專利名稱：借助分析物/聚合物活化劑雙層排列檢測(cè)分析物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析傳感器領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及借助電極排列檢測(cè)樣品中分析物的方法，所述電極排列的特征在于在電極表面形成分析物和增加所述分析物導(dǎo)電性的試劑的導(dǎo)電雙層。本發(fā)明還涉及用于進(jìn)行這種方法的電極排列，以及這種電極排列作為生物傳感器的用途。
背景技術(shù)：
諸如大分子生物聚合物的分析物的檢測(cè)和定量是分析化學(xué)以及生物化學(xué)、食品工程或醫(yī)學(xué)中的基本方法。至今為止，用于確定生物聚合物存在和濃度的最常用方法包括通過放射自顯影、熒光、化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光以及電化學(xué)技術(shù)進(jìn)行的檢測(cè)(例如在Bakker，E.and Telting-Diaz.M.(2002)Anal.Chem.74，2781-2800中綜述)。
但是，放射自顯影由于使用危險(xiǎn)的放射物質(zhì)而在許多領(lǐng)域不能應(yīng)用，而光學(xué)檢測(cè)方法通常涉及繁雜的標(biāo)記程序以及昂貴的試劑與技術(shù)設(shè)備。另一方面，電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)由于高靈敏度和低成本已經(jīng)變成有吸引力的替代手段。
在核酸分子的檢測(cè)方面，目前使用三種主要的電化學(xué)檢測(cè)方法，即導(dǎo)電性測(cè)量(Park，S.J.et al.(2002)Science 295，1503-1506)、核酸嵌入方法(Zeman，S.M.et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，11561-11565；Erkkila，K.E.et al.(1999)Chem.Rev.99，2777-2795)和通過催化性擴(kuò)增的檢測(cè)(Caruana，D.J.& Heller，A.J.(1999)J.Am.Chem.Soc.121，769-774；Patolsky，F(xiàn).et al.(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41，3398-3402)。
Park等，同上報(bào)道了使用經(jīng)金納米顆粒功能化的寡核苷酸的DNA陣列檢測(cè)方法。但是發(fā)現(xiàn)500fM的檢測(cè)限不足以鑒定非常稀少的核酸物質(zhì)，例如編碼轉(zhuǎn)錄因子或某些細(xì)胞表面受體的核酸物質(zhì)。核酸嵌入方法經(jīng)常受制于低的信噪比，因?yàn)榇蠖鄶?shù)DNA嵌入劑不僅嵌入到雙鏈DNA(dsDNA)中，還通過靜電相互作用和單鏈DNA分子結(jié)合，雖然結(jié)合程度低得多。但是已經(jīng)合成了改進(jìn)的二茂鐵標(biāo)記的萘二酰亞胺穿線(threading)嵌入劑，其更高選擇性(但非派他性)地與dsDNA結(jié)合(Takenaka，S.etal.(2000)Anal.Chem.72，1334-1341)。
目前DNA生物電子學(xué)方面的進(jìn)展集中于采用核酸/酶偶聯(lián)物作為生物電催化劑(Caruana & Heller，同上；Patolsky et al.，同上)。類似地，也使用核酸功能化的脂質(zhì)體或納米顆粒作為顆粒標(biāo)記來放大DNA傳感過程。最近，報(bào)道了使用酶放大檢測(cè)法對(duì)于38個(gè)堿基的寡核苷酸的檢測(cè)限是0.5fM，這對(duì)應(yīng)于約3000個(gè)分子(Zhang，Y.et al.(2003)Anal.Chem.，page EST 2.4)。但是，只有當(dāng)分析通常長度為20-50個(gè)堿基的短DNA寡核苷酸時(shí)才達(dá)到這種靈敏度。已經(jīng)表明使用這些方法來檢測(cè)較大的核酸分子如基因組DNA是困難的，因?yàn)楸尘靶盘?hào)高，這導(dǎo)致pM或甚至nM級(jí)的相當(dāng)?shù)挽`敏度。
因此，仍需要能夠克服上述缺陷并允許以高靈敏度檢測(cè)大分子分析物的替代性分析物檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了借助檢測(cè)電極對(duì)分析物分子進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)的方法，該方法包括(a)將能夠結(jié)合待檢測(cè)分析物分子的捕獲分子固定在檢測(cè)電極上；(b)使電極和假設(shè)含有待檢測(cè)分析物分子的溶液接觸；(c)使所述溶液中所含的分析物分子與電極上的捕獲分子結(jié)合，從而使得形成捕獲分子和分析物分子之間的復(fù)合物，所述復(fù)合物在電極上形成第一層；(d)使檢測(cè)電極與電化學(xué)活化劑接觸，其中所述的電化學(xué)活化劑具有靜電凈電荷，其與捕獲分子和分析物分子之間形成的復(fù)合物的靜電凈電荷互補(bǔ)，從而在電極上形成第二層，其中所述第二層和所述第一層一起形成導(dǎo)電雙層；(e)使檢測(cè)電極與能夠分別從電極向電化學(xué)活化劑或相反方向傳遞電子的試劑接觸；(f)在檢測(cè)電極上進(jìn)行電測(cè)量；和(g)通過將獲得的電測(cè)量結(jié)果和對(duì)照測(cè)量結(jié)果比較來檢測(cè)分析物。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種電極排列，包含用于如本文所述對(duì)分析物分子進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)的檢測(cè)電極，包含(a)檢測(cè)電極上的第一層，包含捕獲分子和分析物分子之間的復(fù)合物，所述捕獲分子能夠結(jié)合待檢測(cè)的分析物分子；和(b)包含電化學(xué)活化劑的第二層，其中所述的電化學(xué)活化劑具有靜電凈電荷，其與捕獲分子和分析物分子之間形成的復(fù)合物的靜電凈電荷互補(bǔ)，其中所述第二層和第一層一起形成導(dǎo)電雙層。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了電化學(xué)檢測(cè)分析物分子的生物傳感器，包含(a)檢測(cè)電極；(b)檢測(cè)電極上的第一層，包含捕獲分子和分析物分子之間的復(fù)合物，所述捕獲分子能夠結(jié)合待檢測(cè)的分析物分子；和(c)包含電化學(xué)活化劑的第二層，其中所述的電化學(xué)活化劑具有靜電凈電荷，其與捕獲分子和分析物分子之間形成的復(fù)合物的靜電凈電荷互補(bǔ)，其中所述第二層和第一層一起形成導(dǎo)電雙層。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種水溶性氧化還原聚合物，包含(a)包含可聚合二茂鐵衍生物的第一單體單元；和(b)包含丙烯酸衍生物的第二單體單元，所述丙烯酸衍生物具有能夠獲得凈電荷的(末端)一級(jí)酸或堿、酸或堿官能團(tuán)。
在一種實(shí)施方案中，該新型水溶性氧化還原聚合物中的丙烯酸衍生物由通式(I)表示 其中R選自CnH2n-NH2、CnH2n-COOH、NH-CnH2n-PO3H和NH-CnH2n-SO3H，其中烷基鏈可以是任選取代的，并且其中n是0-12的整數(shù)。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了制備水溶性氧化還原聚合物的方法，所述方法包括將第一單體單元和第二單體單元聚合，所述第一單體單元包含可聚合的二茂鐵衍生物，所述第二單體單元包含丙烯酸衍生物，所述丙烯酸衍生物具有能夠獲得凈電荷的酸或堿官能團(tuán)，其中所述聚合在含水的醇介質(zhì)中進(jìn)行。


參照詳細(xì)描述，并結(jié)合非限制性的實(shí)施例和附圖，將更好地理解本發(fā)明，所述附圖中圖1描述了根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法的示意性說明。首先，如圖1a所示，將能夠結(jié)合待檢測(cè)分析物的捕獲分子20固定在檢測(cè)電極10的表面上。任選的，可以加入封閉劑15——單獨(dú)加入或和捕獲分子一起加入——以占據(jù)電極表面上的自由結(jié)合位點(diǎn)，從而減少背景信號(hào)。接著使檢測(cè)電極暴露于假設(shè)含有目標(biāo)分析物30的溶液。使得分析物分子與捕獲分子結(jié)合，在檢測(cè)電極的表面上形成第一層。然后，使電化學(xué)活化劑40和試劑50與電極表面接觸(以任意順序或作為混合物)，其中所述的試劑50用于從電極向電化學(xué)活化劑或相反方向傳遞電子。電化學(xué)活化劑具有靜電凈電荷，其與捕獲分子和分析物分子之間形成的復(fù)合物的靜電凈電荷互補(bǔ)，從而在電極上形成第二層，其中所述的第二層和第一層一起形成導(dǎo)電雙層。在任選的底物分子55存在下，從底物的催化性氧化產(chǎn)生的電流經(jīng)電流分析檢測(cè)。電流與樣品溶液中的目標(biāo)分析物濃度直接相關(guān)。圖1b說明了使用接頭分子以改性檢測(cè)電極的表面(如金電極)。
圖2描述了編碼全長大鼠TP53cDNA(泳道1-3)和全長GAPDH cDNA(泳道4-6)的、使用不同比例的生物素-dUTP/dTTP的PCR產(chǎn)物的代表性凝膠電泳分離。泳道M，DNA大小標(biāo)記物。泳道1-3分別對(duì)應(yīng)的生物素-16-dUTP/dTTP比例為0∶100、35∶65和65∶35。泳道4-6分別對(duì)應(yīng)的生物素-21-dUTP/dTTP比例為0∶10、1∶10和2∶10。
圖3說明金電極的循環(huán)伏安圖，其中(a)在2.5mM K3Fe(CN)6和0.50M Na2SO4中、包覆有混合自組裝單層，(b)在PBS中、包覆有DNA/氧化還原聚合物雙層，(c)在2.5mM K3Fe(CN)6和0.50M Na2SO4中，包覆有DNA/氧化還原聚合物雙層。掃描速率100mV/s。為清楚起見，(b)中的電流刻度放大了10倍。
圖4說明在PBS(曲線a)和20mM葡萄糖溶液(曲線b)中和GAPDH cDNA雜交后金電極的循環(huán)伏安圖，(A)使用與GAPDH cDNA互補(bǔ)的捕獲探針，(B)使用與GAPDH cDNA不互補(bǔ)的捕獲探針。掃描速率10mV/s。
圖5說明在PCR混合物中與GAPDH cDNA雜交后金電極的電流分析反應(yīng)，(a)使用與GAPDH cDNA互補(bǔ)的捕獲探針，(b)使用與GAPDH cDNA不互補(bǔ)的捕獲探針。工作電位0.36V，40mM葡萄糖。
圖6說明分別與50、100、200和500fM TP53 cDNA在2.5μl小滴中雜交后金電極的電流分析反應(yīng)。工作電位0.36V，40mM葡萄糖。
圖7說明與大腸桿菌16S rRNA、大腸桿菌23S rRNA和全長大鼠GAPDH cDNA的混合物雜交后金電極的電流分析反應(yīng)。曲線(a)對(duì)應(yīng)于大腸桿菌16S rRNA的反應(yīng)，曲線(b)對(duì)應(yīng)于大鼠GAPDH cDNA的反應(yīng)，而曲線(c)表示空白對(duì)照。使用1μl小滴。工作電位0.35V，60mM葡萄糖。
圖8說明與200fM的大腸桿菌16S rRNA特異性DNA捕獲探針在1μl小滴中雜交后金電極的電流分析反應(yīng)，所述探針分別具有(a)完全互補(bǔ)的合成寡核苷酸、(b)單堿基錯(cuò)配的寡核苷酸和(c)兩個(gè)堿基錯(cuò)配的寡核苷酸，以評(píng)價(jià)分析系統(tǒng)的靈敏度。工作電位0.35V，60mM葡萄糖。
