專利名稱：生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及傳感器，具體涉及用于測定測試樣品中存在分析物的傳感器。本發(fā)明還涉及納米顆粒膜。本發(fā)明進一步涉及水溶性氧化還原聚合物及制備聚合物的方法。
背景技術(shù)：
近年來，聚合物材料在許多領(lǐng)域得到廣泛的理論關(guān)注和實際使用[G.Harsanyi.Materials Chemistry anf Physics Vol.43，Issue 3，1996，199]。具體而言，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)導電聚合物逐漸用于生物傳感領(lǐng)域，其中導電聚合物提供作為智能傳感器與智能分子接收器之間的界面的獨特功能。在所有已知的導電聚合物中，例如離子導電聚合物、電荷轉(zhuǎn)移聚合物和共軛導電聚合物，迄今為止，氧化還原聚合物被最廣泛地用于生物傳感領(lǐng)域。
葡萄糖傳感，作為生物傳感的一個方面已經(jīng)在最近進行了重大研究，其基于葡萄糖氧化酶將葡萄糖酶氧化成葡萄糖酸所需的電子介導。氧化還原聚合物的電子介導功能已被廣泛研究并應用于許多電流測量的葡萄糖生物傳感器。
在其天然酶反應中，輔酶黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)是存在于葡萄糖氧化酶中的電子載體，其被還原成FADH2(從FAD還原)并由分子氧氧化恢復為FAD。O2隨后被還原為H2O2。該氧化和還原循環(huán)使FAD能夠作為電子受體。由于葡萄糖和葡萄糖酸在-0.5-1.0V的工作電位窗口內(nèi)均沒有電活性，因此增加H2O2濃度或降低O2濃度成為定量葡萄糖濃度的測量手段。
然而，基于測量H2O2和O2的測量精確性有損害，這是由于首先空氣中的O2分壓影響電流計的響應，其次因為當進行傳感時O2用量上升，因而在高葡萄糖濃度下定量測量O2很困難。利用H2O2在鉑電極上氧化而檢測H2O2需要0.5-0.6V的工作電位(相對于Ag/AgCl)，因而受到血液中電活性物質(zhì)的干擾，例如在該電位處具有電化學活性的抗壞血酸和尿酸。
為了解決與涉及O2或H2O2的葡萄糖檢測有關(guān)的上述問題，已經(jīng)提出將氧化還原介體作為人工電子受體以替代用于FADH2的氧分子。
原則上，成功的介體應該滿足三個條件1)與酶和電極的快速電子交換速率，2)穩(wěn)定附著于電極上，和3)可在水性介質(zhì)中加工。
為此，廣泛研究了兩類介體，即過渡金屬配合物和二茂鐵基材料。近年來，許多研究小組關(guān)注單聚和多聚的二茂鐵基材料的合成和生物傳感器應用。例如，聚二茂鐵基化合物已經(jīng)用作分子識別中的氧化還原指示劑[J.E.Kinston，et al，J.Chem.Soc.，Dalton.Trans(1999)251.]、生物傳感器中的介體[S.Koide，et al，J.Electroanal.Chem.，468(1999)193.]和改性電極表面的涂層[S.Nlate，et al，Chem.Commun.，(2000)417]。然而，大多數(shù)已知的二茂鐵基材料僅可溶于非極性介質(zhì)中，僅有少數(shù)二茂鐵基和聚二茂鐵基材料是水溶性的[O.Hatozaki，et al，J.Phys.Chem.，199(1996)8448.]。人們對水溶性二茂鐵基材料作為生物傳感器中的氧化還原介體特別關(guān)注。通過將烯烴取代的二茂鐵如乙烯基二茂鐵與適當?shù)乃苄跃酆衔锕簿?，可以制備易溶于水的二茂鐵基材料。但是，已經(jīng)表明自由基引發(fā)的乙烯基二茂鐵聚合是不常見的[A.J.Tinker，et al，J.Polym.Sci.，Polym.Chem.Ed.，13(1975)2133；M.H.George，et al，J.Polym.Sci.，Polym.Chem.Ed.，14(1975)475.]。已知乙烯基二茂鐵的共聚是困難的，這是因為在聚合體系中茂鐵離子是自由基清除劑，導致反應不遵守正常的自由基聚合動力學。聚合反應的終止通過從二茂鐵核至增長鏈自由基的電子傳遞而發(fā)生。這導致聚合物鏈失活和含有高自旋鐵(III)物質(zhì)的聚合物。
聚丙烯酰胺已經(jīng)廣泛用作酶固定化和生物傳感中的載體基質(zhì)，這是因為其良好的化學和機械穩(wěn)定性及其對微生物降解的惰性[I，Willner，et al，J.Am.Chem.Soc.112(1990)6438]。然而，乙烯基二茂鐵和丙烯酰胺及其衍生物的共聚嘗試并不成功[H.Bu，et al，Anal.Chem.，67(1995)4071及其中的參考文獻]。相反，為了避免低效的乙烯基二茂鐵的共聚，提出了制備二茂鐵基材料中的化學接枝程序[S.Koide，et al，J.Electroanal.Chem.，468(1999)193；J.Hodak，et al，Langmuir，13(1997)2708；A.Salmon，et al，J.Organomet.Chem.，637-639(2001)595]。在最近的兩篇報導中[N.Kuramoto，et al，Polymer 39(1998)669；H.Ahmad，et al，Colloids and Surfaces，186(2001)221]，合成了乙烯基二茂鐵共聚物，但是在這些聚合物中二茂鐵負載量小且缺少可交聯(lián)基團，這限制其在生物傳感器中的應用。
商業(yè)可得的生物傳感器包括Therasense Inc.(參見例如US專利6,338,790)、Inverness Medical Technology(參見例如US專利6,241,862)和Matsushita Electric(參見例如US專利6,547,954)制造的生物傳感器。
因此，仍然需要具有優(yōu)異性能特征的二茂鐵基聚合物介體。結(jié)果，本發(fā)明的目的在于開發(fā)合成新型二茂鐵基聚合物介體的新方法。本發(fā)明的另一目的是提供具有增強性能的生物傳感器，并且該生物傳感器將使生物傳感器終端用戶的不便盡可能小。
這些目的通過本發(fā)明的各個方面得到解決，所述各個方面亦即在各獨立權(quán)利要求中限定的傳感器、膜、聚合物和方法。

發(fā)明內(nèi)容
在一個方面中，本發(fā)明提供用于確定分析物存在于測試樣品中的傳感器，所述傳感器包含納米顆粒膜，其含有選自周期表中IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIb、IIIB、IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族的元素的至少一種無機氧化物納米顆粒，其中氧化還原酶和電化學活化劑擴散分布于所述納米顆粒膜中。
在另一方面中，本發(fā)明提供非導電納米顆粒膜，所述納米顆粒膜含有選自周期表中IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIb、IIIB、IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族的元素的至少一種無機氧化物納米顆粒，其中氧化還原酶和電化學活化劑擴散分布于所述納米顆粒膜中。
在又一方面中，本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)非導電納米顆粒膜的方法，包括將電化學氧化還原介體與氧化還原酶和來自周期表中IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIb、IIIB、IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族元素的氧化物納米顆?；旌?，以形成納米復合材料墨；和將所述納米復合材料墨涂布至基材上。
在再一方面中，本發(fā)明提供水溶性氧化還原聚合物，其包含第一單體單元，包含可聚合的二茂鐵衍生物；和第二單體單元，包含具有能夠獲得凈電荷的(末端)伯酸或堿官能團的丙烯酸衍生物。
在一個實施方案中，該新水溶性氧化還原聚合物中的丙烯酸衍生物由以下通式(I)示出
其中，R選自CnH2n-NH2、CnH2n-COOH、NH-CnH2n-PO3H和NH-CnH2n-SO3H，其中烷基鏈可以是任選取代的，其中n是0-12的整數(shù)。
在再一方面中，本發(fā)明提供一種制備水溶性氧化還原聚合物的方法，所述方法包括將第一單體單元與第二單體單元聚合，所述第一單體單元包含可聚合的二茂鐵衍生物，所述第二單體單元包含丙烯酸衍生物，所述丙烯酸衍生物具有能夠獲得凈電荷的酸或堿官能團，其中所述聚合在含水的醇介質(zhì)中進行。


當結(jié)合非限制性實施例和附圖考慮時，通過以下詳細說明將更好地理解本發(fā)明，其中圖1是根據(jù)本發(fā)明一個實施方案的生物傳感器的等比例分解圖。
圖2A是示出圖1的生物傳感器沿圖1箭頭A方向觀察的端視圖。
圖2B是示出圖1的生物傳感器沿圖1箭頭B方向觀察的端視圖。
圖3是根據(jù)本發(fā)明另一實施方案的生物傳感器的等比例分解圖。
圖4示出發(fā)生在氧化還原聚合物介導的生物傳感器中的氧化還原偶聯(lián)反應的示意圖。
圖5示出本發(fā)明的水溶性且可交聯(lián)聚合物的基本單元的結(jié)構(gòu)。該圖示出在乙烯基二茂鐵和丙烯酸衍生物的共聚物中發(fā)現(xiàn)的重復單元。
圖6說明在乙烯基二茂鐵和丙烯酸衍生物的共聚反應中的通用反應方程式。
圖7示出根據(jù)本發(fā)明方法生產(chǎn)的氧化還原聚合物PAA-VFc和PAAS-VFc的傅立葉變換紅外(FT-IR)光譜。
圖8示出Fc、PAA、PAAS和由同VFc共聚得到的共聚物的紫外(UV)-可見光譜。
圖9示出各種系統(tǒng)中氧化還原聚合物的循環(huán)伏安圖。使用磷酸鹽緩沖鹽水，用于獲得伏安圖的電位掃描率為100mV/s。
圖10示出與金電極上的葡萄糖氧化酶-牛血清白蛋白(GOx-BSA)膜交聯(lián)的氧化還原聚合物PAA-VFc的另一循環(huán)伏安圖。使用磷酸鹽緩沖鹽水，用于獲得伏安圖中的電位掃描率為50mV/s。
圖11示出用于本工作中可一次性葡萄糖生物傳感器的分解圖。
