專利名稱：可溶性分析物的檢測和擴增的制作方法
技術領域：
本發(fā)明通常涉及化合物檢測的領域，尤其是檢測化合物的方法和檢測化合物的試劑盒。
背景技術：
過去15年以來，在患者血清中檢測對病原生物的免疫應答或檢測病原體相關蛋白或其它抗原，極大的得益于免疫測定法的發(fā)展。在一種形式的免疫測定中，使用識別其它物種免疫球蛋白的單克隆或多克隆抗體。這些試劑，被稱為抗物種抗體，典型地使用熒光染料或酶標記它們，用于通過免疫血清中發(fā)現的免疫球蛋白檢測結合的抗原。在另一種形式的被稱為夾心測定的免疫測定中，定向作用病原蛋白的抗體用于從例如患者血清或腦脊液(CSF)中捕獲抗原，然后通過結合另外定向作用相同抗原的標記抗體而進行檢測。然而，所有這些測定受檢測結合免疫球蛋白的靈敏度限制，并需要相當高摩爾濃度的標記試劑。
最近的測定法利用了核酸擴增的方法，例如用于DNA擴增的聚合酶鏈反應(PCR)，以檢測非常低水平的核酸。核酸擴增方法可允許以遠低于免疫測定法的水平檢測血清或環(huán)境中的病理因子。然而，這項技術對來自環(huán)境的污染通常非常敏感，并且為了鑒定核酸部分并擴增其用于檢測需要目標核酸序列的現有知識。核酸擴增需要有核酸存在以進行擴增和檢測，因此當目標化合物為蛋白、碳水化合物或其它非核酸分子時，不能利用或用途有限。此外，希望改進樣品中化合物檢測的效果和敏感度，本發(fā)明解決了存在的問題，提供了相關的益處。
發(fā)明概述在本申請書引用了各種出版物。這些出版物的公開內容通過引用整體結合到本申請書中。這些文獻的引用并不有意承認它們的任何一項是有關的現有技術。所有關于這些文獻內容的數據或陳述的說明都基于可獲自申請人的信息，不構成任何承認這些數據和文獻內容的正確性。
本發(fā)明涉及檢測可低水平存在于樣品中的目標化合物的方法。具體而言，本發(fā)明涉及通過結合目標化合物的核酸標記的結合構建物、分離未結合的核酸標記的結合構建物、以及檢測溶液相中結合的核酸標記的結合構建物，檢測溶液中目標化合物的方法。本發(fā)明尤其適用于與核酸擴增方法聯合使用，檢測樣品中是否存在結合構建物的核酸部分，因此表明是否存在目標化合物。
本發(fā)明認識到，通過從溶液中分離沒有結合目標化合物的任何過量或未結合的結合構建物，因此增加了真“陽性”信號與假“陽性”信號之比，可使化合物的檢測方法更靈敏，并因此更有效。本發(fā)明還提供了通用的檢測系統(tǒng)，其不需要固相捕捉或檢測目標化合物。當目標化合物包括非核酸分子如肽或蛋白時，本發(fā)明的方法還具有不需要編碼目標肽或蛋白的核酸序列現有知識以鑒定它和使用DNA擴增進行檢測的優(yōu)點。
本發(fā)明的第一個方面是檢測樣品中的目標化合物的方法，包括使用結合構建物。該結合構建物包括識別和結合目標化合物的識別部分和核酸部分。當該結合構建物與樣品混合時，該識別部分與目標化合物結合，形成構建物-化合物復合物。本發(fā)明也包括具有一個或多個可接近結合靶位的表面，該可接近結合靶位能結合結合構建物的識別部分。當表面與樣品混合物接觸時，該表面的可接近結合靶位與任何過量的或未結合的結合構建物結合，形成構建物-表面復合物。經充分孵育之后，從混合物中分離構建物-表面復合物與任何未結合或過量的表面，在溶液中留下構建物-化合物復合物。經分離之后，分析溶液以檢測是否存在結合構建物的核酸部分，其中存在結合構建物的核酸部分表明樣品中存在目標化合物。
本發(fā)明的第二個方面是增加液相檢測樣品中目標化合物的靈敏度。本方法包括提供懷疑含有目標化合物的樣品；提供包括能結合目標化合物的識別部分和核酸部分的結合構建物；將樣品與結合構建物接觸一段時間，該時間足以允許識別部分結合樣品中的任何目標化合物，因此在溶液中形成構建物-化合物復合物。本方法還包括提供一種或多種具有可接近結合靶位的表面，該結合靶位能結合識別部分；將該表面與溶液接觸一段時間，該時間足以允許可接近結合靶位結合任何未結合目標化合物的結合構建物的識別部分，因此形成構建物-表面復合物。從溶液中分離構建物-表面復合物，在溶液中留下構建物-化合物復合物。檢測溶液中是否存在結合構建物的核酸部分。從溶液中分離構建物-表面復合物導致基本分離所有未結合目標化合物的結合構建物，增加了檢測目標化合物的靈敏度，存在結合構建物的核酸部分表明樣品中存在目標化合物。
本發(fā)明的第三個方面是檢測目標化合物的試劑盒，其包括含有識別部分和核酸部分的結合構建物，該識別部分識別和結合目標化合物。本發(fā)明的試劑盒也包含一種或多種具有一個或多個可接近結合靶位的表面，該結合靶位能結合結合構建物的識別部分。本發(fā)明的試劑盒也可任選包括核酸擴增引物對，其中引物對的各引物在結合構建物的核酸部分的靶核酸序列3’末端與它的互補序列雜交。
附圖簡述

圖1描述了多種結合構建物，每一種包含識別部分和核酸部分(參見實施例I)。
圖2描述了多種結合構建物，其中某些已將目標化合物識別和結合到它們的識別部分，形成構建物-化合物復合物(參見實施例I)。
圖3描述了具有可接近結合靶位的表面，其被結合構建物的識別部分識別并結合，形成構建物-表面復合物(參見實施例I)。
圖4描述從構建物-化合物復合物分離構建物-表面復合物(參見實施例I)。
圖5描述實施例II的結果Mopep2顆粒能結合并從溶液中分離單克隆抗體12D5(12D.5Mab)辣根過氧化物酶(HRPO)綴合物，因此阻止12D.5Mab HRPO綴合物以劑量依賴方式結合到涂布Mopep2的孔上。涂布有牛血清白蛋白(BSA)的顆粒不能抑制12D.5Mab HRPO綴合物結合到涂布Mopep2的孔。OD，吸光度。
圖6描述實施例IV中獲得的結果，使用本發(fā)明的方法檢測目標化合物，其中結合構建物的核酸部分經PCR擴增。該實驗證明結合構建物Fab-DNA(Mab 12D.5/pUC19構建物)結合到目標化合物，游離抗原(OMPE或rOMPE的細菌重組片段)，的能力，因此在溶液中形成構建物-化合物復合物。具有可接近結合靶位(Mopep2肽)的表面(磁性顆粒)結合任何未結合目標化合物的Fab-DNA，并使用磁體分離表面，在溶液中留下構建物-化合物復合物(結合抗原的Fab-DNA)，結合構建物的核酸部分(pUC19)可用于核酸擴增。聚合酶鏈反應擴增導致下列樣品中的可檢測2.6千堿基DNA片段790皮克、395皮克、198皮克、98皮克和12皮克。在49皮克和24皮克的樣品中也觀察到非常細微的2.6kb條帶。
發(fā)明詳述介紹本發(fā)明認識到，通過增加真陽性信號與假陽性信號之比，可使化合物的檢測方法更靈敏，因而更有效。本發(fā)明還認識到不需要固相檢測目標化合物的檢測系統(tǒng)的通用性，還認識到從信號擴增方法(如核酸擴增)中得益的希望，甚至在檢測不包含核酸的目標化合物時。
作為本發(fā)明的范圍的非限制介紹，本發(fā)明包括某些常規(guī)和有用的方面，包括
1)檢測樣品中目標化合物的方法，包括以下步驟提供包含識別部分和核酸部分的結合構建物，該識別部分識別和結合目標化合物；結合構建物與樣品混和以形成構建物-化合物復合物；提供一種或多種表面，其中該表面具有一個或多個能識別和結合結合構建物識別部分的可接近結合靶位；將表面引入結合構建物和樣品的混合物，以使表面與任何未結合的結合構建物形成構建物-表面復合物；從混合物中分離構建物-表面復合物，留下構建物-化合物復合物；檢測是否存在結合構建物的核酸部分，其中存在結合構建物的核酸部分表明樣品中存在目標化合物。
2)增加液相檢測目標化合物的靈敏度的方法，包括以下步驟提供懷疑含有目標化合物的樣品；提供包含識別部分和核酸部分的結合構建物，該識別部分能結合目標化合物；樣品與結合構建物接觸一段時間，該時間足以允許識別部分結合樣品中的任何目標化合物，因此在溶液中形成構建物-化合物復合物；提供一種或多種具有一個或多個可接近結合靶位的表面，該結合靶位能結合識別部分；使表面與溶液接觸一段時間，該時間足以允許可接近結合靶位結合任何未結合目標化合物的結合構建物的識別部分，因此形成構建物-表面復合物；從溶液中分離構建物-表面復合物，在溶液中留下構建物-化合物復合物；檢測在溶液中是否存在結合構建物的核酸部分，其中從溶液中分離構建物-表面復合物導致基本分離了所有未結合目標化合物的結合構建物，增加了檢測目標化合物的靈敏度，其中存在結合構建物的核酸部分表明樣品中存在目標化合物。
3)檢測目標化合物的試劑盒，包含含有識別部分和核酸部分的結合構建物，該識別部分識別和結合目標化合物；一種或多種表面，其中該表面具有一個或多個已知能結合結合構建物識別部分的可接近結合靶位。該試劑盒任選包含核酸引物對，其中引物對的各引物在結合構建物核酸部分的靶序列3’末端與其互補序列雜交。