圖9說明氧化電流對(duì)分析物濃度的依賴性。將GAPDH cDNA捕獲探針固定在金電極的表面上，并與10μM的生物素化的GAPDH cDNA接觸。雜交后，通過親合素-生物素相互作用結(jié)合葡萄糖氧化酶/親合素偶聯(lián)物。最后，通過層層間靜電自組裝將氧化還原聚合物帶到電極表面上。葡萄糖檢測(cè)介質(zhì)PBS(pH 7.4)。工作電位0.35V。
圖10所示為發(fā)生在氧化還原聚合物介導(dǎo)的生物傳感器中的偶聯(lián)氧化還原反應(yīng)的示意圖。
圖11說明本發(fā)明的水溶性并可交聯(lián)的聚合物的基本單元的結(jié)構(gòu)。該圖示出了乙烯基二茂鐵和丙烯酸衍生物的共聚物中發(fā)現(xiàn)的重復(fù)單元。
圖12說明乙烯基二茂鐵和丙烯酸衍生物的共聚反應(yīng)中的一般反應(yīng)方程式。
圖13所示為根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的氧化還原聚合物PAA-VFc和PAAS-VFc的傅立葉變換紅外(FT-IR)光譜。
圖14所示為Fc、PAA、PAAS和與VFc共聚而得到的共聚物的紫外-可見光譜。
圖15所示為不同系統(tǒng)中的氧化還原聚合物的循環(huán)伏安圖。使用磷酸鹽緩沖液，獲得伏安圖所使用的電位掃描速率為100mV/s。
圖16示出了與金電極上的葡萄糖氧化酶-牛血清白蛋白(GOx-BSA)膜交聯(lián)的氧化還原聚合物PAA-VFc的另一循環(huán)伏安圖。使用磷酸鹽緩沖液，獲得伏安圖所使用的電位掃描速率為50mV/s。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明基于下列發(fā)現(xiàn)，即分析物如生物聚合物(通常是非導(dǎo)電性的或僅有弱的導(dǎo)電性)的檢測(cè)靈敏度可以通過使用電化學(xué)活化劑顯著提高，所述電化學(xué)活化劑以溶解形式存在，其在溶液中的凈電荷與待檢測(cè)的分析物分子或包含待檢測(cè)的分析物分子的復(fù)合物的凈電荷互補(bǔ)(即相反)。由于其相反的電荷，分析物和包含分析物的復(fù)合物與電化學(xué)活化劑一起通過靜電層層自組裝形成非常穩(wěn)定的雙層。該雙層充當(dāng)跨電極全部表面的“電子交換橋”(或電子穿梭)，影響用來檢測(cè)分析物的電極處的電流流動(dòng)。與本領(lǐng)域中已知的其他程序相比，使用雙層還具有提供與電極的更大和更均勻接觸面積的優(yōu)點(diǎn)，有利于增加本發(fā)明檢測(cè)方法的靈敏度。
根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“檢測(cè)”指樣品中分析物的定性和定量檢測(cè)，意味著術(shù)語“檢測(cè)”也包括確定樣品中分析物的缺失。通過使用本方法，可以明確地檢測(cè)到低至約1fM(即10-15M)的分析物濃度。本發(fā)明方法中適于檢測(cè)的分析物濃度范圍為約10-12M～10-15M。進(jìn)行檢測(cè)的分析物濃度上限通常為10-11M。從這一點(diǎn)上說應(yīng)注意在明確認(rèn)為樣品中分析物的存在量高于10-11M時(shí)可以將樣品稀釋，使其量位于本發(fā)明的靈敏度范圍內(nèi)。
本文所用的術(shù)語“捕獲分子”可以指單一類型的分子，例如具有特定核酸序列的單鏈核酸探針。但是，捕獲分子也可包含不同類型的分子，例如具有不同核酸序列的核酸探針(因此其也表現(xiàn)出不同的結(jié)合特異性)。捕獲分子也可以是抗體或其他類型的蛋白質(zhì)結(jié)合分子，如anticalins類型(象抗體一樣表現(xiàn)出對(duì)給定配體的特異性結(jié)合特征的多肽，也參見Beste et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，1898-1903)，其識(shí)別蛋白質(zhì)化合物的不同表面區(qū)域(表位)。使用不同類型的捕獲分子不僅允許同時(shí)或依次檢測(cè)不同的分析物，如兩種或多種基因組DNA，它們中的每一種具有對(duì)一種特定類型捕獲分子的結(jié)合特異性，還允許通過不同的識(shí)別序列如核酸分子的5’-和3’-末端或受體分子的兩個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)來檢測(cè)相同的分析物，增強(qiáng)檢測(cè)到樣品中甚至幾個(gè)拷貝的分析物的可能性。
本文所用的術(shù)語“電化學(xué)活化劑”指能夠活化在分析物和電極之間傳遞電子的因子、與待檢測(cè)分析物結(jié)合(優(yōu)選特異性結(jié)合)、并表現(xiàn)出高于所述分析物的導(dǎo)電性的任意化合物。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，電化學(xué)活化劑是聚合物氧化還原介質(zhì)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，電化學(xué)活化劑含有氧化還原活性金屬離子。這種金屬離子的例子有銀、金、銅、鎳、鐵、鈷、鋨或釕離子或其混合物，它們都能作為陽離子通過靜電相互作用與待檢測(cè)分析物表面上的帶負(fù)電的基團(tuán)結(jié)合。例如，如果待檢測(cè)分析物是核酸，這種陽離子與所述核酸的帶負(fù)電荷的磷酸骨架結(jié)合。如果要檢測(cè)蛋白質(zhì)，這種陽離子可以與酸性氨基酸如天冬氨酸或谷氨酸的側(cè)鏈結(jié)合。
通常，合適的聚合物氧化還原介質(zhì)應(yīng)該具有在樣品被分析期間阻止或?qū)嵸|(zhì)性減少氧化還原物質(zhì)擴(kuò)散損失的化學(xué)結(jié)構(gòu)。一種類型的這種非釋放性聚合物氧化還原介質(zhì)包含與聚合化合物共價(jià)結(jié)合的氧化還原物質(zhì)。這種氧化還原聚合物通常是過渡金屬化合物，其中基于氧化還原活性的過渡金屬的側(cè)基與合適的聚合物骨架共價(jià)結(jié)合，所述聚合物骨架本身可以具有或不具有電活性。這種類型的例子有聚(乙烯基二茂鐵)和聚(乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酰胺)。作為替代方案，聚合物氧化還原介質(zhì)可以包含離子性結(jié)合的氧化還原物質(zhì)。通常，這些介質(zhì)包括與帶相反電荷的氧化還原物質(zhì)結(jié)合的帶電荷的聚合物。這種類型的例子包括與帶正電荷的氧化還原物質(zhì)如鋨或釕聚吡啶基陽離子結(jié)合的帶負(fù)電荷的聚合物，如Nafion(Dupont)，或反之，與帶負(fù)電荷的氧化還原物質(zhì)如鐵氰化物或亞鐵氰化物結(jié)合的帶正電荷的聚合物，如聚(1-乙烯基咪唑)。此外，氧化還原物質(zhì)還可以與聚合物配位結(jié)合。例如，氧化還原介質(zhì)可以通過將鋨或鈷2，2’-二吡啶基絡(luò)合物和聚(1-乙烯基咪唑)或聚(4-乙烯基吡啶)配位而形成。另一個(gè)例子是與鋨4，4’-二甲基-2，2’-二吡啶基絡(luò)合物配位結(jié)合的聚(4-乙烯基吡啶-共聚-丙烯酰胺)。有用的氧化還原介質(zhì)及其合成方法描述在美國專利No.5,264,104；5,356,786；5,262,035；5320,725；6,336,790；6,551494和6,576,101。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，電化學(xué)活化劑選自本文后面詳細(xì)描述的新型氧化還原聚合物。簡(jiǎn)言之，新型氧化還原聚合物包含聚(乙烯基二茂鐵)、聚(乙烯基二茂鐵)-共聚-丙烯酰胺、聚(乙烯基二茂鐵)-共聚-丙烯酸和聚(乙烯基二茂鐵)-共聚-丙烯酰胺-(CH2)n-磺酸，以及聚(乙烯基二茂鐵)-共聚-丙烯酰胺-(CH2)n-膦酸，其中n是0-12的整數(shù)。
本文所用的術(shù)語“能夠傳遞電子的試劑”指由電化學(xué)活化劑活化時(shí)能夠分別從電極向電化學(xué)活化劑傳遞電子或從電化學(xué)活化劑向電極傳遞電子的任意試劑，即能夠提供并重新接受電子、導(dǎo)致所述試劑的至少一個(gè)原子的氧化態(tài)降低或增加的試劑。因此，該試劑分別結(jié)合、嵌入或連接由分析物/捕獲分子復(fù)合物和電化學(xué)活化劑分子形成的導(dǎo)電雙層。
傳遞電子的試劑可以只用于這一目的。但是，它還可能是能夠傳遞電子的試劑同時(shí)充當(dāng)捕獲分子。當(dāng)待檢測(cè)分析物是酶底物是尤其是這種情形，所述酶底物的轉(zhuǎn)化可以通過電測(cè)量來檢測(cè)(參見實(shí)施例2)。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，能夠傳遞電子的試劑是酶或酶偶聯(lián)物。通常，可以使用導(dǎo)致可檢測(cè)電流產(chǎn)生的任意酶。酶可以選自氧化還原酶。合適的氧化還原酶的例子有葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、乳酸氧化酶、醇脫氫酶、羥基丁酸脫氫酶、乳酸脫氫酶、甘油脫氫酶、山梨醇脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、半乳糖脫氫酶、蘋果酸氧化酶、半乳糖氧化酶、黃嘌呤脫氫酶、醇氧化酶、膽堿氧化酶、黃嘌呤氧化酶、膽堿脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、草酸氧化酶、膽紅素氧化酶、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、胺氧化酶、NADPH氧化酶、尿酸氧化酶、細(xì)胞色素C氧化酶和兒茶酚氧化酶。
通過本發(fā)明方法檢測(cè)的分析物可以是核酸、寡核苷酸、蛋白質(zhì)、肽或其復(fù)合物，如DNA/蛋白質(zhì)復(fù)合物或RNA/蛋白質(zhì)復(fù)合物。分析物也可以是寡糖或多糖或表現(xiàn)出免疫性半抗原特征的游離或偶聯(lián)形式的低分子量化合物。僅舉幾個(gè)例子，這種化合物的例子有小分子藥物、營養(yǎng)物、殺蟲劑或毒素。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，待檢測(cè)分析物是核酸分子。因此，本文所用的術(shù)語“核酸或核酸分子”指基因組DNA、cDNA以及RNA分子。根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“寡核苷酸”指長度約為10-80個(gè)堿基對(duì)(bp)的較小核酸分子(DNA和RNA)，優(yōu)選長度為15-40bp的分子。核酸可以是雙鏈的，但是也可以具有至少一個(gè)單鏈區(qū)，或完全以單鏈形式存在，這種單鏈形式例如是為其檢測(cè)而預(yù)先熱變性或進(jìn)行另一種鏈分離所導(dǎo)致的。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，待檢測(cè)核酸的序列是預(yù)定的，即是已知的，其中可以已知全序列或其至少一部分。由于本發(fā)明檢測(cè)方法的高度靈敏度，待檢測(cè)核酸分子可以來源于基因組樣品，并可以以低拷貝數(shù)、中等拷貝數(shù)或高拷貝數(shù)存在。
用于根據(jù)本發(fā)明方法檢測(cè)核酸的合適捕獲分子是核酸探針，即單鏈DNA或RNA分子。優(yōu)選使用具有與各自的核酸的單鏈區(qū)部分或完全互補(bǔ)的序列的探針。核酸探針可以是合成的寡核苷酸或較長的核酸序列，只要較長的核酸序列不折疊成阻止探針與待檢測(cè)核酸雜交的任意結(jié)構(gòu)即可。還優(yōu)選包含修飾核苷酸如帶有生物素、地高辛或硫醇標(biāo)記物的核酸探針作為捕獲分子。但是，也可以使用DNA或RNA結(jié)合蛋白或試劑作為捕獲分子。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，待檢測(cè)分析物是蛋白質(zhì)或肽。這些可以由21個(gè)天然存在的氨基酸(包括硒代半胱氨酸)組成，但是也可以含有例如由糖殘基或任意類型的翻譯后修飾而修飾的氨基酸殘基。通過本發(fā)明方法，還可以檢測(cè)核酸和蛋白質(zhì)的復(fù)合物，如RNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)RNA靶的復(fù)合物，或轉(zhuǎn)錄因子和其相應(yīng)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的復(fù)合物。
