專利名稱：包含免疫球蛋白Fc片段的長(zhǎng)效人內(nèi)皮抑素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制品制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種長(zhǎng)效重組人內(nèi)皮抑素的制備方法。
背景技術(shù)：
自Folkman于1971年提出“腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移都依賴于新生血管的生成”[Folkman J.N Engl J Med 1971 ；285 =1182-1186]的觀點(diǎn)以來，人們就把抑制腫瘤血管生成作為一種研究對(duì)象。血管內(nèi)皮抑素(Endostatin)由美國(guó)O' Reilly等人于1997年首先發(fā)現(xiàn)。O' Reilly等人在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞瘤(EOMA)的細(xì)胞培養(yǎng)液能抑制體外牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，他們從這種培養(yǎng)液中提純出了一種新的蛋白質(zhì)，并命名為內(nèi)皮抑素(Endostatin，ES)。經(jīng)鑒定表明鼠內(nèi)皮抑素由膠原蛋白XVIII C末端區(qū)內(nèi)184個(gè)氨基酸片段構(gòu)成[O’Reily M S.et al.US 005854205A]。我國(guó)徐根興等人也于當(dāng)年在研究?jī)?nèi)皮抑素工作中發(fā)現(xiàn)了人的血管內(nèi)皮抑素，并從人肝臟cDNA文庫中篩選克隆得到人體血管內(nèi)皮抑素基因[徐根興等，CN1177005A]。內(nèi)皮抑素的直接作用是通過抑制血管生長(zhǎng)而起到抗腫瘤作用，并且不會(huì)導(dǎo)致抗藥性產(chǎn)生。恩度(Endostar)是我國(guó)自主研發(fā)的重組人血管內(nèi)皮抑素(Recombinant HumanEndostatin, rhES),于2005年上市,用于非小細(xì)胞肺癌的治療。它與天然的血管內(nèi)皮抑素相比，在N端添加了 9個(gè)氨基酸序列，提高了生物活性和穩(wěn)定性。恩度與化療藥物長(zhǎng)春瑞賓和順鉬(NP化療方案)聯(lián)用有一定的協(xié)同作用，可延緩患者的腫瘤進(jìn)展。但是內(nèi)皮抑素作為小分子蛋白，性質(zhì)很不穩(wěn)定，易于發(fā)生酶促降解并被清除，因此在體內(nèi)的半衰期較短。而且，目前恩度臨床用藥量很大，在聯(lián)合NP化療方案用于治療初治或復(fù)治的III/IV期非小細(xì)胞肺癌患者時(shí)，注射劑量為7.5mg/m2，每天靜脈滴注3_4小時(shí)，連續(xù)給藥14天為一周期。因此，提高rhES的體內(nèi)半衰期，從而減少治療劑量，降低患者痛苦以提高患者依從性成為一個(gè)急需解決的問題。為了穩(wěn)定蛋白質(zhì)、預(yù)防酶促降解和被腎臟清除，可以使用諸如聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)等具有高溶解性的聚合物來化學(xué)修飾蛋白質(zhì)藥物的表面。PEG分子具有兩親性，既可以溶于水，又可以溶于大多數(shù)的有機(jī)溶劑，無毒、無免疫原性，是可用于藥物制備的高分子之一。通過與靶蛋白質(zhì)的特定區(qū)域或各種區(qū)域結(jié)合，PEG能夠提高血漿半衰期，增強(qiáng)生物利用度，減低蛋白質(zhì)免疫原性、提高藥物療效及安全性等。另外，可通過在PEG兩端連接同樣的蛋白質(zhì)藥物來制備二倍體，以提高蛋白藥物的活性。也可以將兩種不同的蛋白質(zhì)藥物連接于PEG的兩端，得到具有兩種活性的藥物組合物。
