專利名稱：環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖以及環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶和它們的制造方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖(以下、在本說明書中有時(shí)也簡單略稱為“環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖”)和環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶以及它們的制造方法及其用途和編碼該酶的DNA與含有該DNA的重組DNA，具體而言，涉及到環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖和環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶及其制造方法、生產(chǎn)環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的微生物、編碼該酶的DNA和含有該DNA的重組DNA和轉(zhuǎn)化體、使用該酶的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的生成方法和制造方法、以及含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的組成物。
背景技術(shù)：
作為以葡萄糖為構(gòu)成糖的糖，例如，已知有以淀粉作為原料制造的淀粉部分分解物的直鏈淀粉、淀粉糊精、麥芽糖糊精、麥芽低聚糖、異麥芽低聚糖等。已知這些糖通常在分子的兩端含有非還原性末端和還原性末端，表現(xiàn)出還原性。一般來說，淀粉部分分解物將每單位該固形物的還原能力的大小以作為葡萄糖當(dāng)量(Dextrose Equivalent、DE)表示。已知該值大的糖通常分子小，粘度低，甜味濃，但反應(yīng)性強(qiáng)，具有容易與氨基酸或蛋白質(zhì)等帶有氨基的物質(zhì)發(fā)生氨基羰基反應(yīng)，進(jìn)行褐變，發(fā)生惡臭，使品質(zhì)易劣化的性質(zhì)。為了改善這樣的缺點(diǎn)，人們從很早就期盼不改變淀粉部分分解物的構(gòu)成糖的葡萄糖，而使其還原能力降低或消除的方法。例如已知有象Journal of AmericanChemical Society、美國、1949年、第71卷、353至358頁報(bào)道的那樣，通過使macerans淀粉酶(macerans amylase)作用于淀粉，使6至8分子的葡萄糖生成通過α-1，4糖苷鍵鍵合的α-、β-或γ-環(huán)糊精的方法?，F(xiàn)在可從淀粉在工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)這些環(huán)糊精，這些環(huán)糊精可用于充分發(fā)揮它們具有的非還原性，而且無味，具有包合能力等特性的用途。另外，就像先前本申請人在特開平7-143876號公報(bào)、特開平7-213283號公報(bào)等中公開的那樣，已知有通過使非還原性糖合成酶以及海藻糖水解酶作用于麥芽低聚糖等淀粉部分分解物，使2分子葡萄糖生成通過α，α-1，1糖苷鍵結(jié)合的海藻糖的方法?，F(xiàn)在，已知由淀粉可以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)海藻糖，由于其非還原性溫和，可以在產(chǎn)生高品質(zhì)的甜味特性等用途中利用。另外，就像先前本申請人在國際公開WO01/90338A1號說明書、國際公開WO02/055708A1號說明書、國際公開WO02/40659A1號說明書等中公開的那樣，已知有通過使α-異麥芽糖基葡糖合成酶和α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶作用于淀粉或其部分分解物，生成具有4分子的葡萄糖通過α-1，3糖苷鍵和α-1，6糖苷鍵交互結(jié)合的結(jié)構(gòu)、即具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀四糖的方法。該環(huán)狀四糖由于具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，所以具有包合能力，在表現(xiàn)出可使揮發(fā)性有機(jī)物穩(wěn)定的作用的同時(shí)，還由于是非還原性糖，使氨基羰基反應(yīng)不發(fā)生，可預(yù)期在利用、加工中不用擔(dān)心褐變、劣化。
這樣一來，作為以葡萄糖為構(gòu)成糖的非還原性糖，具有葡萄糖聚合度為6至8的α-、β-、γ-環(huán)糊精、葡萄糖聚合度為2的α，α-海藻糖以及葡萄糖聚合度為4的環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀四糖，由于可充分發(fā)揮各自的特性，所以可以在各種領(lǐng)域中利用，如果在這些糖以外還可以提供以葡萄糖為構(gòu)成糖的非還原性糖，那么非還原性糖的選擇的范圍變寬，預(yù)期可以用于更多樣的用途中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明課題在于提供以葡萄糖為構(gòu)成糖的新型非還原性糖，在使非還原性糖的選擇范圍擴(kuò)展的同時(shí)，提供生成這樣的非還原性糖的新型酶以及它們的生成方法和制造方法、編碼該酶的DNA、含有該DNA的重組DNA和轉(zhuǎn)化體、以及含有這樣非還原性糖的組成物及其用途。
本發(fā)明人等為了解決上述課題，寄希望于可由淀粉部分分解物生成新型非還原性糖的全新的酶，所以一直在廣泛尋找產(chǎn)生這樣的酶的微生物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)從岡山縣岡山市的土壤新分離到了新的微生物、屬于節(jié)桿菌(Arthrobacter)屬的新型微生物M6株生產(chǎn)新的酶，通過這個(gè)新酶的作用，可以由淀粉或其部分分解物等α-1，4葡聚糖大量生成具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的新的環(huán)狀糖、即環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖。另外，在闡明環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的諸性質(zhì)的同時(shí)，確立了其制造方法，另外還確立了編碼該酶的DNA和含有該DNA的重組DNA和轉(zhuǎn)化體，以及確立了通過本酶生成環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的生成方法、以及使用本酶的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖或含有該糖的糖類的制造方法。另外還發(fā)現(xiàn)環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖可以很容易地從其過飽和水溶液中析出結(jié)晶、采集結(jié)晶，另外發(fā)現(xiàn)環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖具有包合甲醇、乙醇或醋酸等揮發(fā)成分的作用，不發(fā)生氨基羰基反應(yīng)，褐變或劣化少，對熱和pH穩(wěn)定，具有難消化性-難發(fā)酵性等有用的特性，可以很容易地制造環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖、或含有該糖的糖類的組成物，例如，味道好的高品質(zhì)食品、低熱量飲食食品或者減肥食品、穩(wěn)定且高品質(zhì)的化妝品、以及高活性且穩(wěn)定的醫(yī)藥品等，完成了本發(fā)明。
本發(fā)明通過提供具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的新的環(huán)狀糖、即環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖和生成該糖的新的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶及其生成方法和制造方法、還有編碼該酶的DNA和含有該DNA的重組DNA和轉(zhuǎn)化體、以及環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖或含有該糖的糖類的組成物和其用途，解決上述課題。
通過本發(fā)明在使以葡萄糖為構(gòu)成糖的非還原性糖的選擇范圍擴(kuò)展的同時(shí)，也可以大量地供應(yīng)以往未知的新的環(huán)狀糖、環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖，可用于以飲食物、化妝品、醫(yī)藥品為首的各種各樣的領(lǐng)域中。


圖1是表示非還原糖標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC洗脫圖。
圖2是表示分離的非還原性糖的1H-NMR譜圖。
圖3是表示法分離的非還原性糖質(zhì)的13C-NMR譜圖。
圖4是表示本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖結(jié)構(gòu)的圖。
圖5是表示環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的最適溫度的圖。
圖6是表示環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的最適pH的圖。
圖7是表示環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的溫度穩(wěn)定性的圖。
圖8是表示環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的pH穩(wěn)定性的圖。
圖9是表示重組DNA、pBMB1的圖。圖中，黑粗線表示的部分是編碼來自球形節(jié)桿菌M6(FERM BP-8448)的本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的DNA。
圖10是表示結(jié)晶環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的粉末X射線衍射圖。
圖11是表示結(jié)晶環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的熱重量曲線的圖。
符號說明a1位進(jìn)行α-1，4糖苷鍵結(jié)合的葡萄糖殘基b1位進(jìn)行α-1，6糖苷鍵結(jié)合的葡萄糖殘基f1(+)orif1噬菌體復(fù)制起點(diǎn)Amp氨芐青霉素抗性基因ColE1 ori大腸桿菌素E1復(fù)制起點(diǎn)具體實(shí)施方式