本發(fā)明涉及依靠能識別和結合目標化合物的核酸標記的結合構建物，檢測樣品中存在的目標化合物的靈敏方法，樣品如生物液體、生物抽提物或環(huán)境樣品。這種化合物的檢測方法被稱為可溶性分析物檢測和擴增。本發(fā)明提供了檢測目標化合物的方法，其尤其適用于目標化合物低水平存在于樣品中的樣品。“靈敏度”可定義為通過系統(tǒng)檢測到的真陽性的比例，該系統(tǒng)設計為區(qū)分通常稱為陽性和陰性的兩類。本發(fā)明提供了增強的檢測靈敏度，因為可能提供了甚至過量的結合構建物，然后從樣品中分離任何未結合的(即沒有結合目標化合物)或過量的結合構建物(其檢測將導致假“陽性”信號)，因此在溶液中只留下構建物-化合物復合物中的結合目標化合物的結合構建物，以用于檢測為真“陽性”信號。因此，檢測靈敏度與從溶液中分離未結合或過量的結合構建物的效率成比例。本發(fā)明也通常更通用，因為檢測發(fā)生在溶液相，不限于固相檢測。此外，只需要一種結合實體(結合構建物)以識別和結合目標化合物，從而避免了使用兩種結合實體的方法伴隨的問題，例如，由第一種抗體結合引起的構象變化導致的位阻或敏感性潛在丟失的問題，例如可發(fā)生在，例如，雙抗體夾心分析法中。
隨著說明的進行并當與附圖組合時，本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點將是顯而易見的。為獲得本發(fā)明范圍完整的正確評價，將進一步認識到可組合本發(fā)明的各個方面以獲得本發(fā)明希望的實施方案。
除非另有說明，所有本文使用的技術和科學術語都具有本發(fā)明所屬領域中普通技術人員通常理解的相同含意。通常，本文使用的命名法和如下描述的制造或實驗室方法是公知的，并普遍應用于本領域。本文使用的技術術語具有本領域使用的普通含義，如各種技術字典所例證。當提供的術語為單數形式時，發(fā)明者也考慮到了此術語的復數形式。本文使用的命名法和如下描述的操作是公知的并普遍應用于本領域。當通過引用結合到本文中的參考文獻使用的術語和定義有不符之處時，用于本申請的術語具有本文中給出的定義。用于本文的其它技術術語具有其使用領域中的其普通含義，為各種技術字典所例證(例如Chambers Dictionary of Science和Technology，Peter M.B.Walker(editor)，Chambers Harrap Publishers，Ltd.，Edinburgh，UK，1999，1325頁)。發(fā)明人無意限制作用的機制或方式。提供其參考文獻只是為了說明目的。
I檢測樣品中的目標化合物的方法本發(fā)明的第一種方法包括檢測樣品中的目標化合物的靈敏方法，其能檢測到樣品中存在的非常微量的化合物。本發(fā)明的第一種方法包括通過核酸標記的結合構建物識別目標化合物，依靠一種或多種具有一個或多個結合靶位的表面分離未結合的核酸標記結合構建物，檢測溶液中是否存在結合構建物的核酸部分，其中存在結合構建物的核酸部分表明樣品中存在目標化合物。懷疑含有目標化合物的樣品可以是，例如，完全天然來源的，完全非天然來源的(如合成來源)，或天然和非天然來源的組合。樣品可包括全細胞、組織、器官、生物液體、抽提物或環(huán)境樣品。
本發(fā)明的第一種方法包括使用結合構建物。將結合構建物與樣品混合，允許結合構建物的識別部分結合到目標化合物，以在溶液中形成構建物-化合物復合物。
結合構建物包含可識別和結合到目標化合物的識別部分以及核酸部分。該識別部分事實上可包含任何能識別和結合目標化合物的分子或分子組合。這種識別部分可包括但不限于，肽、多肽、抗體、Fab片段、核酸、核酸模擬物、細胞表面抗原、碳水化合物或其組合。在一個實施方案中，識別部分包括抗體(天然的、修飾的或重組的)或抗體片段(如Fab片段或單鏈抗體可變區(qū)片段)。在另一個實施方案中，識別部分可以是結合抗體的抗原、結合靶如肽或小分子的適體或結合配基的受體。在一個優(yōu)選實施方案中，識別部分單價結合到目標化合物上。在另一個優(yōu)選實施方案中，識別部分多價結合，例如二價和任選雙特異性結合目標化合物。
結合構建物的核酸部分可包括能被檢測的任何核酸或核酸模擬物。用作結合構建物核酸部分的核酸可包括任何類型的核酸，例如DNA或RNA、或核酸模擬物(例如，但不限于，肽核酸)或其組合。本發(fā)明的核酸可以是單鏈或雙鏈。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的結合構建物包括核酸部分，其中核酸部分的序列不包括預期在樣品中存在的序列，因此有理由期待較不易受到樣品中核酸序列的污染，但是要設計成容易檢測到。核酸部分優(yōu)選足夠長以容易通過所選擇的檢測方法檢測到。
識別部分可通過任何方法、共價或非共價、直接或間接連接于核酸部分，其取決于給定識別部分的性質。非共價連接方法包括但不限于物理吸附、靜電力、離子相互作用、氫鍵、親水-疏水相互作用、范德華力和磁力。其中希望的是，例如，當需要增加靈活性時，可使用間隔臂間接將識別部分連接于核酸部分。優(yōu)選的是，通過共價鍵或通過高親和的非共價鍵相互作用(如生物素和抗生物素蛋白的作用)，將識別部分連接于核酸部分。
本發(fā)明的第一種方法包括使用一種或多種具有一個或多個可接近結合靶位的表面，該結合靶位已知為識別并結合結合構建物的識別部分。這種表面可以是任何能從液體樣品中分離的顆粒，或這種表面可以是非顆粒表面如平面或非平面表面，或其組合。該表面可任選被封裝，例如，封裝入室中。結合靶位可包括任何能識別和結合到結合構建物的識別部分的靶位，例如，抗體可變區(qū)的肽模擬表位或表位模擬物、全抗原或半抗原、核酸或糖部分。該可接近結合靶位可通過任何方法連接至表面，這取決于給定表面和結合靶位的性質。
當將表面引入樣品與結合構建物的混合物時，充分孵育后，表面的可接近結合靶位結合了任何未結合的結合構建物的識別部分，形成構建物-表面復合物。然后通過適合使用的表面類型的方法，例如，磁體或分離的磁性顆粒，從平面表面傾析，或通過壓力或真空、離心或過濾分離，從樣品溶液中將構建物-表面和任何過量的未結合的表面從構建物-化合物復合物中分離出來?；蛘?，任何未結合目標化合物形成構建物-化合物復合物的結合構建物，都可通過以下方法從溶液中分離出來，例如但不限于沉淀、鹽析、分子排阻或過濾、萃取或相分離。
分離步驟后，通過檢測是否存在結合構建物的核酸部分，確定樣品中是否存在目標化合物?？赏ㄟ^任何能檢測是否存在核酸的方法，例如酶擴增、雜交或標記檢測，檢測是否存在結合構建物的核酸部分。在本發(fā)明的一個實施方案中，優(yōu)選可使該方法適合于通過核酸部分的擴增，例如依靠使用合適引物的聚合酶鏈反應，檢測是否存在結合構建物的核酸部分。在這個實施方案中，只需要少數、最少只要一個構建物-化合物復合物用作核酸擴增的模板。通過任何合適的方法，例如，使用標記的寡核苷酸或通過檢測聚丙烯酰胺凝膠電泳上適當的條帶，可測量或檢測擴增的核酸。
在本發(fā)明的一個實施方案中，待分析的樣品可含有兩種或更多目標化合物。為了檢測樣品中的兩種或更多不同的目標化合物，提供了兩種或更多不同類型的結合構建物，每一類結合構建物都具有能識別不同化合物的不同識別部分。為了檢測樣品中是否存在兩種或更多目標化合物，每類結合構建物都包括各類獨特的核酸部分。
II.提高液相檢測目標化合物靈敏度的方法本發(fā)明的第二種方法包括提高液相檢測目標化合物靈敏度的方法。該方法尤其適合于懷疑含有低濃度或少量目標化合物的樣品。
本發(fā)明的第二種方法包括以下步驟提供懷疑含有目標化合物的樣品；提供了包含能結合目標化合物的識別部分和核酸部分的結合構建物；將樣品與結合構建物接觸一段時間，該時間足以允許識別部分結合樣品中的任何目標化合物，因此在溶液中形成構建物-化合物復合物；提供一種或多種具有一個或多個能結合到識別部分的可接近結合靶位的表面；將表面與溶液接觸一段時間，該時間足以使得可接近結合靶位結合任何未結合目標化合物的結合構建物的識別部分，因此形成構建物-表面復合物；從溶液中分離構建物-表面復合物，在溶液中留下構建物-化合物復合物；檢測溶液中是否存在結合構建物的核酸部分，其中從溶液中分離構建物-表面復合物導致基本分離了所有未結合目標化合物的結合構建物，增加了檢測目標化合物的靈敏度，其中存在結合構建物的核酸部分表明樣品中存在目標化合物。
本發(fā)明的第二種方法包括提供懷疑含有目標化合物的樣品和提供結合構建物的步驟。懷疑含有目標化合物的樣品可以是，例如，完全天然來源的，完全非天然來源的(如合成來源)，或天然和非天然來源的組合。樣品可包括全細胞、組織、器官、生物液體、抽提物或環(huán)境樣品。結合構建物包括可識別和結合目標化合物的識別部分和核酸部分。將樣品與結合構建物接觸一段時間，該時間足以允許結合構建物的識別部分結合目標化合物，在溶液中形成構建物-化合物復合物。