用于檢測(cè)蛋白質(zhì)或肽的優(yōu)選捕獲分子是對(duì)待檢測(cè)蛋白質(zhì)或肽具有結(jié)合活性的任意類型配體。這種配體的例子有低分子量酶激動(dòng)劑或拮抗劑、受體激動(dòng)劑或拮抗劑、藥物、糖、抗體或能夠特異性結(jié)合蛋白質(zhì)或肽的任意分子。
無論與之有結(jié)合活性的分析物如何，都可以將捕獲分子通過合適的物理或化學(xué)相互作用固定到檢測(cè)電極上。這些相互作用例如包括疏水相互作用、范德華相互作用或離子(靜電)相互作用以及共價(jià)鍵。這還意味著捕獲分子可以通過疏水相互作用、范德華相互作用或靜電相互作用直接固定到電極表面上，或者如果電極表面不適于直接固定時(shí)使用接頭分子進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)。還可以使用對(duì)捕獲分子具有結(jié)合活性的分子作為接頭分子，通過由非共價(jià)相互作用即形成復(fù)合物與接頭分子結(jié)合而固定捕獲分子(參見實(shí)施例2，其中葡萄糖氧化酶分子用作捕獲分子)。
根據(jù)本發(fā)明的方法實(shí)際上可以通過使用本領(lǐng)域中已知的包含檢測(cè)或工作電極的任意電極排列進(jìn)行。這種電極排列通常還包含反電極和參考電極。檢測(cè)電極可以是常規(guī)金屬電極(金電極、銀電極等)或由聚合物材料或碳制成的電極，其表面任選地改性，以促進(jìn)捕獲分子的固定。包含檢測(cè)電極的電極排列也可以是常見的硅或砷化鎵襯底，其上覆有金層和氮化硅層，隨后通過常規(guī)的平版印刷和蝕刻技術(shù)結(jié)構(gòu)化，以產(chǎn)生電極排列。在結(jié)構(gòu)化中，檢測(cè)電極和反電極之間的距離可以改變，取決于所用結(jié)構(gòu)化技術(shù)的種類和待檢測(cè)分析物的類型。電極之間的距離通常為約50μm至1000或幾個(gè)1000μm之間。
根據(jù)本發(fā)明的方法還使得在單次測(cè)量中同時(shí)或依次檢測(cè)多于一種分析物。為此，可以使用含有本文中公開的多個(gè)電極排列的襯底，其中將不同類型的捕獲分子固定在單個(gè)電極排列的電極上，所述不同類型捕獲分子的每一種表現(xiàn)出對(duì)特定待檢測(cè)分析物的(特異性)結(jié)合親和力。作為替代方案，還可以使用多個(gè)電極排列，其中每一個(gè)僅被提供一種捕獲分子。
可以用來實(shí)施本發(fā)明方法的電極排列的一個(gè)例子是常規(guī)的交錯(cuò)電極(interdigitated electrode)。因此，可以使用提供有多個(gè)交錯(cuò)電極的排列，即電極陣列，以進(jìn)行平行或多重測(cè)定。另一個(gè)可用的電極排列是槽或腔形式的電極排列，該排列例如通過容納位于兩個(gè)相對(duì)側(cè)壁上的區(qū)域如金層而形成，所述金層上固定有能夠結(jié)合分析物的捕獲分子。
作為第一步，本發(fā)明的方法包括將能夠結(jié)合待檢測(cè)分析物的捕獲分子固定到電極表面上。捕獲分子可以通過本領(lǐng)域已知的任意常規(guī)技術(shù)固定。如果進(jìn)行多重分析，例如可以借助噴墨印刷技術(shù)施加捕獲分子。
任選的，可以加入封閉劑——單獨(dú)加入或和捕獲分子一起加入——以降低背景信號(hào)。當(dāng)單獨(dú)加入時(shí)，封閉劑可以在樣品溶液前加入，或在電極(包覆有捕獲分子)已經(jīng)與樣品溶液接觸后加入，以防止不與分析物分子結(jié)合的那些捕獲分子以非特異性方式和電化學(xué)活化劑相互作用。能夠固定在電極上并能夠防止(或至少顯著降低)捕獲分子與分析物分子之間相互作用的任意試劑都適合于該目的。這種試劑的例子有硫醇分子、二硫化物、噻吩衍生物和聚噻吩衍生物。本發(fā)明使用的封閉劑的一種特別有用類型是硫醇分子，如16-巰基十六烷酸、12-巰基十二烷酸、11-巰基癸酸或10-巰基癸酸。
然后將假設(shè)含有待檢測(cè)分子的溶液如電解質(zhì)與電極接觸，使得分析物分子可以與捕獲分子結(jié)合，在電極表面上形成第一層。如果溶液含有多種不同的待檢測(cè)分析物，選擇條件使得所述分析物可以同時(shí)或依次與其相應(yīng)的捕獲分子結(jié)合。
使得分析物分子與捕獲分子結(jié)合后，可以從電極除去未結(jié)合的捕獲分子。除去未結(jié)合的捕獲分子是任選的，但經(jīng)常是有利的，因?yàn)槟承┎东@分子(如寡核苷酸)不僅能夠結(jié)合待檢測(cè)分析物，還能夠結(jié)合用于增加所述分析物導(dǎo)電性的試劑(如可還原金屬陽離子)，這必然會(huì)干擾電化學(xué)測(cè)量的結(jié)果。
未結(jié)合的捕獲分子可以酶法除去。在捕獲分子是DNA探針的情況下，這可以通過選擇性降解單鏈DNA的酶來完成，如綠豆核酸酶、核酸酶P1或核酸酶S1。如果捕獲分子是低分子量配體，這些配體通過可被酶切割的共價(jià)鍵固定在電極上，例如通過酯鍵固定。在這種情況下，例如可以使用羧基酯水解酶(酯酶)，以除去未結(jié)合的配體分子。該酶選擇性地水解電極和未結(jié)合配體分子之間的酯鍵。相反，電極和由肽或蛋白質(zhì)結(jié)合的配體分子之間的酯鍵保持完整，因?yàn)樵撴I的立體可接近性降低。
然后使通過特異性捕獲分子固定有待檢測(cè)分析物的檢測(cè)電極與電化學(xué)活化劑接觸，使得電化學(xué)活化劑與所述分析物結(jié)合并賦予它們導(dǎo)電性。電化學(xué)活化劑具有靜電凈電荷，其與捕獲分子和分析物分子之間形成的復(fù)合物的靜電凈電荷互補(bǔ)，從而在電極上形成第二層，其中所述第二層和第一層一起通過靜電自組裝形成穩(wěn)定的導(dǎo)電雙層。
進(jìn)而，使檢測(cè)電極與能夠分別從電極向電化學(xué)活化劑傳遞電子或從電化學(xué)活化劑向電極傳遞電子的試劑接觸，這可以促進(jìn)或甚至放大分析物和電極之間的電子傳遞。能夠傳遞電子的試劑可以和電化學(xué)活化劑同時(shí)加入，在使電極排列與電化學(xué)活化劑接觸之前加入，或在電化學(xué)活化劑已經(jīng)結(jié)合于電極排列之后加入?？梢允褂媒?jīng)電化學(xué)活化劑活化(任選地在底物分子存在下)后能夠向或從電化學(xué)活化劑傳遞電子的能夠傳遞電子的任意試劑。因此，試劑結(jié)合、嵌入或連接電極表面上形成的導(dǎo)電雙層。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，試劑是酶或酶偶聯(lián)物。導(dǎo)電雙層結(jié)構(gòu)的層層構(gòu)造顯著降低或甚至消除能夠傳遞電子的試劑的非特異性吸附和靜電相互作用，從而導(dǎo)致更高的信噪比和更高的檢測(cè)限。
然后，在檢測(cè)電極處進(jìn)行電測(cè)量。根據(jù)本發(fā)明的電測(cè)量包括電流和電壓的測(cè)量。然后將獲得的結(jié)果與對(duì)照測(cè)量結(jié)果相比，所述對(duì)照測(cè)量中使用不能與待檢測(cè)分析物結(jié)合的捕獲分子。這種“對(duì)照”捕獲分子的例子是序列不與目標(biāo)核酸分子的序列互補(bǔ)的核酸探針，或不能與待檢測(cè)受體分子相互作用的低分子量配體。如果兩次電測(cè)量，即“樣品”和“對(duì)照”測(cè)量的區(qū)別程度使得所測(cè)值的差異大于預(yù)定閾值，則樣品溶液中含有待檢測(cè)的相關(guān)分析物。
還可以以這樣的方式設(shè)計(jì)方法，使得參照測(cè)量和檢測(cè)分析物的測(cè)量同時(shí)進(jìn)行。例如這可以通過同時(shí)進(jìn)行僅用對(duì)照介質(zhì)的參照測(cè)量和用假設(shè)含有待檢測(cè)分析物的樣品溶液的測(cè)量來實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明還涉及電極排列，包含檢測(cè)電極，該檢測(cè)電極適于如本文所公開的那樣對(duì)分析物分子進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，包含(a)固定在檢測(cè)電極上的第一層，包含捕獲分子和分析物分子之間的復(fù)合物，所述捕獲分子能夠結(jié)合待檢測(cè)的分析物分子；和(b)包含電化學(xué)活化劑的第二層，其中所述的電化學(xué)活化劑具有靜電凈電荷，其與捕獲分子和分析物分子之間形成的復(fù)合物的靜電凈電荷互補(bǔ)，其中所述第二層和第一層一起形成導(dǎo)電雙層。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選電極排列中，在檢測(cè)電極上形成部分導(dǎo)電雙層的電化學(xué)活化劑是能夠在分析物和電極之間傳遞電子的聚合物氧化還原介質(zhì)。更優(yōu)選的是電化學(xué)活化劑含有金屬離子的電極排列，特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些金屬離子選自銀、金、銅、鎳、鐵、鈷、鋨、釕及其混合物。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，電極排列還包含能夠分別從電極向聚合物氧化還原介質(zhì)傳遞電子或從聚合物氧化還原介質(zhì)向電極傳遞電子的試劑，其中試劑結(jié)合、嵌入或連接檢測(cè)電極上的導(dǎo)電雙層。在根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選電極排列中，試劑是酶或酶偶聯(lián)物。
本發(fā)明的檢測(cè)電極和相應(yīng)電極排列可以用作生物傳感器。在許多領(lǐng)域如分析化學(xué)、生物化學(xué)、藥理學(xué)、微生物學(xué)、食品技術(shù)或醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中都需要這種傳感器，以分析給定樣品中特定分析物的存在和濃度。例如，生物傳感器可以用于監(jiān)測(cè)糖尿病患者血液或尿液樣品中的葡萄糖或危急護(hù)理事件期間的乳酸。但是，這些生物傳感器還可用于檢測(cè)或定量飲用水、奶或任意其他食物中的污染物。另一種應(yīng)用是這種生物傳感器在基因組計(jì)劃中的用途，例如用于檢測(cè)作為疾病原因或結(jié)果的基因或基因突變，如單核苷酸多態(tài)性(SNP)。另一方面，這種生物傳感器也可用于蛋白質(zhì)組學(xué)，例如用于分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，以及鑒定特定受體分子的配體。
本發(fā)明還提供了電化學(xué)檢測(cè)分析物分子的生物傳感器，包含(a)檢測(cè)電極；(b)檢測(cè)電極上的第一層，包含捕獲分子和分析物分子之間的復(fù)合物，所述捕獲分子能夠結(jié)合待檢測(cè)的分析物分子；和(c)包含電化學(xué)活化劑的第二層，其中所述的電化學(xué)活化劑具有靜電凈電荷，其與捕獲分子和分析物分子之間形成的復(fù)合物的靜電凈電荷互補(bǔ)，其中所述第二層和第一層一起形成導(dǎo)電雙層。
本發(fā)明還涉及基于二茂鐵的新型氧化還原聚合物，其非常適于用作本發(fā)明檢測(cè)方法以及其他任意電化學(xué)檢測(cè)中的電化學(xué)活化劑。雖然含有二茂鐵的單體通常非常難以進(jìn)行自由基聚合，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)含有二茂鐵的氧化還原聚合物可以極好地并容易地使用醇介質(zhì)和作為自由基引發(fā)劑的過硫酸鹽制備，所述醇介質(zhì)例如從乙醇和水的混合物制得。