圖12示出納米顆粒印刷墨加入(a)和不加入(b)100mg/dl葡萄糖的循環(huán)伏安圖。應用的電位掃描率為100mV/s。
圖13示出生物傳感器在含有(a)200和(b)0.0mg/dl葡萄糖的PBS中的電流計響應。所施加的平衡電位為0.30V。
圖14示出300mg/dl葡萄糖的電流計峰值電流對(a)PVFcAA濃度、(b)GOX濃度、(c)平衡電位和(d)納米顆粒膜厚度的依賴性。
圖15示出(a)不存在和(b)存在溶解氧時，PBS中的200mg/dl葡萄糖的電流計響應。所施加的平衡電位為0.30V。
圖16示出(a)對PBS中順序增加的100mg/dl葡萄糖的電流計響應和(b)在不同取樣時間下的標定曲線。所施加的平衡電位為0.30V。
具體實施例方式
一方面，本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)，即水溶性且可交聯(lián)的氧化還原聚合物可很容易地在含有過硫酸鹽作為引發(fā)劑的乙醇與水的化合物中制備。該制備方法允許更早面對所要克服的問題，如涉及二茂鐵分子的共聚反應的不利動力學。試驗表明得自本方法的乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酰胺共聚物的分子量為2000-4000道爾頓，對應于約400個單體單元，二茂鐵負載為3-14％。該水平的二茂鐵負載在之前使用自由基聚合技術(shù)已經(jīng)可以得到(參見例如N.Kuramoto et al.)。通過克服該限制，本發(fā)明已經(jīng)給出用于生物傳感應用的具有有用性能的新型聚合物和電化學檢測分析物的其它方法。
本發(fā)明氧化還原聚合物中的二茂鐵中心能夠提供局部電活性，因而能夠用于氧化還原反應而不帶來聚合物中分子內(nèi)鍵的重組。此外，本發(fā)明的氧化還原聚合物包含具有功能基團的側(cè)鏈，其有利于與其它具有合適官能團的分子交聯(lián)。這還允許該聚合物連接至大量的分子。組合這兩個特征，這些聚合物很好地適用于需要電子介導的應用，如用于生物傳感器和生物燃料電池中的酶電極，以及在電子酶反應器中進行的酶合成。
在另一方面中，根據(jù)本發(fā)明的葡萄糖傳感器引入能夠精確測量以極小量存在的流體中的葡萄糖濃度的傳感元件，因而只需要小于1μL或優(yōu)選約0.2μL-0.3μL的測試樣品。測試樣品通常包括動物生物樣本如生物流體(例如血液樣本、汗液樣本、尿液樣本)；排泄物樣本和含有脂肪組織或皮下脂肪的新鮮樣本?？梢岳帽緜鞲衅鞣治龅钠渌鼧悠钒ㄓ糜诳茖W實驗的試劑或含有葡萄糖的食物和用于葡萄酒或啤酒生產(chǎn)工業(yè)中的發(fā)酵液體培養(yǎng)基。試驗樣品也可包括微生物培養(yǎng)基(例如用于大腸桿菌、酵母或其它宿主生物高密度發(fā)酵的生長培養(yǎng)基，通常用于多肽的重組生產(chǎn))。
由于進行診斷測試需要的是小量測試樣品，因此使得對終端用戶帶來的不便最小。例如，對于需要連續(xù)葡萄糖評估的糖尿病人來說，抽取次微升水平的血液樣本將給患者帶來最小的疼痛和不便。
一般來說，本發(fā)明的傳感器利用本文中所詳述的納米顆粒膜。除了適合以亞微升水平測試血液樣本之外，該膜還具有可低成本制造和甚至在保存期延長的條件下穩(wěn)定的優(yōu)點。
該膜可引入電化學活化劑和底物特異酶，二者均擴散分布在沉積于氧化葡萄糖的傳感器電極上的膜中。此處使用的術(shù)語“電化學活化劑”是指能夠使葡萄糖和傳感器的工作(檢測)電極之間傳遞電子的酶活化的任意化合物。電化學活化劑可以是聚合物氧化還原介體。作為替代方案，也可以使用單體的電化學活化劑，如水溶性二茂鐵衍生物、鋨-二吡啶配位化合物、釕配位化合物(例如五胺吡啶釕和Ru(NH3)63+)以及六氰合鐵酸鹽和六氰合釕酸鹽。在本發(fā)明的一些實施方案中，電化學活化劑含具有氧化還原活性的金屬離子。該金屬離子的例子是銀、金、銅、鎳、鐵、鈷、鋨或釕離子或其混合物。
一般來說，引入本發(fā)明納米顆粒膜中的合適氧化還原介體應該具有防止或?qū)嵸|(zhì)性減少氧化還原物質(zhì)在樣品被分析期間的擴散損失的化學結(jié)構(gòu)。氧化還原介體的擴散損失可以通過使聚合物氧化還原介體不可從傳感器的工作電極上釋放來減少。這可以通過結(jié)合或固定氧化還原介體例如將氧化還原介體通過共價結(jié)合或雙共軛結(jié)合至電極上的聚合物而實現(xiàn)。作為替代方案，氧化還原介體可以通過提供具有反電荷物質(zhì)或?qū)ρ趸€原介體具有高親和力的物質(zhì)的粘合劑來固定。在本發(fā)明的一個實施方案中，一種非可釋放的聚合物氧化還原介體包含共價連接至聚合物的氧化還原物質(zhì)。該氧化還原聚合物通常是過渡金屬化合物，其中具有氧化還原活性的過渡金屬基側(cè)基共價結(jié)合至合適的聚合物骨架上，所述骨架自身可以具有或不具有電活性。該類實例是聚(乙烯基二茂鐵)和聚(乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酰胺)。作為替代方案，聚合物氧化還原介體可包含離子結(jié)合的氧化還原物質(zhì)。通常，這些介體包括偶聯(lián)至帶有相反電荷的氧化還原物質(zhì)上的帶電聚合物。此類實例包括帶負電荷的聚合物如Nafion(Dupont)，其偶聯(lián)至帶正電荷的氧化還原物質(zhì)如鋨或釕聚吡啶陽離子；或者相反，帶正電荷的聚合物如聚(1-乙烯基咪唑)偶聯(lián)至帶負電荷的氧化還原物質(zhì)如鐵氰化物或亞鐵氰化物。此外，氧化還原物質(zhì)還可以配位結(jié)合至聚合物。例如，氧化還原介體可以通過鋨或鈷2，2’-二吡啶基配位化合物與聚(1-乙烯基咪唑)或聚(4-乙烯基吡啶)的配位結(jié)合而形成。另一實例是聚(4-乙烯基吡啶-共聚-丙烯酰胺)與鋨4，4’-二甲基-2，2’-二吡啶基配位化合物配位。有用的氧化還原介體及其合成方法描述于美國專利No.5,264,104；5,356,786；5,262,035；5,320,725；6,336,790；6,551,494和6,576,101。
在本發(fā)明另一實施方案中，電化學活化劑選自下文中詳細描述的新一類氧化還原聚合物。簡而言之，該新一類氧化還原聚合物包括聚(乙烯基二茂鐵)、聚(乙烯基二茂鐵)-共聚-丙烯酰胺、聚(乙烯基二茂鐵)-共聚-丙烯酸和聚(乙烯基二茂鐵)-共聚-丙烯酰胺-(CH2)n-磺酸以及聚(乙烯基二茂鐵)-共聚-丙烯酰胺-(CH2)n-膦酸，其中n為0-12的整數(shù)，優(yōu)選0-8。
本發(fā)明的膜也可引入氧化還原聚合物，該聚合物與蛋白質(zhì)如酶或抗原交聯(lián)，并固定在電極表面。
傳感器的一個實施方案包含容納測試樣品的腔，由此該腔至少結(jié)合在工作電極的工作區(qū)域與參比電極的工作區(qū)域之間。同樣在該實施方案中，氧化還原酶和水溶性氧化還原聚合物涂布在工作電極的工作區(qū)域上。
參考附圖，本發(fā)明的傳感器描述如下。圖1示出根據(jù)本發(fā)明一個實施方案的頂部填充的生物傳感器2的等比例分解圖。生物傳感器2包括由幾層構(gòu)成的堆疊體。根據(jù)圖1和2從下往上，該堆疊體包括襯底層4、工作電極6、隔離物8、反電極10和頂層12。隔離物8隔離工作電極6和反電極10，從而使它們電絕緣。形成在隔離物8的分叉末端的兩腿之間的凹槽14限定工作電極6和反電極10之間的樣品腔14(參見圖2A)。由此方式，樣品腔14通過反電極10和工作電極6各自相對面對面的表面而結(jié)合或限定在頂部和底部，以及通過隔離物8的側(cè)壁結(jié)合或限定在兩側(cè)。樣品腔14一側(cè)暴露，如圖2所示。工作電極6的該表面稱作工作表面。傳感化學材料載體，如納米復合材料膜18設(shè)置在樣品腔14中。該膜18與工作電極6物理接觸。傳感化學材料優(yōu)選包括電子轉(zhuǎn)移劑、如可擴散氧化還原介體(未能示出)。氧化還原介體和其它傳感化學材料將在以下詳述。空洞16形成在頂層12中，并穿過反電極到達樣品腔14。襯底4和頂層12凹陷，使得工作電極6和反電極10的部位20和22(圖2B)依然暴露，從而其可相互連接以形成電路。
樣品腔14的配置或成形使得當樣品或分析物提供在腔14中時，分析物與工作電極6和反電極10電解接觸。這種電解接觸允許氧化還原介體介導的電流在電極6、10之間流動，以實現(xiàn)分析物的電解作用(電致氧化或電致還原)。氧化還原介體使可能不適合在工作電極6上直接進行電化學反應的分析物分子的電化學分析成為可能。樣品腔14的容積可以是0.1-1μl，但是其它容積也是可以的。稱為測量區(qū)的樣品腔14的區(qū)域僅含有在分析物分析期間被探詢的部分分析物。在圖1的生物傳感器2中，測量區(qū)容積近似等于樣品腔14的容積。然而，應該注意更小的測量區(qū)例如樣品腔14的尺寸的80％或90％也是可以的。
由隔離物8的厚度所限定的樣品腔14的高度優(yōu)選小，以促進分析物的快速電解，這是因為對于給定分析物體積將有更多的分析物與電極6和10的表面接觸。此外，高度小的樣品腔14有助于減少分析物分析期間分析物從樣品腔14的其它部分擴散到更小測量區(qū)而帶來的誤差，因為擴散時間比測量時間要長。通常，樣品腔的厚度不大于約0.2mm。優(yōu)選樣品腔的厚度不大于約0.1mm，更優(yōu)選樣品腔的厚度為約0.05mm或更小。
襯底4和頂層12可由惰性非導電材料如聚酯形成。作為替代方案，襯底4和頂層12可由模制碳纖維復合材料形成。工作電極6優(yōu)選具有較低電阻，并且通常在運行期間在生物傳感器電位范圍內(nèi)是電解惰性的。用于形成工作電極6的合適材料包括金、碳、鉑、二氧化釕、鈀和導電環(huán)氧樹脂，例如ECCOCOAT CT5079-3碳填充導電環(huán)氧樹脂涂料(可得自W.R.Grace Company，Woburn，Mass.)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它非腐蝕材料。反電極10也可使用適合形成工作電極6的上述任意材料來形成。工作電極6和反電極10可通過任意合適的方例如通過氣相沉積或印刷而沉積在襯底4和頂層12的表面。