改善蛋白藥物的體內(nèi)半衰期還可以通過用基因重組技術(shù)，將藥物蛋白的基因與編碼具高血清穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)基因相融合，從而生產(chǎn)融合蛋白藥物。例如將蛋白質(zhì)藥物與白蛋白或其片段融合，或者與免疫球蛋白Fe片段融合。研究表明，藥物與免疫球蛋白Fe片段融合，可以明顯改善藥物的體內(nèi)半衰期。不過，盡管PEG能增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，PEG偶聯(lián)也存在一些問題，如降低蛋白生物學(xué)活性。此外，隨著PEG分子量的提高，其產(chǎn)量也會(huì)有所降低等等。通過基因重組產(chǎn)生融合蛋白也具有一些缺點(diǎn)。例如，其導(dǎo)致所產(chǎn)生的融合蛋白的活性顯著降低。蛋白質(zhì)作為生理學(xué)功能性物質(zhì)的活性是由蛋白質(zhì)的構(gòu)象決定的。當(dāng)多肽藥物通過重組方法與免疫球蛋白Fe片段融合時(shí)，利用原核細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，融合蛋白常常發(fā)生錯(cuò)誤折疊并以包涵體的形式表達(dá)；而利用真核細(xì)胞表達(dá)，免疫球蛋白Fe片段通常會(huì)被糖基化，從而可能引起體內(nèi)的不良免疫應(yīng)答。融合的接頭區(qū)也可能對(duì)蛋白水解酶的降解作用敏感等等。韓國(guó)韓美藥品有限公司開發(fā)了一種新型長(zhǎng)效重組蛋白或多肽藥物的技術(shù)平臺(tái)(W02005/047337)，其中公開了一種包含免疫球蛋白Fe片段作為載體的藥物組合物可以延長(zhǎng)蛋白或多肽藥物的半衰期，并提高藥物的體內(nèi)生物利用率。然而，如WO 2005/047337中所記載，其所得重組蛋白或多肽藥物最多僅保留約50%的體外細(xì)胞學(xué)活性。本領(lǐng)域還需要在提高人內(nèi)皮抑素的穩(wěn)定性和體內(nèi)半衰期的同時(shí)保留其生物活性，從而提高其生物利用度，減少治療劑量，并提高患者依從性的長(zhǎng)效rhES制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種長(zhǎng)效血管內(nèi)皮抑素制劑，從而增強(qiáng)血管內(nèi)皮抑素在體內(nèi)的穩(wěn)定性，提高其有效血藥濃度和生物利用度，并延長(zhǎng)半衰期。本發(fā)明還提供了制備、分離和純化長(zhǎng)效血管內(nèi)皮抑素制劑的方法，以及所述長(zhǎng)效血管內(nèi)皮抑素制劑在制備用于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。第一方面，本發(fā)明提供了一種長(zhǎng)效血管內(nèi)皮抑素制劑，所述長(zhǎng)效重組人內(nèi)皮抑素是通過聚乙二醇與免疫球蛋白Fe片段共價(jià)連接的人內(nèi)皮抑素分子。本發(fā)明中的長(zhǎng)效rhES制劑以免疫球蛋白Fe片段作為載體。免疫球蛋白Fe片段是在體內(nèi)可新陳代謝的生物可降解多肽，因此，將其作為藥物載體是安全的。本文中所述的“免疫球蛋白Fe片段”具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。具體地，所述的“免疫球蛋白Fe片段”是指包含免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)2 (Ch2)和重鏈恒定區(qū)3(Ch3)且不含免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)的蛋白質(zhì)。免疫球蛋白Fe片段可進(jìn)一步包含位于重鏈恒定區(qū)的鉸鏈區(qū)。此外，本發(fā)明的免疫球蛋白Fe片段還可包含重鏈恒定區(qū)I (ChI)和/或輕鏈恒定區(qū)I(Ql)的一部分或全部，只要它具有與天然蛋白基本相似或更好的生理學(xué)功能。由于免疫球蛋白Fe片段不包含在抗體亞型之間具有高度非同源性的Fab片段，因此其抗原性大大降低。本發(fā)明的免疫球蛋白Fe片段可來自人類或其它動(dòng)物，包括牛、山羊、豬、小鼠、兔子、倉鼠、大鼠和豚鼠，優(yōu)選來自人類。本發(fā)明的免疫球蛋白Fe片段可以是從人類或其它動(dòng)物分離的天然形式或其衍生物。在本文中，可以通過從人或動(dòng)物體中分離完整的免疫球蛋白并用蛋白水解酶處理，從而從天然免疫球蛋白獲得Fe片段。例如，可以使用木瓜蛋白酶處理分離的天然免疫球蛋白，從而獲得Fab片段和Fe片段，并對(duì)這些片段進(jìn)行純化，從而分離出Fe片段。此外，如果需要，也可以 對(duì)Fe片段進(jìn)行衍生化，從而獲得Fe衍生物。