本發(fā)明所說的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖指的是4分子的葡萄糖通過α-1，4糖苷鍵和α-1，6糖苷鍵交互結(jié)合的環(huán)狀四糖、即具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀四糖。本糖是本發(fā)明人等在從土壤中得到的微生物的培養(yǎng)液中首次發(fā)現(xiàn)的以往未知的新糖，以葡萄糖為構(gòu)成糖的環(huán)狀的四糖只要是具有上述結(jié)構(gòu)不管其來源、形態(tài)、純度、制造方法都包含在本發(fā)明中。
本發(fā)明所說的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶指的是作用于葡萄糖聚合度3以上的α-1，4葡聚糖，通過將麥芽糖移到其它的α-1，4葡聚糖的非還原末端葡萄糖的6位的α-1，6轉(zhuǎn)移，生成6-α-麥芽糖基α-1，4葡聚糖，然后使其進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)，生成具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的整個(gè)酶。催化上述反應(yīng)的酶沒有其來源、形態(tài)、粗酶或純化酶之分都包含在本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶。
本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的酶活性可以象以下那樣進(jìn)行測定。使可溶性淀粉按照終濃度2w/v％那樣溶解于含有2mM氯化鈣的50mM醋酸緩沖液(pH6.0)，作為底物液，向該底物液0.5ml中加入0.5ml酶液，于40℃下進(jìn)行30分鐘酶反應(yīng)，將該反應(yīng)液于約100℃下加熱10分鐘，使反應(yīng)停止后，為了分解殘存可溶性淀粉或夾雜寡糖，按照每1克固形物添加α-糖苷酶4000單位，和按照1克固形物添加250單位葡萄糖淀粉酶后，于50℃下處理1小時(shí)，對該處理液中的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖量用后述實(shí)驗(yàn)1所述HPLC法進(jìn)行定量。環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的1個(gè)活性單位定義為在上述條件下，1分鐘內(nèi)生成1μ摩爾環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的酶量。
作為本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶具體例子，例如，具有下述理化性質(zhì)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶。
(1)分子量通過SDS-凝膠電泳法測得72000±20000道爾頓。
(2)等電點(diǎn)通過含有兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)電泳法測得pI3.6±0.5。
(3)最適溫度在pH6.0、反應(yīng)30分鐘的條件下，最適溫度在50℃至55℃范圍。
(4)最適pH在40℃、反應(yīng)30分鐘的條件下，最適pH在pH5.5至6.5范圍。
(5)溫度穩(wěn)定性在pH6.0、保持60分鐘的條件下，直至30℃都穩(wěn)定。
在1mM鈣離子存在下，直至50℃都穩(wěn)定。
(6)pH穩(wěn)定性在4℃、保持24小時(shí)的條件下，在pH5.0至9.0下穩(wěn)定。
而具有上述理化性質(zhì)的一個(gè)環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶不僅要具有上述理化性質(zhì)，而且作為N末端氨基酸序列，往往具有序列表中序列編號1所示的氨基酸序列。
本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶通常具有所定的氨基酸序列，作為其中一例，例如序列表中序列編號2表示的氨基酸序列或與其相同的氨基酸序列。作為具有與序列表中序列編號2所示氨基酸序列相同的氨基酸序列的變異體酶，在作用于葡萄糖聚合度3以上的α-1，4葡聚糖，生成環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的保持酶活性的范圍內(nèi)序列編號2所示氨基酸序列中缺失、置換或添加1個(gè)或2個(gè)以上氨基酸的氨基酸序列的酶通常對于序列編號2所示氨基酸序列具有60％以上、優(yōu)選70％以上、更優(yōu)選80％以上、進(jìn)一步優(yōu)選90％以上同源性的氨基酸序列的酶合適。
不過具有上述理化性質(zhì)或氨基酸序列的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶，說到底作為一個(gè)例子，具有與上述不同的理化學(xué)的性質(zhì)或氨基酸序列的酶只要是生成環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖，不用說也都包含在本發(fā)明中。
本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶雖然不受其來源限制，但作為理想的來源如微生物，特別是本發(fā)明人等從土壤分離的微生物M6株最適合。以下給出了具有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶產(chǎn)生能力的微生物M6株的鑒定試驗(yàn)結(jié)果。而鑒定試驗(yàn)是按照《微生物的分類和鑒定》(長谷川武治編、學(xué)會(huì)出版中心、1985年)進(jìn)行的。
<A細(xì)胞形態(tài)>
(1)肉汁瓊脂培養(yǎng)、27℃通常0.4×1.0至0.8×3.0μm的短桿菌～球菌。有多形性。具有運(yùn)動(dòng)性。無胞子。革蘭氏陽性。
(2)EYG瓊脂培養(yǎng)基、27℃表現(xiàn)出桿菌-球菌的繁殖周期。
<B培養(yǎng)性質(zhì)>
(1)肉汁瓊脂平板培養(yǎng)、27℃形狀圓形 大小在3天為1至2mm。
邊緣邊緣完整隆起半透鏡狀光澤鈍光(鈍光)表面平滑色調(diào)不透明、淡黃色(2)肉汁瓊脂斜面培養(yǎng)、27℃生育中等程度形狀線狀(3)肉汁明膠穿刺培養(yǎng)、27℃沒有液化。
<C生理學(xué)性質(zhì)>
(1)VP試驗(yàn)陰性(2)吲哚的生成陰性(3)淀粉的水解陽性(5)色素生成沒有可溶性色素生成(6)脲酶陰性(7)氧化酶陽性(8)過氧化氫酶陽性
(9)繁殖范圍pH5.5至10.0、溫度 15至37℃(10)對氧的態(tài)度好氧性(11)細(xì)胞壁的主要二氨基酸賴氨酸(12)細(xì)胞壁的肽聚糖型賴氨酸-丙氨酸(13)細(xì)胞壁的N-酰基型乙?；?14)細(xì)胞壁的構(gòu)成糖半乳糖、葡萄糖、鼠李糖(15)維生素的需求性無(16)DNA的GC含量70％(17)DNA-DNA同源性與球形節(jié)桿菌(ATCC8010)之間、表現(xiàn)出69.3％的DNA-DNA同源性。
根據(jù)以上菌學(xué)性質(zhì)，參考Bergey’s Manual of SystematicBacteriology、第2卷(1986年)，研究與公知菌的異同。結(jié)果判明本菌是屬于球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)的微生物。根據(jù)這些結(jié)果本發(fā)明人等將本菌命名為新的微生物球形節(jié)桿菌M6，于平成15年8月6日，保藏于日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6所在的獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心，以保藏編號FERM BP-8448保藏。
在本發(fā)明的具有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶產(chǎn)生能力的微生物中，上述菌包括原始菌、其變異株、還包括具有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶產(chǎn)生能力的重組體微生物的其它微生物、以及這些微生物的變異株等。
所謂本發(fā)明的DNA指的是編碼上述環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的所有DNA。本發(fā)明的DNA只要是編碼環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的DNA，無論是來自天然的，還是人為合成的DNA都可以。作為天然的來源，例如，包括球形節(jié)桿菌M6(FERM BP-8448)在內(nèi)的節(jié)桿菌屬的微生物，從這些菌體可以獲得包含本發(fā)明DNA的基因DNA。就是說，將這樣的微生物接種于營養(yǎng)培養(yǎng)基，于好氧條件下培養(yǎng)約1至3日后，從培養(yǎng)物采集菌體，通過溶菌酶或β-葡聚糖酶等細(xì)胞壁溶解酶或超聲波進(jìn)行處理，使含有該DNA的基因DNA溶出到菌體外。此時(shí)可并用蛋白酶等蛋白質(zhì)水解酶，也可以在使SDS等表面活性劑共存，進(jìn)行凍融。對這樣得到的處理物運(yùn)用例如酚抽提、醇沉淀、離心分離、核糖核酸酶處理等常規(guī)方法，可以得到目的基因DNA。對于人為合成本發(fā)明的DNA，例如，可以根據(jù)序列表中序列編號2所示氨基酸序列進(jìn)行化學(xué)合成。另外也可以有利實(shí)施將含有該DNA的基因DNA作為模板，使用可作為適當(dāng)引物的化學(xué)合成DNA，進(jìn)行PCR合成。
本發(fā)明的DNA通常具有所定堿基序列，作為其中一例，例如，序列表中序列編號3所示堿基序列或與其同源的堿基序列。作為具有與序列表中序列編號3所示堿基序列同源的堿基序列的變異體DNA，如具有在保持編碼的酶的活性的范圍內(nèi)，在序列編號3所示的堿基序列中缺失、置換或添加1個(gè)或2個(gè)以上堿基的堿基序列的DNA，通?？梢娤鄬τ谛蛄芯幪?所示堿基序列具有60％以上、優(yōu)選70％以上、更優(yōu)選80％以上、進(jìn)一步優(yōu)選90％以上同源性的堿基序列的DNA。另外、根據(jù)基因編碼的簡并性，不改變該編碼的酶的氨基酸序列，將1個(gè)或2個(gè)以上堿基置換為其它堿基的DNA當(dāng)然也包含在本發(fā)明的DNA中。