隔離物8通常由惰性非導電材料如壓敏膠粘劑、聚酯、Mylar、kevlar或任意其它強力聚合物薄膜構(gòu)成，或者作為替代方案，由根據(jù)其化學惰性而選擇的聚合物薄膜如Teflon膜構(gòu)成。其它隔離物包括膠粘劑層或雙面膠粘帶(例如在膜反面具有膠粘劑的載體膜)。
在一個具體的實施方案中，襯底4和頂層12是聚酯膜，工作電極6是絲網(wǎng)印刷的碳層，反電極10是絲網(wǎng)印刷的Ag/AgCl層，隔離物8是雙面膠粘帶。
生物傳感器2使用期間，樣品腔14的暴露側(cè)用于接觸分析物如血液或血清。其中具有納米復合材料膜18的樣品腔14通過芯吸或毛細作用接收用于分析的分析物。根據(jù)氧化還原介體的類型，可擴散的氧化還原介體可快速擴散入分析物，或擴散發(fā)生在一段時間內(nèi)。類似地，膜18中的可擴散氧化還原介體可首先溶解，隨后擴散進入分析物，或快速或經(jīng)過一段時間。如果氧化還原介體擴散經(jīng)過一段時間，則可指示用戶在測量分析物濃度前等待一段時間，以允許氧化還原介體擴散。
不應認為生物傳感器的結(jié)構(gòu)和構(gòu)造受上述限制；具有其它結(jié)構(gòu)和使用其它方法構(gòu)成的生物傳感器也是可以的。圖2示出根據(jù)本發(fā)明另一實施方案的一個這樣的生物傳感器24。該生物傳感器24是圖1中的生物傳感器2的變體，其包括生物傳感器2的層4、6、10、12和膜18。然而，該實施方案中的隔離物8包括由其間的溝槽26所分隔的第一隔離物部分8A和第二隔離物部分8B。當隔離物8夾在工作電極6和反電極10之間時，該溝槽26限定樣品腔14。樣品腔14的兩個相對側(cè)均暴露。由此，在生物傳感器20中不需要空洞。
某些其它的生物傳感器公開在Feldman等的題目為“Small Volume in vitroanalyte sensor with diffusible or non-leachable redox mediator”的美國專利6,338,790中。這些生物傳感器中的一些包含多于一個的反電極6。
大量氧化還原酶可用于本發(fā)明的傳感器。酶在傳感器中的一個功能是通過移除或加入電子來催化酶底物的氧化和還原反應。例如，當帶檢測的底物或分析物是葡萄糖時，可利用葡萄糖氧化酶將葡萄糖氧化成葡萄糖酸。雖然在酶不存在時葡萄糖氧化反應是熱力學可行的，但是適當?shù)难趸€原酶的存在有助于加速氧化反應，由此允許更方便地研究酶活性和底物分析。此外，該酶可廉價而方便地得到。
在本發(fā)明的一些實施方案中，氧化還原酶選自葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、辣根過氧化物酶、黃嘌呤氧化酶、膽固醇氧化酶、氫氫化酶、乳酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、NADH脫氫酶、肌氨酸氧化酶、乳酸氧化酶、醇脫氫酶、羥基丁酸脫氫酶、甘油脫氫酶、山梨醇脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、半乳糖脫氫酶、蘋果酸氧化酶、半乳糖氧化酶、黃嘌呤脫氫酶、醇氧化酶、膽堿氧化酶、黃嘌呤氧化酶、膽堿脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、草酸氧化酶、膽紅素氧化酶、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、胺氧化酶、NADPH氧化酶、尿酸氧化酶、細胞色素C氧化酶、兒茶酚氧化酶及其混合物。
標記周期表族的三種常用約定是新IUPAC約定、舊IUPAC約定(也稱為歐洲約定)以及CAS族標記約定(也稱為美國約定)。本發(fā)明采用CAS約定。在CAS約定中，IA、IIA、IIIA和IVA族分別指第1族(Li、Na、K等)、第2族(Be、Mg、Ca等)、第3族(B、Al、Ga等)和第4族(C、Si、Ge等)的主族元素，而IB、IIb、IIIb、IVAB、VB、VIB、VIIB和VIIIB族指過渡元素。CAS約定下的IA、IIA、IIIA和IVA族分別等同于舊IUPAC約定下的IA、IIA、IIIB和IVB族，分別等同于新IUPAC約定下的1、2、13和14族。CAS約定下的IB、IIb、IIIB、IVAB、VB、VIB、VIIB和VIIIB族分別等同于舊IUPAC約定下的IA、IIA、IIIA、IVA、VA、VIA、VIIA和VIIIA族，也分別等同于新IUPAC約定下的3、4、5、6、7、8-10、11和12族。
可使用的納米顆?？梢允沁x自周期表中IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIB、IIIB、IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族的元素的任意無機氧化物。納米顆粒可具有任意合適的尺寸和形狀，只要其能夠提供足夠的擴散通道使葡萄糖分子轉(zhuǎn)運至位于氧化電極表面附近的膜中。此外，用于本發(fā)明的納米顆?？梢允嵌嗫椎幕驘o孔的。用于本發(fā)明膜中的無機納米顆粒的平均尺寸通常為約5nm-約1μm，或約100-約1000nm，包括約100-約500nm，或約200-約300nm。納米顆粒的尺寸可根據(jù)所需應用來選擇(例如影響上述擴散通道的長度)，或改變用于制備本發(fā)明膜的漿墨的粘度或密度。
適合用于本發(fā)明膜的氧化物的實例包括但不限于氧化鋰錳、氧化鎂、氧化鋅、氧化鈷、氧化釔、氧化鈮、氧化鈣、氧化鑭、氧化鈰、氧化鋁、二氧化硅及其混合物。
在一些實施方案中，所述膜引入鋁、硅、鎂或鋅的氧化物。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)將這種氧化物例如氧化鋁或二氧化硅引入所述膜中有利于制備所述膜，并賦予所述膜良好的機械強度，使得其甚至在長期使用之后也不開裂。
至于二氧化硅顆粒，任意合適種類的二氧化硅顆粒(例如氣相二氧化硅或膠體二氧化硅)可用于本發(fā)明。如本文所限定的每一種其它無機氧化物的顆粒一樣，二氧化硅顆粒可基于多種因素如其直徑、長徑比、平均孔徑或形狀來選擇。這些參數(shù)可選擇用來獲得納米顆粒膜中所期望的轉(zhuǎn)移特性。合適顆粒的選擇也可取決于沉積技術(shù)的選擇。二氧化硅顆粒的尺寸可為約5-約1000nm，或約100-約1000nm，包括約100-約500nm，或約200-300nm。二氧化硅顆粒可在實驗室中合成或得自商品供應商。例如，膠體二氧化硅(Chemical Abstracts Number 7631-86-9)可商業(yè)購自許多供應商。例如其由Nissan Chemicals以商品名Snowtex出售或由NyacolNanotechnologies，Inc.以商品名NYACOL出售。
本發(fā)明的納米膜的厚度為50-1000微米，或100-700微米，或優(yōu)選250-500微米。膜厚度可取決于幾個因素，例如所需電極尺寸或膜的構(gòu)成?？梢酝ㄟ^選擇沉積技術(shù)(僅舉幾個例子，如絲網(wǎng)印刷、浸涂或旋涂)來控制納米顆粒材料的含量或墨漿的濃度。當使用絲網(wǎng)印刷來沉積制備所述膜的墨漿時，可以通過絲網(wǎng)的網(wǎng)目尺寸來控制膜厚度。
在傳感器的又一實施方案中，本發(fā)明的納米顆粒膜還可包含聚合物粘合劑。任意適合的聚合物粘合劑可用于所述膜中，包括靜電惰性聚合物、離聚物、能夠獲得凈電荷的聚合物、能夠提供雙連接的聚合物和蛋白質(zhì)。聚氨酯、纖維素或彈性體聚合物是靜電惰性聚合物的例子。能夠獲得凈電荷從而變成帶正電荷或負電荷的聚合物的例子是含氮雜環(huán)如吡啶或咪唑。糖蛋白是一類可用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)。具體實例包括抗生物素蛋白、生物素和抗生物素蛋白鏈菌素，其可以與存在于所述膜中的電化學活化劑結(jié)合以形成用于本發(fā)明的合適的聚合物粘合劑。有用的粘合劑及其合成方法例如公開在美國專利No.6,592,745中。
在一個實施方案中，聚合物粘合劑是包含選自乙烯基吡啶、乙烯基咪唑、丙烯酰胺、丙烯腈和丙烯酰肼的單體單元和丙烯酸單體單元的聚合物或共聚物。具有選自上述單體的聚合物粘合劑的具體實例是乙烯基吡啶。衍生自這些單體單元的粘合劑適合涉及血液樣本的葡萄糖傳感應用，例如這是因為所述粘合劑的膜內(nèi)粘合和分析物調(diào)節(jié)的雙重功能。通過引入粘合劑如乙烯基吡啶至膜中，所述膜在水合時不破裂，但溶脹形成在絲網(wǎng)印刷的碳表面上容納各種膜組分的凝膠層。隨后，介體、酶和分析物如葡萄糖可在該層內(nèi)自由移動，從而使含氧合血紅蛋白的紅細胞由于靜電排斥不能進入所述膜。陰離子抗壞血酸和尿酸用陰離子粘合劑排除，溶解進入納米顆粒膜的溶解氧部分由于該層的親水特性而被最小化。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)非導電納米顆粒膜的方法。納米復合材料即包含電化學活化劑如氧化還原聚合物、酶和納米顆粒的漿墨可以在商業(yè)購得的混合器、混料機和攪拌機中根據(jù)漿料的量、粘度和均勻度來制備?？稍谀軌蛴欣诩庸ぜ{米顆粒膜的任意合適的液體或分散介質(zhì)例如極性溶劑、水溶液、PBS緩沖液和有機化合物或溶劑(例如醇)中制備所述漿料。
用于形成漿墨的組分的適當比例可變。例如，所述復合材料可根據(jù)應用或所用的酶或用來沉積漿墨的沉積技術(shù)而變化，并且每一組分的用量可憑經(jīng)驗確定。例如，用于制備葡萄糖傳感器膜的漿墨的合適組成包括以下組成范圍的組分—葡萄糖氧化酶0.10-1.0mg/ml；氧化還原介體5-50mg/ml；納米顆粒10-200mg/ml；粘合劑10-300mg/ml。在該實施例中，不需要靜置期，而是漿墨可立即使用。然而，對于其它制劑來說，漿墨可能必須在應用于合適的底物之前靜置適當?shù)臅r間。在另一具體實施方案中，漿墨可包含葡萄糖氧化酶、聚(VFc-co-AA)、氧化鋁納米顆粒和PVPAC粘合劑，其以1∶50∶150∶200-1∶40∶200∶300重量份的混合比例來混合。本發(fā)明的氧化還原聚合物加入該混合物中，其中酶、納米顆粒和水得到均化。之后，將該均勻混合物應用至任意合適的底物上?？梢圆捎酶鞣N沉積技術(shù)以在表面上沉積膜，所述沉積技術(shù)包括但不限于噴涂、刷涂、浸涂、旋涂、噴墨印刷和絲網(wǎng)印刷。
