專利名稱：測定多核苷酸序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及測定多核苷酸序列或檢測多核苷酸序列之間變異的方法。
背景技術：
能夠測定多核苷酸序列在科學上非常重要，這一點已被人類基因組計劃所證實，該計劃已經測定了人類基因組30億個堿基的全部序列。然而，這些序列信息只代表普通人，很有必要了解其在基因水平上的個體差異。
常用的大規(guī)模DNA測序的主要方法是鏈終止法。該方法由Sanger和Coulson(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1977；745463-5467)首先提出，依靠在聚合酶鏈反應中，將四種三磷酸核苷的雙脫氧衍生物引入新生多核苷酸鏈。引入后，雙脫氧衍生物終止聚合酶反應的進行，然后通過凝膠電泳分離產物，分析顯示特定雙脫氧衍生物引入鏈中的位置。
盡管該方法被廣泛使用，并且能夠得到可靠的結果，但人們也意識到該方法費時費力，價格昂貴。而且，對于檢測兩個序列的差異(經常由單堿基變換構成，稱為單核苷酸多態(tài)性，即SNP)來說，該方法并非有效方法。
核酸陣列近來成為測定多核苷酸序列和SNP的優(yōu)選方法，通常用于雜交事件環(huán)境中(Mirzabekov，Trends in Biotechnology(1994)1227-32)。大量基于陣列的測序方法使用標記的核苷酸，以獲得加入的(雜交的)堿基的身份。這些陣列依靠對適當標記的堿基進行逐一識別，這在US-A-5634413中稱為“單堿基”測序方法。這種“單堿基”方法使用兩種類型的標記放射標記和熒光標記。核苷酸的放射標記具有高靈敏度和低背景的優(yōu)點。然而，放射標記的解析度較差。
熒光標記的核苷酸現(xiàn)已在許多技術中廣泛應用。該核苷酸可通過聚合酶鏈反應逐一引入新生多核苷酸鏈。每種核苷酸(A、T、G和C)在3’位引入一個獨特的熒光團，該熒光團可使用靈敏的熒光檢測器(如電荷耦合檢測器，CCD)檢測。該熒光團通常還用作“封閉基團”，使引入的核苷酸不能作為底物以進一步增加核苷酸，因而可防止失控的聚合反應。通常使用“可去除的封閉基團”，該基團可通過能夠導致核苷酸和封閉基團之間的共價鍵斷裂的特殊處理而去除，使得測序反應繼續(xù)進行。
可去除的封閉基團依賴于幾種可能的去除處理手段，例如光化學、化學或酶處理。然而，這些手段已被證明難以控制和應用。局部環(huán)境(例如在一個陣列內)的差異可導致整個核苷酸，甚至幾個核苷酸被除去，而不僅僅是除去預想的標記。這些現(xiàn)象對測序方法的精度具有嚴重影響，這是由于核苷酸的失控去除可導致測序數(shù)據不同相，序列數(shù)據破壞或不可用。
兩種標記方法的另一缺點是重復序列可導致結果模糊。在Automation Technologies for Genome Characterisation，Wiley-Interscience(1997)，ed.T.J.Beugelsdijk，Chapter 10205-225中已經注意到這個問題。
因此需要一種測定多核苷酸序列，特別是測定多核苷酸序列內變異(如測定SNP)，并且結合了放射標記的核苷酸的高靈敏度、低背景和熒光標記的標記的高解析度的改進的方法。而且，該方法與現(xiàn)有方法相比，應該能夠高通量、自動化地進行，并且減少成本。

發(fā)明內容
本發(fā)明基于可通過測量聚合酶反應過程中聚合酶與靶多核苷酸的結合時間來測定多核苷酸序列這一發(fā)現(xiàn)。一般情況下，當沒有核苷酸可引入時，聚合酶與靶多核苷酸的結合時間較短。因此，如果唯一可用的核苷酸非互補，聚合酶結合多核苷酸的時間就會縮短，這樣就可檢測并顯示出靶多核苷酸的互補序列的身份。
