèi)皮細胞遷移活性。使用若干種劑量的內(nèi)皮抑制素肽確定對人微脈管內(nèi)皮細胞(HMVECs)的VEGF誘導(dǎo)遷移的抑制(圖5)。使用人肽是由于所述細胞是人源的，HMVEC的遷移反應(yīng)使用經(jīng)修飾的Boyden小室進行分析。使用VEGF(5ng/ml)作為趨化劑，細胞由人內(nèi)皮抑制素(Entremed；EM-ES)、人Fc-內(nèi)皮抑制素(nFcES)、人P1(hP1)、人P2(hP2)、人P6(hP6)以及人P1-H1/3A(hP1-H1/3A)攻擊。利用Scion圖像軟件(NationalInstitutes of Health)可以從捕捉的圖像中測量每一層膜的遷移總數(shù)，而且統(tǒng)計分析中還應(yīng)用了不成對的Student t檢驗。人重組內(nèi)皮抑制素(Entremed)在500和200ng/ml(30％)而不是100ng/ml抑制內(nèi)皮細胞遷移，而人Fc-內(nèi)皮抑制素產(chǎn)生同樣的抑制是在500和100ng/ml(25-30％)的濃度之間(圖5)。有趣的是，觀察到在100ng/ml的Fc-內(nèi)皮抑制素和200ng/ml的內(nèi)皮抑制素(Entremed)對內(nèi)皮細胞遷移的抑制稍好于更高濃度的情況，這說明了內(nèi)皮抑制素反應(yīng)的U形分布。hP1最好的抑制作用是在100、62.5和25ng/ml時。在這些濃度之間沒有觀察到明顯的差別。在升高或降低的濃度中則觀察到降低的或無抑制作用。在hP1為500ng/ml時觀察不到抑制作用。因此，與全長的內(nèi)皮抑制素相似，hP1對內(nèi)皮細胞遷移的抑制作用也存在U形反應(yīng)。內(nèi)皮抑制素hP2肽即使在較高的濃度也根本沒有效果。然而，hP6卻在比hP1更高的濃度抑制內(nèi)皮細胞遷移，在濃度低于100ng/ml時觀察不到抑制作用。
還檢測了hP1-H1/3A，確定鋅結(jié)合對于抗內(nèi)皮細胞遷移活性是否重要。這些突變體肽在200和100ng/ml濃度時確實顯示了一些微小的抑制作用。但是，這些抑制作用在統(tǒng)計上是不顯著的。因此，肽hP1可以在與全長內(nèi)皮抑制素或人內(nèi)皮抑制素(EntreMed)(200ng/ml)等摩爾濃度(25ng/ml)的情況下抑制VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞遷移，而hP6僅在100和200ng/ml的劑量出現(xiàn)抑制。有趣的是，hP1在抑制內(nèi)皮細胞遷移方面比全長的內(nèi)皮抑制素更有效。這種結(jié)果說明內(nèi)皮抑制素N末端的P1肽保持了抑制VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞遷移的能力，而鋅結(jié)合部位是這種活性的關(guān)鍵。
內(nèi)皮抑制素肽的抗?jié)B透性活性也利用Miles試驗(Miles and Miles(1952)J Physiol，118228-257)檢測了內(nèi)皮抑素肽抑制VEGF誘導(dǎo)的滲透性的能力。以前利用Miles試驗已經(jīng)顯示了內(nèi)皮抑制素可抑制VEGF誘導(dǎo)的滲透性。在進行Miles試驗5天以前對免疫損傷的SCID小鼠進行處理。具體地說，對SCID小鼠皮下注射(s.c.；每天兩次)100毫克/千克/天劑量的人內(nèi)皮抑制素(EntreMed；EM-ES)；20毫克/千克/天劑量的鼠Fc-內(nèi)皮抑制素；2.8毫克/千克/天或14毫克/千克/天劑量的鼠內(nèi)皮抑制素肽mP1和mP1-H1/3A；或者PBS(樣本數(shù)為3)，持續(xù)5天。在高劑量(14毫克/千克/天)時，mP1和mP1-H1/3A對VEGF誘導(dǎo)的滲透性的抑制作用與人內(nèi)皮抑制素(EntreMed)和鼠Fc-內(nèi)皮抑制素相當(圖6)。然而，當使用等摩爾濃度(2.8毫克/千克/天)時也獲得了相似的結(jié)果(圖6)。由于甚至在等摩爾濃度時mP1-H1/3A也顯示了與mP1相同的抑制作用，這說明抗腫瘤活性和抗?jié)B透性活性是分開的。