如上所提及，漿墨中的氧化還原介體的濃度可以變化，例如從5至50mg/ml。在采用乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酰胺氧化還原介體的下述一個實施方案中，可將10-20mg/ml的介體加入漿墨中。在一個實施方案中，納米復合材料墨中的氧化還原介體濃度為約15mg/ml。
漿墨中的酶濃度也可變化。典型范圍是0.1-1mg/ml。在一個實施方案中，納米復合材料墨中的酶濃度為約0.2mg/ml。
納米復合材料墨的配方可如下變化。由于催化反應發(fā)生在介體和酶之間，介體濃度必須足夠高以具有高靈敏度并且使催化氧化電流和葡萄糖濃度之間的關(guān)系為線性。如果限制介體用量，即使樣本中的葡萄糖濃度上升，傳感器的測量電流響應也會出現(xiàn)平臺。此事發(fā)生時，介體量成為瓶頸，并且傳感器讀數(shù)改為依賴于膜中的介體量，而不是樣本中的葡萄糖濃度。對于后述具體實施例來說，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)介體濃度為約15mg/ml，GOX最優(yōu)濃度為約0.20mg/ml。
本發(fā)明還涉及新型二茂鐵基氧化還原聚合物，其在其它應用中非常適合用作本發(fā)明葡萄糖傳感器中的電化學活化劑并且用于任意以及例如任意其它已知的分析物電化學檢測中。雖然含二茂鐵的單體通常很難進行自由基聚合，但是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)含二茂鐵的氧化還原聚合物可以使用由例如乙醇和水的混合物制備的醇介質(zhì)與作為自由基引發(fā)劑的過硫酸鹽一起來極好且容易地制備。
當任意有機金屬氧化還原物質(zhì)可用作氧化還原介體(例如二茂鎳和二茂鈷)時，優(yōu)選二茂鐵基氧化還原介體，例如這是因為來自將二茂鐵氧化成二茂鐵離子的合適氧化還原電位。
二茂鐵衍生物可被用作均一體系中的擴散電子傳遞介體。應該注意的是擴散介體通常分子量低并且可以漏出電極而損失在所測量的樣品中。由于該原因，基于擴散介體的傳感器適合作為使用一次而隨即丟棄的一次性傳感器。
二茂鐵衍生物也可用作固定在電極表面上的介體，其隨后與蛋白質(zhì)分子如酶或抗原結(jié)合，所述結(jié)合是通過酶和氧化還原聚合物側(cè)鏈中發(fā)現(xiàn)的可交聯(lián)官能團之間的交聯(lián)。
可用作第一單體以形成氧化還原聚合物的合適可聚合二茂鐵衍生物應該具有含不飽和鍵如C-C雙鍵或三鍵、或N-N雙鍵或S-S雙鍵的側(cè)鏈單元。該側(cè)鏈單元的實例包括通式R1—C＝C—所示的烯基。雙鍵可位于沿碳鏈的任意位置處。也可以使用芳香族基團如苯基、甲苯?；洼粱?。此外，所述可聚合基團還可包含取代的C原子，其中例如鹵素(例如氟、氯、溴或碘)、氧或羥基取代基團碳原子上的一個或多個氫原子。其它實例包括炔基和二硫基團。
在優(yōu)選實施方案中，可聚合二茂鐵衍生物選自乙烯基-二茂鐵、乙炔基-二茂鐵、苯乙烯基-二茂鐵和氧化乙烯-二茂鐵。
這些衍生物中不飽和鍵的存在將使二茂鐵分子通過與其它也具有至少一個不飽和C-C雙或三鍵、或N-N雙鍵或S-S雙鍵的物質(zhì)共聚而連接至聚合物主鏈。
對于用于與可聚合二茂鐵衍生物共聚的第二單體單元來說，可以采用能夠獲得凈電荷的具有伯酸或伯堿官能團的任意合適的丙烯酸衍生物。這意味著本發(fā)明提供帶正電荷和負電荷的聚合物，并因而確保可以形成上述導電雙層，而與形成在捕獲分子和分析物分子之間的配位化合物的凈電荷無關(guān)。一般來說，對于用作單體的合適丙烯酸衍生物的選擇有兩個要求。為了使其與二茂鐵衍生物共聚，其應該具有至少一個不飽和鍵，該不飽和雙鍵例如可通過C-C雙或三鍵、或N-N雙鍵或S-S雙鍵來提供。第二，該丙烯酸衍生物應該能夠通過生成H+離子或接受H+離子而分別執(zhí)行bronsted-Lowry酸或堿的功能?？梢蕴峁゜ronsted-Lowry酸或堿功能的官能團實例包括可以接受H+離子形成帶電胺基的伯胺基團，或羧基，或當酸官能團解離釋放H+離子時可貢獻H+離子的硫酸鹽。在此，注意到雖然在本發(fā)明中優(yōu)選使用伯胺基團，但是對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言很明顯也可使用存在于丙烯酸衍生物中的仲或叔胺基團，以產(chǎn)生帶正電荷的氧化還原聚合物。在此，也應注意盡管酸或堿官能團是一元的，但是并不需要成為端基，除了在支化側(cè)鏈可存在于更短的一個側(cè)鏈“內(nèi)”的情況下。
雖然可以使用具有酸或堿官能團的任意合適的丙烯酸衍生物，用作本發(fā)明的氧化還原聚合物中的第二單體的優(yōu)選單體是通式(I)所示的丙烯酸衍生物 其中，R選自CnH2n-NH2、CnH2n-COOH、NH-CnH2n-SO3H和NH-CnH2n-PO3H，其中烷基鏈可以是任選取代的，其中n是0-12的整數(shù)，優(yōu)選0-8。因而，烷基可以是直鏈或支鏈烷基，還可包含雙或三鍵、或環(huán)狀結(jié)構(gòu)如環(huán)己基。僅舉幾個例子，取代基R之內(nèi)的合適脂肪族基團有甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、戊基、異戊基、己基、環(huán)己基或辛基等。脂肪族基團可進一步例如被芳香族基團如苯基、鹵素原子、其它堿基或酸基或O-烷基所取代?？勺鳛槿〈嬖诘氖纠苑枷阕寤鶊F是苯基、甲苯?；蜉粱?。鹵素原子可選自氟、氯或溴。合適的O-烷基的例子是甲氧基、乙氧基、丙氧基或丁氧基，而N-烷基選自-NHMe、-N(Me)2、-N(Ethyl)2或-N(Propyl)2。
如果丙烯酸衍生物單體不可商業(yè)購得，則可從丙烯酰胺開始通過親核取代而制備，例如通過其末端NH2-基團與具有上述烷基鏈的酸或堿化合物的適當活化的衍生物反應而制備。例如，丙烯酰胺可與4-溴丁酸或其酯衍生物反應，得到各種丙烯酰胺單體。類似過程可用于磺酸或磷酸衍生物。
通常，對于生物樣品，pH可以是約6.5-7.5。在該pH范圍內(nèi)，氧化還原聚合物中的丙烯酰胺單元可獲得正電荷，即成為陽離子。該正電荷使聚合物中的二茂鐵基團通過靜電作用更為靠近葡萄糖氧化酶的氧化還原中心(此處葡萄糖氧化酶是所選擇的氧化還原酶)，因為葡萄糖氧化酶在該pH范圍內(nèi)是帶負電荷的，即陰離子。
在本發(fā)明的一個傳感器中，氧化還原酶通過交聯(lián)鍵共價結(jié)合至氧化還原聚合物。本發(fā)明的氧化還原聚合物可與電極表面上的氧化還原酶共固定，使所述酶成為電極的集成(功能)部分。酶和介體的共固定化可通過用氧化還原介體標記所述酶并隨后將酶固定至電極表面來完成。作為替代方案，氧化還原聚合物可先固定在電極表面上，接著將所述酶固定至氧化還原聚合物中。也可以將酶和氧化還原聚合一起固定在由導電聚合物形成的基質(zhì)中。
在本發(fā)明的另一傳感器中，氧化還原酶和氧化還原聚合物均可擴散分布在納米顆粒膜中，所述納米顆粒膜包含選自周期表中IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIB、IIIB、IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族的元素的至少一種無機氧化物納米顆粒。
在該傳感器中，氧化還原聚合物用作在電極表面和測試樣品之間穿梭的擴散介體。引入氧化還原聚合物的納米顆粒膜不僅提供電子介導功能，而且提供分析物過濾功能，以防止電極接觸樣品中的其它電化學活性材料。膜中的納米顆粒提供分析物分子可以擴散進入以到達傳感器中氧化電極的微通道。
在本發(fā)明傳感器的一個實施方案中，式(I)的氧化還原聚合物具有約1000-5000道爾頓或優(yōu)選約2000-4000道爾頓的分子量。
在本發(fā)明的另一實施方案中，式(I)的氧化還原聚合物的二茂鐵負載率為約2％-17％，或3％-14％。希望具有高二茂鐵負載水平，優(yōu)選至少在3％以上。通常，低水平的二茂鐵負載將限制可測量的葡萄糖濃度。例如，當葡萄糖濃度大大高于存在的二茂鐵分子介導能力時，產(chǎn)生的測量電流響應可受到小量介導二茂鐵分子的限制，導致測量不精確。因此，通過采用具有高二茂鐵負載水平的式(I)的氧化還原聚合物，可用傳感器檢測的葡萄糖濃度的上限提高，由此只需要更小體積的樣品。
本發(fā)明還涉及制備水溶性氧化還原聚合物的方法。該方法主要涉及將可聚合二茂鐵衍生物的第一單體單元與包含丙烯酸衍生物如一元、二元或三元丙烯酰胺的第二單體單元聚合，以產(chǎn)生共聚物。丙烯酸衍生物具有能夠獲得凈電荷的酸或堿官能團。重要的是，聚合反應在引發(fā)劑存在下在醇水溶液介質(zhì)中進行。
單體和引發(fā)劑的加入次序可以改變。例如，可以在醇介質(zhì)中混合第一和第二單體，接著加入引發(fā)劑引發(fā)反應。也可以先將單體之一溶解在醇水溶液介質(zhì)中，接著加入引發(fā)劑，再將另一單體加入混合物中。
可采用任意有機醇例如脂肪族醇如乙醇、或芳香族醇如苯酚來制備醇介質(zhì)。常用體積比為ca 5∶1-1∶1(醇/水)。在一些實施方案中為約3∶1。
在根據(jù)本發(fā)明的方法的實施方案中，利用含體積比為約2∶1-3∶1的乙醇和水的水醇溶劑來進行聚合。
雖然可在不加入引發(fā)劑的條件下進行聚合，但是希望加入攻擊單體中不飽和鍵的富電子中心的自由基引發(fā)劑。由此，在本發(fā)明的另一實施方案中，通過加入自由基引發(fā)劑來引發(fā)聚合。
可以使用任意自由基引發(fā)劑。實例包括無機鹽如過硫酸鹽，以及有機化合物如過氧化苯甲?；蚺嫉惗‰?AIBN)，其可以產(chǎn)生稱作引發(fā)劑碎片的自由基碎片，每個碎片具有一個能夠起到自由基作用的未成對電子，其攻擊單體單元中的不飽和鍵。