根據本發(fā)明的第一方面，一種測定多核苷酸序列的方法包括(i)在適合聚合酶反應進行的條件下，將靶多核苷酸與聚合酶、核苷酸A、T(U)、G和C中的一種接觸；(ii)測定聚合酶結合靶多核苷酸以及隨后解離的時間，由此確定聚合酶是否將核苷酸引入靶多核苷酸上；(iii)可選地，使用其他核苷酸重復步驟(i)和(ii)，由此確定靶多核苷酸的序列。
根據本發(fā)明的第二方面，一種識別靶多核苷酸突變的方法，包括如下步驟(i)在適合聚合酶反應進行的條件下，將靶多核苷酸與聚合酶、核苷酸A、T(U)、G和C中的一種接觸；(ii)測定聚合酶結合靶多核苷酸以及隨后解離的時間，由此確定聚合酶是否將核苷酸引入靶多核苷酸上，參照靶標的原始序列確定是否存在突變。
具體實施例方式
本文所用術語“多核苷酸”或“靶多核苷酸”應從廣義上解釋，它包括DNA和RNA，包括修飾的DNA和RNA，以及其他雜合的核酸樣分子，如肽核酸(PNA)。靶多核苷酸可為雙鏈或單鏈。靶多核苷酸優(yōu)選至少為部分單鏈，更優(yōu)選具有與之相結合的引物序列，以使聚合酶能夠附著于靶多核苷酸上，這一點能夠為本領域技術人員所理解。
酶為聚合酶，可在互補鏈延伸過程中與靶多核苷酸相互作用，并且可為任何已知類型。例如，聚合酶可為任何DNA依賴的DNA聚合酶。如果靶多核苷酸為RNA分子，那么聚合酶可為RNA依賴的DNA聚合酶(即反轉錄酶)或RNA依賴的RNA聚合酶(即RNA復制酶)。引發(fā)酶也包含在此定義之中。
靶多核苷酸優(yōu)選位于支持材料的特定位點。多核苷酸優(yōu)選通過固定于固體支持物上而定位。適合用于固定多核苷酸的支持物對本領域技術人員來說是顯而易見的，例如硅、玻璃或陶瓷材料都可使用?？梢怨矁r或非共價方式進行固定。例如，可使用共價接頭分子。在優(yōu)選的實施方案中，將引物固定于支持材料上，再將靶多核苷酸與該引物雜交。另外，靶多核苷酸和引物的雜交可在溶液中進行，隨后或同時將引物或靶多核苷酸附著于支持材料上。
可將一種或多種靶多核苷酸固定于固體支持材料上。在優(yōu)選的實施方案中，多種靶多核苷酸附著于支持物上。這些靶多核苷酸陣列可為任何已知密度，包括多分子、高密度陣列和“單分子”陣列。在單分子陣列中，可分辨出單個多核苷酸的位置，即可以監(jiān)測發(fā)生于單個多核苷酸上的聚合酶反應。
在本測序方法的第一步中，可在雜交/聚合緩沖液中將靶多核苷酸與適當?shù)囊锝佑|。通常，緩沖液的溫度應足夠高，以破壞(或離解)存在于靶多核苷酸上的任何二級結構。冷卻后，引物退火至靶標的互補處。然后將其與聚合酶接觸，形成靶多核苷酸/聚合酶復合物。
在本發(fā)明的一個實施方案中，控制核苷酸的加入，以使不同的核苷酸依次加入聚合酶/靶標復合物中。例如，可加入dGTP并使其流過聚合酶/靶標復合物；然后測定聚合酶與多核苷酸結合的時間。未結合的dGTP流出反應位置，再加入另一種核苷酸。用這種方式，復合物形成的時間可與該時間內存在的特定核苷酸相關聯(lián)，因而可測定多核苷酸序列。
該反應也可通過將聚合酶加至包括靶多核苷酸和核苷酸的反應混合物中起始。監(jiān)測聚合酶與靶多核苷酸的結合和解離所需時間之后，除去未結合的核苷酸，引入下一種核苷酸繼續(xù)進行測序步驟。
將核苷酸引入靶標上要求聚合酶與靶標結合的時間要長于不可能發(fā)生引入時的時間。因而，測量聚合酶與靶標的結合可顯示出具有連續(xù)同種核苷酸的靶標區(qū)域上是否發(fā)生了引入事件，結合時間會成比例增加。因此，該方法可用于測定連續(xù)的同種核苷酸。
通過測量施加的輻射(applied radiation)的變化對聚合酶和靶多核苷酸之間的相互作用進行檢測。可使用常規(guī)設備測量聚合酶和靶多核苷酸相互作用時發(fā)生的輻射變化。
在一個實施方案中，使用非線性成像系統(tǒng)測量聚合酶與靶多核苷酸的相互作用。
非線性成像系統(tǒng)為本領域所公知。一般地，物質的非線性極化可表示為P＝X(2)E1+X(2)E2+X(3)E3+......