這些基于二茂鐵衍生物的聚合物可以用作均相系統(tǒng)中的擴(kuò)散電子傳遞介質(zhì)。
這些基于二茂鐵衍生物的聚合物還可以用作固定在電極表面上的介質(zhì)，然后通過酶和氧化還原聚合物的側(cè)鏈中發(fā)現(xiàn)的可交聯(lián)官能團(tuán)之間的交聯(lián)結(jié)合于蛋白質(zhì)分子，如酶或抗原。
可以用作第一單體以形成氧化還原聚合物的合適可聚合二茂鐵衍生物應(yīng)具有含不飽和鍵的側(cè)鏈單元，所述不飽和鍵如C-C雙鍵或三鍵，或N-N雙鍵或S-S雙鍵。這種側(cè)鏈單元的例子包括由通式R1-C＝C-表示的烯基。雙鍵可以位于沿碳鏈的任意位置。也可以使用芳香基團(tuán)，如苯基、甲苯?；洼粱鶊F(tuán)。另外，可聚合的基團(tuán)也可以含有取代的C原子，其中例如鹵素(如氟、氯、溴或碘)、氧或羥基取代基團(tuán)中碳原子上的一個(gè)或多個(gè)氫原子。其他的例子包括炔基和二硫基。
在本發(fā)明聚合物的一些實(shí)施方案中，可聚合的二茂鐵衍生物選自乙烯基二茂鐵、乙炔二茂鐵、苯乙烯基二茂鐵和氧化乙烯基二茂鐵。
這些衍生物中不飽和鍵的存在將使得二茂鐵分子通過與另一種物質(zhì)通過自由基聚合的共聚而結(jié)合至聚合物骨架，所述另一種物質(zhì)也具有至少一個(gè)不飽和C-C雙鍵或三鍵，或N-N雙鍵或S-S雙鍵。
至于用于和可聚合二茂鐵衍生物共聚的第二種單體單元，可以使用具有能夠獲得凈電荷的一級(jí)酸或堿官能團(tuán)的任意丙烯酸衍生物。這意味著本發(fā)明提供帶正電荷以及帶負(fù)電荷的聚合物，從而保證可以形成如上所解釋的導(dǎo)電雙層，而與捕獲分子和分析物分子之間形成的復(fù)合物的凈電荷無關(guān)。通常，選擇用作單體的合適丙烯酸衍生物有兩個(gè)要求。為了使之與二茂鐵衍生物共聚，它應(yīng)該具有至少一個(gè)不飽和鍵，例如可由C-C雙鍵或三鍵、N-N雙鍵或S-S雙鍵提供。其次，丙烯酸衍生物應(yīng)該能夠分別通過產(chǎn)生H+離子或通過接受H+離子來分別充當(dāng)Bronsted-Lowry酸或堿。能夠提供Bronsted-Lowry酸或堿功能的官能團(tuán)的例子包括能夠接受H+離子以形成帶電胺基的伯胺基團(tuán)，或羧基，或硫酸，當(dāng)酸官能團(tuán)解離釋放H+離子時(shí)能提供H+離子。從這方面說，應(yīng)注意的是，雖然在本發(fā)明中優(yōu)選使用伯胺基團(tuán)，對(duì)技術(shù)人員顯而易見的是，也可使用存在于丙烯酸衍生物中的仲胺基或叔胺基來產(chǎn)生帶正電荷的氧化還原聚合物。從這方面說，還應(yīng)注意的是，酸或堿官能團(tuán)，即使是一級(jí)的，也不必需是末端基團(tuán)，但是對(duì)于分支的側(cè)鏈，可以存在于較短一個(gè)側(cè)鏈的“內(nèi)部”。
雖然可以使用具有酸或堿官能團(tuán)的任意合適丙烯酸衍生物，用作本發(fā)明傳感器的氧化還原聚合物中第二單體的優(yōu)選單體是通式(I)表示的丙烯酸衍生物
其中R選自CnH2n-NH2、CnH2n-COOH、NH-CnH2n-PO3H和NH-CnH2n-SO3H，其中烷基鏈?zhǔn)侨芜x取代的，其中n是0-12、優(yōu)選0-8的整數(shù)。因此，烷基可以是直鏈或支鏈的，還可以含有雙鍵或三鍵或環(huán)結(jié)構(gòu)，如環(huán)己基。僅舉幾個(gè)例子，取代基R中合適脂肪族基團(tuán)的例子是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、戊基、異戊基、己基、環(huán)己基或辛基。脂肪族基團(tuán)還可以被芳香基團(tuán)如苯基、鹵素原子、另外的堿或酸基團(tuán)或O-烷基取代?？梢宰鳛槿〈嬖诘氖纠苑枷慊鶊F(tuán)有苯基、甲苯酰基或萘基。鹵素基團(tuán)可以選自氟、氯或溴。合適o-烷基的實(shí)例有甲氧基、乙氧基、丙氧基或丁氧基，而n-烷基選自-NHMe、-N(Me)2、-N(乙基)2或-N(丙基)2。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的氧化還原聚合物分子量為約1000-5000道爾頓，或優(yōu)選為約2000-4000道爾頓。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)自由基引發(fā)劑的量影響聚合程度。大量的自由基引發(fā)劑顯著降低聚合效率，導(dǎo)致氧化還原聚合物具有較低的分子量。這還意味著與常規(guī)的自由基聚合反應(yīng)相比，聚合過程中需要相對(duì)更少的自由基引發(fā)劑。除了所用的自由基引發(fā)劑的量之外，將結(jié)合本發(fā)明方法更詳細(xì)討論的反應(yīng)物添加順序也影響聚合效率。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，氧化還原聚合物的二茂鐵含量為約2％-約20％，通常為約3％-約14％。
本發(fā)明還涉及制備這種水溶性氧化還原聚合物的方法。該方法基本包括使可聚合二茂鐵衍生物的第一單體單元與包含丙烯酸衍生物如伯、仲或叔丙烯酰胺的第二單體單元聚合，以產(chǎn)生共聚物。丙烯酸衍生物具有能夠獲得凈電荷的酸或堿官能團(tuán)。重要的是，聚合反應(yīng)在引發(fā)劑的存在下于含水醇介質(zhì)中進(jìn)行。
單體和引發(fā)劑的添加順序可以改變。例如，可以將第一和第二單體在醇介質(zhì)中混合，然后加入引發(fā)劑來引發(fā)反應(yīng)。還可以首先將一種單體溶解在含水醇介質(zhì)中，然后加入引發(fā)劑，之后再將另一種單體加入混合物中。
醇介質(zhì)例如可以用與水混溶的任意有機(jī)醇來制備，例如用脂肪醇如乙醇或芳香醇如苯酚。體積比通常為5∶1-1∶1(醇/水)。在有些實(shí)施方案中，約為3∶1。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，使用包含乙醇和水的含水醇溶劑實(shí)施所述方法。
雖然可以不加入引發(fā)劑來進(jìn)行聚合，期望加入引發(fā)劑，所述引發(fā)劑攻擊單體中不飽和鍵處的富電子中心。因此，在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，通過加入自由基引發(fā)劑來引發(fā)聚合。
可以使用任意自由基引發(fā)劑。例子包括無機(jī)鹽如過硫酸鹽或有機(jī)化合物如過氧化苯甲酰或2，2’-偶氨-雙-異丁酰腈(AIBN)，它們能夠產(chǎn)生稱作引發(fā)劑片段的自由基片段，其中每一個(gè)具有一個(gè)不配對(duì)電子，充當(dāng)攻擊單體單元中不飽和鍵的自由基。
在根據(jù)本發(fā)明方法的一些實(shí)施方案中，自由基引發(fā)劑選自過硫酸銨、過硫酸鉀和過硫酸鈉。
在本發(fā)明這些實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，所加入自由基引發(fā)劑的重量比為每1g單體中約20mg-40mg。
根據(jù)本發(fā)明的方法可以在室溫以上但通常低于100℃的回流下進(jìn)行。在一種實(shí)施方案中，聚合在溫度為約60℃-80℃的回流下進(jìn)行。
聚合所需的時(shí)間長度可以依賴于所用的溫度和向反應(yīng)液中加入的引發(fā)劑的量。通常，聚合進(jìn)行的時(shí)間為10-40小時(shí)，優(yōu)選為約24小時(shí)。
本發(fā)明方法的一種實(shí)施方案還包括在將所述第一和第二單體聚合之前產(chǎn)生預(yù)反應(yīng)混合物，包括將丙烯酸衍生物單體單元溶解在含水醇介質(zhì)中，然后加入自由基引發(fā)劑；然后向混合物中加入可聚合的二茂鐵衍生物單體單元。
在上述方法的進(jìn)一步實(shí)施方案中，預(yù)反應(yīng)混合物中丙烯酸衍生物與可聚合二茂鐵衍生物的進(jìn)料比優(yōu)選為占所加單體重量的約5％-15％，以獲得具有合適分子量和粘度的氧化還原聚合物。
在另一種實(shí)施方案中，可聚合二茂鐵衍生物單體單元在加入反應(yīng)混合物之前溶解于含水醇介質(zhì)中。
實(shí)施例實(shí)施例1核酸的檢測(cè)通常，根據(jù)本發(fā)明的核酸檢測(cè)如圖1所示進(jìn)行。首先，將用作捕獲分子(20)的硫醇化寡核苷酸(還攜帶生物素修飾作為標(biāo)記物)和用作封閉劑(15)以降低背景的硫醇分子的混合物固定在金電極表面(10)上。然后，使電極暴露于假設(shè)含有目的分析物(30)的溶液。與其互補(bǔ)的生物素化目標(biāo)DNA(即捕獲分子)雜交后，通過親合素-生物素相互作用結(jié)合酶偶聯(lián)物(50)。最后，通過層-層靜電自組裝將氧化還原聚合物(40)帶到電極表面上。氧化還原聚合物層電化學(xué)活化結(jié)合于目標(biāo)DNA的酶標(biāo)記物。在底物分子(55)存在下，由底物的催化氧化產(chǎn)生的電流得以電流分析檢測(cè)。電流與樣品溶液中目標(biāo)分析物的濃度直接相關(guān)。
實(shí)施例1.1從大鼠組織的mRNA提取和生物素化cDNA的合成使用DynabeadsmRNA DIRECTTMKit(Dynal ASA，Oslo，Norway)，根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行大鼠肝臟mRNA的提取。對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄(RT)，在20μl總體積中使用10ng該mRNA，所述20μl總體積中含有Sigma-Aldrich的1×eAMV緩沖液(50mMTris-HCl，pH 8.3，40mM KCl，8.0mM MgCl2，1mM DTT)、500μM每種dNTP、1.0μM反義引物、20U RNase抑制劑和20U增強(qiáng)的禽成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(eAMV)。將樣品在DNA熱循環(huán)儀(Gene Amp PCR System 9700，Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)中于56℃孵育50min，將所得到的cDNA直接用作PCR擴(kuò)增的模板。
在50μl總體積中使用2.0μl RT-反應(yīng)混合物進(jìn)行PCR，所述50μl總體積中含有Sigma-Aldrich的1×AccuTaq緩沖液(5mM Tris-HCl，15mM硫酸銨，pH 9.3，2.5mMMgCl2，0.1％Tween 20)、0.40μM每種引物、2.5U JumpStart AccuTaq LA DNA聚合酶和10mM dNTP(Roche，Basel，Swizerland)。選擇兩種不同的基因作為分析物，即管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和受調(diào)控的腫瘤蛋白基因53(TP53)。
使用下列引物GAPDH正義，5′-ATGGTGAAG GTCGGTGTCAA-3′(SEQ ID NO1)；GAPDH反義，5′-TTACTCCTTGGA GGCCATGT-3′(SEQ ID NO2)；TP53正義，5′-ATGGAGGATTCACAGTC GGA-3′(SEQ ID NO3)和TP53反義，5′-TCAGTCTGAGTCAGGCCC-3′(SEQ ID NO4)。