本文中所述的“Fe片段衍生物”是指具有與本發(fā)明Fe片段相同或更高的性能，例如結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性(包括耐熱性、PH穩(wěn)定性)等的衍生物。由Fe片段獲得Fe片段衍生物的方法是本領(lǐng)域已知的。例如可以通過化學(xué)方式,如磷酸化、甲基化、乙?；?或者生物方式,例如突變或重組等方式獲得Fe片段的衍生物。由Fe片段獲得的Fe片段衍生物也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明的免疫球蛋白Fe片段還可以由轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，例如動(dòng)物細(xì)胞或微生物細(xì)胞表達(dá)而獲得。例如，本發(fā)明的免疫球蛋白Fe片段可以是得自于微生物的重組人源免疫球蛋白Fe片段。本發(fā)明的免疫球蛋白Fe片段可以是具有天然糖鏈、與天然形式相比糖鏈增加或減少的形式，或者可以是去糖基化的形式。免疫球蛋白Fe糖鏈的增加、減少或去除可以通過本領(lǐng)域的常規(guī)方法完成，諸如化學(xué)法、酶促法和利用微生物的遺傳工程方法等，但不限于此。去除免疫球蛋白Fe片段的糖基可導(dǎo)致它與第一補(bǔ)體成分Cl的Clq部分的結(jié)合親和力明顯降低，抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)的降低或喪失，從而不會(huì)在體內(nèi)引起不必要的免疫應(yīng)答反應(yīng)。因此，在本發(fā)明中優(yōu)選使用去糖基化或非糖基化的免疫球蛋白Fe片段。本文中的術(shù)語“去糖基化”或“非糖基化”是指從免疫球蛋白Fe片段除去了糖基部分或以沒有糖基化的形式產(chǎn)生的免疫球蛋白Fe片段。此外，免疫球蛋白Fe片段可以是來自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fe片段，或者通過它們的組合或雜合制備而來的Fe片段。優(yōu)選的Fe片段來自IgG或IgM，它們是人類血液中最豐富的蛋白質(zhì)之一?？紤]到IgG能延長(zhǎng)配體結(jié)合蛋白質(zhì)的半衰期,最優(yōu)選來自IgG的Fe片段。本文中的術(shù)語“組合”是指編碼同一來源的單鏈免疫球蛋白Fe片段的多肽與不同來源的單鏈多肽連接形成的二聚體或多聚體。例如由IgGlFC、IgG2Fc、IgG3Fc和IgG4Fc片段中的兩種或多種片段所形成的免疫球蛋白Fe片段。

本文中的術(shù)語“雜合”是指編碼不同來源的兩種或多種免疫球蛋白Fe片段的序列存在于單鏈免疫球蛋白Fe片段中。各種類型的雜合體包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的免疫球蛋白Fe片段可以包含選自CH1，Ch2，Ch3，Ch4結(jié)構(gòu)域中的1_4個(gè)結(jié)構(gòu)域。例如，所述免疫球蛋白Fe片段可以包含免疫球蛋白Fe片段的CH1，Ch2，Ch3，和Ch4中的一種或四種結(jié)構(gòu)域。此外，所述免疫球蛋白Fe片段還可以包含鉸鏈區(qū)。另一方面，IgG被劃分為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亞型。因此，本發(fā)明所述的免疫球蛋白Fe片段可以選自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4的Fe片段及其組合和雜合體組成的組。其中，在本發(fā)明中優(yōu)選IgG2和IgG4亞型，最優(yōu)選IgG4的Fe片段。它幾乎不具有諸如CDC等效應(yīng)器功能。S卩，作為本發(fā)明的藥物載體，最優(yōu)選的免疫球蛋白Fe片段是人IgG4來源的非糖基化Fe片段。本發(fā)明中所述的人內(nèi)皮抑素分子是指由183個(gè)氨基酸構(gòu)成的膠原蛋白XVIIIC末端區(qū)片段(氨基酸序列如圖1SEQ ID NO:1所示)，基于該片段的重組蛋白或生物活性片段?；谒鋈藘?nèi)皮抑素分子的重組蛋白是本領(lǐng)域公知的，例如本發(fā)明中使用的人內(nèi)皮抑素分子可以是含有His-tag的重組人內(nèi)皮抑素分子。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用的人內(nèi)皮抑素分子可具有如圖2所示氨基酸序列(SEQ ID N0:2)的重組人內(nèi)皮抑素(rhES)。