也可有利地實(shí)施將本發(fā)明的DNA插入到可自我復(fù)制的適當(dāng)載體后做成重組DNA。重組DNA通常由DNA和可自我復(fù)制的載體構(gòu)成，只要能夠獲得DNA，就可通過常規(guī)方法的重組DNA技術(shù)，比較容易地制備。作為這樣載體的例子，如pBR322、pUC18、Bluescript II SK(+)、pUB110、pTZ4、pC194、pHV14、TRp7、YEp7、pBS7等質(zhì)粒載體和λgt-λC、λgt-λB、ρ11、φ1、φ105等噬菌體載體。其中為了使本發(fā)明的DNA在大腸桿菌中表達(dá)，可優(yōu)選pBR322、pUC18、Bluescript IISK(+)、λgt-λC以及λgt-λB，另外為了在枯草菌中表達(dá)，可優(yōu)選pUB110、pTZ4、pC194、ρ11、φ1以及φ105。pHV14、TRp7、YEp7以及pBS7在使重組DNA于二種以上宿主內(nèi)復(fù)制時(shí)有用。為了將DNA插入到這樣的載體，通常采用在該領(lǐng)域中一般的方法。具體來說，首先將含有DNA的基因DNA和可自我復(fù)制的載體用制限酶和/或超聲波切斷，然后將生成的DNA片段和載體片段連接。如果使用特異作用于核苷酸的制限酶、特別是II型制限酶、詳細(xì)講，Sau 3AI、Eco RI、HindIII、Bam HI、Sal I、Xba I、Sac I、Pst I等切斷基因DNA和載體的切斷，容易對DNA片段和載體片段進(jìn)行連接。根據(jù)需要，將兩者進(jìn)行退火后，可以在生物體內(nèi)或生物體外經(jīng)DNA連接酶作用。這樣得到的重組DNA導(dǎo)入到適當(dāng)宿主后作為轉(zhuǎn)化體，通過對轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)，可以無限復(fù)制。
這樣得到的重組DNA可以導(dǎo)入到以大腸桿菌、枯草菌、放線菌、酵母為首的適當(dāng)宿主微生物。為了獲得轉(zhuǎn)化體，可以運(yùn)用菌落雜交法，或在含有葡萄糖聚合度在3以上的α-1，4葡聚糖的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，選擇由該糖生成環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的菌體。
在培養(yǎng)含有具有本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶產(chǎn)生能力的轉(zhuǎn)化體的微生物中使用的培養(yǎng)基只要是微生物能夠繁殖、可以產(chǎn)生環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的營養(yǎng)培養(yǎng)基就可以，無論是合成培養(yǎng)基，還是天然培養(yǎng)基都可以。作為碳源只要是微生物在繁殖中可利用的物質(zhì)都可以，例如，來自植物的淀粉或植物糖原、來自動(dòng)物或微生物的糖原或支鏈淀粉，這些物質(zhì)的部分分解物或葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、糖蜜等糖，另外也可以使用檸檬酸、琥珀酸等有機(jī)酸。培養(yǎng)基中的這些碳源的濃度可以根據(jù)碳源的種類適當(dāng)選擇。作為氮源，例如，可以適當(dāng)使用銨鹽、硝酸鹽等無機(jī)氮化合物以及，例如，尿素、玉米漿、酪蛋白、胨、酵母提取物、肉汁等含有機(jī)氮物。此外，作為無機(jī)成分，例如可以適當(dāng)使用鈣鹽、鎂鹽、鉀鹽、鈉鹽、磷酸鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、銅鹽、鉬鹽、鈷鹽等鹽類。另外根據(jù)需要也可以適當(dāng)使用氨基酸、維生素等。
培養(yǎng)通常從在溫度15至37℃、pH5.5至10的范圍、優(yōu)選溫度20至34℃、pH5.5至8.5的范圍中選出的條件下，進(jìn)行好氧培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間只要是該微生物可增殖的時(shí)間就可以，優(yōu)選10小時(shí)至150小時(shí)。另外對于培養(yǎng)條件中培養(yǎng)液的溶氧濃度沒有特別限制，通常0.5至20ppm比較好。為了進(jìn)行培養(yǎng)可以適當(dāng)采用調(diào)節(jié)通氣量，進(jìn)行攪拌等手段。另外培養(yǎng)方式無論是分批培養(yǎng)還是連續(xù)培養(yǎng)，哪一種都可以。
通過上述那樣操作對具有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶產(chǎn)生能力的微生物進(jìn)行培養(yǎng)后，對含有本發(fā)明的酶的培養(yǎng)物進(jìn)行回收。環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶活性在所培養(yǎng)的微生物為球形節(jié)桿菌M6(FERMBP-8448)時(shí)，主要在培養(yǎng)物的除菌液中確認(rèn)，可以將除菌液作為粗酶液采取，也可以將培養(yǎng)物全體用作粗酶液。為了從培養(yǎng)物中除去菌體，可以采用常規(guī)方法的固液分離法。例如，可以適當(dāng)采用對培養(yǎng)物本身進(jìn)行離心分離的方法、或使用多孔質(zhì)濾層過濾機(jī)等進(jìn)行過濾分離的方法、通過平膜、中空絲膜等膜過濾進(jìn)行分離的方法等。雖然可以將除菌液直接作為粗酶液使用，但一般都是濃縮后使用。作為濃縮法，可以采用硫銨鹽析法、丙酮和醇沉淀法、使用平膜、中空膜等膜濃縮法等。
另外使用具有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶活性的除菌液及其濃縮液，也可以將環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶通過在該領(lǐng)域中常用的適當(dāng)方法進(jìn)行固定化。例如，可以適當(dāng)采用對離子交換體的結(jié)合法、與樹脂及膜等的共價(jià)結(jié)合法-吸附法、使用高分子物質(zhì)的包埋法等。
象上述那樣，本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶可以直接使用粗酶液或濃縮后使用，根據(jù)需要，也可以通過該領(lǐng)域中常用的適當(dāng)?shù)姆椒ㄔ龠M(jìn)行分離、純化后利用。例如，培養(yǎng)液的上清或粉碎處理物進(jìn)行硫銨鹽析、對濃縮的酶標(biāo)準(zhǔn)品透析后、通過使用DEAE-Toyopearl650S樹脂的陰離子交換柱層析、接下來使用Phenyl-Toyopearl 650M樹脂的疏水層析進(jìn)行純化，可以得到作為在電泳后表現(xiàn)出單一帶的純化酶的本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶。
對于環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶為重組型酶時(shí)，因宿主種類不同有時(shí)酶會(huì)在菌體內(nèi)蓄積。這種情況下，也可以直接使用菌體或培養(yǎng)物，通常在使用之前，根據(jù)需要，也可適當(dāng)?shù)貙?shí)施通過浸透壓沖擊或表面活性劑從菌體提取后，通過超聲波或細(xì)胞壁溶解酶破碎菌體，通過過濾、離心分離等將重組型酶從菌體或菌體破碎物分離后使用。
象上述那樣得到的本發(fā)明環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶作用于葡萄糖聚合度3以上的α-1，4葡聚糖，可以生成具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖。本酶作用于葡萄糖聚合度3以上的α-1，4葡聚糖，推測通過在分子間進(jìn)行α-麥芽糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，可生成在非還原性末端葡萄糖的6位結(jié)合了α-麥芽糖基殘基的6-α-麥芽糖基-α-1，4葡聚糖，通過對該葡聚糖進(jìn)行環(huán)化，可以生成具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖。本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶具體來說往往具有下述理化性質(zhì)。
(1)分子量通過SDS-凝膠電泳法測得72000±20000道爾頓。
(2)等電點(diǎn)通過含有兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)電泳法測得pI3.6±0.5。
(3)最適溫度在pH6.0、反應(yīng)30分鐘的條件下，最適溫度范圍在50℃至55℃。
(4)最適pH在40℃、反應(yīng)30分鐘的條件下，最適pH范圍在pH5.5至6.5。
(5)溫度穩(wěn)定性在pH6.0、保持60分鐘的條件下，至30℃穩(wěn)定。
在1mM鈣離子存在下，至50℃穩(wěn)定。
(6)pH穩(wěn)定性在4℃、保持24小時(shí)的條件下，在pH5.0至9.0穩(wěn)定。
(7)N末端氨基酸序列具有序列表中序列編號1所示氨基酸序列、即天冬氨酸-脯氨酸-蘇氨酸-蘇氨酸-絲氨酸的氨基酸序列。
作為本發(fā)明環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶底物的葡萄糖聚合度3以上的α-1，4葡聚糖，如淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原等，以及用淀粉酶或酸等對它們進(jìn)行部分水解后得到的淀粉糊精、麥芽糖糊精、麥芽低聚糖等部分分解物。作為用淀粉酶分解的部分分解物，例如，可以使用用Handbook of Amylases and Related Enzymes(1988年)Pergamon Press公司(東京)所報(bào)道的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、麥芽四糖生成淀粉酶(EC 3.2.1.60)、麥芽五糖生成淀粉酶、麥芽六糖生成淀粉酶(EC 3.2.1.98)等淀粉酶將淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原等分解后得到的部分分解物。另外，在制備部分分解物時(shí)，也可任選使用支鏈淀粉酶(EC 3.2.1.41)、異淀粉酶(EC 3.2.1.68)等淀粉去分枝酶進(jìn)行作用。