為了合成生物素化的cDNA，向反應(yīng)物中加入不同量的生物素-16-dUTP(Roche，Germany)或生物素-21-dUTP(Clontech，PaloAlto，USA)。使用下列程序進(jìn)行擴(kuò)增95℃持續(xù)5min的初始變性步驟之后，進(jìn)行35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)95℃ 30s，55.5℃ 1min，72℃ 2min。包括72℃持續(xù)10min的最后延伸步驟，以確保合成全長的DNA鏈。擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上分離，并通過用溴化乙錠染色顯示(圖2)。
在圖2中，泳道1和4所示為不加生物素-dUTP的對(duì)照試驗(yàn)。擴(kuò)增到的PCR片段分別和全長大鼠TP53(泳道1，1176bp)和GAPDH(泳道4，1002bp)基因的大小一致。為了標(biāo)記，將不同量的生物素修飾的核苷酸和dNTP混合，并加入到PCR反應(yīng)混合物中，以檢測(cè)標(biāo)記效率(對(duì)于TP53見泳道2和3，對(duì)于GAPDH見泳道5和6)。生物素-16-dUTP(或生物素-21-dUTP)/dTTP的比例越高，凝膠中對(duì)片段的阻滯越強(qiáng)。但是，隨著生物素修飾的核苷酸比正常核苷酸的比例增加，擴(kuò)增效率下降，這可能是因?yàn)樯锼匦揎椇塑账岬凝嫶髠?cè)鏈。
實(shí)施例1.2捕獲探針固定和單層質(zhì)量的評(píng)價(jià)在DNA分析物的檢測(cè)之前，將用作捕獲探針的硫醇化寡核苷酸和硫醇分子的混合物通過自組裝固定到金電極表面上。為了將與目標(biāo)DNA非雜交相關(guān)的吸收最小化，使用陰離子硫醇分子形成混合單層的封閉組分。使用下列捕獲探針用于GAPDH檢測(cè)，5′-T12TTACTCCTTGGAGGCCATGTAGG-3′(SEQ ID NO5)；和5′-T12ATGGTGAAGGTCGGTGTCAACGG-3′(SEQ ID NO6)；用于TP53檢測(cè)，5′-T12ATGGAGGATTCACAGTCGGA-3′(SEQ ID NO7)和5′-T12TCAGTCTGAGTCAGGCCCCA-3′(SEQ ID NO8)；以及用作對(duì)照，5′-T12CCTCTCGCGAGTCAACAGAAACG-3′(SEQID NO9)。寡核苷酸根據(jù)常規(guī)程序使用11-巰基十一烷酸進(jìn)行硫醇化，并通過將清潔的電極暴露于50μM寡核苷酸溶液中3-16小時(shí)而組裝到金電極上。剩余表面用11-巰基十一烷酸(MUA)進(jìn)行封閉。
金電極上混合自組裝單層的形成通常由橢圓偏光、接觸角和表面覆蓋測(cè)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。所有獲得的數(shù)據(jù)都表明在金電極上包被了單一的致密混合分子層。如所期望的，單層包被電極和溶液中電子活性物質(zhì)之間電子傳遞的明顯通路將通過跨絕緣單層的電子隧道效應(yīng)。在含有2.5mM鐵氰化物的0.50M Na2SO4溶液中通過循環(huán)伏安分析研究了捕獲探針單層和混合單層的電子隧道屏蔽特征(圖3)。如圖3a所示，與裸露金電極處獲得的可逆過程的59mV值相比，在混合單層包覆的金電極處觀察到了具有非常大峰峰間電位分離(100mVs-1處＞400mV)的Fe(CN)63-/4-的不可逆伏安波，說明單層阻礙電極和溶液之間的電子傳遞。主要由跨單層的電子隧道效應(yīng)引起的氧化還原電流顯著減小，并喪失其可逆特征。使用通過吡啶與Os(4，4’-二甲基-2，2’-二吡啶)2Cl+/2+部分絡(luò)合的聚(乙烯基吡啶-共聚-丙烯酰胺)共聚物(PVP-PAA-Os)作為氧化還原聚合物(Gao，Z.et al.(2003)Angew.Chem.Int.Ed.41，810-813)。但是，由于氧化還原聚合物帶有正電荷，電極帶有負(fù)電荷，電極在5.0mg/ml PVP-PAA-Os溶液中的短暫浸泡導(dǎo)致通過層-層靜電自組裝在電極上形成DNA/氧化還原聚合物雙層。如圖3b所示，正如所期望的，雙層包被的電極表現(xiàn)出高可逆性表面固定的氧化還原電對(duì)，其用水和PBS徹底洗滌后和-0.4V至+0.8V的多次重復(fù)電位循環(huán)后幾乎沒有變化，顯示出在金電極上高度穩(wěn)定的表面固定的靜電雙層。這種結(jié)果確證了所有鋨氧還中心可以到達(dá)電極表面，并進(jìn)行可逆的異質(zhì)電子傳遞。從氧化峰或還原電流峰的面積估算結(jié)合態(tài)鋨氧還中心的總量1.8-8.0×10-10mole/cm2，其依賴于陰離子物質(zhì)(核酸和酶標(biāo)記物)的量和結(jié)合于電極的核酸的量。隨后鐵氰化物溶液中的伏安法測(cè)試示出與裸露電極處所得相同的結(jié)果(圖3c)。這些改變歸因于雙層形成所致的電子隧道效應(yīng)下降。膜中陰離子物質(zhì)的存在不明顯改變氧化還原聚合物的電化學(xué)。
實(shí)施例1.3.GAPDH cDNA雜交和檢測(cè)在初步雜交測(cè)試中，使用PCR擴(kuò)增混合物作用分析物，而不進(jìn)行進(jìn)一步純化。使用生物素化的GAPDH cDNA(見實(shí)施例1.1)作為目標(biāo)物，使用含0.10MNaCl的TE(10mM Tris-HCl，1.0mM EDTA)作為雜交緩沖液。在雜交之前，將目標(biāo)cDNA于95℃變性5min，并在冰上冷卻。在55℃水浴中進(jìn)行雜交30分鐘，其中GAPDHcDNA選擇性地與互補(bǔ)性捕獲探針結(jié)合，從而固定在電極的表面上。使用雜交緩沖液的重復(fù)洗滌步驟除去所有的非特異性核酸。然后，將電極于35℃暴露于2.5μl葡萄糖氧化酶/親合素D偶聯(lián)物(GOx-A，5mg/ml；Vector Laboratories，San Diego，CA，USA)中30分鐘。用PBS緩沖液進(jìn)行3次洗滌步驟以除去過量的酶標(biāo)記物之后，將電極暴露于2.5μl PVP-PAA-Os氧化還原聚合物溶液至少10分鐘，并用PBS緩沖液漂洗。
在法拉第籠中用低噪音CH Instruments Model 660A電化學(xué)工作站(CHInstrumens，Austin，TX，USA)和Pentium計(jì)算機(jī)聯(lián)用進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量。在PBS緩沖液和含有20mM葡萄糖的PBS緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安分析。使用Ag/AgCl電極(Cypress Systems，Lawrence，KS，USA)作為參考電極，使用鉑線作為反電極。在0.36V下進(jìn)行電流測(cè)量。該報(bào)道中所有的電位都相對(duì)于Ag/AgCl參考電極。
圖4中示出了與目標(biāo)分析物雜交的電極的典型循環(huán)伏安圖。圖4A是雜交后PBS緩沖液(曲線a)和20mM葡萄糖溶液(曲線b)中具有與GAPDH cDNA互補(bǔ)的捕獲探針的電極的伏安圖。在葡糖糖的存在下，由于雙層中葡萄糖氧化酶的存在觀察到了明顯的催化電流。相反，非互補(bǔ)探針不能從PCR混合物中捕獲任何的GAPDHcDNA，因而沒有酶標(biāo)記物能夠結(jié)合到電極表面上，導(dǎo)致沒有可檢測(cè)的催化電流(圖4B，分別為曲線a和b)。
當(dāng)將電極組件浸在PBS緩沖液中時(shí)，將40mM葡萄糖加入到緩沖液中后，電流分析中氧化電流在0.36V(與Ag/AgCl相比)處增加10.2nA(圖5)。在使用非互補(bǔ)捕獲探針的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，觀察到的電流改變可以忽略。電流分析結(jié)果與循環(huán)伏安分析數(shù)據(jù)一致，再一次證實(shí)GAPDH cDNA以高特異性從PCR混合物中得以成功檢測(cè)。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，動(dòng)態(tài)范圍發(fā)現(xiàn)在2.0fM和1.0pM之間，檢測(cè)限為0.50fM。
實(shí)施例1.4大鼠TP53 cDNA的檢測(cè)如實(shí)施例1所述合成生物素化的大鼠TP53cDNA。PCR擴(kuò)增后，TP53cDNA的總量測(cè)定為17.2ng/μl(22.5pM)。分析含有10、50、100、200、500和800fM TP53cDNA的樣品(稀釋在TE緩沖液中)。分別在加入酶標(biāo)記物和氧化還原聚合物之前，將存在于PCR混合物中的TP53特異性cDNA通過其互補(bǔ)性捕獲探針固定在電極表面上(參見實(shí)施例1.3)。在電壓0.36V處檢測(cè)催化電流，其直接對(duì)應(yīng)于TP53 cDNA的量。如圖6所示，在此范圍內(nèi)，電流隨TP53 cDNA濃度線性增加。檢測(cè)限發(fā)現(xiàn)為約1.0fM。考慮到樣品體積，使用所提出的方法成功地檢測(cè)到少至1500拷貝的TP53 DNA分子。據(jù)我們所知，這是目前報(bào)道的電化學(xué)檢測(cè)到基因組DNA的最低量。
實(shí)施例1.5核酸混合物中核酸的檢測(cè)將核酸生物傳感器應(yīng)用于檢測(cè)含有下列組分的混合物中的大腸桿菌16S rRNA和GAPDH cDNA0.5-1500fM大腸桿菌16S rRNA，100-5000fM大腸桿菌23S rRNA，0.2-2000fM全長大鼠GAPDH cDNA，1-500mM BSA，和1-100mM鮭精DNA。通過如實(shí)施例1.1所述分離大鼠肝臟mRNA并隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增來制備GAPDH cDNA。所獲得的GAPDH cDNA的總量為5.0±0.5μg。然后，PCR產(chǎn)物用pH8.0的Tris-EDTA緩沖液稀釋106倍。
使用下列探針大腸桿菌16S rRNA特異性捕獲探針5′-GCCAGCGTTCAATCTGAGCCATGATCAAACTCTTCAAAAAAAAAAAAAA-3′(SEQ ID NO10)；大腸桿菌16S rRNA特異性檢測(cè)探針5′-AAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3′(SEQ ID NO11)。如實(shí)施例1.2所述將捕獲探針固定在金電極上。
在大腸桿菌RNA樣品上進(jìn)行直接雜交和電化學(xué)檢測(cè)(分別參見實(shí)施例1.3和1.4)。引入葡萄糖氧化酶和氧化還原聚合物之后，在0.35V處檢測(cè)催化電流，其直接對(duì)應(yīng)于核酸的量。將非互補(bǔ)捕獲探針作為對(duì)照固定到電極表面上。電流分析反應(yīng)對(duì)于大腸桿菌16S rRNA來說是2.95nA，對(duì)于GAPDH cDNA來說是1.65nA，分別對(duì)應(yīng)于290fM大腸桿菌16S rRNA和150fM GAPDH cDNA的濃度(圖7)。這些結(jié)果與通過凝膠電泳分析獲得的值一致性良好(310fM大腸桿菌16S rRNA和160fMGAPDH cDNA，數(shù)據(jù)未示出)。
實(shí)施例1.6檢測(cè)系統(tǒng)的選擇性使用上述捕獲探針5′-GCCAGCGTTCAATCTGAGCCATGATCAAACTCTTCAAAAAAAAAAAAAAAA-3′(SEQ ID NO10)以及下列合成寡核苷酸評(píng)價(jià)生物傳感器的選擇性互補(bǔ)的5′-AAATTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCAAAAAAAAAAAAAACTCCTACGGGAGGCAGC-3′(SEQ ID NO12)；單堿基錯(cuò)配的5′-AAATTGAAGAGTTTGATCATGTCTCAGATTGAACGCTGGCAAAAAAAAAAAAAACTCCTACGGGAGGCAGC-3′(SEQ ID NO13)；兩堿基錯(cuò)配的5′-AAATTGAAGAGTATGATCATGTCTCAGATTGAACGCTGGCAAAAAAAAAAAAAACTCCTACGGGAGGCAGC-3′(SEQ ID NO14)(核苷酸變異以粗體和下劃線示出)。如實(shí)施例1.2所述將捕獲探針固定到金電極上。