所述rhES可以由大腸桿菌表達(dá)，在這種情況下，其N末端的Met可任選地被刪除。就人內(nèi)皮抑素而言，本發(fā)明所述的“生物活性片段”是指由SEQ ID NO:1所示人內(nèi)皮抑素分子衍生出的任何蛋白片段，前提是該片段保留了 SEQ IDNO:1所示人內(nèi)皮抑素分子70%以上，優(yōu)選90%以上的抑制血管生長(zhǎng)的活性。本發(fā)明中所述的PEG是指聚乙二醇，例如分子量2_5kDa的聚乙二醇。優(yōu)選使用兩端具有醛基功能團(tuán)的3.4kDa PEG(ALD-PEG-ALD)進(jìn)行連接，將Fe片段與人內(nèi)皮抑素組合。更優(yōu)選地，一個(gè)rhES分子與一個(gè)Fe片段通過一分子PEG進(jìn)行連接，兩者與PEG的連接位點(diǎn)均為N端。第二方面，本發(fā)明提供了所述長(zhǎng)效人內(nèi)皮抑素制劑的制備和純化方法，所述方法包括以下步驟:首先，通過PEG與人內(nèi)皮抑素N端α氨基的共價(jià)結(jié)合和層析純化，制備單PEG化的人內(nèi)皮抑素(rhES-PEG)。對(duì)于rhES-PEG的制備，可以在反應(yīng)緩沖液中，將人內(nèi)皮抑素與PEG混合，并向反應(yīng)混合物中還原劑氰基硼氫化鈉進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物稀釋，經(jīng)層析純化獲得N末端單PEG化的rhES。具體地，可以在一定pH值(如ρΗ3.5，ρΗ5.5，ρΗ6.5)的醋酸鈉反應(yīng)緩沖液下，將rhES與PEG按一定的摩爾比例(如1: 5，1: 10，1: 15)混合；并向反應(yīng)混合物中加入終濃度20mM的還原劑氰基硼氫化鈉；不同的時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行反應(yīng)，如lh，2h，4h，20h。優(yōu)選地，使摩爾比為1: 15的rhES和PEG，在pH5.5，4°C的條件下反應(yīng)lh。反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物用醋酸鈉緩沖液稀釋，經(jīng)Source S層析純化獲得N末端單PEG化的rhES。其次，通過與PEG共價(jià)結(jié)合，將Fe片段與PEG化的人內(nèi)皮抑素進(jìn)一步偶聯(lián)，再經(jīng)過層析純化，制備所述長(zhǎng)效人內(nèi)皮抑素。在獲得rhES-PEG后，可以將其與Fe片段在緩沖液中混合，加入還原劑氰基硼氫化鈉進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物稀釋，經(jīng)層析純化獲得經(jīng)PEG連接的rhES與Fe片段。具體地，在ρΗ3.5，ρΗ5.5或ρΗ6.5的醋酸鈉緩沖液中，將rhES-PEG與Fe片段按1: 5，1: 10或1: 15的摩爾比例混合，加入終濃度20mM的還原劑氰基硼氫化鈉，并在溫和攪拌下4V反應(yīng)8h，16h或24h。優(yōu)選地，使摩爾比為1: 15的rhES-PEG與Fe片段，在pH5.5，4°C的條件下反應(yīng)16h。反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物用醋酸鈉緩沖液稀釋，經(jīng)Source S層析純化獲得經(jīng)PEG連接的rhES與Fe片段。經(jīng)SDS-PAGE和HPLC對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定，該聚合物純度可達(dá)97 %以上，為rhES-PEG-Fc產(chǎn)物。因此，本發(fā)明成功得到了含有免疫球蛋白Fe片段作為載體的重組人內(nèi)皮抑素聚合物。第三方面，本發(fā)明還提供了所述長(zhǎng)效人內(nèi)皮抑素制劑在制備用于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四方面涉及使用所述長(zhǎng)效人內(nèi)皮抑素制劑治療癌癥的方法。由本發(fā)明所述的長(zhǎng)效人內(nèi)皮抑素制劑延長(zhǎng)了人內(nèi)皮抑素的半衰期、提高了人內(nèi)皮抑素的穩(wěn)定性和生物利用度，因此，可用于人內(nèi)皮抑素治療的各種癌癥，包括但不限于乳腺癌、肺癌、直腸癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌、前列腺癌、胃癌、宮頸癌、胰腺癌、食管癌、絨毛膜上皮癌、惡性葡萄胎、膀胱癌、皮膚癌、頭頸部癌、支氣管肺癌、大腸癌和白血病。優(yōu)選地，所述癌癥為肺癌，最優(yōu)選非小細(xì)胞肺癌?？蓪⒈景l(fā)明的藥物組合物與藥學(xué) 可接受的載體組合配制成各種劑型，包括適于胃腸道或非胃腸道給藥的各種劑型。