來源于mP1的更小的肽也顯示出抑制腫瘤生長的作用。利用LLC腫瘤模型測定了兩種肽，mP1-15(SEQ ID NO118)和mP1-20(SEQ ID NO108)的抗腫瘤活性。以2.8毫克/千克/天的劑量在第4、7、10和14天用所述肽每天兩次進行皮下給藥。PBS作為對照。圖7顯示了mP1-15和mP1-20均有抑制腫瘤體積的作用(標明了T/C而且每一組的樣本量n為5)。
因此，我們顯示相當于內(nèi)皮抑制素的N末端的合成肽，決定著它的抗腫瘤、抗遷移以及抗?jié)B透性活性。鋅的結(jié)合是所述抗腫瘤和抗遷移活性需要的，因為在所述肽中氨基酸位置1和3上兩個組氨酸的置換會完全地阻斷它的性質(zhì)。然而，對于抗?jié)B透性性質(zhì)來說鋅的結(jié)合是不需要的。
內(nèi)皮抑制素抑制腫瘤形成對于結(jié)合鋅的需要已經(jīng)引起爭論，從不同的組中報告了沖突的結(jié)果(Boehm et al.(1998)Biochem Biophys Res Commun，252190-194；Yamaguchi et al.(1999)Embo J，184414-4423；Sim et al.(1999)Angiogenesis，341-51)。然而，最早的報告顯示由丙氨酸對組氨酸1和3的取代阻斷了內(nèi)皮抑制素在LLC中的抑制效果(Boehm et al.(1998)BiochemBiophys Res Commun，252190-194)，兩個在后的出版物則挑戰(zhàn)了這一發(fā)現(xiàn)(Yamaguchi et al.(1999)Embo J，184414-4423；Sim et al.(1999)Angiogenesis，341-51)。在其中一個上述報告中，通過在C末端和N末端都刪除5個氨基酸而制備成內(nèi)皮抑制素突變體(Yamaguchi et al.(1999)Embo J，184414-4423)。這種構(gòu)建體得到了與全長的內(nèi)皮抑制素相似的抗腫瘤活性。然而，在使用腎Rc-9癌腫瘤模型中，當腫瘤大小為300立方毫米時開始進行內(nèi)皮抑制素給藥，這樣持續(xù)僅4天后，腫瘤大小達到了500立方毫米。注射部位是在腫瘤的周圍，注射劑量為10微克/千克/天。與此相反，在我們的實驗中，當LLC腫瘤到達約100立方毫米大小的開始進行治療處理，一直持續(xù)到腫瘤成為約6000-7000立方毫米。而且，我們進行全身治療處理而不是注射到腫瘤的外周組織中。
另一個涉及內(nèi)皮抑制素抗腫瘤活性與結(jié)合鋅的關(guān)聯(lián)性的出版物，證明從人內(nèi)皮抑制素N末端除去4個氨基酸的“HSHR”并未影響它的抗腫瘤活性(Sim et al.(1999)Angiogenesis，341-51)。鋅結(jié)合的測定顯示這種突變體結(jié)合2原子的鋅每分子內(nèi)皮抑制素，而其野生型結(jié)合10原子的鋅每個內(nèi)皮抑制素分子。然而，在我們的內(nèi)皮抑制素晶體結(jié)構(gòu)研究中，我們已經(jīng)證明那些用于結(jié)晶研究的內(nèi)皮抑制素含有1原子鋅/內(nèi)皮抑制素分子而除去N末端4個氨基酸的“HSHR”會缺乏鋅的結(jié)合(Ding et al.(1998)Proc Natl Acad SciUSA，9510443-10448)。
內(nèi)皮抑制素是通過蛋白水解裂解膠原18生成的(O′Reilly et al.(1997)Cell，88277-285；Wen et al.(1999)Cancer Res，596052-6056；Felbor et al.(2000)Embo J，191187-1194)。內(nèi)皮抑制素N末端的第一個氨基酸是組氨酸。組氨酸存在對于鋅結(jié)合內(nèi)皮抑制素是重要的。因此，引導(dǎo)我們可以推斷出膠原18到內(nèi)皮抑制素的加工過程中可能是受到高度調(diào)節(jié)的。