其中，P為誘導極化，X(n)為n階非線性極化率(susceptibility)，E為電場矢量。第一項描述光的正常吸收和反射；第二項描述二次諧波發(fā)生(SHG)、和頻及差頻發(fā)生；第三項描述光散射、受激拉曼過程、三次諧波發(fā)生(THG)以及二光子和三光子吸收。
本發(fā)明優(yōu)選的成像系統(tǒng)依靠檢測起因于二次或三次諧波發(fā)生的信號。
使用二次或三次諧波發(fā)生(以下稱SHG)的單分子解析已為本領域所公知(Peleg等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999；956700-6704和Peleg等，Bioimaging，1996；4215-224)。適當?shù)南到y(tǒng)記載于WO-A-02/095070。
在一個實施方案中，使用拉曼散射和/或LSPR技術在溶液相(即未將聚合酶和靶多核苷酸固定)中進行檢測。
當光線照射于分子時，大量入射光子被彈性散射，而頻率不發(fā)生變化。這叫做瑞利散射(Rayleigh scattering)。然而，一些入射光子(大約每107個光子中有1個)的能量與分子鍵的不同振動模式發(fā)生偶聯(lián)。這種偶聯(lián)導致一些入射光線被分子非彈性散射，散射光線的頻率范圍與入射光線的頻率范圍不同。這叫做拉曼效應。作出這種非彈性散射光線頻率對強度的曲線，就可獲得所研究分子的獨特拉曼光譜。分析未知樣本的拉曼光譜可獲得樣本的分子組成信息。
通過將拉曼活性分子置于結構金屬表面附近(≤50)，拉曼效應可顯著增強，該區(qū)域離表面呈指數(shù)規(guī)律衰減。將分子帶到金屬表面鄰近一般通過將拉曼活性分子吸附至適當粗糙的金、銀、銅或其他自由電子金屬來實現(xiàn)。拉曼活性的表面增強可在金屬膠體粒子、電介質基質上的金屬膜，以及金屬粒子陣列中觀察到。不很清楚發(fā)生表面增強的拉曼散射機制，但被認為由以下因素相結合而產生(i)金屬的表面等離子共振，可增強局部光密度；(ii)在金屬表面和拉曼活性分子之間形成導電復合物并隨后躍遷。
拉曼效應可用于測量聚合酶和靶多核苷酸結合的時間。優(yōu)選將靶標固定于金屬表面，以增強拉曼信號。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，通過使用與聚合酶結合的金屬膠體納米粒子(如金或銀納米粒子)來使用表面增強拉曼散射(SERS)。關聯(lián)于或結合于拉曼活性分子的拉曼增強金屬納米粒子可用作光標記。其一般概念在美國專利6,514,767中記載，其內容通過援引的方式納入本文。在一個實施方案中，靶多核苷酸和聚合酶可通過搜索拉曼活性分子的特征拉曼光譜檢測。因為單個拉曼光譜(從100至3500cm-1)可檢測許多不同的拉曼活性分子，結合于或關聯(lián)于聚合酶的SERS活性納米粒子可以多重檢測方式用于本發(fā)明環(huán)境中。
在一個單獨的實施方案中，通過使用表面電磁波技術監(jiān)測輻射變化。
使用表面電磁波技術的生物傳感器(特別是表面等離子共振-SPR-傳感器)是基于表面電磁波(SEW)對傳播SEW的表面的鄰近薄層的折射率的敏感性。在生物傳感器中，使聚合酶和核苷酸流經含固定靶多核苷酸的表面。由于發(fā)生結合，表面上物質的積聚或重新分布會改變局部折射率，而折射率可由傳感器實時監(jiān)測。
已經提出幾項利用SPR技術的方法并在生物傳感器中實現(xiàn)。應用最廣的方法基于Kretschmann-Raether構造，其可監(jiān)測傳感器反射的光強度。該技術被認為是最靈敏的技術之一，記載于J.Homola等，Sensors and Actuators B 54，p.3-15(1999)，其具有5×10-7折射率單位的檢測極限。測量SPR相變化可使傳感器的靈敏度進一步提高一個或兩個數(shù)量級。該技術記載于Nelson等，Sensors and Actuators B 35-36，p.187(1996)和Kabashkin等，Optics Communications 150，p.5(1998)。已對現(xiàn)有的干涉測量裝置如Mach Zehnder干涉儀進行改造，使之可通過相改變測量傳感器表面的折射率變化。該技術公開于國際專利申請WO-A-0120295。該裝置需要四種獨立組分，并且對這些組分的亞波長相對替換敏感，因此對微小的機械和環(huán)境微擾敏感。機械上更為牢固的單塊干涉測量裝置記載于WO-A-03014715。