本發(fā)明使用的“藥學(xué)可接受的載體”是指不干擾所述長(zhǎng)效人內(nèi)皮抑素的生理作用，且對(duì)包括人類在內(nèi)的受試者沒有毒性的任何物質(zhì)。本發(fā)明所用藥學(xué)可接受的載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際需要選擇適合的載體，并通過本領(lǐng)域已知的方法配制本發(fā)明的制齊 。所述制劑包括但不限于片齊 、溶液、懸劑、油劑、乳劑、凝膠、氣溶膠、吸入劑、噴霧、膠囊、丸劑、貼劑和栓劑等。本發(fā)明所述的長(zhǎng)效人內(nèi)皮抑素制劑在所述藥物中的劑量可以在1.5-37.5mg/m2的范圍。由于本發(fā)明所述的長(zhǎng)效人內(nèi)皮抑素制劑在體內(nèi)具有很長(zhǎng)的作用持續(xù)時(shí)間，所以可以大大降低所述藥物的給藥頻率。本發(fā)明的長(zhǎng)效人內(nèi)皮抑素制劑可以每周給藥一次，因此，提高了患者的依從性。對(duì)該產(chǎn)物rhES-PEG-Fc進(jìn)行了體內(nèi)和體外的生物學(xué)活性檢測(cè)。體外細(xì)胞學(xué)活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該聚合物rhES-PEG-Fc的抗內(nèi)皮細(xì)胞遷移活性與未修飾的rhES的活性相近。Fe片段的連接基本沒有影響rhES的體外細(xì)胞學(xué)活性。藥物代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該聚合物rhES-PEG-Fc的體內(nèi)半衰期為62.4h，比未修飾的rhES的體內(nèi)半衰期(2.4h)提高了 26倍。藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rhES-PEG-Fc每周給藥1.3mg/kg和4mg/kg組,具有與每天給藥4mg/kg的rhES相似的抗腫瘤活性。上述優(yōu)點(diǎn)表明，rhES經(jīng)PEG與Fe片段連接后，半衰期顯著延長(zhǎng)，且保持了抗內(nèi)皮細(xì)胞遷移活性和抗腫瘤活性，從而能夠減少給藥劑量，降低給藥頻率。


圖1:顯示了人內(nèi)皮抑素氨基酸序列SEQ ID NO:1。圖2:顯示了 N端添加 了 9個(gè)氨基酸的重組人內(nèi)皮抑素的氨基酸序列SEQ ID NO:2。圖3:顯示了純化后rhES-PEG-Fc的SDS-PAGE鑒定圖。在圖3中，泳道1:非還原的rhES-PEG ;泳道2:非還原的rhES-PEG-Fc ;泳道3:非還原的Fe片段；泳道4:非還原的rhES ;泳道5:非還原的Fe片段；泳道6:還原的rhES-PEG ;泳道7:還原的rhES-PEG-Fc ;泳道8:還原的Fe片段；泳道9:還原的rhES ;泳道10:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)圖4:顯示了純化后rhES-PEG-Fc的RP-HPLC純度檢測(cè)結(jié)果，其中以99.7%峰面積歸一 O圖5:顯示了 rhES和rhES-PEG-Fc的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)曲線。圖6:顯示了 rhES和rhES-PEG-Fc的體內(nèi)抗腫瘤活性檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。實(shí)施例1.rhES-PEG的制備將兩端具有醛基的3.4kDa聚乙二醇(ALD-PEG-ALD)與重組人內(nèi)皮抑素rhES (來自江蘇先聲麥得津生物制藥有限公司，產(chǎn)品批號(hào)20100305，序列如圖2所示)以15: I的摩爾比例溶于2M醋酸鈉緩沖液中，向此混合物中加入終濃度20mM的還原劑氰基硼氫化鈉，并在溫和攪拌下于4V反應(yīng)Ih，使PEG與rhES的N末端氨基連接。