在一些實施各方案中，自由基引發(fā)劑選自過硫酸銨、過硫酸鉀和過硫酸鈉。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所加入的自由基引發(fā)劑的重量比為約20mg-40mg/g單體。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)自由基引發(fā)劑量影響聚合度。高用量的自由基引發(fā)劑明顯降低聚合效率，導致氧化還原聚合物具有低分子量。這也意味著與正常的自由基結(jié)合反應相比，在所述聚合過程中需要較少的自由基引發(fā)劑。除了所用的自由基引發(fā)劑的用量之外，反應物的加入次序(參見與本發(fā)明方法相關(guān)的下文)也影響聚合效率。
可在室溫和常壓的標準條件下實施根據(jù)本發(fā)明的方法。然而，為了加速反應，通常優(yōu)選使反應混合物回流。還必須注意不要使用過高溫度，這會導致聚合物或反應物分解。由此，適合的上限一般低于100℃。在本方法的優(yōu)選實施方案中，在約60-80℃溫度下回流進行聚合。
在另一實施方案中，在惰性氣氛中回流進行聚合。惰性氣氛可以由例如氮氣或氦氣或氬氣提供。
聚合所需時間長度可取決于所要溫度和加入反應混合物中的引發(fā)劑的量。通常，聚合時間為10-40小時，優(yōu)選約24小時。
本發(fā)明方法的一個實施方案還包括在聚合所述第一和第二單體之前產(chǎn)生預反應混合物，包括將丙烯酸衍生物單體單元溶解于水醇介質(zhì)中；然后加入自由基引發(fā)劑；然后將可聚合二茂鐵衍生物單體單元加入所述混合物中。
在上述方法的另一實施方案中，預反應混合物中的丙烯酸衍生物與可聚合二茂鐵衍生物的進料比優(yōu)選占所加入單體重量的約5％-15％，以便得到具有合適分子量和粘度的氧化還原聚合物。
在又一實施方案中，可聚合二茂鐵衍生物單體單元在加入反應混合物之前溶解于水醇介質(zhì)中。
在本發(fā)明方法的實施方案中，氧化還原聚合物沉淀在有機溶劑中?？捎脕砣芙鈪⑴c聚合的單體的有機溶劑例如包括醚、酮和醇。
實施例實施例1擴散介體生物傳感器的構(gòu)造圖1示出根據(jù)本發(fā)明一個實施方案的頂端填充生物傳感器2的等比例分解圖。根據(jù)具體實施方案的生物傳感器2的制造方法如下所述。首先，將碳電極陣列如可得自Acheson Colloids Co.，Ontario，California，U.S.A.的Electrodag 423SS利用合適的模具印制在聚酯膜襯底上。隨后在約70℃的溫度下持續(xù)干燥所印制襯底一段時間，例如24小時。之后，將具有適當形成在其中的孔的雙面帶至于所述印制襯底上。這些孔將最終限定凹陷14和暴露電極部分20、22的開口。隨后利用合適的模具將相同的納米顆粒膜絲網(wǎng)印刷在具有PVFcAA(如實施例2所述制備，見下)、GOX、聚(乙烯基吡啶-共聚-丙烯酸)(PVPAC)粘合劑和氧化鋁納米顆粒的水漿“墨”的碳電極的工作表面上。隨后在約37℃于受控環(huán)境中干燥所得結(jié)構(gòu)。納米顆粒膜的厚度一般可通過調(diào)整墨含量、同時保持涂覆在工作區(qū)域上的體積恒定而得到控制，例如通過調(diào)節(jié)絲網(wǎng)印刷機中絲網(wǎng)的目徑或調(diào)節(jié)納米顆粒材料的含量或印刷漿料的“濃度”來操作。
當上述結(jié)構(gòu)形成時，利用合適的模具將Ag/AgCl或碳反電極陣列類似地絲網(wǎng)印刷在第二聚酯膜上并干燥。接著，將該第二聚酯膜置于膠粘帶上，使得反電極與其對應的工作電極對準。之后，使結(jié)構(gòu)單一化以生產(chǎn)多個生物傳感器2，其中之一示于圖1。
實施例2合成聚(乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酰胺)、聚(乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酸)和聚(乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酰胺-磺酸)共聚物葡萄糖氧化酶(GOx，EC1.1.3.4，來自Aspergillus niger，191單位/mg)購自Fluka(CH-9470Buchs，瑞士)。二茂鐵(Fc)、乙烯基二茂鐵(VFc)、丙烯酰胺(AA)、丙烯酸(AC)、2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙烷-磺酸(cat.no.28，273，“丙烯酰胺-磺酸“或AAS)和過硫酸鹽均購自Sigma-Aldrich(St.Luis，MO，USA)。所有其它所用的化學品如丙酮、乙醇和磷酸鹽緩沖鹽水具有檢定的分析級。所用的所有溶液均用去離子水制備。
實驗中生成的聚合物的UV光譜在Agilent 8453UV-可見光譜測光儀上進行和記錄。分子量采用Toyo Soda高效凝膠滲透色譜在水中測定，使用標準聚氧化乙烯和聚乙二醇來校準。
i)合成聚(乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酰胺)聚合物制備含有溶于10ml乙醇/水(3份/1份)混合物中的1.0g丙烯酰胺的三個樣品。脫氧10分鐘后在每個樣品中加入0.30ml等分的0.10g/ml無氧過硫酸鹽溶液。將用量為0.05-0.16g的三種用量的乙烯基二茂鐵溶于脫氣的乙醇中以形成三種乙烯基二茂鐵溶液樣品，計算加入每個樣品中的二茂鐵的量以分別得到95∶5、90∶10和85∶15的丙烯酰胺/乙烯基二茂鐵進料比(w/w)。接著，將各乙烯基二茂鐵樣品加入丙烯酰胺-引發(fā)劑混合物中。反應混合物在氮氣氣氛中于70℃下回流24小時。冷卻后，將反應混合物分別逐滴加入快速攪拌的丙酮中以沉淀氧化還原聚合物。用丙酮洗滌沉淀的氧化還原聚合物并通過多次水溶解-丙酮沉淀循環(huán)進行純化。隨后在50℃下真空干燥純化產(chǎn)物。
ii)合成聚(乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酸)聚合物制備含有溶于10ml乙醇/水(3份/1份)混合物中的1.0g丙烯酸的三個樣品。脫氧10分鐘后在每個樣品中加入0.30ml等分的0.10g/ml無氧過硫酸鹽溶液。將用量為0.05-0.16g的三種用量的乙烯基二茂鐵溶于脫氣的乙醇中以形成三種乙烯基二茂鐵溶液樣品，計算加入每個樣品中的二茂鐵的量以分別得到95∶5、90∶10和85∶15的丙烯酰胺/乙烯基二茂鐵進料比(w/w)。接著，將各乙烯基二茂鐵樣品加入丙烯酰胺-引發(fā)劑混合物中。反應混合物在氮氣氣氛中于70℃下回流24小時。冷卻后，將反應混合物分別逐滴加入快速攪拌的丙酮中以沉淀氧化還原聚合物。用丙酮洗滌沉淀的氧化還原聚合物并通過多次水溶解-丙酮沉淀循環(huán)進行純化。隨后在50℃下真空干燥純化產(chǎn)物。
iii)制備聚(乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酰胺-磺酸)聚合物制備含有溶于10ml乙醇/水(3份/1份)混合物中的1.0g丙烯酸的三個樣品。脫氧10分鐘后在每個樣品中加入0.30ml等分的0.10g/ml無氧過硫酸鹽溶液。將用量為0.05-0.16g的三種用量的乙烯基二茂鐵溶于脫氣的乙醇中以形成三種乙烯基二茂鐵溶液樣品，計算加入每個樣品中的二茂鐵的量以分別得到95∶5、90∶10和85∶15的丙烯酰胺/乙烯基二茂鐵進料比(w/w)。接著，將各乙烯基二茂鐵樣品加入丙烯酰胺-引發(fā)劑混合物中。反應混合物在氮氣氣氛中于70℃下回流24小時。冷卻后，將反應混合物分別逐滴加入快速攪拌的丙酮中以沉淀氧化還原聚合物。用丙酮洗滌沉淀的氧化還原聚合物并通過多次水溶解-丙酮沉淀循環(huán)進行純化。隨后在50℃下真空干燥純化產(chǎn)物。
結(jié)果和討論乙烯基二茂鐵與丙烯酰胺及其衍生物的共聚合反應基于傳統(tǒng)自由基聚合反應進行。一般反應方程式示于圖6中。
然而，為了成功共聚所述單體，極為關(guān)注體系中乙烯基二茂鐵的末端效應。如在引言部分所述，乙烯基二茂鐵通常在共聚合體系中用作自由基清除劑。發(fā)現(xiàn)自由基引發(fā)劑的量明顯少于正常聚合反應中所需要的量。較高用量的自由基引發(fā)劑明顯降低聚合效率和產(chǎn)物的分子量。此外，加入次序也影響聚合效率。
當在乙烯基二茂鐵和丙烯酰胺中加入過硫酸鹽自由基引發(fā)劑時，觀察到聚合低于20％。這可能是因為在反應混合物中形成了二茂鐵，其導致阻滯聚合速率并過早地使聚合物鏈生長過程終止。如表1所示，在最優(yōu)條件下，得到較高的產(chǎn)率。
表1乙烯基二茂鐵、丙烯酰胺及其衍生物的共聚

然而，聚合物產(chǎn)率隨乙烯基二茂鐵進料比的增加而下降，這表明自由基聚合中的末端效應依然存在，即使在聚合過程中已經(jīng)極為注意也是如此。發(fā)現(xiàn)當反應混合物變藍時獲得微小的產(chǎn)率，這是由于聚合溶液中形成相當大量的二茂鐵。二茂鐵負載量在3-14％之間變動，總是小于單體進料中的二茂鐵含量。
氧化還原聚合物中二茂鐵的負載量由元素分析確定。能量色散X射線分析(Energy Dispersive X-ray Analysis，EDX)用于該目的。用在所得氧化還原聚合物樣品上的電子束能量為120keV。用鋰漂移硅檢測器對樣品產(chǎn)生的X射線進行分析。
通過凝膠滲透色譜測定氧化還原聚合物的分子量。通常，用較高二茂鐵進料比制備的氧化還原聚合物具有較低的分子量和較寬的分子量分布。
合成的氧化還原聚合物的特征合成的共聚物為淡黃色的粉末狀物質(zhì)。共聚物的分子量為2000-4000道爾頓。FT-IR實驗(參見圖7)清楚示出1650處的乙烯基的吸收完全消失，說明丙烯酰胺和乙烯基二茂鐵成功聚合，所得的氧化還原聚合物具有高純度，沒有單體。其他證據(jù)存在于1000-1300cm-1區(qū)域。1126cm-1處伴隨一個弱峰的極強吸收說明氧化還原聚合物中存在二茂鐵單元，1218em-1處的強吸收說明聚合物中存在酰胺基團。UV實驗也證實了乙烯基二茂鐵和丙烯酰胺之間的成功共聚。300nm處的微小肩峰清楚指示為共聚物中的二茂鐵基團(參見圖8)。氧化還原聚合物中具有二茂鐵和胺基或羧酸基團使它們具有雙功能介導電子的氧化還原活性和與蛋白質(zhì)交聯(lián)的化學活性。