結合構建物的識別部分事實上可包括任何能識別和結合目標化合物的分子或分子組合。這種識別部分可包括但不限于肽、多肽、抗體、Fab片段、核酸、核酸模擬物、細胞表面抗原、碳水化合物或其組合。在一個實施方案中，識別部分包括抗體(天然的、修飾的或重組的)或抗體片段(如Fab片段或單鏈抗體可變區(qū)片段)。在另外的實施方案中，識別部分可以是結合抗體的抗原、結合靶如肽或小分子的適體或結合配基的受體。在一個優(yōu)選實施方案中，識別部分單價結合到目標化合物。在另一個優(yōu)選實施方案中，識別部分多價，例如，二價或任選雙特異性結合到目標化合物。
結合構建物的核酸部分可包含能被檢測到的任何核酸或核酸模擬物。用作結合構建物核酸部分的核酸可包括任何類型的核酸，例如DNA或RNA，或核酸模擬物(例如，但不限于，肽核酸)，或其組合。本發(fā)明的核酸可以是單鏈或雙鏈。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的結合構建物包括核酸部分，其中，核酸部分的序列不包括預期在樣品中存在的序列，因此可有理由預期樣品較不易受到樣品中核酸序列的污染，但是要設計成容易檢測。核酸部分優(yōu)選足夠長以容易被所選擇的檢測方法檢測到。
識別部分可通過任何方法，共價或非共價、直接或間接連接于核酸部分，其取決于給定核酸部分的性質。非共價結合的方法包括但不限于物理吸附、靜電力、離子相互作用、氫鍵、親水-疏水相互作用、范德華力和磁力。其中希望的是，例如，當需要增加靈活性時，可使用間隔臂間接將識別部分結合于核酸部分。優(yōu)選的是，通過共價鍵或通過高親和力的非共價相互作用(如生物素和抗生物素蛋白的作用)，使識別部分連接至核酸部分。
本發(fā)明的第二種方法包括提供一種或多種具有一個或多個可接近結合靶位的表面，已知該結合靶位識別并結合到結合構建物的識別部分。這種表面可以是任何能從液體樣品中分離的顆粒，或這種表面可以是非顆粒表面，如平面或非平面，或其組合。該表面可被任選封裝，例如，封裝入室中。結合靶位可包含任何能識別和結合結合構建物識別部分的靶位，例如，抗體可變區(qū)的肽模擬表位或表位模擬物、全抗原或半抗原、核酸或糖部分。該可接近結合靶位可通過任何方法連接表面，這取決于給定表面和結合靶位的性質。
將表面與溶液接觸一段時間，該時間足以使可接近結合靶位結合任何未結合目標化合物的結合構建物的識別部分，因此形成構建物-表面復合物。從溶液中分離構建物-表面復合物和任何過量的未結合表面，留下構建物-化合物復合物?？赏ㄟ^任何適合于所使用表面的方法進行分離，例如，分離磁性顆粒的磁體，從平面表面傾析，或通過壓力或真空、離心或過濾分離?；蛘?，可通過方法例如，但不限于，沉淀、“鹽析”、分子排阻或過濾、萃取或相分離，從溶液中分離任何未結合目標化合物形成構建物-化合物復合物的結合構建物。分離構建物-表面復合物和任何過量的未結合表面導致基本分離了所有未結合目標化合物的結合構建物。最優(yōu)選的是，所有的未結合目標化合物的結合構建物都從溶液中分離出來。構建物-表面復合物和任何過量未結合表面的分離導致減少了由未結合目標化合物的結合復合物產生的假陽性信號，因此相對沒有分離未結合的或過量的結合構建物的測定，增加了檢測目標化合物的靈敏度。
經分離步驟后，通過檢測是否存在結合構建物的核酸部分，確定樣品中是否存在目標化合物。通過任何能檢測是否存在核酸的方法，例如，酶擴增、雜交或標記檢測，可檢測是否存在結合構建物的核酸部分。在本發(fā)明的一個實施方案中，優(yōu)選可使該方法適合于通過核酸部分的擴增，例如依靠使用適合引物的聚合酶鏈反應，檢測是否存在結合構建物的核酸部分。在這個實施方案中，只需要少數、最少只要一個構建物-化合物復合物作為核酸擴增的模板。通過合適的方法，例如，使用標記的寡核苷酸或通過檢測聚丙烯酰胺凝膠電泳上適當的條帶，測量或檢測擴增的核酸。
在本發(fā)明的一個實施方案中，待分析的樣品可含有兩種或更多目標化合物。為了檢測樣品中的兩種或更多種不同的目標化合物，提供了兩種或更多不同類型的結合構建物，每一種都具有能識別不同化合物的不同識別部分。為了檢測樣品中是否存在兩者或更多種目標化合物，每一類型的結合構建物包含各類獨特的核酸部分。
III.檢測目標化合物的試劑盒本發(fā)明也包括用于檢測樣品中的目標化合物的試劑盒，其能檢測樣品中存在的非常微量的目標化合物。
本發(fā)明的試劑盒包含結合構建物。該結合構建物包括能識別和結合目標化合物的識別部分和核酸部分。識別部分事實上可包括能識別和結合目標化合物的任何分子或分子組合。這種識別部分可包括，不限于，肽、多肽、抗體、Fab片段、核酸、核酸模擬物、細胞表面抗原、碳水化合物或其組合。在一個實施方案中，識別部分包括抗體(天然的、修飾的或重組的)或抗體片段(如Fab或單鏈抗體可變區(qū)片段)。在另外的實施方案中，識別部分可以是結合抗體的抗原、結合靶如肽或小分子的適體或結合配基的受體。在一個優(yōu)選實施方案中，識別部分單價結合目標化合物。在另一個優(yōu)選實施方案中，識別部分多價結合，例如二價和任選雙特異性結合目標化合物。
結合構建物的核酸部分可包括能檢測到的任何核酸或核酸模擬物。用作結合構建物核酸部分的核酸可包括任何類型的核酸，例如DNA或RNA或核酸模擬物(例如，但不限于，肽核酸)，或其組合。本發(fā)明的核酸可以是單鏈或雙鏈。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的結合構建物包括核酸部分，其中核酸部分的序列不包括預期在樣品中存在的序列，因此可有理由預期樣品較不易受到樣品中核酸序列的污染，但是要設計成容易檢測。核酸部分優(yōu)選充分長以容易被所選擇的檢測方法檢測到。
識別部分可通過任何方法，共價或非共價、直接或間接連接于核酸部分，這取決于給定核酸部分的性質。非共價結合的方法包括但不限于物理吸附、靜電力、離子相互作用、氫鍵、親水-疏水相互作用、范德華力和磁力。其中預期的是，例如，當需要增加靈活性時，可使用間隔臂將識別部分間接結合于核酸部分。優(yōu)選的是，通過共價鍵或通過高親和力的非共價相互作用(如生物素和抗生物素蛋白的作用)，使識別部分連接至核酸部分。
本發(fā)明的試劑盒也包括一種或多種具有一個或多個可接近結合靶位的表面，已知該結合靶位識別并結合結合構建物的識別部分。這種表面可以是任何能從液體樣品中分離的顆粒，或這種樣品可以是非顆粒表面，例如平面或非平面，或其組合。該表面可被任選封裝，例如，封裝入室中。結合靶位可包含任何能識別和結合結合構建物識別部分的靶位，例如，抗體可變區(qū)的肽模擬表位或表位模擬物、全抗原或半抗原、核酸或糖部分。該可接近結合靶位可通過任何方法連接表面，這取決于給定物質和結合靶位的性質。
在結合構建物的核酸部分通過核酸擴增檢測的實施方案中，試劑盒可任選包括核酸擴增引物對，例如PCR引物對，其中引物對的各引物在核酸部分的靶核酸序列3’末端與它的互補序列雜交。該試劑盒還任選包括核酸擴增的酶，例如Taq聚合酶或RNA逆轉錄酶。在結合構建物的核酸部分通過核酸雜交檢測的實施方案中，試劑盒可包含一種或多種雜交探針，例如使用可檢測標記標記的寡核苷酸。在包括信號放大的實施方案中，試劑盒任選包括進行信號放大所需的試劑，如酶或底物。本發(fā)明的試劑盒可任選包括直接檢測結合構建物核酸部分的試劑，例如分子指示物或合適的抗體。該試劑盒任選包括分離構建物-表面復合物和任何未結合表面的方法，例如，磁體用于其中該表面為磁性顆粒的實施方案，濾器用于其中表面為可濾顆粒的實施方案，或移液器用于其中表面為管壁的實施方案。
任選試劑盒可包括使用試劑盒的說明。這種說明可以是任何合適的形式，例如小冊子、傳單、手冊、不裝訂的小冊或視聽材料。優(yōu)選說明為足夠詳細的說明，以允許試劑盒的使用者成功地使用試劑盒檢測樣品中的目標化合物。這種說明可包括，例如，混合試劑、操作試劑盒元件、樣品適當處理的說明、安全測量和解釋結果的指南，以及故障檢查說明。
目標化合物本發(fā)明的方法和試劑盒可用于檢測各類目標化合物。該方法尤其適用于檢測懷疑以少量或低濃度存在于樣品中的目標化合物。目標化合物可包括但不限于核酸、肽、蛋白、糖蛋白、脂蛋白、凝集素、抗體、酶和受體；碳水化合物(單糖、寡糖和多糖)和糖基化的分子；脂質、脂肪和脂化的分子；全抗原或半抗原。目標化合物可以是小分子(例如，受體的配基、濫用的藥物、無機離子、金屬或螯合物、代謝物、化學中間體或天然產物)。目標化合物可以是單體、低聚體或聚合物；它們也可以是多分子組件(例如，淀粉樣蛋白β初原纖維、肌養(yǎng)蛋白-糖蛋白裝配物、蛋白體、侶伴蛋白或細胞壁或細胞膜的片段)。目標化合物可以是完全天然來源的、完全人工來源或兩者的組合(例如經化學或物理修飾的天然來源化合物)。