采用Source S (購自 GE Healthcare, Source 15S，貨號(hào) 17-0944-03)純化反應(yīng)終產(chǎn)物。將上述反應(yīng)混合物用50mM，pH6.4的4-嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液20倍稀釋后上樣。洗脫緩沖液為含有IM NaCl的50mM MES緩沖液，采用梯度濃度洗脫。梯度為在120min內(nèi)洗脫緩沖液濃度由15%過渡到45%，流速為3ml/min，獲得產(chǎn)物的濃度范圍是30% -40%。使用分部收集器收集樣品并經(jīng)SDS-PAGE鑒定。結(jié)果表明所制得的rhES-PEG為單PEG化的rhES片段。實(shí)施例2.rhES-PEG-Fc 的制備將上述實(shí)施例1純化獲得的單PEG化rhES與免疫球蛋白Fe片段的N末端做進(jìn)一步偶聯(lián)。將Fe片段(由大腸桿菌BL21 (DE3)表達(dá)的非糖基化人IgG4Fc片段，NCBI GeneID:3503。得自于北京韓美藥品有限 公司)與所述rhES-PEG以15:1的摩爾比例溶于50mM,pH5.5醋酸鈉緩沖液中，向此混合物中加入終濃度20mM的還原劑氰基硼氫化鈉，并在溫和攪拌下在4V反應(yīng)16h，使所述rhES-PEG與Fe片段的N末端偶聯(lián)。采用Source S (購自 GE Healthcare, Source 15S，貨號(hào) 17-0944-03)純化反應(yīng)終產(chǎn)物。將上述反應(yīng)混合物用50mM，pH5.5的醋酸鈉緩沖液20倍稀釋后上樣。洗脫緩沖液為含有IM NaCl的50mM醋酸鈉緩沖液。采用梯度濃度洗脫。梯度為在200min內(nèi)洗脫緩沖液濃度由20%過渡到50%，流速為3ml/min，獲得產(chǎn)物的濃度范圍是35% -45%。使用分部收集器收集樣品，從而分離得到高純度的rhES-PEG-Fc蛋白質(zhì)組合物。所得產(chǎn)物用SDS-PAGE鑒定，結(jié)果如圖3所示。rhES_PEG_Fc的理論分子量約為74kD。Fe片段的分子量約為49kD (泳道3和泳道5)，由兩條相同的肽鏈通過二硫鍵連接形成。在所述rhES-PEG-Fc還原型電泳中，將Fe片段內(nèi)的二硫鍵被打開后應(yīng)顯示兩個(gè)條帶:其中一個(gè)條帶為連接了 rhES-PEG的單鏈Fe條帶，分子量約為49kD，另一條為單鏈Fe約25kD的條帶(參見泳道7)。圖3中顯示了所述rhES-PEG-Fc在非還原型電泳中表現(xiàn)為分子量約74kD的單個(gè)條帶(參見泳道2)。因此，本發(fā)明成功制備了 rhES-PEG-Fc。此外，還對(duì)所得rhES-PEG-Fc終產(chǎn)物進(jìn)行了反相HPLC分析，所用儀器為安捷倫1200型，配備C4色譜柱(Vydac 214TP)，梯度為在50min內(nèi)由5%水/95%乙腈過渡到95%水/5%乙腈，流速為lml/min，柱溫設(shè)為60°C。所得典型HPLC譜圖如圖4所示，主峰峰面積占97 %以上，表明所得rhES_PEG_Fc具有很高的純度。實(shí)施例3.rhES-PEG-Fc的體外抗血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移活性的測(cè)定本實(shí)施例中檢測(cè)了本發(fā)明所述的rhES-PEG-Fc對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMVEC)的抗遷移活性。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HMVEC細(xì)胞(購自ATCC，貨號(hào)CRL-4025)饑餓過夜后，接種8 XlO4個(gè)細(xì)胞于檢測(cè)細(xì)胞遷移的培養(yǎng)皿Transwell(購自Corning公司，貨號(hào)為3422)中。Transwell培養(yǎng)皿是一種帶有通透性支持物的培養(yǎng)小室，小室底層為一張有通透性的膜，即通透性支持物。本實(shí)施例中采用的是帶有孔徑8.0 μ m的PC膜的Transwell培養(yǎng)皿。分別設(shè)陰性對(duì)照組(N.C.