增加乙烯基二茂鐵的進料比傾向于增加氧化還原聚合物中二茂鐵基團的比例。但是，改變乙烯基二茂鐵的量也影響聚合物產(chǎn)率。當乙烯基二茂鐵進料比最低時獲得最高產(chǎn)率，這和自由基聚合中二茂鐵化合物的不尋常行為非常一致。如表1所示，雖然聚合物中二茂鐵基團的含量隨乙烯基二茂鐵進料比增加而增加，但是遠不是線性的。發(fā)現(xiàn)對于生物傳感目的來說，10％的乙烯基二茂鐵進料比是足夠的，其具有良好的介導功能和良好的經(jīng)濟性。用于聚合的引發(fā)劑的量也影響氧化還原聚合物的組成和產(chǎn)率。發(fā)現(xiàn)當引發(fā)劑為20-40mg/g單體時獲得良好的氧化還原聚合物。
實施例3得到氧化還原聚合物的循環(huán)伏安圖氧化還原聚合物制備在存在0.0μg、10μg GOx和10μg GOx以及10μM葡萄糖的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液中。
在4.9版general purpose electrochemical system(GPES)管理器的AutoLabpotentiostat/galvanostat運行下進行電化學測試。將3-電極系統(tǒng)電池裝在法拉第籠中。所述電極是(Ag/AgCl)參比電極、鉑線反電極和Au工作電極(表面面積為7.94mm2)。
與乙烯基二茂鐵相比，合成的氧化還原聚合物在水中具有高溶解度，但是不溶于多數(shù)有機溶劑。該特征使得氧化還原聚合物理想地用作生物傳感、尤其是酶聯(lián)生物傳感中的介體，因為多數(shù)酶僅在含水介質(zhì)中有活性。
圖9示出在僅含有氧化還原聚合物的PBS中的典型循環(huán)伏安圖，伏安圖表現(xiàn)出高度可逆的溶液電化學氧化還原波動中心在～0.18V(與Ag/AgCl相比)，伏安圖具有擴散受限的形狀，陰離子和陽離子的峰值電流的幅度相同，峰間電位差為60mV，與25℃下理論值59mV非常接近。這些氧化還原波動可以歸為氧化還原聚合物中二茂鐵基團的氧化和還原，指示聚合物的優(yōu)異氧化還原活性。伏安分析實驗再一次驗證了乙烯基二茂鐵成功地與丙烯酰胺及其衍生物共聚，并且聚合物中的二茂鐵基團保留其電活性。氧化還原聚合物的PBS溶液是具有自由擴散行為的真溶液形式。向該溶液中摻加不同量的葡萄糖并不改變伏安圖，說明單獨通過氧化還原聚合物不催化氧化葡萄糖。另外，當在氧化還原聚合物溶液中加入少量的GOx時未觀察到明顯變化。所得溶液的電化學實際上與單獨的氧化還原聚合物溶液的電化學相同。但是，當向該溶液中加入10mM葡萄糖時，溶液中進行GOx對葡萄糖的酶促氧化。GOx中的氧化還原中心FAD轉(zhuǎn)化成FADH2。當電極電位掃描過氧化還原聚合物的氧化還原電位時，在電極表面附近，氧化還原聚合物中大量的二茂鐵基團氧化成二茂鐵。GOx中FAD/FADH2的氧化還原電位是-0.36V(與Ag/AgCl相比)，遠低于二茂鐵/二茂鐵電對的氧化還原電位，F(xiàn)ADH2附近的二茂鐵基團將它氧化回FAD，氧化還原聚合物中的二茂鐵基團還原成原來的二茂鐵基團。這兩個反應形成催化循環(huán)，如圖4所示，或者換句話說，GOx的葡萄糖氧化由氧化還原聚合物介導。
因此，氧化還原聚合物引起的催化反應大大增加含葡萄糖的溶液中的氧化電流，見圖9(淺灰色跡線)。如果FADH2、氧化還原聚合物和電極之間的電子交換都非常快，則在電化學氧化期間產(chǎn)生大量的二茂鐵基團，所述二茂鐵基團又快速被FADH2所消耗。這是與無葡萄糖的溶液中獲得的還原電流相比二茂鐵基團的還原電流更低的原因。這些數(shù)據(jù)表明氧化還原聚合物在酶促反應中有效地作為氧化還原介體起作用，使電子在酶的氧化還原中心和電極表面之間穿梭。
實施例4包含與葡萄糖氧化酶-牛血清白蛋白(GOx-BSA)交聯(lián)的乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酰胺的膜的合成進行氧化還原聚合物與蛋白質(zhì)的交聯(lián)反應，以研究所得膜的電化學特性。在本實施例中使用酶GOx。選擇戊二醛和聚乙二醇二縮水甘油醚(PEG)作為交聯(lián)劑。生物級的戊二醛(50％水溶液，產(chǎn)品編號00867-1EA)和聚乙二醇二縮水甘油基醚(PEGDE)(產(chǎn)品編號03800)得自Sigma-Aldrich。
首先，將從實施例1得到的聚(乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酰胺)沉積到金電極上。用交聯(lián)劑修飾GOx-BSA，以提供具有脂肪碳鏈的GOx-BSA，所述脂肪碳鏈具有末端醛官能團，其能夠提供與固定介體上合適官能團的交聯(lián)。隨后，使修飾的GOx-BSA沉積，并與固定的引發(fā)劑反應。修飾的GOx-BSA上的醛基團與PAA-VFc上的胺基反應，形成共價交聯(lián)鍵。反應進行后，使PAA-VFc-GOx-BSA膜干燥。
將金電極上交聯(lián)的PAA-VFc-GOx-BSA膜進行伏安分析。使用空白PBS，施加的電位掃描速率為50mV/s。
圖10示出空白PBS中PEG交聯(lián)的PAA-VFc與金電極上的GOx及BSA的循環(huán)伏安圖。如圖10所示，正如所期望的，交聯(lián)膜表現(xiàn)出固定氧化還原電對的高度可逆的表面(A.J.Bard，L.R.Faulkner，Electrochemical Methods，John Wiley & SonsNew York，2001.)，其用水和PBS徹底洗滌后和在-0.2V至+0.8V之間多次重復電位循環(huán)后幾乎沒有變化，顯示出在金電極上固定有二茂鐵膜的高度穩(wěn)定表面。在＜100mV/s的低掃描速率下，如預期那樣對表現(xiàn)出理想Nernstian行為的表面限定的單電子氧化還原體系記錄明顯對稱的信號峰電流與電位掃描速率成比例，峰間電位差遠低于59mV，如在溶液中擴散行為的情況下觀察到的(見圖9)，半峰高度處電流的寬度為約90mV。該結(jié)果證實所有的二茂鐵氧化還原中心都允許到達電極表面，進行可逆的異質(zhì)電子傳遞。向PBS溶液中加入10mM葡萄糖時，獲得典型的催化電化學曲線。但是，氧化還原聚合物的還原峰消失(圖10，灰色跡線)。這意味著傳感層通過電子從還原態(tài)GOx向二茂鐵基團的傳遞均勻地維持在還原狀態(tài)。檢測到的快速應答和電流表明氧化還原聚合物的優(yōu)異介導功能，生物傳感器的高電流靈敏性(750nA/mM葡萄糖)。
實施例5制備引入共分散擴散的聚(乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酰胺)和葡萄糖氧化酶的納米顆粒膜i)制備聚(乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酰胺)氧化還原聚合物D-(+)-葡萄糖和葡萄糖氧化酶(GOx，EC1.1.3.4，來自Aspergillus niger，191單位/mg)購自Sigma-Aldrich(St.Luis，MO，USA)。粒徑為10-1000nm的氧化鋁納米顆粒在室內(nèi)合成如下。將硝酸鋁(Al(NO3)3·9H2O，88.30g)溶于471ml水中，隨后逐滴加入到由205.9ml濃氫氧化銨溶于411.93ml水中制備的堿溶液中。將所得沉淀物攪拌并在25℃下陳化過夜，隨后離心除去上清液。洗滌之后，將沉淀物洗滌、干燥并研磨，并在空氣中于700℃下煅燒3小時。得到的γ-氧化鋁納米晶體具有從幾十到幾百納米的可控尺寸。
磷酸鹽緩沖鹽水溶液(PBS)(pH7.4)由磷酸鹽(0.020M)和氯化鈉(0.15M)制備。聚(乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酰胺)、葡萄糖和GOX用PBS緩沖液制備。葡萄糖貯液允許在使用前進行旋光改變至少24小時。所有溶液均用從Millipor得到的去離子水制備。用于本實驗中的所有其它化學品均具有檢定的分析級。
根據(jù)以下程序制備聚(乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酰胺)(PVFcAA)氧化還原聚合物將0.15g乙烯基二茂鐵和1.0g丙烯酰胺溶于10ml水醇(2份乙醇1份水)中。為了引發(fā)聚合，將0.50ml等分的0.10g/ml無氧過硫酸銨溶液在脫氣之后加入反應混合物中。冷卻后，將氧化還原聚合物在丙酮中沉淀。通過在水中溶解粗產(chǎn)物并在丙酮/水混合物中沉淀來進行純化。
ii)合成納米復合材料膜利用PVFcAA、GOX、聚(乙烯基吡啶-共聚-丙烯酸)(PVPAC)粘合劑和氧化鋁納米顆粒的水漿“墨”，將納米復合材料膜絲網(wǎng)印刷至碳條上。該水漿墨通過將以上制備的PVFcAA、GOX、聚(乙烯基吡啶-共聚-丙烯酸)(PVPAC)或聚(乙烯基吡啶-共聚-丙烯酰胺-磺酸)(PVPPAS)粘合劑和氧化鋁納米顆粒根據(jù)以下濃度范圍混入水中而制備所述水漿墨葡萄糖氧化酶0.20-0.50mg/ml，介體10-20mg/ml，納米顆粒30-100mg/ml，PVPPAC或PVPPAS粘合劑40-150mg/ml。所述漿墨可儲存或立即使用。當希望以膜層涂覆傳感器電極時，將所述漿墨裝入沉積裝置如絲網(wǎng)印刷機中，并且沉積在電極上以形成膜。在組裝成傳感器之前，首先使所述膜干燥。
實施例6使用共分散在納米顆粒膜中的擴散性聚(乙烯基-共聚-丙烯酰胺)介體和葡萄糖氧化酶的葡萄糖生物傳感器的循環(huán)伏安法分析在本實施例中，利用實施例5中制備的漿墨，將傳感器與絲網(wǎng)印刷碳工作電極和Ag/AgCl參比電極組裝。所述傳感器性能利用循環(huán)伏安法來分析。使用CHI 660A型電化學工作站(CH Instruments，Austin，USA)在室溫下進行所有電化學測量。使用傳統(tǒng)三電極系統(tǒng)進行循環(huán)伏安測量，所述三電極系統(tǒng)由絲網(wǎng)印刷碳工作電極、微型Ag/AgCl參比電極(Cypress Systems，Lawrence，KS，USA)和鉑線反電極組成。為了避免印刷墨擴散分布至2mm直徑工作區(qū)域之外，將圖案化的憎水膜涂覆至碳電極。為了避免電極結(jié)垢和墨中可能的濃度改變，對每次伏安測量試驗使用新鮮的電極和墨。所有葡萄糖測量均在PBS溶液中進行。在pH變化的實驗中，使用1.0M HCL和1.0M NaOH溶液來調(diào)節(jié)PBS緩沖液的pH。在電流分析實驗中，工作電極平衡在0.30V處(與Ag/AgCl相比)。