樣品本發(fā)明的方法可用于任何合適的懷疑含有目標化合物的樣品。該樣品可以是完全天然來源的、完全非天然來源的(例如合成來源)、或天然來源和非天然來源的組合。樣品可包括全細胞(例如原核細胞、細菌細胞、真核細胞、植物細胞、真菌細胞或來自多細胞生物的細胞(包括無脊椎動物、脊椎動物、哺乳動物和人類))、組織、器官、或生物液體(例如但不限于血液、血清、血漿、尿、精液和腦脊液)。樣品可以是從生物材料制得的抽提物，例如來自原核生物、細菌、真核生物、植物、真菌、多細胞生物或動物、無脊椎動物、脊椎動物、哺乳動物、非人哺乳動物和人類。樣品可以是從以下制得的抽提物全生物體或生物體部分、細胞、器官、組織、液體、全培養(yǎng)物或培養(yǎng)物部分、或環(huán)境樣品或其部分。用于本發(fā)明方法的樣品可需最少制備(例如收集于合適的容器)，或更多制備(例如，但不限于，去除、滅活或阻斷不希望的物質或污染物、過濾、尺寸選擇、親和提純、細胞溶解或組織消化、濃縮或稀釋)。樣品可為任何相(固相、液相或氣相)、在溶液或懸浮液中，只要可處理它(例如通過機械破碎、裂解、加熱、添加溶劑或懸浮劑)以允許檢測溶液中的構建物-化合物復合物。例如，樣品可以是土壤樣品，其可懸浮于水緩沖液中，在引入結合構建物之前任選過濾去除不希望的顆粒。
結合構建物本發(fā)明包括結合構建物。該結合構建物包含能識別和結合目標化合物的識別部分和核酸部分。識別部分事實上可以是任何能識別和結合目標化合物的分子或分子組合。這種識別部分可包括但不限于肽、多肽、模擬表位、抗體、Fab片段、核酸、核酸模擬物、適體、細胞表面抗原、碳水化合物、小分子(如小分子抗原或受體的配基)、無機離子或螯合物、或其組合。尤其優(yōu)選的是能單價結合目標化合物的識別部分。
在一個實施方案中，識別部分為抗體，例如，人或其它哺乳動物的IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、SigA或IgE或鳥類IgY，在另一個優(yōu)選的實施方案中，識別部分為抗體片段?？鼓繕嘶衔锏目贵w和抗體片段的制備為本領所熟知。這些技術描述于，例如，Antibodies，A Laboratory Manual，(Harlow和Lane)Cold SpringHarbor Laboratory Press(1988)，在Using Antibodies，A LaboratoryManual，(Harlow和Lane)Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)中得到更新。當識別部分是抗體或抗體片段時，其可以是天然的(如從血清中分離到的免疫球蛋白)、修飾的(如還原的或去糖基化的抗體)、重組體(如由噬菌體展示技術生產的抗體)或其組合。
識別部分可以是天然的、修飾的或重組的抗體結合片段，如Fab片段、或如單鏈抗體可變區(qū)片段或ScFv，ScFv中免疫球蛋白輕鏈和重鏈域的重組可變區(qū)通過連接序列相連(Pantoliano等，(1991)Biochemistry，3010117-10125)。在一個實施方案中，結合構建物的識別部分包括Fab片段，能單價結合目標化合物。通過還原或酶裂解二硫鍵(此二硫鍵使得重鏈連接在一起)，裂解抗目標化合物的抗體，將抗體轉化成兩個獨立的Fab片段，每一個片段都能識別和結合目標化合物，并具有可連接到其它分子(如結合構建物的核酸部分)的活化巰基，這時可生產抗目標化合物的Fab片段。在一個實施方案中，Fab片段可通過Fab片段游離的巰基直接共價結合核酸部分，因此形成了結合構建物。在另一個實施方案中，通過能特異結合所述Fab片段和所述核酸部分的雙功能連接體，Fab片段可間接共價結合到結合構建物的核酸部分，形成結合構建物。或者，本發(fā)明的識別部分也可通過非共價方式連接核酸部分，例如，通過抗生物素蛋白-生物素相互作用、鋅-多聚組氨酸相互作用、抗體-抗原相互作用、適體-肽相互作用，或通過能結合核酸的其它多肽如結合鋅的多肽域。
識別部分(例如，肽、模擬表位、抗體或適體)可包括天然分子、人工分子、融合或嵌合分子、隨機或非隨機組合合成獲得的分子(Dooley和Houghten(1993)Life Sci.，521509-1517；Kramer等，(1993)Peptide Res.，6314-319；Folgori等，(1994)EMBO J.，132236-2243；Smith & Petrenko(1997)Chem.Rev.，97391-410)，或通過定向進化方法如酵母雙雜交系統(tǒng)、蛋白片段互補測定、噬菌體展示、核糖體展示、酵母表面展示和細菌表面展示技術獲得的分子(Crameri和Suter(1993)Gene，13769-75；Meola等，(1995)J.Immunol.，1543162-3172；Georgiou等，(1997)Nature Biotechnol.，1529-34；Mossner和Pluckthun(2001)Chimia，55324；B.K Kay，J.Winter和J.McCafferty(editors)，″Phage Display of Peptides and proteinsA Laboratory Manual″，Academic Press，Inc.，San Diego，1996，344頁)，或其組合。也可通過本領域已知的合適方法，例如，通過親和選擇、親和純化、反復淘選或表面等離子共振技術(Fagerstam等，(1991)J.Mol.Recognition，3208-214；Houshmand等，(1999)Anal.Biochem.，268363-370)，選擇識別部分識別和結合目標化合物的能力。
結合構建物的識別部分可以單價或多價形式結合目標化合物。在一個優(yōu)選實施方案中，結合構建物的識別部分與目標化合物的結合是單價的。單價結合的實例包括但不限于單價結合抗原的Fab片段、單價結合配基的受體分子、單價結合肽的適體。在某些其它實施方案中，結合構建物的識別部分與目標化合物的結合可優(yōu)選是多價的，例如，二價或三價。多價可為希望的，例如，以增加結合構建物和目標化合物之間的親合力。在某些實施方案中，結合構建物的識別部分與目標化合物的結合可以是二價和雙特異的(即識別部分可結合和識別目標化合物的兩種獨立的特異性結合位點)。二價單特異性結合的實例是設計成單特異性結合的二聚抗體片段或雙抗體(Holliger等，(1993)Proc.Natl.Acad Sci.USA，906444-6448)。二價雙特異性抗體的實例是設計成結合目標化合物兩種不同結合位點的雙抗體。
結合構建物的核酸部分可包括任何能檢測到的核酸或核酸模擬物。用作結合構建物核酸部分的核酸可包括任何類型的核酸，例如DNA或RNA、或核酸模擬物(例如但不限于肽核酸)、或其組合。在這方面，結合構建物的核酸部分作為標記用于檢測，例如，通過核酸擴增、核酸雜交、酶信號放大、標記的檢測或這些檢測方法的組合進行檢測。本發(fā)明的核酸可以是單鏈或雙鏈。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的結合構建物包括核酸部分，其中核酸部分的序列不包括預期在樣品中存在的序列，因此可有理由預期樣品較不易受到樣品中核酸序列的污染，但是要設計成容易檢測。例如，當樣品是來自哺乳動物的血清樣品時，核酸部分的序列可包括認為只存在于高等植物中的核酸序列，因此不可能在哺乳動物血清中存在。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的結合構建物包括核酸部分，其中核酸部分的序列不包括認為天然出現的序列。在其它實施方案中，本發(fā)明的核酸部分可包括人工衍生序列(例如通過隨機或非隨機組合方法獲得的序列)或重復序列，例如，可與單一雜交引物或探針互補的重復序列。在其它的實施方案中，本發(fā)明的核酸部分可包括多個重復的核酸部分，串聯或并列連接至識別部分。
核酸部分優(yōu)選足夠長，以容易被所選擇的檢測方法檢測到。當核酸部分的檢測包括核酸擴增時，核酸部分優(yōu)選包含長度約50到約5000個核苷酸的單鏈，或約100到約4000個核苷酸，或約200到約3000個核苷酸。然而，核酸部分可包括適合所選擇核酸部分擴增方法(例如PCR或逆轉錄PCR)的任何數量的核苷酸。當核酸部分的檢測不包括核酸擴增時，核酸部分優(yōu)選包括約4個核苷酸至約5000個核苷酸長度的單鏈，或約20個核苷酸至約4000個核苷酸，或約100個核苷酸至約3000個核苷酸。然而，核酸部分可包括適合所選檢測核酸部分方法的任何數量的核苷酸。