在1μl小滴中使用三種不同DNA寡核苷酸的200fM溶液在有利于完全匹配序列的雜交條件下進(jìn)行雜交(分別參見實(shí)施例1.3和1.4，只是雜交溫度使用53℃)。所獲得的電流分析反應(yīng)總結(jié)在圖8中。將60mM葡萄糖加入到完全匹配序列的檢測(cè)介質(zhì)中時(shí)電流增量是4.3±0.4nA(曲線a)，而對(duì)于單堿基錯(cuò)配(曲線b)和二堿基錯(cuò)配(曲線c)分別檢測(cè)到1.0±0.3nA和0.3±0.1nA。因而，所述生物傳感器容易區(qū)分完全匹配和錯(cuò)配的DNA寡核苷酸。
實(shí)施例2小(低分子量)酶底物的檢測(cè)為了評(píng)價(jià)氧化電流對(duì)分析物濃度的依賴性，將飽和量的GAPDH cDNA捕獲探針固定到金電極的表面上，并與10μM生物素化的互補(bǔ)性GAPDH cDNA接觸。雜交后，使葡萄糖氧化酶/親合素偶聯(lián)物通過親合素-生物素相互作用結(jié)合。最后，將氧化還原聚合物通過層層靜電自組裝帶到電極表面上。使用PBS(pH 7.4)作為檢測(cè)介質(zhì)，工作電位為0.35V。如圖9所示，直到約20mM葡萄糖，在所獲得的氧化電流和檢測(cè)到的分析物的量之間都有線性關(guān)系。
從這方面說，應(yīng)注意的是該實(shí)施例中用到的雙層設(shè)置和實(shí)施例1中完全相同。但是，當(dāng)要如實(shí)施例1中所述檢測(cè)核酸時(shí)，在本發(fā)明方法中可以使用非常高的葡萄糖濃度，以將酶“飽和”，或者換句話說，可以使用非常高的葡萄糖氧化速率，以獲得足夠的靈敏度。當(dāng)不是要檢測(cè)核酸，而是要檢測(cè)氧化還原酶的酶底物時(shí)，可以通過用非常高的核酸濃度、用互補(bǔ)性核酸和氧化還原酶如葡萄糖氧化酶將捕獲探針飽和進(jìn)行工作來實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。因?yàn)殡娏魇怯捎谌芤褐衅咸烟茄趸?或一般意義的酶底物氧化)所致，存在電流-濃度關(guān)系，其可用于檢測(cè)葡萄糖或一般意義的可氧化酶底物。還應(yīng)注意的是，在實(shí)施例2中，葡萄糖氧化酶分子用作捕獲分子，同時(shí)用做能分別從電極向電化學(xué)活化劑傳遞電子或從電化學(xué)活化劑向電極傳遞電子的試劑。因此，實(shí)施例2示出了本發(fā)明的檢測(cè)方法，其中捕獲分子(也)能夠分別從電極向電化學(xué)活化劑傳遞電子，或從電化學(xué)活化劑向電極傳遞電子。
實(shí)施例3多肽的檢測(cè)蛋白質(zhì)的檢測(cè)(如核酸相似，參見實(shí)施例1)如圖1a和圖1b所列進(jìn)行。這種情況下，電極首先包被硫醇分子(如16-巰基十六烷酸)，其在這里充當(dāng)接頭分子，用于共價(jià)結(jié)合捕獲分子。然后將包被電極浸在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺/N-羥基-琥珀酰亞胺(EDC/NHS)的混合物中，以活化接頭的羧酸基團(tuán)，所述羧酸基團(tuán)繼爾與捕獲分子的氨基基團(tuán)形成共價(jià)鍵。例如，捕獲分子可以是對(duì)蛋白質(zhì)分析物具有結(jié)合親合力的抗體或低分子量配體。然后使電極與懷疑含有分析物的溶液接觸，使得在在捕獲分子和分析物分子之間形成復(fù)合物。然后，將連接有酶標(biāo)記物的氧化還原聚合物通過層-層靜電自組裝帶到電極表面上(參見圖1a)。在底物分子存在下，電流分析檢測(cè)由底物的催化氧化所產(chǎn)生的電流。該電流與樣品溶液中目標(biāo)分析物的濃度直接相關(guān)。還可以如圖1b所示以類似三明治ELISA的方式進(jìn)行檢測(cè)。為此，包含作為捕獲分子的抗體和分析物的復(fù)合物與對(duì)分析物也具有結(jié)合親和力的第二抗體接觸。該第二抗體可以與酶如葡萄糖氧化酶偶聯(lián)，充當(dāng)能分別從電極向電化學(xué)活化劑傳遞電子或從電化學(xué)活化劑向電極傳遞電子的試劑。然后，使結(jié)合有酶標(biāo)記物的氧化還原聚合物與電極表面接觸，從而形成層-層靜電自組裝件(參見圖1a)，并允許檢測(cè)多肽。
實(shí)施例4低分子量配體的檢測(cè)使用實(shí)施例3中解釋的“三明治-ELISA樣”程序，其中使用抗體作為捕獲分子，并使該捕獲抗體與分析物的復(fù)合物與偶聯(lián)合適酶的第二抗體接觸，顯然事實(shí)上任意小配體如藥物(例如可卡因、嗎啡(morphium))、營養(yǎng)物(蔗糖、氨基酸等)、環(huán)境有害產(chǎn)物(殺蟲劑如三嗪、DDT等)都可通過本發(fā)明檢測(cè)。
實(shí)施例5.1聚(乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酰胺)、聚(乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酸)和聚(乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酰胺基-磺酸)共聚物的合成葡萄糖氧化酶(GOx，EC 1.1.3.4，Aspergillus niger，191單位/mg)購自Fluka(CH-9470 Buchs，Switzerland)。二茂鐵(Fc)、乙烯基二茂鐵(VFc)、丙烯酰胺(AA)、丙烯酸(AC)、2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸(“丙烯酰胺基磺酸”，AAS，目錄號(hào)28，273)和過硫酸鹽購自Sigma Aldrich(St.Luis，MO，USA.)。所有的其他化學(xué)試劑如丙酮、乙醇和磷酸鹽緩沖液都是驗(yàn)證合格的分析級(jí)。所有用到的溶液都用去離子水制備。
實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生聚合物的UV光譜在Agilent 8453紫外可見光譜儀上進(jìn)行并記錄。用Toyo Soda高效凝膠滲透色譜在水中測(cè)定分子量，并用標(biāo)準(zhǔn)聚氧化乙烯和聚乙二醇進(jìn)行校準(zhǔn)。
i)聚(乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酰胺)聚合物的合成制備含有溶于10ml乙醇/水(3份比1份)混合溶劑的1.0g丙烯酰胺的三個(gè)樣品。脫氧10分鐘后，將0.30ml份的0.10g/ml無氧過硫酸鹽溶液加入到每個(gè)樣品中。將0.05g-0.16g范圍的3種量的乙烯基二茂鐵溶解于脫氣乙醇中，形成3個(gè)乙烯基二茂鐵溶液樣品，計(jì)算每個(gè)樣品所加入二茂鐵的量，得到丙烯酰胺-乙烯基二茂鐵進(jìn)料比(w/w)分別為95∶5、90∶10和85∶15。然后將每個(gè)乙烯基二茂鐵樣品加入到丙烯酰胺-引發(fā)劑混合物中。反應(yīng)混合物在氮?dú)夥罩杏?0℃回流24小時(shí)。冷卻后，將反應(yīng)混合物分別滴加到快速攪拌的丙酮中，以沉淀氧化還原聚合物。將沉淀的氧化還原聚合物用丙酮洗，并通過多次水溶解丙酮沉淀循環(huán)進(jìn)行純化。然后將純化的產(chǎn)物于50℃真空干燥。
ii)聚(乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酸)聚合物的合成制備含有溶于10ml乙醇/水(3份比1份)混合溶劑的1.0g丙烯酸的三個(gè)樣品。脫氧10分鐘后，將0.30ml份的0.10g/ml無氧過硫酸鹽溶液加入到每個(gè)樣品中。將0.05g-0.16g范圍的3種量的乙烯基二茂鐵溶解于脫氣乙醇中，形成3個(gè)乙烯基二茂鐵溶液樣品，計(jì)算每個(gè)樣品所加入二茂鐵的量，得到丙烯酰胺-乙烯基二茂鐵進(jìn)料比(w/w)分別為95∶5、90∶10和85∶15。然后將每個(gè)乙烯基二茂鐵樣品加入到丙烯酰胺-引發(fā)劑混合物中。反應(yīng)混合物在氮?dú)夥罩杏?0℃回流24小時(shí)。冷卻后，將反應(yīng)混合物分別滴加到快速攪拌的丙酮中，以沉淀氧化還原聚合物。將沉淀的氧化還原聚合物用丙酮洗，并通過多次水溶解丙酮沉淀循環(huán)進(jìn)行純化。然后將純化的產(chǎn)物于50℃真空干燥。
iii)聚(乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酰胺基磺酸)聚合物的合成制備含有溶于10ml乙醇/水(3份比1份)混合溶劑的1.0g丙烯酸的三個(gè)樣品。脫氧10分鐘后，將0.30ml份的0.10g/ml無氧過硫酸鹽溶液加入到每個(gè)樣品中。將0.05g-0.16g范圍的3種量的乙烯基二茂鐵溶解于脫氣乙醇中，形成3個(gè)乙烯基二茂鐵溶液樣品，計(jì)算每個(gè)樣品所加入二茂鐵的量，得到丙烯酰胺-乙烯基二茂鐵進(jìn)料比(w/w)分別為95∶5、90∶10和85∶15。然后將每個(gè)乙烯基二茂鐵樣品加入到丙烯酰胺-引發(fā)劑混合物中。反應(yīng)混合物在氮?dú)夥罩杏?0℃回流24小時(shí)。冷卻后，將反應(yīng)混合物分別滴加到快速攪拌的丙酮中，以沉淀氧化還原聚合物。將沉淀的氧化還原聚合物用丙酮洗，并通過多次水溶解丙酮沉淀循環(huán)進(jìn)行純化。然后將純化的產(chǎn)物于50℃真空干燥。
基于常規(guī)的自由基聚合反應(yīng)進(jìn)行乙烯基二茂鐵和丙烯酰胺及其衍生物的共聚。一般性反應(yīng)方程式示于圖12。
但是，為了將單體成功地共聚，非常關(guān)注系統(tǒng)中乙烯基二茂鐵的終止作用。乙烯基二茂鐵通常用作聚合系統(tǒng)中的自由基清除劑。發(fā)現(xiàn)自由基引發(fā)劑的量大大小于一般聚合系統(tǒng)中所必需的量。更高量的自由基引發(fā)劑明顯降低聚合效率和產(chǎn)物的分子量。此外，加入次序也影響聚合效率。
當(dāng)將過硫酸鹽自由基引發(fā)劑加入到乙烯基二茂鐵和丙烯酰胺的溶液中時(shí)，觀察到低于20％的聚合。這可能是因?yàn)榉磻?yīng)混合物中形成二茂鐵(ferrocenium)，導(dǎo)致阻滯聚合速率并非常早地終止聚合物鏈生長過程。如表1所示，在優(yōu)化條件下，獲得了相對(duì)較高的產(chǎn)量。
表1.乙烯基二茂鐵和丙烯酰胺及其衍生物的共聚

但是，聚合物產(chǎn)率隨乙烯基二茂鐵進(jìn)料比增加而降低，說明雖然在聚合過程中已經(jīng)非常注意，仍存在自由基聚合的終止作用。還發(fā)現(xiàn)當(dāng)反應(yīng)混合物變藍(lán)時(shí)獲得微小的產(chǎn)量，這是因?yàn)榫酆先芤褐行纬上喈?dāng)大量的二茂鐵。二茂鐵加載量在3-14％之間變動(dòng)，總是小于單體進(jìn)料中二茂鐵的含量。
氧化還原聚合物中二茂鐵的加載量由元素分析確定。能量色散X射線分析(Energy Dispersive X-ray Analysis，EDX)用于該目的。用在所產(chǎn)生的氧化還原聚合物樣品上的電子束能量為120keV。用鋰漂移硅檢測(cè)器(lithium drifted silicon detector)分析樣品產(chǎn)生的X射線。
通過凝膠滲透色譜測(cè)定氧化還原聚合物的分子量。通常，用較高二茂鐵進(jìn)料比制備的氧化還原聚合物具有較低的分子量和較寬的分子量分布。