結(jié)果和討論平面納米復合材料墨中的PVFcAA介體的典型循環(huán)伏安圖示于圖12中。電極表現(xiàn)出擴散受控動力學的快速氧化還原電對的典型特征。峰值電流隨電位掃描速率的平方根而線性增加，對于最大200mV/s的掃描速率，還原和氧化峰值電位差保持為59mV不變，這表明從介體至電極的電荷轉(zhuǎn)移迅速。用葡萄糖強化該墨并未改變伏安圖，這提示不存在單獨通過介體的葡萄糖催化氧化。此外，在存在0.10-20mg/ml的不同GOX量時得到實際相同的伏安圖，如圖12a所示，這表明酶并不顯著影響墨中的Fc+/Fc氧化還原對的電化學。然而，向該墨中加入極少量的葡萄糖，導致陰極電流增強和陽極電流減小(圖12b)。此外，如圖12b中所可見，伏安圖在介體的氧化還原電位附近，朝陰極側(cè)上升。該變化暗示典型的化學偶聯(lián)電極過程(電催化)。該電催化可通過以下反應方程式描述(1)(2)(3)由此，GOX-FAD通過滲入膜的葡萄糖還原成GOX-FADH2(方程式1)，電子從GOX-FADH2傳遞至Fc+位置(方程式2)，隨后電子經(jīng)過聚合物介體的Fc+/Fc位置傳遞至電極表面(方程式3)。電極下方處二茂鐵的氧化是圖12b所示陰極電流增強的原因。
Fc和GOX之間的催化反應速率常數(shù)k可從存在大大過量的葡萄糖以確保酶被完全還原時得到的伏安測量數(shù)據(jù)來估計。該條件下，GOX和Fc之間的反應(方程式2)實際上是擬一級的。如Nicholson和Shain以及Liaudet與其同事們所顯示的，由于Fc和GOX之間的介導氧化還原過程引起的限制電流IL可描述如下IL＝nFACFc(2DFckCGOX)1/2(4)其中CFc和CGOX分別是Fc和GOX的濃度。DFc是Fc的擴散系數(shù)，其它符號具有其常用意義。如方程式4所預期的，在足夠低的電位掃描速率下，限制電流與電位掃描速率無關(guān)，并且與Fc濃度和GOX濃度的平方根成比例。這些觀察結(jié)果證明使用方程式4確定介導葡萄糖氧化的速率常數(shù)的正當性。結(jié)合方程式4和以線性掃描伏安測量表達的峰值電流ip，得到iL/ip關(guān)系如下IL/iP＝(2kCGOD)1/2/
(5)該方程式包含任意確定的經(jīng)驗參數(shù)并很好地適用于確定速率常數(shù)的目的，這是因為Fc/Fc+對的電極過程僅由擴散控制。根據(jù)在慢掃描速率＜5.0mV/s下，在含有0.50mM的Fc、60mM葡萄糖和0-30μM的GOX的溶液中得到數(shù)據(jù)估計速率常數(shù)為約3.8×103l/s mol。該速率常數(shù)表明PVFcAA有效介導GOX的氧化，是連接葡萄糖酶氧化與電極表面的優(yōu)異介體。本工作得到的速率常數(shù)明顯大于之前報導的其它二茂鐵衍生物-GOX體系的速率常數(shù)。可能的原因是pH7.4下在氧化還原聚合物中存在陽離子丙烯酰胺單元，由于GOX在該pH下是陰離子，因此其使Fc基團通過靜電相互作用而更加接近GOX的氧化還原中心。
實施例7使用共分散在納米顆粒膜中的擴散性聚(乙烯基-共聚-丙烯酰胺)介體和葡萄糖氧化酶的葡萄糖生物傳感器的電流測量響應在本實施例中，利用如實施例5中制備的漿墨，將傳感器與絲網(wǎng)印刷碳工作電極和Ag/AgCl參比電極組裝。葡萄糖在生物傳感器的空氣飽和PBS緩沖液中的典型電流測量響應如圖13a所示。電流測量測試示出生物傳感器具有對葡萄糖的快速響應時間和高靈敏度。在0.30V處，在強化葡萄糖濃度之后，氧化電流增大并在5秒內(nèi)非?？焖俚剡_到最大值，之后是保持60％以上的峰值電流持續(xù)20s的逐步瞬態(tài)。在相同實驗條件下，在空白PBS緩沖液中沒有觀察到催化氧化電流(圖13b)，但是納米顆粒膜的存在增大背景電流并經(jīng)過相當長時間才下降至微小水平。
為了獲得滿意性能的生物傳感器，優(yōu)化納米復合材料墨的配方。因為催化反應發(fā)生在介體和GOX之間，由此介體濃度必須足夠高以具有高靈敏度和催化氧化電流與葡萄糖濃度之間的線性關(guān)系。否則，介導葡萄糖氧化的部分將非常小并取決于膜中的介體量，而不是葡萄糖濃度。既考慮靈敏度又考慮生物傳感器的經(jīng)濟性，發(fā)現(xiàn)為此目的的最佳介體濃度為15mg/ml，并且最優(yōu)GOX濃度發(fā)現(xiàn)是0.20mg/ml(圖14a和14b)。希望平衡電位影響生物傳感器的電流測量響應；因此平衡電位檢測處于0.0-0.70V。如圖13c所示，隨著平衡電位上升并到達0.30V的平臺，電流靈敏度增加。當平衡電位變得大于0.50V時，觀察到微小的靈敏度下降，可能是由于背景電流增大所致。此外，過高的平衡電位消弱葡萄糖測量的精確性，這是因為來自大大增加的背景電流和電極下大量電活性物質(zhì)可能直接氧化的復雜性。因此，對于葡萄糖的電流分析測量，生物傳感器的電位平衡在0.30V。
也研究了葡萄糖的催化氧化電流對納米顆粒膜厚度的依賴性(圖14d)。如圖14d所示，對于厚度為250-500μm的納米顆粒膜，催化氧化電流達到最大值。更薄的膜中材料不足導致較低的靈敏度和電流峰值的消失。相反，納米顆粒膜膜厚進一步增加超過500μm將不利地影響膜對葡萄糖和GOX催化反應產(chǎn)物的通透性。而且，注意到膜越厚則響應時間越長。
與使用表面固定傳感膜不同，使用非導電納米顆粒傳感膜在靈敏度方面提供優(yōu)于已知一次性葡萄糖生物傳感器的優(yōu)點。在前者的系統(tǒng)中，傳感膜是電極的一部分并且直接接觸血液樣本。血液中的某些成分例如血細胞包括紅細胞和白細胞、蛋白質(zhì)和抗壞血酸可與傳感膜相互反應，抵消血糖測量的精確性。本工作中，納米顆粒膜是非導電性的，因此在結(jié)構(gòu)和功能上都不是電極的一部分。葡萄糖的催化氧化僅僅發(fā)生在電極/納米顆粒膜的界面上。換言之，電活性物質(zhì)只有穿過納米顆粒膜到達該界面時才與電極交換電子。因此，納米顆粒膜提供阻斷血液中的大量物質(zhì)如細胞和蛋白質(zhì)可能干擾的屏障。當該配方用于印制納米顆粒膜時，PVPAC粘合劑在傳感膜中發(fā)揮雙重作用粘合和分析物調(diào)節(jié)。當再水合時，膜不破裂，但是溶脹在絲網(wǎng)印刷碳表面上形成凝膠層。反應物，如葡萄糖和介體在該層內(nèi)自由移動，而干擾物質(zhì)如含有氧合血紅蛋白的紅細胞被排除在外。陰離子抗壞血酸和尿酸被陰離子PVAC聚合物排斥，并且部分溶解在納米顆粒膜中的氧由于該層的高親水特征而大大減少。這得到傳感膜，由此響應給定葡萄糖濃度而產(chǎn)生的電流量在40-60％血球比率以上和存在0.20mM抗壞血酸和0.10mM尿酸的情況下變化小于5.0％。這種對血液中干擾成分的所期望不敏感性在全血樣本中觀察到。此外，納米顆粒膜還存在葡萄糖分析物調(diào)節(jié)層，明顯減緩葡萄糖的運輸，使得體系不再動力學可控，由此使線性區(qū)域延伸遍布整個生理相關(guān)葡萄糖濃度范圍40-540mg/dl。
如前所述，氧影響葡萄糖生物傳感器的靈敏度，因為溶解氧氧化葡萄糖作為副反應同時發(fā)生。對采用憎水的聚乙烯基吡啶(PVP)粘合劑的薄納米顆粒薄膜的初始電流分析測試表明不存在氧時的響應高于具有溶解氧時的響應。在低葡萄糖濃度例如50mg/dl下，與氧的競爭引起峰值電流的顯著下降(～20％)。因此，需要抑制系統(tǒng)中的氧干擾，以獲得高選擇性和精確的生物傳感器。在憎水的PVP中引入丙烯酸單元導致生物傳感器性能明顯改進。所得納米顆粒膜高度親水，這改善葡萄糖/氧的滲透比并優(yōu)化生物傳感器響應的精確性和線性。對于以氮氣(圖15a)和氧氣(15b)鼓泡的200mg/dl葡萄糖溶液的兩張電流分析圖重疊良好，峰值電流差小于5％，表明生物傳感器對樣本中的氧含量非常不敏感。
實施例8使用共分散在納米顆粒膜中的擴散性聚(乙烯基二茂鐵-共聚-丙烯酰胺)介體和葡萄糖氧化酶的葡萄糖生物傳感器的特征分析在本實施例中，利用如實施例5中制備的漿墨，將傳感器與絲網(wǎng)印刷碳工作電極和Ag/AgCl參比電極組裝。對≤600mg/dl的葡萄糖濃度，峰值電流的靈敏度為～76nA/mg/dl。如圖16所示，催化氧化電流直接與最高600mg/dl的葡萄糖濃度成比例，覆蓋整個生理相關(guān)的血糖水平。有趣的是，峰值電流之后的任意時間點所得電流也與葡萄糖濃度成線性關(guān)系(見圖16b)，提供在電流分析測試的前20秒內(nèi)作為替代方案的取樣可能性。從40和300mg/dl的葡萄糖溶液的兩組20次反復測量來估計準確性。相對標準偏差分別為4.0％和8.6％。在最優(yōu)條件下對5.0mg/dl葡萄糖反復測量的標準偏差的3倍估計得到的檢測極限發(fā)現(xiàn)為1.8mg/dl，其受生物傳感器的充電電流限制。更重要的是單次測試所需血液樣本體積為約0.20-0.30μl，是市場上所有一次性葡萄糖生物傳感器中的最小樣本體積。在不同溫度下進行穩(wěn)定性測試。結(jié)果表明生物傳感器在室溫下儲存的前180天保持了100％的最初靈敏度，暴露在50℃下60分鐘后損失其最初靈敏度的10％，60℃下60分鐘后損失最初靈敏度的約50％。這可能是由于生物傳感器中酶活性損失所造成的。所提出的方法成功應用于全血中的葡萄糖測定。
表2.血糖分析結(jié)果(10次測試的平均值)


*得自YSI血糖分析儀。
得到的結(jié)果與使用yellow springs血糖儀(YSI 2300型)得到的參考值一致性良好。所得收回率足夠進行實際應用。
已經(jīng)通過乙烯基二茂鐵和丙烯酰胺及其衍生物的傳統(tǒng)自由基聚合制備一系列水溶性和可交聯(lián)二茂鐵基氧化還原聚合物。所得氧化還原聚合物在GOX存在時產(chǎn)生對于葡萄糖的典型催化氧化電流。本實驗結(jié)果表明在氧化還原聚合物和GOx引入PBS中之后，氧化還原聚合物保留快速電子傳遞特性并且GOx保留其催化活性。具有作為側(cè)鏈之一的胺或羧酸基團的氧化還原聚合物允許其方便地與蛋白質(zhì)交聯(lián)，所述蛋白質(zhì)例如是酶和抗體和抗原。交聯(lián)氧化還原聚合物膜的電化學測試表明對氧化溶液中底物的優(yōu)異催化活性、高靈敏度、良好的再現(xiàn)性和穩(wěn)定性，因此指示其適合用作生物傳感器中的傳感膜。