識別部分可通過任何方法共價或非共價、直接或間接連接至核酸部分，取決于給定識別部分和核酸部分的性質。這種連接方法可以是，例如，本領域已知的共價交聯以及非共價連接方法(參見例如R P.Haugland，″Handbook of Fluorescent Probes和Research Products″，9thedition，J.Gregory(editor)，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR，USA，2002，966 pp.；Seitz和Kohler(2001)，Chemistry，73911-3925；PierceTechnical Handbook，Pierce Biotechnology，Inc.，1994，Rockford，IL)。需要時，例如，當需要增加靈活性時，可使用間隔臂將識別部分連接至核酸部分(Keyes等，(1997)Biophys.J，72282-90；Hustedt等，(1995)Biochemistry，344369-4375；Pierce Technical Handbook，PierceBiotechnology，Inc.，1994，Rockford，IL)。在一個實施方案中，識別部分通過共價鍵結合核酸部分。共價方法為本領域所熟知，可包括，例如，使用反應基團、化學修飾或活化、光活化交聯、或雙功能或三功能交聯劑(Pierce Technical Handbook，Pierce Biotechnology，Inc.，1994，Rockford，IL)。在另一個實施方案中，識別部分通過非共價方法結合核酸部分。非共價方法包括但不限于物理吸附、靜電力、離子相互作用、氫鍵、親水-疏水相互作用、范德華力和磁力。可使用共價和非共價連接方法的組合。例如，可生物素化核酸部分(或核酸部分的重復)和非共價連接多價的抗生物素蛋白部分，該抗生物素蛋白與識別部分共價交聯。
表面和可接近結合靶位本發(fā)明也包括一種或多種具有一個或多個可接近結合靶位的表面，已知該結合靶位識別和結合結合構建物的識別部分。這種表面可以是顆粒表面或非顆粒表面，可以由任何合適的材料制成，例如但不限于塑料、聚合物、陶瓷、玻璃、二氧化硅化合物、修飾的二氧化硅化合物、碳氟化合物、金屬或金屬氧化物、吸著劑、樹脂、生物材料(例如，多肽和碳水化合物)或其組合。顆粒表面可以是任何能與液體樣品分離的顆粒，例如磁性顆粒、聚合物顆粒、玻璃顆粒、二氧化硅顆粒、陶瓷顆粒等。顆粒表面可以是任何形狀，包括球狀、非球狀、對稱、不對稱或不規(guī)則的；它們的尺寸可均勻或不均勻。顆粒表面可采取任何合適的形式，例如，粉末、珠、纖維、大分子聚集物、納米顆粒或納米管。任選可將顆粒表面封裝入室中，例如封裝入可重復利用的或一次性的筒、盒、或插入片中。非顆粒表面包括但不限于平面或非平面表面(例如，管或孔的側面)、非多孔薄膜或膜、多孔薄膜或膜、纖維、填充物、篩孔、網格、濾器、基質、凝膠或其組合。
本發(fā)明的可接近結合靶位可以是任何能識別和結合結合構建物識別部分的結合靶位，例如，核酸、抗體可變區(qū)的肽模擬表位或表位模擬物(Geysen等，(1986)Mol.Immunol，23709-715)、蛋白、糖蛋白、脂蛋白、凝集素、抗體、酶、受體、碳水化合物(單糖、寡糖和多糖)和糖基化的分子；脂質、脂肪和脂化的分子；全抗原或半抗原；小分子(例如受體的配基、濫用的藥物、無機離子或螯合物、代謝物、化學中間體或天然產物)。可接近結合靶位可以是單體、寡聚體、多聚體；它們也可以是多分子組件?？山咏Y合靶位可以是完全天然來源的、完全人工來源的或兩者的組合(如經化學修飾的天然來源化合物)。
可接近結合靶位可通過任何方法，共價或非共價、直接或間接連接至表面，這取決于給定表面和可接近結合靶位的性質。可接近結合靶位可通過共價鍵連接表面，例如，使用合適的試劑，使可接近結合靶位的化學活性基團與表面的化學活性基團的反應。例如，具有伯胺的結合靶位可使用氰基硼氫化鈉連接到結合氨基的支持物上，形成仲胺；具有碳水化合物的結合靶位可連接到具有游離酰肼基團的表面，形成穩(wěn)定的腙鍵。在另外的實例中，鹽酸1-乙基-3[3-二甲氨基丙基]-碳二亞胺(EDC)可用于將羧基連接到具有伯胺的表面?？山咏Y合靶位可通過非共價形式連接到表面，包括但不限于物理吸附、靜電力、離子相互作用、氫鍵、親水-疏水相互作用、范德華力和磁力。非共價方式的非限制性實例包括生物素-抗生物素蛋白相互作用、A蛋白或G蛋白與免疫球蛋白的相互作用，和抗原-抗體相互作用。
可接近結合靶位可通過各種表面化學方法共價連接至表面，例如但不限于聚合物、陶瓷、玻璃、硅或有機表面。容易獲得帶有羧基、氨基、羥基、酰肼或氯甲基官能團的表面，無論是顆粒還是非顆粒。在一個實施方案中，其中表面是磁性顆粒，可使用商業(yè)化的磁性材料，可選擇性質以允許希望的可接近結合靶位連接到磁性顆粒。例如，商業(yè)可獲得的磁性顆粒材料Micromod、Nanomag SilicaTM、NH250(目錄編號13-01-252，Micromod Partikeltechnologie GmbH，Rostock-Wamemuende，Germany)在其表面上含有游離的氨基，其能與交聯劑反應，例如(4-碘乙?；?氨基苯甲酸琥珀酰亞胺酯(SIAB)或4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亞胺酯(磺基SMCC)，每一個都具有氨基活性末端和巰基活性末端。SIAB的NSH酯可偶聯到含有伯氨基的分子，確保反應得到穩(wěn)定的酰胺鍵。
分離使用合適的分離方法，在樣品溶液中將構建物-表面和任何過量的未結合表面與構建物-化合物復合物分離，分離方法取決于使用的表面類型。這類方法可包括但不限于通過壓力或真空、離心、分子排阻、過濾或其組合。下面是分離的非限制性實例。當表面為顆粒(例如粉末、殊、維、大分子聚集物、納米顆?；蚣{米管)時，構建物-表面復合物可通過沉淀、離心、過濾、分子排阻或非共價吸引(例如電荷或疏水相互作用)。當表面是平面或非平面非顆粒(例如微量滴定孔或管或容器的壁)時，可通過傾析或抽吸分離構建物-表面復合物。當表面是磁性顆粒時，可通過應用磁力，如通過暴露于磁體，從混合物中分離構建物-表面復合物。
在一個實施方案中，表面可永久或臨時封裝入室中(如管、筒、柱或盒)，這可有利于分離過量或未結合的結合構建物。例如，含有樣品和結合構建物的混合物可經過含有結合可接近結合靶位的表面(如珠、基質、凝膠或濾器)的筒或柱，由此洗脫或經過筒或柱的溶液除去了過量的或未結合的結合構建物。
在某些實施方案中，當足以從液相檢測步驟中分離構建物-表面復合物時，從混合物中分離構建物-表面復合物不需要從溶液中物理清除構建物-表面復合物。例如，當表面是磁性顆粒時，通過應用磁力，例如，應用于含有混合物的容器側壁，因此將磁性顆粒吸引到容器的側壁，并從溶液分離出來，允許取等分溶液作為樣品用于檢測步驟，可適當地完成分離構建物-表面復合物和混合物。
在一個替代性實施方案中，構建物-化合物復合物中任何未結合目標化合物的結合構建物都可通過以下方法從溶液中分離，例如，但不限于，沉淀、“鹽析”、分子排阻或過濾、萃取或相分離。在這個替代性實施方案中，本發(fā)明方法的原理保持相同，也就是說，(1)只使用單種結合實體(結合構建物)；(2)基本分離了所有未結合目標化合物的結合構建物，導致真“陽性”信號與假“陽性”信號之比增加，因此增加了檢測目標化合物的靈敏度；(3)液相中檢測，不需要進行固相檢測；(4)不需要目標化合物核酸序列的現有知識。
檢測分離步驟之后，通過檢測是否存在結合構建物的核酸部分，指示樣品中是否存在目標化合物?？赏ㄟ^任何能檢測是否存在核酸的方法，不一定包括核酸擴增，例如，酶擴增、雜交或標記檢測，檢測是否存在結合構建物的核酸部分?？赏ㄟ^任何適合于此目的的方法進行結合構建物的核酸部分的檢測。這些方法為本領域所熟知，包括但不限于核酸部分的擴增、核酸部分的雜交、信號的放大、標記的檢測或其組合。
本發(fā)明的方法可包括核酸部分的核酸擴增。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案能檢測微量或低濃度的目標化合物，能擴增和檢測少許、最少一個構建物-化合物復合物。在這種優(yōu)選的實施方案中，只需要少許、最少只要一個構建物-化合物復合物保留在溶液中，以在分離構建物-表面復合物之后作為擴增模板?？赏ㄟ^任何合適的方法，例如，使用標記的寡核苷酸作為雜交探針或通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測合適大小的擴增片段，測量或檢測擴增的核酸。擴增核酸部分可使用任何合適的擴增方法，例如聚合酶鏈反應擴增或逆轉錄擴增(Molecular CloningA Laboratory Manual，Joseph Sambrook等，ColdSpring Harbor Laboratory，2001，999頁；Short Protocols in MolecularBiology，Frederick M.Ausubel等(editors)，John Wiley & amp；Sons，2002，1548頁)、滾環(huán)擴增(Liu等(1996)，J.Am.Chem.Soc.，1181587-1594)、反義RNA擴增(Phillips和Eberwine(1996)Methods，10283-288)、鏈置換擴增技術(Walker等(1992)，Nucleic Acids Res.，201691-1696)、混合引物/鏈置換擴增(美國專利第6,251,639號，Kum，″Methods andcompositions for linear isothermal amplification of polynucleotidesequences，using a RNA-DNA composite primer″，2006年1月26日刊發(fā))、Q-β復制酶介導的擴增(Lomeli等(1989)Clin.Chem.，351826-1831)、連鎖線性擴增(linked linear amplification)(Reyes等(2001)Clin.Chem.，4731-40)、自主序列復制(3SR)(Fahy等，(1991)Genome Res.，125-33)、或其它的本領域已知的擴增方法(Andras等，(2001)Mol.Biotechnol.，1929-44)。檢測結合構建物核酸部分的另外方法可以是，例如，通過引物延伸和檢測核酸的延伸。