組，無血清培養(yǎng)基DMEM)，陽性對(duì)照組(P.C.組，添加2%胎牛血清FBS和10ng/ml血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF)和兩組加藥組(在陽性對(duì)照組的基礎(chǔ)上分別添加rhES或按照本發(fā)明實(shí)施例2制備的rhES-PEG-Fc，加藥濃度為2.5,5,10，20，40，80，160 μ g/ml。rhES-PEG-Fc組按其所含rhES的量進(jìn)行計(jì)算)。將各組的細(xì)胞在37°C孵育4h。隨后，取出培養(yǎng)皿，用4%聚甲醛固定細(xì)胞15min，刮掉Transwell膜上層的未遷移細(xì)胞，用結(jié)晶紫對(duì)下層細(xì)胞染色。最后利用顯微鏡在相同大小視野下計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)算半數(shù)抑制濃度ED5tlt5計(jì)算結(jié)果顯示，rhES的 ED50 為 36.7 μ g/ml, rhES-PEG-Fc 的 ED50 為 37.3 μ g/ml。因此，本發(fā)明的rhES-PEG-Fc保持了 rhES的98.4%的抗內(nèi)皮細(xì)胞遷移活性。實(shí)施例4.rhES-PEG-Fc的藥代動(dòng)力學(xué)研究 本實(shí)施例檢測(cè)了本發(fā)明的rhES-PEG-Fc在大鼠體內(nèi)的半衰期。將10只雄性SD大鼠(購自北京華阜康生物科技股份有限公司，6-8周，180_220g/只)隨機(jī)分成2組，按4.5mg/kg體重皮下給藥。A組為rhES，B組為按照本發(fā)明實(shí)施例2制備的 rhES-PEG-Fc。在給藥后5min、15min、0.5h、lh、l.5h、2h、3h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、192h、288h取血，血樣以肝素抗凝，3000rpm離心15min，得到血漿樣品凍存于_80°C，待測(cè)。

根據(jù)廠商的說明，使用人內(nèi)皮抑素Quantikine酶聯(lián)免疫試劑盒(購自R&DSystems，貨號(hào)DNST0)通過ELISA夾心法測(cè)定血漿中樣品的rhES含量。結(jié)果見圖5。rhES的半衰期T1/2為2.4h，濃度-時(shí)間曲線下面積AUC為8.61 μ g.Vml，達(dá)到最大濃度的時(shí)間Tmax為1.63h，最大濃度Cmax為2026.15ng/ml。與rhES相比，rhES-PEG-Fc的體內(nèi)半衰期 T1/2 為 62.4h，AUC 為 894.05 μ g.h/ml，Tmax 為 24.00h, Cmax 為 6644.33ng/ml。由以上試驗(yàn)結(jié)果可見，與rhES相比，本發(fā)明rhES-PEG-Fc的體內(nèi)半衰期提高了 26倍。并且，根據(jù)所測(cè)定的AUC數(shù)據(jù)，本發(fā)明rhES-PEG-Fc的生物利用度比rhES提高了 100倍以上。實(shí)施例5.rhES-PEG-Fc的體內(nèi)抗腫瘤活性研究本實(shí)施例中測(cè)試了本發(fā)明的rhES-PEG-Fc對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的體內(nèi)抑制活性。實(shí)驗(yàn)材料選用雌性BALB/c裸鼠(購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，6_8周，18-25g/只)，分別接種2 X IO6個(gè)人肺癌細(xì)胞A549 (購自ATCC，貨號(hào)CCL-185)于裸鼠左側(cè)胸腔內(nèi)。待瘤體積長(zhǎng)至100-300mm3時(shí)，進(jìn)行隨機(jī)分組，8只/組，并開始給藥。分別設(shè)定陰性對(duì)照組(醋酸鈉緩沖液，NaAC)、陽性對(duì)照組(rhES 4mg/kg體重，每天給藥，連續(xù)給藥14天)、兩組給藥組(以按照本發(fā)明實(shí)施例2制備的rhES-PEG-Fc分別給藥1.3mg/kg和4mg/kg體重,每周給藥一次,連續(xù)給藥兩周。按rhES-PEG-Fc中所含rhES的量進(jìn)行計(jì)算)。給藥方式為皮下注射。