作為底物的淀粉，例如，可以是來自玉米、小麥、米等地上淀粉，也可以是來自馬鈴薯、甘薯、木薯等地下淀粉，最好是將淀粉做成糊化和/或液化的溶液使用。由于該淀粉的部分分解的程度越低，環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖生成率越高，DE約20以下、優(yōu)選約12以下、更優(yōu)選約5以下的部分分解物合適。而本說明書中所謂的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖生成率指的是用公式環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖生成率(％)＝{(生成的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的質(zhì)量)/(反應(yīng)液中的全糖的質(zhì)量)}×100算出的值。
在使本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶作用于底物時(shí)，該底物濃度沒有特別限定，例如，即使在使用底物濃度0.1％(w/v)的比較低濃度的溶液的情況下，進(jìn)行本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶反應(yīng)也可生成環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖。工業(yè)上底物濃度在1％(w/v)以上合適，在這樣的條件下，有利生成環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖。而作為底物溶液，即使是含有不能完全溶解的不溶性底物的高濃度底物溶液也可以。反應(yīng)溫度可以在反應(yīng)進(jìn)行的溫度、即直至60℃附近進(jìn)行。優(yōu)選使用30至50℃附近的溫度。反應(yīng)pH通常調(diào)整到5至9范圍、優(yōu)選pH5至7范圍。酶的使用量和反應(yīng)時(shí)間關(guān)系密切，可以通過目的酶反應(yīng)的進(jìn)行適當(dāng)選擇。
例如，通過使本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶作用于底物濃度1％(w/v)的淀粉或其部分分解物或直鏈淀粉的水溶液，可以由淀粉或其部分分解物以約30％以上、由直鏈淀粉以約44％的高的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖生成率得到本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖。通過該環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶生成環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的生成機(jī)制推測如下。
1)本酶作用于作為底物的葡萄糖聚合度為3以上的α-1，4葡聚糖，催化該非還原性末端的麥芽糖基殘基轉(zhuǎn)移到另外的分子的非還原性末端葡萄糖殘基的6位羥基的分子間的6-α-麥芽糖基轉(zhuǎn)移，生成在非還原末端具有6-α-麥芽糖基的葡萄糖聚合度增加2的6-α-麥芽糖基-α-1，4葡聚糖以及葡萄糖聚合度減少2的α-1，4葡聚糖。
2)本酶另外作用于6-α-麥芽糖基-α-1，4葡聚糖，催化環(huán)化反應(yīng)，生成具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖以及由6-α-麥芽糖基-α-1，4葡聚糖出發(fā)計(jì)算，葡萄糖聚合度減少4的α-1，4葡聚糖。
3)有1)以及2)中新生成的α-1，4葡聚糖再度進(jìn)行1)至2)的反應(yīng)，據(jù)此生成環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖。
另外，該環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖生成反應(yīng)時(shí)，也可同時(shí)并用其它的酶，有利于使環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖生成率提高。例如，也可通過同時(shí)并用環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶和異淀粉酶等淀粉去分枝酶，使它們作用于淀粉可以有利于進(jìn)一步使環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的生成率提高。
通過上述反應(yīng)得到的反應(yīng)液也可以直接作為環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含有糖液使用。另外根據(jù)需要，使從α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶以及α-糖苷酶中選擇的1種或2種以上酶作用于環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含有糖液，也可以作為對夾雜的寡糖進(jìn)行水解的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含有糖液使用。一般來說，環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含有糖液可以進(jìn)一步精制后使用。作為精制方法，可以適當(dāng)采用糖精制中使用的通常方法，例如，適當(dāng)采用通過活性碳進(jìn)行脫色、通過H型、OH型離子交換樹脂的脫鹽、通過離子交換柱層析、活性碳柱層析、硅膠柱層析等柱層析的分級、通過醇和丙酮等有機(jī)溶劑的分級、通過具有適度分離性能的膜進(jìn)行分離、以及通過不能利用環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的可對夾雜糖消化吸收、分解的微生物、例如酵母等進(jìn)行發(fā)酵處理或通過堿處理等對殘存的還原性糖進(jìn)行分解除去等1種或2種以上的精制方法。
特別是作為工業(yè)大量生產(chǎn)方法，采用離子交換柱層析合適，例如，通過使用特開昭58-23799號公報(bào)、特開昭58-72598號公報(bào)等報(bào)道的強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂的柱層析除去夾雜糖，可以有利于制造使目的物含量提高的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖、或含有該糖的糖類。此時(shí)可任選采用固定床方式、移動(dòng)床方式、模擬移動(dòng)床方式中的任一種方式。
含有通過這樣操作得到的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的水溶液、或使其含量提高的糖水溶液通常是每單位固形物含有10質(zhì)量％以上、最好是40質(zhì)量％以上環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的糖水溶液，通常對其進(jìn)行濃縮，做成糖漿狀制品。該糖漿狀制品也可以隨意再進(jìn)行干燥做成粉末狀制品。
為了制造環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的結(jié)晶，例如，將每單位固形物的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖純度約50％以上、濃度約5至90質(zhì)量％的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含有液放到助晶罐，在每單位固形物0.1至20質(zhì)量％的種晶共存下，于溫度95℃以下、優(yōu)選10至90℃范圍下，邊攪拌邊慢慢冷卻，制造含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖結(jié)晶的結(jié)晶漿液。作為由結(jié)晶漿液制造環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖結(jié)晶的方法，如分蜜，另外作為制造環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的含蜜結(jié)晶的方法，例如，塊粉碎、流動(dòng)造粒、噴霧干燥等眾所周知的方法。這樣制造的本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖結(jié)晶或含蜜結(jié)晶為上品，而且是具有低甜味的非還原性白色粉末，是穩(wěn)定的糖，即使是與其它原料、特別是氨基酸、寡肽、蛋白質(zhì)等含有氨基酸的物質(zhì)進(jìn)行混合、加工，也不褐變，也不產(chǎn)生異臭，對混合的其它原料損害也少。
另外由于本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖具有包合能力，可防止包合的香氣成分、有效成分等揮散、品質(zhì)劣化，所以可非常穩(wěn)定地保持香氣成分、有效成分。此時(shí)根據(jù)需要，也可有利實(shí)施通過并用環(huán)糊精類、支化環(huán)糊精類，本申請人在專利文獻(xiàn)國際公開WO01/90338A1號說明書、國際公開WO02/055708A1號說明書、國際公開WO02/40659A1號說明書中公開的具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀四糖、分岐環(huán)狀四糖類、環(huán)糊精類、環(huán)果聚糖類等其它環(huán)狀糖，通過包合能力強(qiáng)化穩(wěn)定性。作為環(huán)糊精類等環(huán)狀糖，不必限定于高純度的糖，也可以有效利用低純度的環(huán)狀糖，例如，大量的麥芽糖糊精以及含有各種環(huán)狀糖的淀粉部分分解物等。
另外，本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖由于實(shí)質(zhì)上不能被淀粉酶或α-糖苷酶分解，所以即使經(jīng)口攝取也不能被消化吸收，另外難于被腸內(nèi)細(xì)菌發(fā)酵，作為極低熱量的糖，可以作為水溶性食物纖維樣物質(zhì)利用。本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖為粉末制品時(shí)，其本身的吸濕性低，不僅難于付著、固結(jié)，而且也可以防止與其它粉末混合后得到的粉末狀物的付著、固結(jié)。另外環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖本身是無毒、無害的新的甜味料。
另外本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖由于是穩(wěn)定的甜味料，在制作結(jié)晶制品時(shí)，也可與支鏈淀粉、羥乙基淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮等結(jié)合劑并用，作為片劑或糖衣片利用。另外，具備浸透壓調(diào)節(jié)性、賦形性、增光性、保濕性、粘性、防止其它糖的結(jié)晶性、難發(fā)酵性等性質(zhì)。