在單獨實驗中，還表明葡萄糖氧化酶和PVFcAA可與憎水PVPAA粘合劑一起容易而均勻地分散在納米顆粒氧化鋁中，并且所得膜產(chǎn)生對于葡萄糖的典型催化氧化電流。實驗結(jié)果表明在將介體和GOX絲網(wǎng)印刷在碳電極上之后，介體保留其快速電子傳遞性質(zhì)，GOX保留其催化活性。其還表明生物傳感器對利用少至0.20μl的血液樣本體積進行血糖監(jiān)測具有良好的靈敏度和穩(wěn)定性。絲網(wǎng)印刷技術(shù)在制造生物傳感器中的用途使得可以容易和低成本地大量生產(chǎn)。這些生物傳感器特征對于開發(fā)高市場價值的微型葡萄糖生物傳感器是有前途的。
權(quán)利要求
1.一種用于測定分析物在測試樣品中存在與否的傳感器，所述傳感器包括納米顆粒膜，其含有選自周期表中IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIB、IIIB、IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族的元素的至少一種無機氧化物納米顆粒，其中氧化還原酶和電化學活化劑擴散分布于所述納米顆粒膜中。
2.權(quán)利要求1的傳感器，其中所述氧化還原酶選自葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、辣根過氧化物酶、黃嘌呤氧化酶、膽固醇氧化酶、氫氫化酶、乳酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、NADH脫氫酶、肌氨酸氧化酶、乳酸氧化酶、醇脫氫酶、羥基丁酸脫氫酶、甘油脫氫酶、山梨醇脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、半乳糖脫氫酶、蘋果酸氧化酶、半乳糖氧化酶、黃嘌呤脫氫酶、醇氧化酶、膽堿氧化酶、黃嘌呤氧化酶、膽堿脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、草酸氧化酶、膽紅素氧化酶、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、胺氧化酶、NADPH氧化酶、尿酸氧化酶、細胞色素C氧化酶和兒茶酚氧化酶。
3.權(quán)利要求1的傳感器，其中所述的電化學活化劑是能夠在分析物和存在于傳感器中的電極之間傳遞電子的聚合物氧化還原介體。
4.權(quán)利要求3的傳感器，其中所述的氧化還原酶通過交聯(lián)鍵與聚合物氧化還原介體共價連接。
5.權(quán)利要求1的傳感器，其中所述選自周期表中IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIB、IIIB、IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族的元素選自鋁、硅、鎂和鋅。
6.權(quán)利要求1的傳感器，其中所述膜的厚度為250-500μm。
7.權(quán)利要求6的傳感器，其中所述納米顆粒的尺寸為10nm-1μm。
8.權(quán)利要求1的傳感器，其中所述膜還包含聚合物粘合劑。
9.權(quán)利要求8的傳感器，其中所述聚合物粘合劑是含有選自乙烯基吡啶、乙烯基咪唑、丙烯酰胺、丙烯腈和丙烯酰肼以及丙烯酸的單體單元的聚合物或共聚物。
10.權(quán)利要求1的傳感器，還包括用于容納測試樣品的腔，所述腔至少結(jié)合在工作電極上的工作區(qū)域與參比電極上的工作區(qū)域之間，其中氧化還原酶和電化學活化劑涂布在工作電極的工作區(qū)域上。
11.權(quán)利要求10的傳感器，其中所述工作電極包含選自金、碳、鉑、二氧化釕、鈀和導電環(huán)氧樹脂的材料。
12.一種非導電納米顆粒膜，其包含選自周期表中IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIB、IIIB、IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族的元素的至少一種無機氧化物納米顆粒，其中氧化還原酶和電化學活化劑擴散分布于所述納米顆粒膜中。
13.權(quán)利要求12的膜，其中所述電化學活化劑是能夠傳遞電子的聚合物氧化還原介體。
14.權(quán)利要求12的膜，其中所述選自周期表中IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIB、IIIB、IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族的元素選自鋁、硅、鎂和鋅。
15.權(quán)利要求12的膜，其中所述膜的厚度為250-500μm。
16.權(quán)利要求12的膜，其中所述納米顆粒的尺寸為10nm-1μm。
17.權(quán)利要求12的膜，其中所述膜還包含聚合物粘合劑。
18.權(quán)利要求17的膜，其中所述聚合物粘合劑是含有選自乙烯基吡啶、乙烯基咪唑、丙烯酰胺、丙烯腈和丙烯酰肼以及丙烯酸的單體單元的聚合物或共聚物。
19.一種生產(chǎn)非導電納米顆粒膜的方法，所述方法包括將電化學氧化還原介體與氧化還原酶和來自周期表的IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIB、IIIB、IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族元素的無機氧化物的納米顆?；旌?，以形成納米復合材料墨；和將所述納米復合材料墨涂布至襯底上。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述納米復合材料墨根據(jù)預定圖案涂布。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述納米復合材料墨通過絲網(wǎng)印刷涂布。
22.權(quán)利要求19的方法，其中所述混合還包括將聚合物粘合劑混入所述納米復合材料墨中。
23.權(quán)利要求19的方法，其中納米復合材料墨中的電化學活化劑的濃度為約15mg/ml。
24.權(quán)利要求19的方法，其中納米復合材料墨中的酶濃度為約0.2mg/ml。
25.一種水溶性氧化還原聚合物，包含第一單體單元，包含可聚合的二茂鐵衍生物；和第二單體單元，包含具有能夠能夠獲得凈電荷的伯酸或堿官能團的丙烯酸衍生物。
26.權(quán)利要求25的氧化還原聚合物，其中第二單體單元包含具有能夠獲得凈電荷的末端伯酸或堿官能團的丙烯酸衍生物。
27.權(quán)利要求25的氧化還原聚合物，其中所述丙烯酸衍生物由通式(I)表示 其中，R選自CnH2n-NH2、CnH2n-COOH、NH-CnH2n-PO3H和NH-CnH2n-SO3H，其中烷基鏈可以是任選取代的，其中n是0-12的整數(shù)。
28.權(quán)利要求25的氧化還原聚合物，其中所述可聚合二茂鐵衍生物選自乙烯基-二茂鐵、乙炔基-二茂鐵、苯乙烯基-二茂鐵和氧化乙烯-二茂鐵。
29.權(quán)利要求28的氧化還原聚合物，其中所述二茂鐵衍生物是乙烯基二茂鐵。
30.權(quán)利要求25的氧化還原聚合物，其中氧化還原聚合物的分子量是約1000-5000道爾頓。
31.權(quán)利要求25的氧化還原聚合物，其中存在于氧化還原聚合物中的二茂鐵為約3％-14％。
32.一種制備水溶性氧化還原聚合物的方法，所述方法包括將第一單體單元與第二單體單元聚合，所述第一單體單元包含可聚合的二茂鐵衍生物，所述第二單體單元包含丙烯酸衍生物，所述丙烯酸衍生物具有能夠獲得凈電荷的酸或堿官能團，其中所述聚合在水醇介質(zhì)中進行。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述水醇介質(zhì)包含體積比為2∶1-3∶1的乙醇和水。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述聚合通過加入自由基引發(fā)劑而引發(fā)。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述自由基引發(fā)劑選自過硫酸銨、過硫酸鉀和過硫酸鈉。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所加入的自由基引發(fā)劑的重量比為約20mg-40mg/1g單體。
37.權(quán)利要求32的方法，其中所述聚合在約60℃-80℃的溫度下回流進行。
38.權(quán)利要求33的方法，其中所述聚合在惰性氣氛中進行。
39.權(quán)利要求32的方法，其中所述聚合進行約24小時。
40.權(quán)利要求32的方法，還包括在將所述第一和第二單體聚合之前形成反應前混合物，包括將丙烯酸衍生物單體單元溶解在水醇介質(zhì)中，然后加入自由基引發(fā)劑，然后加入可聚合的二茂鐵衍生物單體單元，以形成反應前混合物。
41.權(quán)利要求40的方法，其中反應前混合物中的丙烯酸衍生物和可聚合二茂鐵衍生物的進料比為所加入單體重量的約5％-15％。
42.權(quán)利要求40的方法，其中所述可聚合二茂鐵衍生物單體單元在加入之前溶解于水醇介質(zhì)。
43.權(quán)利要求40的方法，還包括將氧化還原介體沉淀在有機溶劑中。
44.權(quán)利要求40的方法，其中所述有機溶劑選自醚和酮。
45.權(quán)利要求1的傳感器，其中所述傳感器用于測定葡萄糖濃度。
全文摘要
一種用于測定在測試樣品中存在分析物的傳感器，所述傳感器包含納米顆粒膜，所述納米顆粒膜含有選自周期表中IA、IIA、IIIA、IVA、IB、IIB、IIIB、IVAB、VB、VIB、VIIB或VIIIB族的元素的至少一種無機氧化物納米顆粒，其中氧化還原酶和電化學活化劑擴散分布于所述納米顆粒膜中。
文檔編號C12Q1/54GK1875114SQ200480032314
公開日2006年12月6日 申請日期2004年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月29日
發(fā)明者高志強, 徐國林, 應儀如, 穆罕默德·謝里夫·穆罕默德·艾爾沙德, 謝芳 申請人:新加坡科技研究局