在優(yōu)選的實施方案中，所使用的表面電磁波(SEW)傳感器系統(tǒng)能夠補償緩沖液整體折射率的改變，或者使得整體折射率對干涉圖樣的影響與吸附于傳感器表面的分析物對它的影響區(qū)分開來。因此，生物傳感器包括相干輻射源，以產生入射波；支持固定多核苷酸的載體表面，載體表面載有基質，能夠支持表面電磁波(SEW)；將入射波分為SEW和一次散射波的裝置，其中SEW沿載體表面?zhèn)鞑ゲ⑴c固定多核苷酸相互作用；從SEW產生二次散射波的裝置；以及監(jiān)測一次散射波和二次散射波之間干涉的檢測器。
在該實施方案中，由單色激光產生的相干光束使用透鏡來聚焦于能夠支持表面電磁波(SEW)的金屬膜邊緣。光束透過安裝有金屬膜的玻璃棱鏡。使用近紅外激光作為光源。使用近紅外光源的優(yōu)點是金和銀中的表面等離振子具有較長的傳播長度，同時仍可使用常規(guī)光學器件來成像和照明。然而，其他單色光源也適合并且可以使用。
該系統(tǒng)記載于WO-A-04/020985，其內容通過援引的方式納入本文。
在優(yōu)選的實施方案中，聚合酶被標記。
本文所用的術語“標記”可從廣義上解釋。適合的標記對本領域技術人員來說是顯而易見的。在優(yōu)選的實施方案中，標記是熒光團。在一個特定的實施方案中，聚合酶制備成與GFP(綠色熒光蛋白)的重組融合體。它可以是野生型GFP或其光譜移動的變體(Tsien，Ann.Rev.Biochem.1998；67509，US 5,777,079和US 5,625,048)。GFP可位于酶的N或C末端(如果聚合酶用于與“滑動鉗”連接，則C末端較好)。或者，GFP分子可位于酶的任何位置，只要保持酶活性。還可采用其他標記。已經報道了多種標記分子的手段，如微球法(microsphere，Anal.Chem.(2000)72，153678-3681)，金納米粒子法(J.Am.Chem.Soc.(2000)122，153795-3796)，銀膠體粒子法(PNAS，(2000)97，3996-1001)以及量子點法(quantum dot)。任何可清楚分辨聚合酶與靶多核苷酸和核苷酸相互作用的標記技術均可用于本發(fā)明的環(huán)境中。優(yōu)選使用對酶與靶多核苷酸:核苷酸復合物的結合和/或脫離具有時間分辨力的標記。
優(yōu)選地，建立固定靶多核苷酸陣列，在保持酶活性的條件下，使聚合酶與四種核苷酸中的至少一種一起流過該陣列。更優(yōu)選地，該反應在流動池(flow cell)中進行。然后將陣列之中包括單一固定靶多核苷酸或多個相同的靶多核苷酸的各“陣列位置”以時間分辨率成像，以分辨酶與靶多核苷酸/核苷酸復合物之間的結合，優(yōu)選從1至至少幾千赫茲。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，聚合酶使用熒光共振能量轉移(FRET)對標記。該系統(tǒng)記載于WO-A-01/25480。本領域技術人員可以理解，F(xiàn)RET對需要熒光團，以及可與該熒光團相互作用的、用作能量供體或受體的第二分子。該對之間的相互作用改變了所檢測的熒光團的發(fā)射光譜。第二分子可為另一個熒光團，或其他任何適當?shù)姆肿樱缃饘倭Ｗ?。?yōu)選使用常規(guī)FRET對，其兩個標記均為熒光團，所選熒光團滿足一個熒光團的發(fā)射波長相應于另一個的激發(fā)波長的條件。熒光團在酶上的固定位置應該滿足以下條件當酶與多核苷酸結合形成三元復合物時，熒光團之間發(fā)生相對移動。根據FRET對的設計方式，F(xiàn)RET對的這種相對移動會導致該對的發(fā)射譜移。或多或少的來自供體的能量會與受體發(fā)生耦合，導致供體熒光的激發(fā)或衰減。該變化以高時間分辨率監(jiān)測，獲得所需信息。用于對熒光水平進行成像的設備優(yōu)選電荷耦合設備(CCD)，其具有快速讀出時間，并帶有高空間分辨率的適當光學器件。