通過探針與結合構建物的核酸部分雜交，可完成核酸部分的雜交，隨后依據本領域已知的方法檢測雜交結構。探針可包括DNA、RNA、核酸模擬物(例如但不限于肽核酸)或其組合。該探針可包含合適的標記，例如但不限于放射性元素、自旋標記物、熒光團(包括有機染料和鑭系元素螯合物)、發(fā)色團、共振能量轉移對的一個或兩個成員、半抗原、抗原、抗體或酶。標記，例如，熒光團或半抗原，也可通過本領域已知的方法直接摻入核酸，隨后檢測標記。核酸的檢測可包括信號的酶放大(例如來自探針上標記的信號)，例如通過使用過氧化物酶-酪胺信號放大(R P.Haugland，″Handbook ofFluorescent Probes and Research Products″，9thedition，J.Gregory(editor)，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR，USA，2002，966頁)，或堿性磷酸酶-抗-堿性磷酸酶信號放大。也可通過其它方法直接或在擴增或雜交之后檢測結合構建物的核酸部分，其它方法包括但不限于分子指示物(任選與即時檢測組合)或其它共振能量轉移方法、或免疫檢測(例如在ELISA類測定中使用識別和捕獲擴增DNA序列的抗體)。
當結合構建物核酸部分的檢測包括擴增時，優(yōu)選方法為依據本領域已知的方法通過聚合酶鏈反應擴增核酸部分(Molecular CloningA Laboratory Manual，Joseph Sambrook等，Cold Spring HarborLaboratory，2001；Short Protocols in Molecular Biology，Frederick M.Ausubel等(editors)，John Wiley & Sons，2002)。檢測樣品中目標化合物的能力可通過偶聯聚合酶鏈反應得到顯著提高和擴展。PCR擁有巨大的擴增能力，在這個過程中核酸的特定序列可被擴增數百萬倍。這種巨大的擴增能力基于擴增兩側為一套引物的核酸具體靶序列的能力。一旦擴增核酸，可使用任何適合這種目的的方法檢測結果，例如，使用瓊脂糖凝膠。
實施例實施例I檢測樣品中目標化合物的方法的非限制性實施方案圖1描述多種用于本發(fā)明方法的結合構建物，如實施例III所述。每種結合構建物101包括識別和結合目標化合物的識別部分102和核酸部分103。在這個實施方案中，識別部分102優(yōu)選包括Fab片段，如通過裂解抗目標化合物的單克隆抗體重鏈的二硫鍵而制得的Fab片段。在這個實施方案中，核酸部分103優(yōu)選包括DNA。識別部分102可通過共價鍵104連接到核酸部分103，例如通過核酸部分103和識別部分102的Fab片段的游離巰基之間的共價鍵。
圖2顯示許多結合構建物101，其已與含有目標化合物201的樣品混合，如實施例IV所述。結合構建物101的識別部分102已識別目標化合物201，形成構建物-化合物復合物202。圖的最下方部分中也顯示了結合構建物101，其包括未結合目標化合物201的識別部分102和核酸部分103。
圖3顯示表面301，其具有可接近結合靶位302。在這個實施方案中，表面301為磁性顆粒，可接近結合靶位302為肽模擬表位，如實施例II所述。將表面引入樣品混合物，該混合物可含有結合構建物101，其可結合目標化合物形成構建物-化合物復合物201，或未結合目標化合物?？山咏Y合靶位301結合任何未結合目標化合物的結合構建物101的識別部分102，形成構建物-表面復合物303。
圖4顯示用于分離構建物-表面復合物303的磁體401，如實施例IV所述。分離該構建物-表面復合物303和任何過量或未結合的表面301，在溶液中留下構建物-化合物復合物202。分離之后，包含在構建物-化合物復合物202中的結合構建物101的核酸部分103可通過任何適合此目的的方法檢測。檢測存在結合構建物101的核酸部分103表明存在目標化合物201。
實施例II具有模擬表位的磁性顆粒的制備本實施例提供了本發(fā)明的一個非限制性實施方案，其中表面為磁性顆粒，具有作為可接近結合靶位的肽模擬表位。在這個模型系統(tǒng)中，使用了識別細菌細胞壁蛋白粘膜炎莫拉氏菌(Moraxellacatarrhalis)OMPE蛋白的抗體。粘膜炎莫拉氏菌OMPE蛋白的細菌重組片段由Buffalo大學的Dr.Timothy Murphy提供，并用作免疫原用于制備單克隆抗體12D.5(Mab 12D.5)。使用重疊的肽作圖法，顯示抗原表位位于重組片段的187-220氨基酸中。對應這個表位的肽被稱為Mopep2，合成為帶有N末端半胱氨酸，用于合成后連接游離巰基結合結構。使用鹽酸2-巰基乙胺(Pierce)將Mab 12D.5裂解成兩個Fab片段，留下能連接到其它分子的活性巰基。
10毫克/毫升磁性顆粒材料Micromod、Nanomag SilicateTM、NH250(批號210213T，產品目錄號13-01-252，Micromod PartikeltechnologieGmbH，Rostock-Warnemuende，Germany)，其在表面含有游離氨基，將其在DMSO中與140微克SIAB反應，并在黑暗中攪拌2小時。通過磁體的方法分離顆粒，隨后在50毫摩爾pH 9.6的硼酸鈉緩沖液(含有5毫摩爾EDTA)中與100微升1.7mg/ml Mopep2(DMSO中)孵育，孵育過夜。Mopep2肽上的游離巰基與SIAB處理過的磁性顆粒反應，產生了穩(wěn)定的硫醚鍵。使用游離半胱氨酸封閉未反應的位點，洗滌Mopep2標記的顆粒，重新懸浮于1毫升PBS中進行分析。
為了測試Mopep2顆粒結合溶液中游離12D.5 Mab的能力，進行了抑制ELISA。10微升Mopep2顆?；蝾愃朴门Ｑ灏椎鞍?BSA)標記的對照顆粒，與在PBS中2倍連續(xù)稀釋的辣根過氧化物酶(HRPO)綴合12D.5在96孔微量滴定板上孵育(總體積100微升)，辣根過氧化物酶綴合12D.5以2微克/毫升開始，孵育30分鐘。依靠磁體將顆粒分離到孔底部，將每50微升各組稀釋液添加到涂布Mopep2的平板上，再孵育30分鐘。然后加入3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺底物進行標準的ELISA，允許顯色10分鐘，不添加終止液在630納米處讀取吸光度。數據描述于圖5中，顯示Mopep2顆粒能從溶液中結合和分離單克隆抗體12D5(12D.5 Mab)辣根過氧化物酶(HRPO)綴合物，因此阻止了12D.5 Mab HRPO綴合物以劑量依賴方式結合到涂布Mopep2的孔。使用牛血清白蛋白(BSA)涂布的顆粒不能抑制12D.5Mab HRPO綴合物結合到涂布Mopep2的孔。
實施例III結合構建物的制備本實施例提供了結合構建物的一個實施方案，其中Fab片段用作結合構建物的識別部分。質粒pUC19購自Invitrogen，質粒DNA通過EcoRI線性化。從瓊脂糖凝膠中抽提和純化線性化pUC19 DNA。將該DNA連接到Mab 12D.5的Fab片段，用作結合構建物的核酸部分。隨后使用商業(yè)可獲得的引物從線性化pUC19模板中擴增1kb的片段。為了產生可通過游離巰基(-SH)連接12D.5 Fab片段并用作結合構建物核酸部分的DNA片段，通過可獲得的胺將5’-補骨脂素、3’-氨基寡核苷酸結合到SIAB連接體。存在過量寡核苷酸下使pUC 1kb的片段變性，并使用長波紫外急速(snap)退火到補骨脂素上。使用分子量截留(MWCO)濾器去除過量的寡核苷酸，然后使用連接連接體的游離巰基結合末端將SIAB/pUC模板結合到Fab片段。整個結合構建物稱為Fab-DNA，不進一步純化。