一些組顯示出來源于內(nèi)皮抑素的肽具有抗血管生成作用(Wickstrom etal.(2004)J Biol Chem，27920178-20185；Cattaneo et al.(2003)Exp Cell Res，283230-236；Chillemi et al.(2003)J Med Chem，464165-4172；Morbidelli etal.(2003)Clin Cancer Res，95358-5369；Cho et al.(2004)Oncol Rep，11191-195)。含有氨基酸6-49的N末端肽(缺少鋅結(jié)合型組氨酸)能夠抑制內(nèi)皮細胞的增生和遷移(Cattaneo et al.(2003)Exp Cell Res，283230-236；Chillemi et al.(2003)J Med Chem，464165-4172)。使用這種肽進行的Matrigel試驗得到在體內(nèi)具有血管生成抑制作用的結(jié)果。但是，并無抗癌的數(shù)據(jù)。在另一個研究中，保留了Cys135-Cys165二硫鍵的C末端肽(氨基酸135-184)顯示其具有抗腫瘤活性(Morbidelli et al.(2003)Clin Cancer Res，95358-5369)。然而，所述肽是在腫瘤周圍給藥而不是全身給藥的。Cho等顯示了包括鋅結(jié)合位點的N末端并不需要內(nèi)皮抑素的C末端就具有抗腫瘤活性(Cho et al.(2004)Oncol Rep，11191-195)。然而，這種肽和全長的內(nèi)皮抑素并不是在等摩爾濃度下進行試驗的。我們的結(jié)果與這些組的不同之處在于P1肽可以在與全長內(nèi)皮抑素等摩爾濃度的條件下抑制腫瘤的形成、遷移和滲透性。此外，較高濃度(14毫克/千克/天)的mP2以及2.8毫克/千克/天的mP1，可以抑制LLC腫瘤的形成。然而，14毫克/千克/天的mP1對LLC腫瘤形成的抑制作用小于2.8毫克/千克/天的情況。因此，內(nèi)皮抑素的抗腫瘤活性作為所述蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)似乎是U形曲線。在使用胰腺BxPC-3和ASPC-1腫瘤模型對全長的內(nèi)皮抑素進行實驗時觀察到了類似的結(jié)果。所以，最適宜內(nèi)皮抑素濃度的確定可能是重要因素。內(nèi)皮抑素的體外試驗也顯示出類似的二相性特性曲線，例如在遷移試驗中觀察到的那樣(參見圖5)。
全長的內(nèi)皮抑素并不是它的抗腫瘤活性所需的事實解釋了最初內(nèi)皮抑素活性的不一致性。內(nèi)皮抑素具有兩個二硫鍵。大腸桿菌制劑中的內(nèi)皮抑素聚集體是由于PBS透析后的隨機的分子間二硫化物所引起的。然而，在還原條件下，內(nèi)皮抑素顯示為單個的蛋白質(zhì)分子，在非還原條件下，同一樣品中的大部分蛋白都不會進入聚丙烯酰胺凝膠。非特異性的聚集體存在的程度很可能是一些制劑缺乏活性的原因。在一段時間以后內(nèi)皮抑素很可能從動物體內(nèi)的聚集體中釋放出來，從而產(chǎn)生變性蛋白或部分片段，其由于它們的N末端肽而能夠顯示抗腫瘤性質(zhì)。推測起來，一些制劑產(chǎn)生了更大的聚集體，使得釋放效率降低而得到在小鼠體內(nèi)并不會引起抗血管生成反應(yīng)的產(chǎn)品。
什么是內(nèi)皮抑素抗腫瘤活性的基礎(chǔ)呢？已經(jīng)提出了很多機理。其中一個更詳細的研究是內(nèi)皮抑素與整聯(lián)蛋白α5β1的結(jié)合(Wickstrom et al.(2002)Cancer Res，625580-5589)?；谶@些作者的發(fā)現(xiàn)，一些細胞表面蛋白的裝配以及包括α5β1的成分負責(zé)內(nèi)皮抑素和這種整聯(lián)蛋白的互相作用(Wickstrom et al.(2003)J Biol Chem，27837895-37901)。然而，不存在抗腫瘤數(shù)據(jù)來證實上述機理。近年來，相同的作者顯示了來源于含有精氨酸的內(nèi)皮抑素的11氨基酸肽，還顯示出與肝素的結(jié)合負責(zé)內(nèi)皮抑素的抗血管生成活性(Wickstrom et al.(2004)J Biol Chem，27920178-20185)。我們推測研究者們觀察到的那些現(xiàn)象反映了內(nèi)皮抑素與肝素結(jié)合特征相關(guān)的一些性質(zhì)，而不是它的抗腫瘤活性。以前，我們報道了內(nèi)皮抑素與肝素的結(jié)合的破壞(通過在突變蛋白質(zhì)表面上兩個不連續(xù)的精氨酸實現(xiàn))阻遏了細胞運動性(Kuo et al.(2001)J Cell Biol，1521233-1246)。此外，我們的內(nèi)皮抑素hP3肽(參見表1)，其含有作者報告過的肽，并不能抑制腫瘤生長。