因此，本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖、或含有該糖的糖類作為甜味料、呈味改良劑、品質(zhì)改良劑、穩(wěn)定劑、變色防止劑、賦形劑等，在飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化妝品、醫(yī)藥品等各種組成物中有效利用。
本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖、或含有該糖的糖類以直接作為用于賦與甜味的調(diào)味料使用。如果需要，也可以與例如粉飴、葡萄糖、異構(gòu)化糖、砂糖、麥芽糖、海藻糖、蜂蜜、楓糖、山梨糖醇、麥芽糖醇、二氫查爾酮、蛇菊甙、α-葡糖基蛇菊甙、羅漢果甜味物、甘草甜、奇(異果)甜蛋白、蔗糖、L-天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精、甘氨酸、丙氨酸等那樣的其它甜味料，以及與糊精、淀粉、乳糖等那樣的增量劑混合使用。
另外，本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖、或含有該糖的糖類的粉末狀制品可直接、或根據(jù)需要隨意與增量劑、賦形劑、結(jié)合劑等混合后，做成顆粒、球狀、短棒狀、板狀、立方體、片劑等各種形狀后使用。
本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖、或含有該糖的糖類的甜味可以與具有酸味、咸味、澀味、鮮味、苦味等其它呈味的各種物質(zhì)充分調(diào)和，由于耐酸性、耐熱性都大，所以可以有效利用在一般飲食物的賦與甜味、呈味改良或品質(zhì)改良等中。
例如，在作為醬油、粉末醬油、豆醬、粉末豆醬、未過濾的醬油、醬菜、日式料酒、蛋黃醬、調(diào)味汁、食醋、三杯醋、粉末醋飯團(tuán)、中餐基料、天麩羅汁、面鹵、調(diào)味汁、番茄醬、燒肉的佐料汁、咖喱鹵、燜燉菜的佐料、湯的佐料、海味煎出的佐料、復(fù)合調(diào)味料、蜜柑、日式佐料酒、餐用糖、咖啡糖等各種調(diào)味料的甜味料、以及呈味改良劑、品質(zhì)改良劑等使用也可有利實(shí)施。另外在例如日式米餅、糯米點(diǎn)心、加糖點(diǎn)心、皮糖樣點(diǎn)心、餅類、饅頭、米粉糕、餡類、羊羹、水羊羹、錦玉、果凍、蛋糕、圓糖等各種日本點(diǎn)心，面包、餅干、椒鹽餅干、小糖餅、西式餡餅、布丁、奶油冰淇淋、蛋奶羹、奶油泡芙、華夫餅干、松糕、油炸餅、巧克力、口香糖、焦糖、果仁奶糖、糖果等各種西式點(diǎn)心，冰淇淋、雪糕等冰點(diǎn)心，果實(shí)的果子露汁，冰蜜等的糖漿類，花醬、花生醬、水果糊等糊類，果醬、桔子果醬、果脯、糖果等果實(shí)、野菜的加工食品類， 什錦醬菜、暴腌的甜面羅卜、千層咸菜、腌野韭菜等腌物類，腌羅卜的佐料、腌白菜的佐料等腌物的佐料、火腿、香腸等畜肉制品類、魚肉火腿、魚肉香腸、魚糕、筒狀魚卷、炸蝦(魚)等魚肉制品，海膽、咸墨斗魚、醋海帶、干魷魚絲、河豚的浸日式料酒風(fēng)干、大頭魚、加級魚、蝦等的魚松等各種海珍類，用海苔、山菜、墨魚干、小魚、貝等制造的用調(diào)料煮的魚類，煮豆、土豆色拉、海帶卷等家常菜食品，乳制品、魚肉、畜肉、果實(shí)、蔬菜的瓶裝、罐頭類，合成酒、釀造酒、清酒、果實(shí)酒、發(fā)泡酒、啤酒等酒類、咖啡、可可、果汁、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料等清涼飲料水，什錦布丁、什錦熱點(diǎn)心、速成的果汁、速成的咖啡、速成的粘糕小豆湯、速成的湯等速成食品，以及離乳食、治療食、飲劑、肽食品、冷凍食品等各種飲食物的賦與甜味、呈味改良、品質(zhì)改良等中也可以有利施用。
另外，使用于家畜、家禽、以及蜜蜂、蠶、魚等飼育動(dòng)物的飼料、餌料等的以嗜好性提高為目的，也可以使用。此外，作為向香煙、牙膏、口紅、唇膏、內(nèi)服液、片劑、口含片、肝油滴液、口中清涼劑、口中香劑、漱口劑等各種固形物、糊狀、液狀等中嗜好物、化妝品、醫(yī)藥品等各種組成物添加的甜味劑，或作為呈味改良劑、矯味劑，以及作為品質(zhì)改良劑、穩(wěn)定劑等有效利用。
作為品質(zhì)改良劑、穩(wěn)定劑，在含有有效成分、活性等易喪失的各種生理活性物質(zhì)或含有這些成分的健康食品、功能性食品、醫(yī)藥品等中有利運(yùn)用。例如，干擾素-α、-β、-γ、腫瘤壞死因子-α、-β、巨噬細(xì)胞游走抑制因子、菌落刺激因子、轉(zhuǎn)移因子、白介素II等淋巴因子含有液、胰島素、成長激素、催乳激素、促紅細(xì)胞生成素、卵細(xì)胞刺激激素等激素含有液、BCG疫苗、日本腦炎疫苗、麻疹疫苗、小兒麻痹疫苗、痘苗、破傷風(fēng)類毒素、眼鏡蛇抗毒素、人免疫球蛋白等生物制劑含有液、青霉素、紅霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素、硫酸卡那霉素等抗生素含有液、硫胺素、核黃素、L-抗壞血酸、肝油、類胡蘿卜素、麥角固醇、生育酚等維生素含有液、EPA、DHA、花生四烯酸等高度不飽和脂肪酸或其酯衍生物、含有脂肪酶、酯酶、尿激酶、蛋白酶、β-淀粉酶、異淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶等的含酶液、藥用人參提取物、甲魚提取物、小球藻提取物、蘆薈提取物、蜂膠提取物等提取物類、病毒、乳酸菌、酵母等活菌糊、蜂乳等各種生理活性物質(zhì)都不喪失其有效成分、活性，而且穩(wěn)定、高品質(zhì)的液狀、糊狀或固狀健康食品、功能性食品和醫(yī)藥品等可以容易地制造。
作為使上述那樣的各種組成物中含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖、或含有該糖的糖類的方法，包括直至其制品完成為止的工序，例如，可以適當(dāng)選擇混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、涂布、被覆、噴霧、注入、晶析、固化等眾所周知的方法。其量通常含有0.1質(zhì)量％以上、優(yōu)選1質(zhì)量％以上為好。
以下、通過實(shí)驗(yàn)對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
<實(shí)驗(yàn)1非還原性糖的制備>
將由淀粉部分分解物(商品名パインデックス#4、松谷化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制造)1.5w/v％、酵母提取物(商品名聚胨、日本制藥株式會(huì)社制造)0.5w/v％、酵母提取物(商品名酵母提取物S、日本制藥株式會(huì)社制造)0.1w/v％、磷酸氫二鉀0.1w/v％、磷酸鈉二水和物0.06w/v％、硫酸鎂七水和物0.05w/v％、碳酸鈣0.3w/v％以及水構(gòu)成的液體培養(yǎng)基加入到12個(gè)500ml容量的三角燒瓶中，每個(gè)燒瓶100ml，用高壓滅菌器于121℃、進(jìn)行20分鐘滅菌，冷卻。然后接種球形節(jié)桿菌M6(FERM BP-8448)，于27℃、用230rpm進(jìn)行120小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)后、將培養(yǎng)液通過離心分離(8,000rpm、20分鐘)除去菌體，得到培養(yǎng)上清(約1.1L)。將得到的1L培養(yǎng)上清用作酶液，將該酶液添加到含有2w/v％可溶性淀粉以及2mM氯化鈣的1L 50mM醋酸緩沖液中，于40℃下反應(yīng)24小時(shí)后、通過于約100℃下熱處理10分鐘停止反應(yīng)。
為了研究得到的反應(yīng)物中的糖，作為展開溶劑使用n-丁醇、吡啶、水混液(容量比6∶4∶1)，薄層板使用Merk公司生產(chǎn)的キ一ゼルゲル60(鋁板、10×20cm)，進(jìn)行2次展開的硅膠薄層層析(以下、略為TLC)，分離糖。通過硫酸-甲醇法使其顯色，對分離的糖進(jìn)行檢測，除了葡萄糖(Rg值為1.00)、麥芽糖(Rg值為0.82)之外，還檢測到Rg值為約0.44的糖以及Rg值為約0.21的糖。這些糖被認(rèn)為是球形節(jié)桿菌M6的培養(yǎng)上清中的酶作用于可溶性淀粉生成的糖。而這里所說的Rg值表示的是TLC中葡萄糖的移動(dòng)距離與溶質(zhì)的移動(dòng)距離的比值，可通過公式Rg值＝(溶質(zhì)從原點(diǎn)出發(fā)移動(dòng)的距離)/(葡萄糖離開從原點(diǎn)出發(fā)移動(dòng)的距離)算出。
然后將上述反應(yīng)物用鹽酸調(diào)整到pH5.0后，按照1克固形物添加4000單位的α-糖苷酶(商品名轉(zhuǎn)糖苷酶L“Amano”、Amano Enzyme株式會(huì)社制造)和按照1克固形物添加250單位葡萄糖淀粉酶(Nagase生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社銷售)，于50℃下使其反應(yīng)16小時(shí)。反應(yīng)后、在約100℃下進(jìn)行10分鐘熱處理，使反應(yīng)停止。當(dāng)對得到的反應(yīng)液中的糖用TLC進(jìn)行分析時(shí)，只檢測到葡萄糖以及Rg值約0.44的糖，而麥芽糖、Rg值約0.21的糖都沒有檢測到。由這些結(jié)果判明雖然麥芽糖以及Rg值約0.21的糖被α-糖苷酶和葡萄糖淀粉酶分解為葡萄糖，但Rg值約0.44的糖沒有被這些酶分解。
接下來向上述反應(yīng)液添加氫氧化鈉，將pH調(diào)整到12，通過于98℃下保持1小時(shí)，分解還原糖。將不溶物過濾除去后，使用三菱化學(xué)制造的離子交換樹脂Diaion SK-1B和Diaion WA30以及Organo制造的陰離子交換樹脂IRA411進(jìn)行脫色、脫鹽，精密過濾后，用蒸發(fā)器濃縮，進(jìn)行真空干燥，得到固形物約4.0g的糖粉末。
用高效液相層析法(以下、略稱為HPLC。)研究得到的糖的組成，就像圖1所示的那樣，可知在洗脫時(shí)間10.61分外檢測到峰，純度在97％以上，純度極高。HPLC在使用“Shodex SUGAR KS-801”為柱(昭和電工株式會(huì)社制造)，洗脫液使用水，柱溫度60℃、流速0.5ml/分的條件下進(jìn)行，檢測使用差示折射計(jì)RI-8012東洋曹達(dá)株式會(huì)社制造)進(jìn)行。
得到的糖的還原能力用Somogyi糖定量法進(jìn)行測定，其還原能力在檢測界限以下，本標(biāo)準(zhǔn)品被判斷為實(shí)質(zhì)上是非還原性糖。
<實(shí)驗(yàn)2非還原性糖的結(jié)構(gòu)解析>
<實(shí)驗(yàn)2-1質(zhì)量分析>
對于通過實(shí)驗(yàn)1方法得到的非還原性糖，使用質(zhì)量分析裝置“LCQAdvantage”(Thermoelectron公司制造)進(jìn)行質(zhì)量分析時(shí)，顯著地檢測到質(zhì)量數(shù)671的帶有鈉分子的離子，判明本發(fā)明的非還原性糖的質(zhì)量數(shù)為648。