實施例IV通過PCR檢測目標化合物本實施例提供了檢測目標化合物的一個實施方案，其中通過PCR擴增結合構建物的核酸部分。這個試驗證明Fab-DNA結合構建物(Mab12D.5/pUC19構建物)結合目標化合物即游離抗原(OMPE或rOMPE的細菌重組片段)的能力，因此在溶液中形成了構建物-化合物復合物。具有可接近結合靶位(Mopep2肽)的表面結合任何未結合目標化合物的Fab-DNA，并使用磁體分離表面，在溶液中留下構建物-化合物復合物(結合抗原的Fab-DNA)，結合構建物的核酸部分(pUC19)用于核酸擴增。
在兩倍稀釋步驟中，在1ml PBS中將rOMPE從100ng/ml滴定至1.56ng/ml。各系列稀釋物使用20微升(8微克Fab-DNA)孵育30分鐘，然后每個孔添加10微升Mopep2顆粒，再孵育30分鐘。對照孔包括(1)1.1毫升PBS和0.2毫升Fab-DNA，無rOMPE(陽性對照)，(2)1毫升PBS、0.2毫升Fab-DNA和0.1毫升顆粒(陰性對照)。將孔暴露于稀土元素磁體下15分鐘，從溶液中分離磁性顆粒，從每個孔中移取0.2毫升溶液進行擴增。
如下通過PCR擴增樣品。50微升PCR反應混合物含有5微升無MgCl2的10X PCR緩沖液、1微升50毫摩爾的MgCl2、0.5微升50毫摩爾的dNTP、1微升pUC19的有義或反義引物、1微升Taq聚合酶、2微升樣品(溶液)和38.5微升ddH2O。有義引物具有序列CCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGC(SEQ ID NO.1)。反義引物具有序列CACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTG(SEQ ID NO.2)。所有序列以5’-3’方向給出。
使用下列循環(huán)參數擴增樣品
將PCR樣品在1％瓊脂糖凝膠上解析，并通過溴化乙錠顯示。將10微升各濃度的PCR樣品裝載于凝膠。PCR引物擴增大約2650bp的pUC19片段。使用1kb延伸DNA梯(DNA Ladder)(Invitrogen)作為分子量標準。如圖6所示，PCR引物在以下片段中擴增了2.6kb的DNA片段790皮克、395皮克、198皮克、98皮克和12皮克。在49皮克和24皮克的樣品中觀察到非常細微的條帶。
實施例V目標化合物的檢測檢查不同類型目標化合物的非限制性實例如下。
β-淀粉樣蛋白初原纖維在這個實施例中，目標化合物為淀粉樣β蛋白的低聚物，稱為原纖維。淀粉樣蛋白β初原纖維的檢測可用于阿爾茨海默病的早期檢測。樣品為來自懷疑患有或有風險患阿爾茨海默病的患者的血清或腦脊液(CSF)。結合構建物包括(1)識別部分，為識別原纖維的抗體或抗體片段；(2)自然中不存在的核酸部分。核酸部分為能被合成引物識別的DNA模板，該引物設計為以低嚴謹度結合模板進行PCR擴增。將結合構建物加入100微升血清樣品中至10納克/毫升濃度，孵育充足時間以允許抗體或抗體片段結合存在于樣品中的原纖維，因此在樣品中形成構建物-化合物(構建物-原纖維)復合物。結合表面是使用可接近結合靶位標記的磁性顆粒，該結合靶位為用作免疫原產生抗原纖維抗體(結合構建物的識別部分)的相同肽序列。磁性顆粒具有伯胺反應基團，使用水溶性碳二亞胺如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)，允許免疫原肽通過它的羧基末端羧基結合到顆粒。將10微升30％顆粒懸浮液添加到含有構建物-化合物(構建物-原纖維)復合物的溶液中，允許顆粒與未結合的抗原纖維/DNA結合構建物形成構建物-表面復合物。將磁體應用于溶液，分離磁性顆粒，因此分離了未結合的結合構建物，在溶液中留下構建物-化合物復合物。將2微升所得溶液(含有構建物-化合物復合物)添加到含有引物、游離核苷酸和Taq DNA聚合酶的PCR反應溶液中。擴增在溶液中以構建物-化合物復合物存在的任何結合構建物的DNA部分。將PCR反應物在1％瓊脂糖凝膠上解析，并通過溴化乙錠染色顯示。通過凝膠中是否存在對應擴增DNA片段的分子量的條帶，表明樣品中是否存在淀粉樣蛋白β初原纖維。嗜肺軍團菌(Legionella pneumophilia)抗原在這個實施例中，目標化合物為嗜肺軍團菌血清群1糖抗原。嗜肺軍團菌是稱為軍團病和龐蒂亞克熱的社區(qū)獲得性肺炎的致病因子。血清群1是引起大多數軍團病的原因。樣品優(yōu)選為來自懷疑感染嗜肺軍團菌的患者的尿樣。結合構建物包括(1)識別部分，為識別嗜肺軍團菌血清群1糖抗原(“抗原”)的抗體或抗體片段，(2)在自然中不存在的核酸部分。核酸部分為能被合成引物識別的DNA模板，該引物設計為以低嚴謹度結合到模板進行PCR擴增。將結合構建物加入100微升尿樣中至10納克/毫升的濃度，孵育足夠時間以允許抗體或抗體片段結合存在于樣品中的嗜肺軍團菌血清群1糖抗原，因此在溶液中形成構建物-化合物(構建物-抗原)復合物。結合表面是使用可接近結合靶位即能結合抗體或抗體片段可變區(qū)的肽模擬表位(結合構建物的重組片段)標記的磁性顆粒。合適的肽模擬表位可通過本領域已知的方法獲得，例如，隨機或非隨機肽文庫或組合肽合成的噬菌體展示，然后通過親和選擇(Smith & Petrenko(1997)Chem.Rev.，97391-410；Kramer等，(1993)Peptide Res.，6314-319)。磁性顆粒具有伯胺反應基團，使用水溶性碳二亞胺如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)，允許肽模擬表位通過它的羧基末端羧基結合到顆粒。將10微升30％顆粒懸浮液添加到含有構建物-化合物(構建物-嗜肺軍團菌血清群1糖抗原)復合物的溶液中，允許顆粒與未結合的抗抗原纖維/DNA結合構建物形成構建物-表面復合物。將磁體應用于溶液，分離磁性顆粒，因此分離了未結合的結合構建物，在溶液中留下構建物-化合物復合物。將2微升所得溶液(含有構建物-化合物復合物)添加到含有引物、游離核苷酸和Taq DNA聚合酶的PCR反應溶液中。擴增溶液中以構建物-化合物復合物存在的任何結合構建物的DNA部分。將PCR反應物在1％瓊脂糖凝膠上解析，并通過溴化乙錠染色顯示。通過凝膠中是否存在對應擴增DNA片段的分子量的條帶，表明樣品中是否存在嗜肺軍團菌血清群1糖抗原。
結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)特異性人抗體在這個實施例中，目標化合物為結核分枝桿菌-特異性人IgG，其特異性作用來自結核分枝桿菌38千道爾頓胞外蛋白(抗MTb IgG)。結核分枝桿菌是人中肺結核的致病因子。樣品優(yōu)選為來自懷疑感染結核分枝桿菌的患者的血清。結合構建物包括(1)識別部分，其是被抗MTb IgG可變區(qū)識別和結合的肽表位或模擬表位，(2)核酸部分，最優(yōu)選的核酸部分中核酸部分的序列不包括預期在樣品中存在的序列，例如，在哺乳動物或細菌中不存在的來自高等植物的序列。識別部分可以是抗MTb IgG模擬表位，或是被抗MTb IgG識別的細菌蛋白或肽的衍生天然肽序列；在這兩種情況中，該肽能結合結核分枝桿菌特異性人IgG的亞類，形成構建物-化合物(構建物-抗MTb IgG)復合物。核酸部分為能被合成引物識別的DNA模板，該引物設計為以低嚴謹度結合到模板進行PCR擴增。將結合構建物加入100微升血清樣品中至10納克/毫升的濃度，孵育足夠時間以允許結合構建物的識別部分結合存在于樣品中的抗MTb IgG，因此在溶液中形成構建物-化合物(構建物-抗MTB IgG)復合物。結合表面為瓊脂糖珠，能識別和結合結合構建物識別部分的抗體或抗體片段連接到瓊脂糖珠上。該瓊脂糖珠具有醛反應性基團，其可以使用氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)與抗體重鏈上的氨基交聯。將20微升30％顆粒懸浮液添加到含有構建物-化合物(構建物-抗MTb IgG)復合物的溶液中，允許珠與未結合的肽/DNA結合構建物形成構建物-表面復合物。將混合物置于Eppendorf管，離心，從懸浮液中沉淀瓊脂糖珠，在溶液上清中留下保持游離的構建物-化合物(構建物-抗MTb IgG)。將2微升上清溶液添加到含有引物、游離核苷酸和Taq DNA聚合酶的PCR反應溶液中。擴增在溶液中以構建物-化合物復合物存在的任何結合構建物的DNA部分。將PCR反應物在1％瓊脂糖凝膠上解析，并通過溴化乙錠染色顯示。通過凝膠中是否存在對應擴增DNA片段的分子量的條帶表明樣品中是否存在結核分枝桿菌-特異性人IgG。
所有標題是為了方便讀者，不應用于限制標題后的文本的含義，除非另有說明?？蓪Ρ景l(fā)明進行各種變化和修改而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明無意受限于本說明書中的具體描述或附圖中的描述，而只是如權利要求中的闡述。
序列表<110>Lawton，Robert L.