材料和方法細胞培養(yǎng)物和化學(xué)試劑人BxPC-3胰腺癌和Lewis肺癌(LLC)細胞的生長和保存如以前描述(Kisker et al.(2001)Cancer Res，617669-7674；O′Reilly et al.(1994)Cell，79315-328)。為了BxPC-3腫瘤細胞的注射，細胞生長在900-cm2的滾軸(roller)瓶中。人微脈管內(nèi)皮細胞(HMVEC-d；Clonetics，Walkersville，MD)培養(yǎng)在微脈管內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基中(EGM-2MV；Clonetics)，并且保存在5％CO2、37℃的加濕恒溫箱中。重組體人內(nèi)皮抑素是EntreMed公司(Rockville，MD)的慷慨的贈品而重組體人和鼠的Fc-內(nèi)皮抑素是如同以前的描述制備而成的(Bergers et al.(1999)Science，284808-812)。人和鼠的內(nèi)皮抑素肽是由SynPep公司合成的(Dublin，CA)。所述肽再懸浮于PBS或50mM Tris、150mM NaCl，pH為7.5中。PECAM、純化的大鼠抗小鼠CD31是從BDPharmingen(San Diego，CA)獲得的，人重組體VEGF是從NIH(Bethesda，MD)獲得。
動物研究所有的動物實驗操作都是遵照波士頓兒童醫(yī)院(Boston Children′sHospital)的指南進行的，而且草案都是經(jīng)過動物保護和使用制度委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)批準的。使用了雄性(24-27克)具有免疫能力的C57B1/6J小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)和免疫受損的SCID小鼠(Massachusetts General Hospital，Boston，MA)。小鼠年齡為7-9周大小。它們是馴化的，五個一組關(guān)在有柵欄保護裝置的籠中，并且用不限量的動物食物以及水進行喂養(yǎng)。在進行所有外科手術(shù)操作之前都通過吸入異氟烷(Baxter，Deerfield，IL)對動物進行麻醉并且觀察直到完全恢復(fù)。通過一種致死量的CO2窒息對動物進行安樂死。
腫瘤模型BxPC-3和LLC細胞生長在如上所述的細胞培養(yǎng)物中。細胞濃度調(diào)節(jié)在50×106細胞/毫升。在注射腫瘤細胞之前，小鼠進行了剃毛并且背部的皮膚用乙醇進行清洗。將5×106腫瘤細胞在0.1毫升RPMI-1640(對于BxPC-3)或DMEM(對于LLC)中的懸浮液經(jīng)皮下(s.c.)注射到小鼠背部鄰近中線的部位。將BxPC-3細胞植入SCID小鼠而LLC植入C57B1/6J小鼠。
具有Lewis肺癌(600-800立方毫米腫瘤)的動物進行安樂死，并且覆蓋腫瘤的皮膚用聚維酮碘(Betadine)和乙醇清洗。腫瘤組織在無菌狀態(tài)下切除。腫瘤細胞在0.9％生理鹽水中的懸浮液通過使有活力的腫瘤組織通過濾網(wǎng)和一系列依次變小的、直徑22-到30-規(guī)格的皮下注射針頭來制備。調(diào)節(jié)最終濃度到1×107細胞/毫升，然后將懸浮液置于冰上。腫瘤細胞的注射操作如上所述。
稱量小鼠重量并且每3-5天用一個刻度卡尺測量腫瘤的兩處直徑。體積用公式a2×b×0.52來確定(其中a是最短的直徑而b是最長的直徑)。數(shù)據(jù)表示為治療的腫瘤相對于對照的體積(T/C)。在各個實驗完成以后，對小鼠實施CO2窒息的安樂死。腫瘤在10％緩沖福爾馬林(Fisher Scientific，F(xiàn)airLawn，NJ)中固定然后進行石蠟包埋。