<實(shí)驗(yàn)2-2構(gòu)成糖分析>
對于通過實(shí)驗(yàn)1方法得到的非還原性糖按照常規(guī)方法使用硫酸一直水解到單糖，用氣相色譜法研究構(gòu)成糖時(shí)，只檢測到D-葡萄糖，判明本發(fā)明的非還原性糖的構(gòu)成糖是D-葡萄糖?？紤]到上述的質(zhì)量數(shù)，可知本發(fā)明的非還原性糖是由4分子D-葡萄糖構(gòu)成的環(huán)狀糖。
<實(shí)驗(yàn)2-3甲基化分析>
對于通過實(shí)驗(yàn)1方法得到的非還原性糖，按照常規(guī)方法進(jìn)行甲基化分析，用氣相色譜法研究甲基化物。結(jié)果總結(jié)在表1中。


就像表1結(jié)果所表明的那樣，由于2，3，4-三甲基化物和2，3，6-三甲基化物幾乎等量，判明構(gòu)成本發(fā)明的非還原性糖的4分子D-葡萄糖中，2分子在1位和6位通過糖苷鍵結(jié)合，而其它2分子在1位和4位通過糖苷鍵結(jié)合。
<實(shí)驗(yàn)2-4核磁共振分析>
對于通過實(shí)驗(yàn)1方法得到的非還原性糖，按照常規(guī)方法進(jìn)行核磁共振(NMR)分析。1H-NMR譜如圖2所示，13C-NMR譜如圖3所示た。由實(shí)驗(yàn)2-1以及2-2的結(jié)果判明本非還原性糖質(zhì)是由4分子葡萄糖構(gòu)成的糖，而在13C-NMR譜中只確認(rèn)12條碳信號，判明本非還原性糖質(zhì)是具有對稱結(jié)構(gòu)的環(huán)狀四糖。而在1H-NMR譜的約4.93ppm的信號以及約5.26ppm的信號歸屬為D-葡萄糖殘基的1位質(zhì)子，求其自旋-自旋結(jié)合常數(shù)，為約3.309Hz(約4.93ppm的信號)以及約3.677Hz(約5.26ppm的信號)，所以可判明1，4糖苷鍵結(jié)合的D-葡萄糖殘基的1位的異頭物構(gòu)型以及1，6糖苷鍵結(jié)合的D-葡萄糖殘基的1位的異頭物構(gòu)型兩方都為α型。
由以上結(jié)果判明本發(fā)明的非還原性糖質(zhì)是圖4所示的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖、即具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀四糖。具有該結(jié)構(gòu)的糖到目前為止尚且完全未知，所以本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖是新的環(huán)狀糖。
<實(shí)驗(yàn)3環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的生產(chǎn)>
將實(shí)驗(yàn)1所述的液體培養(yǎng)基裝入到2個(gè)500ml容量的三角燒瓶中，每瓶100ml，用高壓滅菌器在121℃下進(jìn)行20分鐘滅菌，冷卻后接種球形節(jié)桿菌M6(FERM BP-8448)，于27℃下用230rpm進(jìn)行48小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)，以之作為種子培養(yǎng)。
將與種子培養(yǎng)同樣組成的液體培養(yǎng)基約20L加入到容量30L的發(fā)酵罐中，加熱滅菌、冷卻到溫度27℃后、接種種種培養(yǎng)液約200ml，于溫度27℃下持續(xù)保持pH5.5至8.0，進(jìn)行96小時(shí)通氣攪拌培養(yǎng)。培養(yǎng)后將培養(yǎng)液從發(fā)酵罐取出，離心分離(8000rpm，20分鐘)除去菌體，得到培養(yǎng)上清約18L。對于培養(yǎng)液和培養(yǎng)上清測定環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶活性，可知在培養(yǎng)液中含有該酶活性約0.028單位/ml，在上清中含有該酶活性約0.026單位/ml，判明通過球形節(jié)桿菌M6生產(chǎn)的本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶其大部分存在于菌體外。
<實(shí)驗(yàn)4環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的純化>
向?qū)嶒?yàn)3中得到的培養(yǎng)上清中的約9.2L(總活性約240單位)添加最終濃度為60％飽和硫銨，通過在4℃下放置24小時(shí)進(jìn)行鹽析。生成的鹽析沉淀物通過離心分離(11000rpm，30分鐘)回收，然后將該沉淀物溶解于10mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.5)后，對同一緩沖液進(jìn)行透析，得到粗酶液約240ml。粗酶液中的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶活性約0.83單位/ml(總活性約200單位)。將該粗酶液供給到通過使用東曹株式會(huì)社制的DEAE-Toyopearl 650S凝膠的陰離子交換層析(凝膠容量100ml)進(jìn)行分離。環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶活性吸附于用10mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.5)平衡的DEAE-Toyopearl650S凝膠，在用食鹽濃度0M至0.4M的線性梯度洗脫時(shí)，在食鹽濃度約0.22M付近洗脫?；厥赵摶钚约壏?，按照終濃度1M那樣添加硫銨，于4℃下放置24小時(shí)后，通過離心分離除去不溶物，通過供給到使用東曹株式會(huì)社制造的Pheny1-Toyopearl 650M凝膠的疏水層析(凝膠容量10ml)進(jìn)行分離。本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶活性吸附于用含有1M硫銨的20mM醋酸緩沖液(pH6.0)平衡的Pheny1-Toyopearl 650M凝膠上，用硫銨濃度1M至0M的線性梯度洗脫時(shí)，在硫銨濃度約0.1M付近洗脫。表2給出了純化的各步驟中的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶活性量、環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶比活性以及收率。


將疏水層析后純化的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶標(biāo)準(zhǔn)品通過5至20w/v％濃度梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定酶標(biāo)準(zhǔn)品的純度，蛋白帶單一，是純度高的標(biāo)準(zhǔn)品。
<實(shí)驗(yàn)5環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的性質(zhì)>
<實(shí)驗(yàn)5-1分子量>
將以實(shí)驗(yàn)4方法得到的精制環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶標(biāo)準(zhǔn)品通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(5乃至20w/v％濃度梯度)與同時(shí)電泳的分子量標(biāo)準(zhǔn)(日本Bio-Rad Laboratories公司)進(jìn)行比較，測定分子量，判明本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的分子量為72000±20000道爾頓。
<實(shí)驗(yàn)5-2等電點(diǎn)>
將通過實(shí)驗(yàn)4方法得到的純化環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶標(biāo)準(zhǔn)品供給含有2.2w/v％兩性電解質(zhì)(Amersham Biosciences公司制)的等電點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠電泳法，與同時(shí)電泳的等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)(AmershamBiosciences公司制)進(jìn)行比較求等電點(diǎn)，判明本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的等電點(diǎn)為pI3.6±0.5。
<實(shí)驗(yàn)5-3酶反應(yīng)的最適溫度以及最適pH>
使用通過實(shí)驗(yàn)4方法得到的純化環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶標(biāo)準(zhǔn)品，在本酶的活性測定法中分別使溫度、pH變化，測定溫度、pH對酶活性的影響。這些結(jié)果如圖5(最適溫度)、圖6(最適pH)所示。本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的最適溫度在pH6.0、30分鐘反應(yīng)的條件下為50至55℃，最適pH在40℃、30分鐘反應(yīng)的條件下為5.5至6.5。
<實(shí)驗(yàn)5-4酶的溫度穩(wěn)定性以及pH穩(wěn)定性>
使用通過實(shí)驗(yàn)4方法得到的純化環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶標(biāo)準(zhǔn)品，研究本酶的溫度穩(wěn)定性以及pH穩(wěn)定性。溫度穩(wěn)定性是通過將酶溶液(10mM醋酸緩沖液、pH6.0)在不存在氯化鈣或存在1mM條件下于各個(gè)溫度保持60分鐘，水冷后測定殘存的酶活性求得的。pH穩(wěn)定性是通過將本酶在各pH 100mM緩沖液中于4℃下保持24小時(shí)后，將pH調(diào)整到6.0，測定殘存的酶活性求得的。這些結(jié)果如第7圖(溫度穩(wěn)定性)、第8圖(pH穩(wěn)定性)所示。就像圖7表明的那樣，判明本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的溫度穩(wěn)定性在沒有氯化鈣存在下在30℃之前穩(wěn)定，在1mM氯化鈣存在下一直到50℃仍然穩(wěn)定，可知鈣離子可提高本酶的溫度穩(wěn)定性。另外就像圖8表明的那樣，本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的pH穩(wěn)定性處于pH5.0至9.0范圍。