自給藥日起每天測(cè)量腫瘤體積直至第28天，計(jì)算公式為:腫瘤體積(mm3) = (aXb2)/2(a為腫瘤的長(zhǎng)徑，b為腫瘤的短徑)。結(jié)果見圖6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯不:rhES-PEG-Fc每周給藥1.3mg/kg和4mg/kg組,具有與陽性對(duì)照組(每天給藥rhES 4mg/kg)相似的抗腫瘤活性。本發(fā)明rhES-PEG-Fc的可大大降低用藥劑量，同時(shí)保持同樣的抗腫瘤效應(yīng)。由此可見，本發(fā)明提供了完全保持了 rhES的抗內(nèi)皮細(xì)胞遷移活性，并且具有更好穩(wěn)定性和生物利用度和更長(zhǎng)體內(nèi)半衰期的rhES-PEG-Fc，從而大大降低用藥劑量。以上說明書提到的全部出版物均通過引用并入本文。盡管已參照具體優(yōu)選實(shí)施方式描述了本發(fā)明，但是應(yīng)該理解所主張的發(fā)明不僅限于所述具體實(shí)施方式
。實(shí)際上，用于實(shí)施本發(fā)明的所述模式的各種修改對(duì)于生物化學(xué)和生物工程或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說都是顯而易見的， 均應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求書的范圍。
權(quán)利要求
1.一種長(zhǎng)效人內(nèi)皮抑素，其特征在于，所述長(zhǎng)效人內(nèi)皮抑素是通過聚乙二醇與免疫球蛋白Fe片段共價(jià)連接的人內(nèi)皮抑素分子。
2.如權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)效人內(nèi)皮抑素，其特征在于:所述免疫球蛋白Fe片段是非糖基化的。
3.如權(quán)利要求1或2所述的長(zhǎng)效人內(nèi)皮抑素，其特征在于:所述免疫球蛋白Fe片段是IgG4的Fe片段。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的長(zhǎng)效人內(nèi)皮抑素，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量為2 5kDa。
5.如權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)的長(zhǎng)效人內(nèi)皮抑素，其特征在于，所述聚乙二醇分子兩端具有醛基功能基團(tuán)。
6.如權(quán)利要求5中所 述的長(zhǎng)效人內(nèi)皮抑素，其特征在于，所述聚乙二醇分子是兩端具有醛基功能團(tuán)的3.4kDa聚乙二醇。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的長(zhǎng)效人內(nèi)皮抑素，其特征在于:所述藥物組合物是通過聚乙二醇將人內(nèi)皮抑素的N端α氨基與免疫球蛋Fe片段的N端通過共價(jià)鍵連接。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的長(zhǎng)效人內(nèi)皮抑素在制備用于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述癌癥是肺癌。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中所述癌癥是非小細(xì)胞肺癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種長(zhǎng)效人內(nèi)皮抑素。所述長(zhǎng)效人內(nèi)皮抑素是通過聚乙二醇與免疫球蛋白Fc片段共價(jià)連接的人內(nèi)皮抑素分子。本發(fā)明還公開了所述長(zhǎng)效人內(nèi)皮抑素的制備和純化方法，以及所述長(zhǎng)效人內(nèi)皮抑素在制備用于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K17/08GK103172745SQ20111043322
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日
發(fā)明者張世奇, 劉家望, 杜伯雨, 馬玉芬, 楊亞平, 李永平, 周筠, 連忠輝, 文圣煥 申請(qǐng)人:北京韓美藥品有限公司