合成的共聚物為淡黃色的粉末狀物質(zhì)。共聚物的分子量為2000-4000道爾頓。FT-IR實(shí)驗(yàn)(參見圖13)清楚表明1650處的乙烯基光吸收完全消失，說明丙烯酰胺和乙烯基二茂鐵成功地聚合了，所得的氧化還原聚合物是高純度的，沒有單體。進(jìn)一步的證據(jù)存在于1000-1300cm-1區(qū)域。1126cm-1處伴隨一個(gè)弱峰的極強(qiáng)吸收說明氧化還原聚合物中存在二茂鐵單元，1218cm-1處的強(qiáng)吸收說明聚合物中存在酰胺基團(tuán)。紫外實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)了乙烯基二茂鐵和丙烯酰胺之間的成功共聚。300nm處的小肩峰明確指示共聚物中有二茂鐵基團(tuán)(參見圖13)。氧化還原聚合物中具有二茂鐵和胺或羧酸基團(tuán)使它們具有雙重功能介導(dǎo)電子的氧化還原活性和與蛋白質(zhì)交聯(lián)的化學(xué)活性。
增加乙烯基二茂鐵的進(jìn)料比是意圖增加氧化還原聚合物中二茂鐵基團(tuán)的比例。但是，改變乙烯基二茂鐵的量也影響聚合物產(chǎn)率。當(dāng)乙烯基二茂鐵進(jìn)料比最低時(shí)獲得最高產(chǎn)量，這和自由基聚合中二茂鐵化合物的不尋常行為非常一致。如表1所示，雖然聚合物中二茂鐵基團(tuán)的含量隨乙烯基二茂鐵進(jìn)料比增加而增加，但是遠(yuǎn)不是線性的。發(fā)現(xiàn)對(duì)于生物傳感目的，乙烯基二茂鐵進(jìn)料比10％是足夠的，其具有良好的介導(dǎo)功能和良好的經(jīng)濟(jì)性。用于聚合的引發(fā)劑的量也影響氧化還原聚合物的組成和產(chǎn)率。發(fā)現(xiàn)當(dāng)引發(fā)劑為每克單體20-40mg時(shí)獲得良好的氧化還原聚合物。
實(shí)施例5.2獲得氧化還原聚合物的循環(huán)伏安圖氧化還原聚合物位于存在0.0μg和10μg GOx和10μg GOx和10μM葡萄糖的磷酸鹽緩沖(PBS)溶液中。
在general purpose electrochemical system(GPES)manager 4.9版下用AutoLabpotentiostat/galvanostat運(yùn)行進(jìn)行電化學(xué)測(cè)試。3-電極系統(tǒng)池裝在法拉第籠中。所述電極是(Ag/AgCl)參比電極、鉑線反電極和Au工作電極(表面面積為7.94mm2)。
與乙烯基二茂鐵相比，合成的氧化還原聚合物在水中具有高的溶解性，但是不溶于多數(shù)有機(jī)溶劑。該特征使得氧化還原聚合物理想地用作生物傳感、尤其是酶聯(lián)生物傳感中的介質(zhì)，因?yàn)槎鄶?shù)酶僅在水性介質(zhì)中有活性。
圖15示出了僅含有氧化還原聚合物的PBS的典型循環(huán)伏安圖，伏安圖表現(xiàn)出高度可逆的溶液電化學(xué)氧化還原波中心為～0.18V(與Ag/AgCl相比)，伏安圖具有擴(kuò)散受限的形狀，陽極和陰極峰電流的幅度相同，峰峰間電位分離為60mV，與25℃下理論值59mV非常接近。這些氧化還原波可以歸因于氧化還原聚合物中二茂鐵基團(tuán)的氧化和還原，指示聚合物的優(yōu)異氧化還原活性。伏安分析實(shí)驗(yàn)再一次驗(yàn)證了乙烯基二茂鐵成功地與丙烯酰胺及其衍生物共聚，并且聚合物中的二茂鐵基團(tuán)保留其電活性。PBS中的氧化還原聚合物是具有自由擴(kuò)散行為的真溶液形式。向該溶液中摻加不同量的葡萄糖完全不改變伏安圖，說明單獨(dú)的氧化還原聚合物不催化氧化葡萄糖。另外，當(dāng)在氧化還原聚合物溶液中加入少量的GOx時(shí)未觀察到明顯變化。所得溶液的電化學(xué)實(shí)際上與單獨(dú)的氧化還原聚合物溶液的電化學(xué)相同。但是，當(dāng)向該溶液中加入10mM葡萄糖時(shí)，溶液中進(jìn)行GOx對(duì)葡萄糖的酶促氧化。GOx中的氧還中心，F(xiàn)AD被轉(zhuǎn)化成FADH2。當(dāng)電極電位掃描過氧化還原聚合物的氧化還原電位時(shí)，在電極表面附近，氧化還原聚合物中顯著量的二茂鐵基團(tuán)氧化成二茂鐵。GOx中FAD/FADH2的氧化還原電位是-0.36V(與Ag/AgCl相比)，遠(yuǎn)低于二茂鐵/二茂鐵電對(duì)的氧化還原電位，F(xiàn)ADH2附近的二茂鐵基團(tuán)將它氧化回FAD，氧化還原聚合物中的二茂鐵基團(tuán)還原成起始的二茂鐵基團(tuán)。這兩個(gè)反應(yīng)形成催化循環(huán)，如圖10所示，或者換句話說，GOx的葡萄糖氧化由氧化還原聚合物介導(dǎo)。
因此，氧化還原聚合物的催化反應(yīng)大大增加含葡萄糖的溶液中的氧化電流，見圖13(淺灰色跡線)。如果FADH2、氧化還原聚合物和電極之間的電子交換都非?？?，電化學(xué)氧化中產(chǎn)生大量的二茂鐵基團(tuán)，所述二茂鐵基團(tuán)又快速被FADH2所消耗。這是與無葡萄糖的溶液中獲得的還原電流相比二茂鐵基團(tuán)的還原電流低得多的原因。這些數(shù)據(jù)表明氧化還原聚合物在酶促反應(yīng)中有效地作為氧化還原介質(zhì)起作用，使電子在酶的氧還中心和電極表面之間穿梭。
實(shí)施例5.3包含與葡萄糖氧化酶-牛血清白蛋白(GOx-BSA)交聯(lián)的乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酰胺的膜的合成進(jìn)行氧化還原聚合物與蛋白質(zhì)的交聯(lián)反應(yīng)，以研究所得膜的電化學(xué)特性。在本實(shí)施例中使用酶GOx。選擇戊二醛和聚乙二醇二縮水甘油基醚(PEG)作為交聯(lián)劑。生物學(xué)級(jí)的戊二醛(50％水溶液，產(chǎn)品編號(hào)00867-1EA)和聚乙二醇二縮水甘油基醚(PEGDE)(產(chǎn)品編號(hào)03800)得自Sigma-Aldrich。
首先，將從實(shí)施例5.1得到的聚(乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酰胺)沉積到金電極上。用交聯(lián)劑修飾GOx-BSA，以提供具有脂肪族碳鏈的GOx-BSA，所述脂肪族碳鏈具有末端醛官能團(tuán)，其能夠提供與固定化介質(zhì)上合適官能團(tuán)的交聯(lián)。隨后，使修飾的GOx-BSA沉積，并與固定化引發(fā)劑反應(yīng)。修飾的GOx-BSA上的醛基團(tuán)與PAA-VFc上的胺基反應(yīng)，形成共價(jià)的交聯(lián)鍵。反應(yīng)進(jìn)行后，使PAA-VFc-GOx-BSA膜干燥。
將金電極上交聯(lián)的PAA-VFc-GOx-BSA膜進(jìn)行伏安分析。使用空白PBS，施加的電位掃描速率為50mV/s。圖16所示為空白PBS中金電極上與GOx和BSA進(jìn)行PEG交聯(lián)的PAA-VFc的循環(huán)伏安圖。如圖16所示，正如所期望的，交聯(lián)膜表現(xiàn)出高度可逆的表面固定的氧化還原電對(duì)(A.J.Bard，L.R.Faulkner，Electrochemical Methods，John Wiley & SonsNew York，2001.)，其用水和PBS徹底洗滌后、和-0.2V至+0.8V之間多次重復(fù)性電位循環(huán)后幾乎沒有變化，顯示出金電極上高度穩(wěn)定的表面固定的二茂鐵膜。在＜100mV/s的慢掃描速率下，如預(yù)期那樣，對(duì)于限定表面的一電子氧化還原系統(tǒng)記錄到明顯對(duì)稱的信號(hào)，表現(xiàn)出理想的能斯特行為峰電流與電位掃描速率成比例，峰峰間電位分離遠(yuǎn)小于59mV，正如在溶液中擴(kuò)散行為的情況下觀察到的(見圖15)，半峰高處電流的寬度為約90mV。該結(jié)果證實(shí)所有的二茂鐵氧還中心都允許到達(dá)電極表面，并進(jìn)行可逆的異質(zhì)電子傳遞。向PBS溶液中加入10mM葡萄糖時(shí)，獲得典型的催化性電化學(xué)曲線。但是，氧化還原聚合物的還原峰消失(圖16，灰色跡線)。這意味著通過將電子從還原態(tài)GOx向二茂鐵基團(tuán)傳遞，傳感層均勻地維持在還原狀態(tài)。檢測(cè)到的快速應(yīng)答和電流表明氧化還原聚合物的優(yōu)異介導(dǎo)功能，生物傳感器的高電流靈敏度(750nA/mM葡萄糖)。
序列表<110>科技研究局<120>借助分析物/聚合物活化劑雙層排列檢測(cè)分析物的方法<150>US 60/515,229<151>2003-10-29<160>14<170>MS Word for Windows<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1ATGGTGAAGG TCGGTGTC18<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2TTACTCCTTG GAGGCCATGT 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3ATGGAGGATT CACAGTCGGA 20<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4TCAGTCTGAG TCAGGCCC18<210>5<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>捕獲探針<400>5TTTTTTTTTT TTTTACTCCT TGGAGGCCAT GTAGG 35<210>6<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>捕獲探針<400>6TTTTTTTTTT TTATGGTGAA GGTCGGTGTC AACGG 35<210>7<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)<223>XXX<220>
<223>捕獲探針<400>7TTTTTTTTTT TTATGGAGGA TTCACAGTCG GA32<210>8<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>捕獲探針
<400>8TTTTTTTTTT TTTCAGTCTG AGTCAGGCCC CA32<210>9<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>捕獲探針<400>9TTTTTTTTTT TTCCTCTCGC GAGTCAACAG AAACG 35<210>10<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>捕獲探針<400>10GCCAGCGTTC AATCTGAGCC ATGATCAAAC TCTTCAAAAA AAAAAAAAA 49<210>11<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>檢測(cè)探針<400>11AAAAAAAAAA AAAAGCTGCC TCCCGTAGGA GT32<210>12<211>71<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>12AAATTGAAGA GTTTGATCAT GGCTCAGATT GAACGCTGGC AAAAAAAAAA 50AAAACTCCTA CGGGAGGCAG C71
<210>13<211>71<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>13AAATTGAAGA GTTTGATCAT GTCTCAGATT GAACGCTGGC AAAAAAAAAA 50AAAACTCCTA CGGGAGGCAG C71<210>14<211>71<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>14AAATTGAAGA GTATGATCAT GTCTCAGATT GAACGCTGGC AAAAAAAAAA 50AAAACTCCTA CGGGAGGCAG C7權(quán)利要求