<實(shí)驗(yàn)5-5金屬鹽對酶活性的影響>
使用通過實(shí)驗(yàn)4方法得到的純化環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶標(biāo)準(zhǔn)品，在濃度1mM的各種金屬鹽存在下，根據(jù)活性測定的方法研究金屬鹽對酶活性的影響。結(jié)果如表3所示。
表3

就像3的結(jié)果表明的那樣，判明本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶活性受Cu2+以及Hg2+離子顯著抑制，也受Al3+、Fe3+和Pb2+離子抑制。另外判明也受金屬離子螯合劑EDTA的抑制。
<實(shí)驗(yàn)5-6N末端氨基酸序列>
使用通過實(shí)驗(yàn)4方法得到的純化環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶標(biāo)準(zhǔn)品，使用蛋白質(zhì)測序儀型號492HT(Applied Biosystems公司制)分析本酶的N末端氨基酸序，判明了序列表中序列編號1表示的氨基酸序列、即具有天冬氨酸-脯氨酸-蘇氨酸-蘇氨酸-絲氨酸的N末端氨基酸序列。
<實(shí)驗(yàn)5-7部分氨基酸序列>
取適量通過實(shí)驗(yàn)4方法得到的純化環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶標(biāo)準(zhǔn)品，對10mM Tris-鹽酸緩沖液(pH9.0)在4℃下透析18小時(shí)后，加同一緩沖液，將蛋白濃度調(diào)整到約1mg/ml。取約1ml該溶液，加賴氨酰內(nèi)肽酶(和光純藥株式會(huì)社銷售)20μg，于30℃下保持16小時(shí)，對酶蛋白進(jìn)行水解。將水解物注入到預(yù)先用含有8％(v/v)乙腈的0.1％(v/v)三氟乙酸平衡的HPLC用柱(商品名マイクロボンダパックC18、直徑3.9mm×長150mm、Waters公司生產(chǎn))，在流速0.9ml/分鐘、室溫的條件下，用0.1％(v/v)三氟乙酸-8％(v/v)乙腈溶液至0.1％(v/v)三氟乙酸-40％(v/v)乙腈溶液的120分鐘線性梯度洗脫，對肽段進(jìn)行分級。從柱上洗脫的肽段通過測定波長210nm的吸光度進(jìn)行檢測。對在通液開始后約12分、約18分、約20分、約36分、約39分和約66分時(shí)洗脫的6種肽段的氨基酸序列分別用與實(shí)驗(yàn)5-6同樣的方法進(jìn)行分析，結(jié)果其分別具有序列表中序列編號4至9所示的氨基酸序列。
<實(shí)驗(yàn)6編碼環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的DNA的克隆以及含有該DNA的重組DNA和轉(zhuǎn)化體的制備>
從球形節(jié)桿菌M6(FERM BP-8448)克隆編碼環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的DNA，制作可自我復(fù)制的重組DNA、確定編碼酶的DNA的堿基序列、以及進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的制備。
<實(shí)驗(yàn)6-1染色體DNA的制備>
將由淀粉部分分解物(商品名パインデックス#4、松谷化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制造)2.0w/v％、酵母提取物(商品名アサヒミ一スト、アサヒフ一ドアンドヘルスケア株式會(huì)社銷售)1.0w/v％、磷酸氫二鉀0.1w/v％、磷酸二氫鈉十二水鹽0.06w/v％、硫酸鎂七水鹽0.05w/v％以及水構(gòu)成的液體培養(yǎng)基加入到500ml容量的三角燒瓶中，每個(gè)燒瓶100ml，用高壓滅菌器于121℃、進(jìn)行20分鐘滅菌，冷卻。然后接種球形節(jié)桿菌M6(FERM BP-8448)，于27℃、用230rpm進(jìn)行24小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)。
將通過離心分離從培養(yǎng)物采集的菌體懸浮于TES緩沖液(pH8.0)中，加0.05％(w/v)溶菌酶，于37℃下溫育30分鐘。將處理物于-80℃下冷凍1小時(shí)后，加TSS緩沖液(pH9.0)，加溫到60℃，加TES緩沖液/酚混合液，于冰水中邊冷卻，邊激烈振蕩5分鐘后，通過離心分離收集上清。向該上清加2倍容量的冷乙醇，收集沉淀的粗染色體DNA，溶解于SSC緩沖液(pH7.1)后，分別加7.5μg和125μg的核糖核酸酶以及蛋白酶，于37℃下保持1小時(shí)，使其反應(yīng)。向反應(yīng)物中加氯仿/異戊醇混合液，提取染色體DNA，加冷乙醇，收集含有生成的染色體DNA的沉淀。將上述得到的精制染色體DNA按照濃度約1mg/ml那樣溶解于SSC緩沖液(pH7.1)中，在-80℃下冷凍。
<實(shí)驗(yàn)6-2重組DNApBMB 1和轉(zhuǎn)化體BMB1的制備>
取0.1ml實(shí)驗(yàn)6-1制備的純化染色體DNA溶液，向該溶液中加約100單位制限酶BamHI，于37℃下反應(yīng)1小時(shí)，對染色體DNA進(jìn)行水解后，通過瓊脂糖凝膠電泳法獲得由約3000至6000堿基對構(gòu)成的DNA片段。另外，按照常規(guī)方法，使制限酶BamHI作用于質(zhì)粒載體(Stratagene·cloning·system制、注冊商標(biāo)Bluescript II SK(+))，將載體完全切斷后使用市售的試劑盒(寶酒造制、商品名DNA連接試劑盒)按照附帶的說明書進(jìn)行操作，將切斷的質(zhì)粒載體0.5μg與先前得到的DNA片段約5μg連接。使用得到的重組DNA，通過通常的感受態(tài)細(xì)胞法對感受態(tài)細(xì)胞(商品名Epicurian ColiXL2-Blue、Stratagene·cloning·system制)100μl進(jìn)行轉(zhuǎn)化，制作基因文庫。
將作為上述那樣得到的基因文庫的轉(zhuǎn)化體接種于通過常規(guī)方法制備的含有10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、5g/l氯化鈉、100mg/l氨芐青霉素鈉鹽、50mg/l的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷的瓊脂平板培養(yǎng)基(pH7.0)上，于37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，將培養(yǎng)基上形成的白色菌落約4000個(gè)固定在尼龍膜(商品名Hybond-N+、Amersham制)上。另外根據(jù)在實(shí)驗(yàn)5-7方法中說明的序列表中序列編號7所示氨基酸序列中的第4至第13位的氨基酸序列，化學(xué)合成具有5′-GACGTSGTSCCSAACCACACSGCSGACTAC-3′所示的堿基序列的寡核苷酸，根據(jù)常規(guī)方法使用[γ-32P]ATP以及T4聚核苷酸激酶進(jìn)行同位素標(biāo)記，得到作為探針1的合成DNA。運(yùn)用通常的菌落雜交法，選擇先前得到的固定在尼龍膜上的菌落中的表現(xiàn)出與探針1顯著結(jié)合的菌落，得到5種轉(zhuǎn)化體。
然后根據(jù)序列表中序列編號8所示氨基酸序列中的第1至第10位的氨基酸序列，化學(xué)合成具有5′-GACTGGGTSGACATGGGSTTCGACGGSATC-3′所示堿基序列的寡核苷酸，與上述同樣進(jìn)行同位素標(biāo)記，得到作為探針2的合成DNA。通過常規(guī)方法從上述5種轉(zhuǎn)化體中提取重組DNA，運(yùn)用通常的Southern雜交，選擇表現(xiàn)出與探針2顯著結(jié)合的重組DNA，將具有該重組DNA的轉(zhuǎn)化體命名為BMB1。
將該轉(zhuǎn)化體BMB1根據(jù)常規(guī)方法接種于含有100μg/ml氨芐青霉素鈉鹽的L-肉湯培養(yǎng)基(pH7.0)，于37℃下進(jìn)行24小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心分離從培養(yǎng)物中收集菌體，運(yùn)用通常的堿-SDS法提取重組DNA。通過通常的雙脫氧法分析這個(gè)重組DNA的堿基序列，該重組DNA含有來自球形節(jié)桿菌M6(FERM BP-8448)的帶有序列表中序列編號10所示鏈長4467堿基對的堿基序列的DNA。就像圖9所示那樣，在這個(gè)重組DNA中，該DNA連接在被制限酶BamHI識(shí)別部位的下游。另外，由該堿基序列推定的氨基酸序列就像并記在那個(gè)序列編號10那樣，該氨基酸序列與用實(shí)驗(yàn)5-6的方法確認(rèn)的本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的N末端氨基酸序列以及用實(shí)驗(yàn)5-7的方法闡明的部分氨基酸序列的序列表中序列編號1以及序列編號4至9所示氨基酸序列進(jìn)行比較，序列表中序列編號1所示氨基酸序列與并記在序列表中序列編號10的氨基酸序列中的第41至第45位的氨基酸序列完全一致。而序列表中序列編號4、5、6、7、8以及9所示氨基酸序列分別與并記在序列表中序列編號10所示堿基序列的氨基酸序列中的第418至第426位、第405至第417位、第323至第332位、第164至第190位、第241至265位和第333至第362位的氨基酸序列完全一致。以上事實(shí)表明本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶是含有序列表中序列編號2所示氨基酸序列的酶，該酶表示在球形節(jié)桿菌M6(FERM BP-8448)中是被序列表中序列編號3所示堿基序列的DNA編碼的酶。而并記在序列表中序列編號10中的氨基酸序列的第1至第40位的氨基酸序列推定為該酶的分泌信號配列。由這些事實(shí)可以判明該酶分泌前的前體由并記在序列表中序列編號10的氨基酸序列構(gòu)成，該氨基酸序列由序列表中序列編號10所示堿基序列編碼。象以上那樣制備的、確認(rèn)堿基序列的重組DNA被命名為pBMB1。
<實(shí)驗(yàn)7通過轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶>