所需監(jiān)測聚合酶和靶標相互作用的解析系統(tǒng)可根據“掃描”所研究的樣本的需要進行修改。這種掃描特別可能存在于高解析系統(tǒng)，如單分子系統(tǒng)。在單分子實驗所需的高水平空間解析的情況下，有效觀察區(qū)域相應減小。由于“動態(tài)”分析通常需要對單個確定的區(qū)域進行連續(xù)“實時”監(jiān)測，掃描會帶來監(jiān)測不連續(xù)的問題。由于會丟失相互作用事件，這種非連續(xù)監(jiān)測與動態(tài)分析不能相容。因而在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，采用在5引物端標記的核苷酸；該標記用作可去除性封閉基團。這樣，在采用高空間分辨率的情形下(如單分子陣列，這時觀察區(qū)域通常只有100μm×100μm，芯片通常至少大100倍)，觀察區(qū)域“移向”新位置，該區(qū)域使用適于去除封閉基團的輻射(如UV)照射。該手段確保了結合/動態(tài)事件只發(fā)生于“觀察”區(qū)域。然后將“觀察”區(qū)域在芯片上移動，通過只將所觀察的區(qū)域暴露于足以使核苷酸去除封閉的輻射下，使選擇性反應只發(fā)生于該區(qū)域。
在另一個獨立的優(yōu)選實施方案中，成像區(qū)域限制在單個流動池中，即在觀察區(qū)域限制在100μm×100μm的事件中，流動池限制在大約與此相應的尺寸內。這樣，在該實施方案中，核苷酸只注射到正在活動成像的流動池內。因而，多核苷酸陣列排布于其上的支持材料可由單個可尋址的流動池“陣列”構成。當成像區(qū)域在芯片上移動時，只將核苷酸注入成像區(qū)域所在的流動池。
在另一個實施方案中，聚合酶的結合通過嵌入分子和聚合酶上的染料/猝滅劑之間的共振能量轉移檢測。嵌入染料(如CYBRGreen，分子探針)只有在與雙鏈引物-模板復合物結合時才會發(fā)出熒光。該信號可用于分辨靶多核苷酸的位置。聚合酶使用染料修飾，該染料為“受體”分子，能夠從嵌入染料吸收并重新發(fā)射能量。或者，“標記”也可為猝滅劑。這樣，結合/相互作用事件可通過觀察能量轉移引起的信號變化來監(jiān)測。
本發(fā)明方法可用于測定靶多核苷酸的完全序列，也可用于測定多核苷酸的部分序列。該方法適于檢測靶標中是否存在突變，例如，與對照序列或參照序列相比，確定是否發(fā)生替換、缺失或插入。
在優(yōu)選的實施方案中，該方法可用于測定基因樣本的單核苷酸多態(tài)性。本文所用術語“多態(tài)性”是指在不同的基因組或受試者之間出現(xiàn)兩種或多種等位基因組序列(alternative genomic sequence)或等位基因。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是單堿基對的變化。通常，SNP是在多態(tài)性位點一種核苷酸被另一種核苷酸替換。單堿基缺失或單堿基插入，同樣產生單核苷酸多態(tài)性。
本方法用來測定位于推測的突變位點的核苷酸的身份，然后將該信息與參照序列比較，確定是否存在突變。
用以下實施例對本發(fā)明作示例性說明。
實施例在本實驗中，通過本領域公知的重組技術制備綠色熒光蛋白(GFP)和聚合酶的融合蛋白。
石英芯片(直徑14mm，厚0.3mm)使用固定鏈親和素(Xantec，Germany)修飾的平整的葡聚糖層旋轉涂布(spin-coated)。使用裝有全內反射(TIR)照明裝置的正立顯微鏡(135TV，Zeiss)作為實驗平臺。峰值488nm、功率100mW的激光束(Melles Griot)通過1/4波片循環(huán)極化在定制棱鏡中進行TIR。通過折射率匹配的凝膠將棱鏡與芯片在光學上耦合。然后將帶有O型密封環(huán)和透明光軸的流動池裝于棱鏡和石英芯片上。物鏡通過流動池的透明上表面收集熒光信號。圖像穿過帶通濾鏡進入薄型背照式電荷耦合器件(Andortechnologies)。