1.借助檢測(cè)電極對(duì)分析物分子進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)的方法，所述方法包括(a)將能夠結(jié)合待檢測(cè)分析物分子的捕獲分子固定在檢測(cè)電極上；(b)使電極和假設(shè)含有待檢測(cè)分析物分子的溶液接觸；(c)使所述溶液中所含的分析物分子與電極上的捕獲分子結(jié)合，從而使得形成捕獲分子和分析物分子之間的復(fù)合物，所述復(fù)合物在檢測(cè)電極上形成第一層；(d)使檢測(cè)電極與電化學(xué)活化劑接觸，其中所述的電化學(xué)活化劑具有靜電凈電荷，其與捕獲分子和分析物分子之間形成的復(fù)合物的靜電凈電荷互補(bǔ)，從而在電極上形成第二層，其中所述第二層和所述第一層一起形成導(dǎo)電雙層；(e)使檢測(cè)電極與能夠分別從電極向電化學(xué)活化劑傳遞電子或從電化學(xué)活化劑向電極傳遞電子的試劑接觸；(f)在檢測(cè)電極上進(jìn)行電測(cè)量；和(g)通過將獲得的電測(cè)量結(jié)果和對(duì)照測(cè)量結(jié)果比較來檢測(cè)分析物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的電化學(xué)活化劑是能夠在分析物和電極之間傳遞電子的聚合物氧化還原介質(zhì)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述的電化學(xué)活化劑包含金屬離子。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述的金屬離子選自銀、金、銅、鎳、鐵、鈷、鋨、釕及其混合物。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述的電化學(xué)活化劑選自聚(乙烯基二茂鐵)、聚(乙烯基二茂鐵)-共聚-丙烯酰胺、聚(乙烯基二茂鐵)-共聚-丙烯酸和聚(乙烯基二茂鐵)-共聚-丙烯酰胺-(CH2)n-磺酸，以及聚(乙烯基二茂鐵)-共聚-丙烯酰胺-(CH2)n-膦酸，其中n＝0-12。
6.權(quán)利要求1的方法，其中能夠向或從電化學(xué)活化劑傳遞電子的試劑是酶或酶偶聯(lián)物。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述的酶是氧化還原酶或氧化還原酶的混合物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述的氧化還原酶選自葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、乳酸氧化酶、醇脫氫酶、羥基丁酸脫氫酶、乳酸脫氫酶、甘油脫氫酶、山梨醇脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、半乳糖脫氫酶、蘋果酸氧化酶、半乳糖氧化酶、黃嘌呤脫氫酶、醇氧化酶、膽堿氧化酶、黃嘌呤氧化酶、膽堿脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、草酸氧化酶、膽紅素氧化酶、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、胺氧化酶、NADPH氧化酶、尿酸氧化酶、細(xì)胞色素C氧化酶和兒茶酚氧化酶。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述的捕獲分子能夠特異性結(jié)合待檢測(cè)的分析物。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述的待檢測(cè)分析物選自核酸、寡核苷酸、蛋白質(zhì)、肽、寡糖、多糖，及其復(fù)合物。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述的待檢測(cè)分析物是核酸分子。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述的核酸分子具有預(yù)定序列。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述的核酸分子包含至少一個(gè)單鏈區(qū)。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述的捕獲分子是具有與待檢測(cè)核酸分子的單鏈區(qū)互補(bǔ)的序列的至少一種核酸探針。
15.權(quán)利要求10的方法，其中所述的待檢測(cè)分析物是蛋白質(zhì)或肽。
15.權(quán)利要求15的方法，其中所述的捕獲分子是能夠結(jié)合蛋白質(zhì)或肽的至少一種配體。
16.權(quán)利要求1的方法，其中在使電極與假設(shè)含有分析物分子的溶液接觸之前將封閉試劑固定在電極上。
17.借助檢測(cè)電極對(duì)分析物分子進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)的方法，所述方法包括(a)將能夠結(jié)合待檢測(cè)分析物分子的捕獲分子固定在檢測(cè)電極上；(b)使電極和假設(shè)含有待檢測(cè)分析物分子的溶液接觸；(c)使所述溶液中所含的分析物分子與電極上的捕獲分子結(jié)合，從而使得形成捕獲分子和分析物分子之間的復(fù)合物，所述復(fù)合物在檢測(cè)電極上形成第一層；(d)使檢測(cè)電極與電化學(xué)活化劑接觸，其中所述的電化學(xué)活化劑具有靜電凈電荷，其與捕獲分子和分析物分子之間形成的復(fù)合物的靜電凈電荷互補(bǔ)，從而在電極上形成第二層，其中所述第二層和所述第一層一起形成導(dǎo)電雙層，并且其中捕獲分子能夠分別從電極向電化學(xué)活化劑傳遞電子或從電化學(xué)活化劑向電極傳遞電子；(e)在檢測(cè)電極上進(jìn)行電測(cè)量；和(f)通過將獲得的電測(cè)量結(jié)果和對(duì)照測(cè)量結(jié)果比較來檢測(cè)分析物。
18.一種電極排列，包含檢測(cè)電極，適于對(duì)分析物分子進(jìn)行如權(quán)利要求1所限定的電化學(xué)檢測(cè)，包含(a)檢測(cè)電極上的第一層，包含捕獲分子和分析物分子之間的復(fù)合物，所述捕獲分子能夠結(jié)合待檢測(cè)的分析物分子；和(b)包含電化學(xué)活化劑的第二層，其中所述的電化學(xué)活化劑具有靜電凈電荷，其與捕獲分子和分析物分子之間形成的復(fù)合物的靜電凈電荷互補(bǔ)，其中所述第二層和第一層一起形成導(dǎo)電雙層。
19.權(quán)利要求18的電極排列，其中所述的電化學(xué)活化劑是能夠在分析物和電極之間傳遞電子的聚合物氧化還原介質(zhì)。
20.權(quán)利要求19的電極排列，其中增加分析物導(dǎo)電性的試劑包含金屬離子。
21.權(quán)利要求20的電極排列，其中所述的金屬離子選自銀、金、銅、鎳、鐵、鈷、鋨、釕及其混合物。
22.權(quán)利要求18的電極排列，還包含能夠分別從電極向聚合物氧化還原介質(zhì)傳遞電子或從聚合物氧化還原介質(zhì)向電極傳遞電子的試劑，其中所述試劑結(jié)合、嵌入或連接導(dǎo)電雙層。
23.權(quán)利要求22的電極排列，其中所述的試劑是酶或酶偶聯(lián)物。
24.權(quán)利要求18的電極排列作為生物傳感器的用途。
25.用于電化學(xué)檢測(cè)分析物分子的生物傳感器，包含(a)檢測(cè)電極；(b)檢測(cè)電極上的第一層，包含捕獲分子和分析物分子之間的復(fù)合物，所述捕獲分子能夠結(jié)合待檢測(cè)的分析物分子；和(c)包含電化學(xué)活化劑的第二層，其中所述的電化學(xué)活化劑具有靜電凈電荷，其與捕獲分子和分析物分子之間形成的復(fù)合物的靜電凈電荷互補(bǔ)，其中所述第二層和第一層一起形成導(dǎo)電雙層。
26.一種水溶性氧化還原聚合物，包含(a)包含可聚合二茂鐵衍生物的第一單體單元；和(b)包含丙烯酸衍生物的第二單體單元，所述丙烯酸衍生物具有能夠獲得凈電荷的一級(jí)酸或堿官能團(tuán)。
27.權(quán)利要求26的氧化還原聚合物，其中所述的第二單體單元包含丙烯酸衍生物，所述丙烯酸衍生物具有能夠獲得凈電荷的末端一級(jí)酸或堿官能團(tuán)。
28.權(quán)利要求26的氧化還原聚合物，其中所述的丙烯酸衍生物由通式(I)表示 其中R選自CnH2n-NH2、CnH2n-COOH、NH-CnH2n-PO3H和NH-CnH2n-SO3H，其中烷基鏈可以是任選取代的，其中n是0-12的整數(shù)。
29.權(quán)利要求26的氧化還原聚合物，其中所述的可聚合二茂鐵衍生物選自乙烯基二茂鐵、乙炔二茂鐵、苯乙烯基二茂鐵和氧化乙烯基二茂鐵。
30.權(quán)利要求29的氧化還原聚合物，其中所述的二茂鐵衍生物是乙烯基二茂鐵。
31.權(quán)利要求26的氧化還原聚合物，其中氧化還原聚合物的分子量是約1000-5000道爾頓。
32.權(quán)利要求26的氧化還原聚合物，其中加載于氧化還原聚合物中的二茂鐵為約3％-14％。
33.制備水溶性氧化還原聚合物的方法，所述方法包括將第一單體單元和第二單體單元聚合，所述第一單體單元包含可聚合的二茂鐵衍生物，所述第二單體單元包含丙烯酸衍生物，所述丙烯酸衍生物具有能夠獲得凈電荷的酸或堿官能團(tuán)，其中所述聚合在含水的醇介質(zhì)中進(jìn)行。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述的含水醇介質(zhì)包含體積比為2∶1-3∶1的乙醇和水。
35.權(quán)利要求33的方法，其中所述聚合通過加入自由基引發(fā)劑而引發(fā)。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述的自由基引發(fā)劑選自過硫酸銨、過硫酸鉀和過硫酸鈉。
37.權(quán)利要求35的方法，其中所加入的自由基引發(fā)劑的重量比為每1g單體約20mg-40mg。
38.權(quán)利要求33的方法，其中所述的聚合在約60℃-80℃的溫度下回流進(jìn)行。
39.權(quán)利要求33的方法，其中所述的聚合在惰性氣體氣氛中進(jìn)行。
40.權(quán)利要求33的方法，其中所述的聚合進(jìn)行約24小時(shí)。
41.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，還包括在將所述第一和第二單體聚合之前形成預(yù)反應(yīng)混合物，包括將丙烯酸衍生物單體單元溶解在含水醇介質(zhì)中，然后加入自由基引發(fā)劑，然后加入可聚合的二茂鐵衍生物單體單元，以形成預(yù)反應(yīng)混合物。
42.權(quán)利要求41的方法，其中預(yù)反應(yīng)混合物中丙烯酸衍生物和可聚合二茂鐵衍生物的進(jìn)料比占所加入單體重量的約5％-15％。
43.權(quán)利要求41的方法，其中所述的可聚合二茂鐵衍生物單體單元在加入之前溶解于含水醇介質(zhì)。
44.權(quán)利要求41的方法，還包括將氧化還原介質(zhì)在有機(jī)溶劑中沉淀。
45.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述的有機(jī)溶劑選自醚或酮。
全文摘要
本發(fā)明涉及分析傳感器領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及借助電極排列檢測(cè)樣品中分析物的方法，所述電極排列的特征在于在電極表面形成分析物和增加所述分析物導(dǎo)電性的試劑的導(dǎo)電雙層。本發(fā)明還涉及用于進(jìn)行這種方法的電極排列，以及這種電極排列作為生物傳感器的用途。還公開了適合用于分析物的電化學(xué)檢測(cè)的新類型的氧化還原聚合物。另外也公開了制造該類型聚合物的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/18GK1875113SQ200480032053
公開日2006年12月6日 申請(qǐng)日期2004年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月29日
發(fā)明者高志強(qiáng), 謝虹, 詹宗原, 余袁宏 申請(qǐng)人:新加坡科技研究局