為了治療攜帶腫瘤小鼠，允許腫瘤體積生長到大約100立方毫米，而且小鼠是隨機化的。通過皮下單次藥團注射的方式進行治療。所述肽每天兩次(每12小時)進行給藥。所述肽的劑量相對于所述肽的純度(大約70％)進行校正。例如，給小鼠注射4毫克/千克/天的所述肽經(jīng)過校正之后實際上是注射了2.8毫克/千克/天。統(tǒng)計分析用到了不成對的Studentt-測驗。
免疫組織化學(xué)將腫瘤在4℃的10％緩沖福爾馬林中固定過夜。第二天，將腫瘤在PBS中洗滌三次然后進行石蠟包埋。用40μg/ml的蛋白酶K(Roche DiagnosticsCorp.)在0.2M Tris-HCl緩沖液(pH7.6)中，于37℃對切片(5μm)進行可滲透化處理25分鐘然后用PBS洗滌。PECAM(1∶250)在4℃過夜保溫。染色通過使用酪胺(tyramide)信號放大直接和間接試劑盒(NEN Life ScienceProducts Inc.，Boston，MA)增強。使用NIKON TE300顯微鏡在400x放大下對切片進行照像。血管密度(三處平均)由IPLab軟件來確定。統(tǒng)計分析用到了不成對的Studentt-測驗。
細胞遷移試驗使用改良的Boyden小室測定HMVEC-d細胞的運動性反應(yīng)。在遷移試驗之前將細胞以0.5×106細胞每燒瓶的濃度平鋪在T75-cm2燒瓶中，生長48小時(～70％融合的)。為便于細胞粘著，37℃在transwell(8mm氣孔；Costar)的上層膜用纖粘連蛋白涂布1小時。涂布后的膜用PBS沖洗然后風(fēng)干立即使用。用胰蛋白酶處理脫離的細胞，用胰酶化的中和溶液(Clonetics)處理，然后在含有0.1％BSA的無血清內(nèi)皮基本培養(yǎng)基(EBM；Clonetics)中以終濃度1×106細胞/毫升重懸浮。然后用0.2毫升含有注明濃度的內(nèi)皮抑素或肽的EBM/BSA處理細胞(200,000，在0.2毫升中)。細胞在37℃不定期振蕩培養(yǎng)20分鐘。在transwell的上方小室中加入細胞(50,000在100μl中)。在下方小室中加入EBM或添加了VEGF(5ng/ml)的EBM，然后在含有5％CO2的加濕恒溫箱中讓細胞向底部小室遷移4小時。用PBS潤洗transwell過濾物一次然后利用Diff-Quik染色試劑盒(Baxter)按照廠商的規(guī)程進行固定和染色。用棉拭將非遷移的細胞從上方小室中去除。將染色的濾紙從小室中剪出并使用Permount(Fisher)覆于載玻片上。利用顯微鏡計數(shù)遷移細胞的數(shù)目(利用40x物鏡從每個膜的三個視野獲得)，而且還可以利用SPOT軟件由CCD攝像機捕獲影象。每片薄膜的總遷移數(shù)由Scion Image軟件(NationalInstitutes of Health)捕獲的影象來定量。所有的實驗均一式三份進行。統(tǒng)計分析用到了不成對的Studentt-測驗。
Miles血管通透性試驗(Miles試驗)在進行Miles試驗(25)之前，對SCID小鼠皮下(s.c.)注射人內(nèi)皮抑素(EntreMed；100毫克/千克/天)、鼠Fc-內(nèi)皮抑素(20毫克/千克/天)、肽(14毫克/千克/天或2.8毫克/千克/天)以及鹽(200μl)(n＝12)，持續(xù)5天。簡要地，Evan氏藍染料(100μl的1％PBS溶液)經(jīng)靜脈注射(i.v.)到小鼠體內(nèi)。經(jīng)過10分鐘后，皮內(nèi)注射50μl的人重組體VEGF(1ng/μl)或者PBS到預(yù)前剃好毛的背部皮內(nèi)。20分鐘之后對動物進行安樂死，然后去掉包括由染料滲漏引起的藍斑的皮膚區(qū)域。用甲酰胺在室溫保溫5天提取出Evan氏藍染料，然后用分光光度計在620納米測定提取的染料的吸光率。統(tǒng)計分析用到了不成對的Studentt-測驗。
統(tǒng)計方法表示為平均數(shù)的數(shù)據(jù)+標準偏差。利用Student t檢驗評價統(tǒng)計顯著性。P＜0.05就認為是統(tǒng)計上顯著的。
參考文獻的并入所有引用過的參考文獻中的內(nèi)容(包括本申請一直引用的參考文獻書目、GenBank登錄號、公布的專利、公開的專利申請)在此都明確地并入以供參考。