使用標準的亞磷酰胺(phosphoamidite)化學法合成兩段寡核苷酸。定義為SEQ ID NO.1的寡核苷酸用作靶多核苷酸，定義為SEQ IDNO.2的寡核苷酸經過生物素化，用作引物。通過將10pM的SEQ IDNO.2溶于含100mM MgCl2的Tris緩沖液中形成的溶液注入流量池，將生物素化引物(SEQ ID NO.2)沉淀到鏈親和素包被的芯片上，溫育10分鐘。
SEQ ID NO.1CAAGGAGAGGACGCTGCTTGTCGAAGGTAAGGAACGGACGAGAGAAGGGAGAGSEQ ID NO.2生物素-CTCTCCCTTCTCTCGTC
流動的緩沖液以500μl/min的速率流入流動池。然后將互補序列SEQ ID NO.1以1μM的濃度、5μl/min的流動速率注入流動池。在注入過程中，通過流動池內的鉑加熱電極將流動池加熱至70℃維持幾分鐘，冷卻至25℃。然后繼續(xù)注入10分鐘。注入結束后，流動緩沖液繼續(xù)以500μl/min的流動速率流過該系統(tǒng)。10分鐘后，在緩沖液中以500μl/min的流動速率注入0.4mM dATP(8μl)，開始測序反應。開始注入后一秒鐘，以最大幀率(每秒30幀)記錄到一系列CCD圖像，并存儲包含最高信號密度的圖像。然后以0.4mM注入互補核苷酸dCTP，注入后一秒鐘，再次存儲一些CCD圖像。
當以“時間解析”的方式成像時，與非互補核苷酸(

圖1b)相比，互補核苷酸產生強信號(圖1a)。
權利要求
1.一種測定靶多核苷酸序列的方法，包括(i)在適合聚合酶反應進行的條件下，將靶多核苷酸與聚合酶、核苷酸A、T(U)、G和C中的一種接觸；(ii)測定聚合酶結合靶多核苷酸以及隨后解離的時間，由此確定聚合酶是否將核苷酸引入靶多核苷酸上；(iii)可選地，使用其他核苷酸重復步驟(i)和(ii)，由此確定靶多核苷酸的序列。
2.一種識別靶多核苷酸突變的方法，包括如下步驟(i)在適合聚合酶反應進行的條件下，將靶多核苷酸與聚合酶、核苷酸A、T(U)、G和C中的一種接觸；(ii)測定聚合酶結合靶多核苷酸以及隨后解離的時間，由此確定聚合酶是否將核苷酸引入靶多核苷酸上，參照靶標的原始序列確定是否存在突變。
3.根據權利要求1或2的方法，其中進行步驟(i)～(ii)時依次使用不同的核苷酸，直至檢測到核苷酸引入。
4.根據前述任一權利要求的方法，其中靶多核苷酸固定于支持材料上。
5.根據前述任一權利要求的方法，其中多種靶多核苷酸固定于支持材料上。
6.根據前述任一權利要求的方法，其中步驟(ii)通過測量施加的輻射進行。
7.根據前述任一權利要求的方法，其中步驟(ii)通過測量拉曼散射進行。
8.根據權利要求1～6之一的方法，其中步驟(ii)通過應用表面電磁波進行。
9.根據權利要求8的方法，其中表面電磁波為表面電漿波。
10.根據權利要求1～8之一的方法，其中通過測量表面電磁波進行檢測。
11.根據前述任一權利要求的方法，其中聚合酶包括附著于其上的可檢測標記。
12.根據權利要求11的方法，其中所述標記為熒光團。
13.根據引用權利要求1～6之一時的權利要求11的方法，其中聚合酶進一步包括能量供體標記或能量受體標記，并且其中步驟(ii)通過測量熒光團和能量供體或受體之間的能量轉移進行。
全文摘要
靶多核苷酸序列可通過以下步驟測定(i)在適合聚合酶反應進行的條件下，將靶多核苷酸與聚合酶、核苷酸A、T(U)、G和C中的一種接觸；(ii)測定聚合酶結合靶多核苷酸以及隨后解離的時間，由此確定聚合酶是否將核苷酸引入靶多核苷酸上；(iii)可選地，使用其他核苷酸重復步驟(i)和(ii)，由此確定靶多核苷酸的序列。
文檔編號C12Q1/68GK1852991SQ200480026931
公開日2006年10月25日 申請日期2004年7月26日 優(yōu)先權日2003年7月24日
發(fā)明者D·H·丹夏姆 申請人:醫(yī)學生物系統(tǒng)有限公司