<120>可溶性分析物的檢測和擴增<130>BX/TF-101.P.1<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構建物<400>1cctctagagt cgacctgcag gcatgc 26<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成構建物<400>2cactggccgt cgttttacaa cgtcgtg 2權利要求
1.一種在樣品中檢測目標化合物的方法，所述方法包括以下步驟a)提供包含識別部分和核酸部分的結合構建物，所述識別部分識別和結合所述目標化合物；b)將所述結合構建物與所述樣品混合形成構建物-化合物復合物；c)提供一種或多種表面，其中所述表面具有一個或多個能識別和結合所述結合構建物的所述識別部分的可接近結合靶位；d)將所述一種或多種表面引入所述結合構建物和所述樣品的所述混合物，以使得所述一種或多種表面與任何未結合的結合構建物形成構建物-表面復合物；e)從所述混合物中分離所述構建物-表面復合物，留下所述構建物-化合物復合物；f)檢測是否存在所述結合構建物的所述核酸部分；其中存在所述結合構建物的所述核酸部分表明在所述樣品中存在所述目標化合物。
2.權利要求1的方法，其中所述-種或多種表面選自顆粒、粉末、珠、平面表面、非平面表面、管、孔、非多孔薄膜、非多孔膜、多孔薄膜、多孔膜、纖維、填充物、篩孔、網格、濾器、基質、凝膠和其組合。
3.權利要求1的方法，其中所述一種或多種表面包括顆粒。
4.權利要求3的方法，其中所述顆粒包括磁性顆粒。
5.權利要求4的方法，其中所述步驟(e)包括依靠磁體將所述構建物-表面復合物分離出所述混合物。
6.權利要求1的方法，其中在步驟(f)中，所述檢測是否存在所述結合構建物的所述核酸部分包括所述核酸部分的擴增、所述核酸部分的雜交、酶擴增、標記的檢測或其組合。
7.權利要求1的方法，其中在步驟(f)中，所述檢測是否存在所述結合構建物的所述核酸部分包括所述核酸部分的擴增。
7.權利要求7的方法，其中所述核酸部分的所述擴增包括聚合酶鏈反應。
8.權利要求5的方法，其中在步驟(f)中，所述檢測是否存在所述結合構建物的所述核酸部分包括所述核酸部分的擴增、所述核酸部分的雜交、酶擴增、標記的檢測或其組合。
9.權利要求5的方法，其中在步驟(f)中，所述檢測是否存在所述結合構建物的所述核酸部分包括所述核酸部分的擴增。
10.權利要求9的方法，其中所述核酸部分的所述擴增包括聚合酶鏈反應。
11.權利要求1的方法，其中所述識別部分包含受體。
12.權利要求1的方法，其中所述識別部分包含抗原。
13.權利要求1的方法，其中所述識別部分包含抗體或抗體片段。
14.權利要求1的方法，其中所述識別部分包含單鏈抗體可變區(qū)片段。
15.權利要求1的方法，其中所述識別部分包含Fab片段。
16.權利要求15的方法，其中所述Fab片段通過Fab片段的游離巰基連接至所述核酸部分。
17.權利要求12的方法，其中所述目標化合物包含抗體或抗體片段，所述結合構建物的所述識別部分包含被所述目標化合物識別的抗原，所述可接近結合靶位包含能識別和結合所述結合構建物的所述識別部分的抗體或抗體片段。
18.權利要求1的方法，其中所述核酸部分包含DNA。
19.權利要求1的方法，其中所述核酸部分包含RNA。
20.權利要求1的方法，其中所述核酸部分包含的核酸序列不包括預期在樣品中存在的序列。
21.權利要求1的方法，其中所述步驟(a)包括提供兩種或更多不同類型的結合構建物，其中所述兩種或更多不同結合構建物各自具有不同的識別部分和不同的核酸部分。
22.一種增加液相檢測目標化合物的靈敏度的方法，所述方法包括以下步驟a)提供懷疑含有所述目標化合物的樣品；b)提供包含以下部分的結合構建物i)能結合所述目標化合物的識別部分，ii)核酸部分；c)將所述樣品與所述結合構建物接觸一段時間，所述時間足以允許所述識別部分結合所述樣品中存在的所述目標化合物，因此在溶液中形成了構建物-化合物復合物；d)提供一種或多種表面，其中所述一種或多種表面具有一個或多個能結合所述識別部分的可接近結合靶位；e)將所述一種或多種表面與所述溶液接觸一段時間，所述時間足以使得所述一個或多個可接近結合靶位結合未結合所述目標化合物的任何結合構建物的所述識別部分，因此形成構建物-表面復合物；f)從所述溶液分離所述構建物-表面復合物，在所述溶液中留下所述構建物-化合物復合物；g)檢測所述溶液中是否存在所述結合構建物的所述核酸部分，其中從所述溶液中分離所述構建物-表面復合物導致基本分離了所有未結合目標化合物的結合構建物，增加了所述目標化合物的檢測靈敏度，并且其中存在所述結合構建物的所述核酸部分表明在所述樣品中存在所述目標化合物。
23.權利要求22的方法，其中所述一種或多種表面選自顆粒、粉末、珠、平面表面、非平面表面、管、孔、非多孔薄膜、非多孔膜、多孔薄膜、多孔膜、纖維、填充物、篩孔、網格、濾器、基質、凝膠和其組合。
24.權利要求22的方法，其中所述一種或多種表面包括顆粒。
25.權利要求24的方法，其中所述顆粒包括磁性顆粒。
26.權利要求25的方法，其中所述步驟(f)包括依靠磁體從所述溶液基本分離了所有所述構建物-表面復合物。
27.權利要求22的方法，其中在步驟(g)中，所述檢測是否存在所述結合構建物的所述核酸部分包括所述核酸部分的擴增、所述核酸部分的雜交、酶擴增、標記的檢測或其組合。
28.權利要求22的方法，其中在步驟(g)中，所述檢測是否存在所述結合構建物的所述核酸部分包括所述核酸部分的擴增。
29.權利要求28的方法，其中所述核酸部分的所述擴增包括聚合酶鏈反應。
30.權利要求26的方法，其中在步驟(g)中，所述檢測是否存在所述結合構建物的所述核酸部分包括所述核酸部分的擴增、所述核酸部分的雜交、酶擴增、標記的檢測或其組合。
31.權利要求26的方法，其中在步驟(g)中，所述檢測是否存在所述結合構建物的所述核酸部分包括所述核酸部分的擴增。
32.權利要求31的方法，其中所述核酸部分的所述擴增包括聚合酶鏈反應。
33.權利要求22的方法，其中所述識別部分包含受體。
34.權利要求22的方法，其中所述識別部分包含抗原。
35.權利要求22的方法，其中所述識別部分包含抗體或抗體片段。
36.權利要求22的方法，其中所述識別部分包含單鏈抗體可變區(qū)片段。
37.權利要求22的方法，其中所述識別部分包含Fab片段。
38.權利要求37的方法，其中所述Fab片段通過Fab片段的游離巰基連接所述核酸部分。
39.權利要求34的方法，其中所述目標化合物包含抗體或抗體片段，所述結合構建物的所述識別部分包含被所述目標化合物識別的抗原，所述可接近結合靶位包含能識別和結合所述結合構建物的所述識別部分的抗體或抗體片段。
38.權利要求21的方法，其中所述核酸部分包含DNA。
39.權利要求21的方法，其中所述核酸部分包含RNA。
40.權利要求21的方法，其中所述核酸部分包含的核酸序列不包括預期在樣品中存在的序列。
41.權利要求21的方法，其中所述步驟(b)包括提供兩種或更多不同類型的結合構建物，其中所述兩種或更多不同結合構建物各自具有不同的識別部分和不同的核酸部分。
42.一種檢測樣品中目標化合物的試劑盒，所述樣品懷疑含有所述目標化合物，所述試劑盒包含a)結合構建物，包含i)識別和結合所述目標化合物的識別部分，ii)核酸部分；b)一種或多種具有一個或多個可接近結合靶位的表面，所述結合靶位能結合所述結合構建物的所述識別部分。
43.權利要求42的試劑盒，所述試劑盒還包含核酸擴增引物對，其中所述引物對的各引物能在所述核酸部分的靶核酸序列3’末端與它的互補序列雜交。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測低水平存在于樣品中的目標化合物的方法。具體而言，本發(fā)明涉及通過核酸標記的結合構建物、分離未結合核酸標記的結合構建物以及液相中檢測結合的核酸標記的結合構建物，檢測溶液中的目標化合物的方法。本發(fā)明尤其適用于與核酸擴增反應聯合，檢測溶液中是否存在結合構建物的核酸部分，表明是否存在目標化合物。
文檔編號C12NGK1875116SQ200480032060
公開日2006年12月6日 申請日期2004年8月31日 優(yōu)先權日2003年9月2日
發(fā)明者羅伯特·L·勞頓 申請人:羅伯特·L·勞頓