等同方案本領(lǐng)域技術(shù)人員僅僅利用常規(guī)實驗就可以認定或能夠探知本發(fā)明描述的具體實施方式
的許多等同方案。所述等同方案旨在包含在權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
1.抗血管生成肽，它包含SEQ ID No.2或4的約12個氨基酸或由SEQ IDNo.2或4的約12個氨基酸組成。
2.權(quán)利要求1所述的抗血管生成肽，它包含SEQ ID No.2或4的約15個氨基酸或由SEQ ID No.2或4的約15個氨基酸組成。
3.權(quán)利要求2所述的抗血管生成肽，它包含SEQ ID No.2或4的約18個氨基酸或由SEQ ID No.2或4的約18個氨基酸組成。
4.權(quán)利要求1所述的抗血管生成肽，其為選自下組的序列SEQ ID No.6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，125，126，127，128，129，130或131。
5.權(quán)利要求1所述的抗血管生成肽，它是SEQ ID No.2或4。
6.藥物組合物，它含有藥學(xué)上可接受的載體和有效量的權(quán)利要求1所述的抗血管生成肽。
7.權(quán)利要求6所述的藥物組合物，它還另外含有第二種肽。
8.權(quán)利要求6所述的藥物組合物，它還另外含有有效量的鋅。
9.權(quán)利要求6所述的藥物組合物， 其中所述抗血管生成肽是SEQ IDNo.2或4。
10.核酸，它編碼權(quán)利要求1所述的抗血管生成肽。
11.核酸，它包含SEQ ID No.1、3或5的約36個核苷酸或由SEQ ID No.1、3或5的約36個核苷酸組成。
12.核酸，它包含SEQ ID No.1、3或5的約60個核苷酸或由SEQ ID No.1、3或5的約60個核苷酸組成。
13.權(quán)利要求10所述的核酸，其為選自下組的序列SEQ ID No.1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121或123。
14.載體，它含有權(quán)利要求10所述的核酸。
15.藥物組合物，它含有權(quán)利要求14所述的載體和藥學(xué)上可接受的載體。
16.治療或預(yù)防受試者中的血管生成相關(guān)疾病的方法，包括給藥受試者權(quán)利要求5所述的藥物組合物。
17.治療或預(yù)防受試者中的血管生成相關(guān)疾病的方法，包括給藥受試者權(quán)利要求8所述的藥物組合物。
18.治療或預(yù)防受試者中的血管生成相關(guān)疾病的方法，包括給藥受試者權(quán)利要求9所述的藥物組合物。
19.治療或預(yù)防受試者中的血管生成相關(guān)疾病的方法，包括給藥受試者權(quán)利要求15所述的藥物組合物。
20.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的血管生成相關(guān)疾病是選自下組的疾病動脈粥樣硬化，血管瘤，實體腫瘤，白血病，轉(zhuǎn)移，毛細血管擴張牛皮癬硬皮病，膿性肉芽腫，心肌血管生成，動脈粥樣斑新血管化，冠狀動脈側(cè)支形成，大腦側(cè)支形成，動靜脈畸形、缺血性四肢血管生成，角膜疾病，虹膜潮紅，新生血管性青光眼，糖尿病性視網(wǎng)膜病，晶狀體后纖維組織形成，關(guān)節(jié)炎，糖尿病性新血管化，黃斑變性，傷口愈合，胃潰瘍，骨折，瘢痕瘤，類天皰瘡(phemphigoid)，沙眼，血管發(fā)生和造血作用。
全文摘要
在此提供一種含有內(nèi)皮抑素N末端的抗血管生成肽，編碼它的核酸、含有有效量所述肽及核酸的藥物制劑以及所述藥物在治療或防止與不良血管生成相關(guān)的疾病或病癥中的用途。
文檔編號C12N15/11GK1875104SQ200480032121
公開日2006年12月6日 申請日期2004年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月29日
發(fā)明者朱達·福爾克曼, 卡什·賈瓦赫里安, 羅伯特·T·T·斯金 申請人:兒童醫(yī)學(xué)中心公司