將由10g/l淀粉部分分解物(商品名パインデックス#4、松谷化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社銷售)、20g/l聚胨、20g/l酵母提取物以及1g/l磷酸氫二鈉十二水鹽和水構(gòu)成的液體培養(yǎng)基加入到500ml容量的三角燒瓶，每個(gè)瓶100ml，用高壓滅菌器在121℃下進(jìn)行20分鐘滅菌，冷卻后有無菌條件下調(diào)整到pH7.0后，在無菌條件下添加氨芐青霉素鈉鹽10mg，制備液體培養(yǎng)基。在該液體培養(yǎng)基中接種用實(shí)驗(yàn)6-2的方法得到的轉(zhuǎn)化體BMB1，于27℃下進(jìn)行約48小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)。按照常規(guī)方法對得到的培養(yǎng)物進(jìn)行離心分離，分離為培養(yǎng)上清和菌體，進(jìn)行回收。對于菌體通過超聲波破碎法制備來自細(xì)胞的全提取物。超聲波破碎法是通過將菌體懸浮于10mM磷酸緩沖液(pH7.0)后，將該菌體懸濁液在冰水中冷卻，通過超聲波勻漿器(型號UH-600、株式會(huì)社SMT制)進(jìn)行細(xì)胞破碎，該破碎物作為全細(xì)胞提取物。
對于上述那樣制備的培養(yǎng)上清和全細(xì)胞提取物，測定各自的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶活性，將各自的活性值按照每1ml培養(yǎng)物換算。另外，作為對照，將大腸桿菌XL2-Blue株在與上述轉(zhuǎn)化體情況的同一條件進(jìn)行培養(yǎng)，由培養(yǎng)物制備培養(yǎng)上清和全細(xì)胞提取物，同樣測定環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶活性。表4給出了這些測定結(jié)果。


表中BMBI以及E.coli分別指的是轉(zhuǎn)化體BMB1和大腸桿菌XL2-Blue株。
就像表4的結(jié)果所表明的那樣，判明轉(zhuǎn)化體BMB1在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶。在作為宿主對照的大腸桿菌中，培養(yǎng)上清、全細(xì)胞提取物任一部分都沒有表現(xiàn)出該酶活性。
將用實(shí)驗(yàn)7的方法得到的全細(xì)胞提取物再按照實(shí)驗(yàn)4所示的方法，進(jìn)行鹽析、透析，供給到使用DEAE-Toyopearl 650S凝膠、Phenyl-Toyopearl 650M凝膠的柱層析進(jìn)行純化，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)5所示的方法對這個(gè)純化酶標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析。結(jié)果通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測得的分子量約72000±20000道爾頓、通過等電點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠電泳法測得的等電點(diǎn)約3.6±0.5、環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶活性的最適溫度約50至55℃、最適pH約5.5至6.5、溫度穩(wěn)定性在沒有氯化鈣存在下在30℃之前穩(wěn)定，而在有1mM氯化鈣存在下在約50℃之前穩(wěn)定，pH穩(wěn)定性在約5.0至9.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定。這些理化性質(zhì)與用實(shí)驗(yàn)4所示方法制備的酶的性質(zhì)實(shí)質(zhì)上一致。以上結(jié)果表明運(yùn)用重組DNA技術(shù)可以很好地制造本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶，而且酶的產(chǎn)率也有意義提高。
<實(shí)驗(yàn)8對各種糖的作用>
使用各種糖，研究本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的底物特異性。制備含有麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖、新海藻糖、海藻糖、曲二糖、黑曲霉糖、異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖、異潘糖、麥芽糖醇、麥芽三糖醇、α-、β-或γ-環(huán)糊精、直鏈淀粉、可溶性淀粉、糖原、支鏈淀粉或糊精的水溶液。向這些底物溶液添加最終濃度20mM醋酸緩沖液(pH6.0)和最終濃度1mM氯化鈣后，按照每1克固形物分別加1單位向底物中加通過實(shí)驗(yàn)4方法得到的純化環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶標(biāo)準(zhǔn)品，將底物濃度調(diào)整到2w/v％，使其在40℃、pH6.0條件下作用24小時(shí)。將酶反應(yīng)前后的反應(yīng)液用實(shí)驗(yàn)1所述的TLC法進(jìn)行分析，確認(rèn)酶對各個(gè)糖有無作用或作用的強(qiáng)度。結(jié)果如表5所示。


注)在酶反應(yīng)前后-表示沒有變化+表示底物的點(diǎn)稍有減少，確認(rèn)有其它生成物++表示底物的點(diǎn)減少很多，確認(rèn)有其它生成物+++表示底物的點(diǎn)幾乎消失，確認(rèn)有其它生成物就像表5的結(jié)果所表明的那樣，本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶很好地作用于試驗(yàn)的糖中的麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖，而對麥芽三糖稍有作用。另外，本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶對于直鏈淀粉、淀粉、糖原也能很好作用。由這些結(jié)果判明本酶作用于葡萄糖聚合度3以上的α-1，4葡聚糖。
<實(shí)驗(yàn)9作用機(jī)制>
<實(shí)驗(yàn)9-1由麥芽四糖生成的生成物>
將最終濃度20mM醋酸緩沖液(pH6.0)和最終濃度1mM氯化鈣加到最終濃度1w/v％的麥芽四糖水溶液后，按照每1克底物固形物加1單位的通過實(shí)驗(yàn)4方法得到的純化環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶，在40℃、pH6.0下使其作用，按照一定時(shí)間間隔取樣，于100℃下保持10分鐘，停止反應(yīng)。采用HPLC法測定該酶反應(yīng)液的糖組成。HPLC使用YMC Pack ODS-AQ303(株式會(huì)社ヮイ·ェム·シ一制造)柱、洗脫液使用水，在柱溫度40℃、流速0.5ml/分的條件下進(jìn)行，檢測使用差示折射計(jì)RID-10A(株式會(huì)社島津制作所制造)。表6給出了其結(jié)果。


表中的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖指的是62-O-α-環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖，判明糖X為來自下面實(shí)驗(yàn)9-3的α-麥芽糖基麥芽四糖(別名64-O-α-環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖)。
就像表6的結(jié)果所表明的那樣，可以判明本酶作用的結(jié)果由底物麥芽四糖在反應(yīng)初期(反應(yīng)1小時(shí))顯著生成麥芽糖和糖X。另外也知道可生成少量的麥芽六糖、環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖以及麥芽糖基麥芽糖苷(62-α-麥芽糖基麥芽糖苷、非環(huán)狀)。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，這些生成糖中麥芽糖和環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖蓄積量顯著，麥芽糖基麥芽糖量也有少量增加。另外判明糖質(zhì)X以及麥芽六糖的生成量在反應(yīng)4小時(shí)之前增加，4小時(shí)以后減少。如果由這些結(jié)果推測，在反應(yīng)初期，本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶作用于麥芽四糖，主要生成麥芽糖和糖X，隨著反應(yīng)進(jìn)行，本酶作用于糖質(zhì)X，生成環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖，糖X被認(rèn)為是來自麥芽四糖的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖生成反應(yīng)的中間體。由于麥芽糖基麥芽糖和麥芽六糖同時(shí)生成，所以推定本酶是以麥芽糖單位催化糖轉(zhuǎn)移的酶，糖X也被推定為通過麥芽糖基轉(zhuǎn)移的生成物。
<實(shí)驗(yàn)9-2糖X的分離>
對被認(rèn)為由麥芽四糖生成環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的反應(yīng)的反應(yīng)中間體糖X進(jìn)行分離。向終濃度1w/v％的2L麥芽四糖水溶液中加最終濃度為20mM醋酸緩沖液(pH6.0)和最終濃度1mM氯化鈣后、按照每1克底物固形物加1單位的通過實(shí)驗(yàn)4方法得到的純化環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶，在40℃、pH6.0下使酶作用4小時(shí)后，在100℃下保持10分鐘，使反應(yīng)停止。然后通過預(yù)試驗(yàn)確認(rèn)糖質(zhì)X沒有被β-淀粉酶分解后，將上述得到的反應(yīng)液調(diào)整到pH5.5，按照每1克底物固形物加5單位的β-淀粉酶(Sigma公司制)，在50℃下處理16小時(shí)，將反應(yīng)液中殘存的麥芽四糖分解為麥芽糖。將反應(yīng)液在100℃下保持10分鐘，使反應(yīng)停止，將不溶物過濾除去后、用三菱化學(xué)制造的離子交換樹脂Diaion WA30進(jìn)行脫色、脫鹽，再用三菱化學(xué)制陽離子交換樹脂Diaion SK-1B和Organo公司制陰離子交換樹脂IRA411S進(jìn)行脫色、脫鹽，精密過濾后，用蒸發(fā)器進(jìn)行濃縮，作為分級原料。將該原料供給分級用HPLC柱YMC-Pack ODS-A R355-15S-1512A(株式會(huì)社ヮイ·ェム·シイ制)進(jìn)行純化，從來自上述麥芽四糖的反應(yīng)物可得到純度99.3％以上的糖X標(biāo)準(zhǔn)品，固形物收率約6.7％。
<實(shí)驗(yàn)9-3糖X的結(jié)構(gòu)解析>
<實(shí)驗(yàn)9-3-1環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的生成試驗(yàn)>
向通過實(shí)驗(yàn)9-2的方法得到的糖X精制標(biāo)準(zhǔn)品水溶液(最終濃度1w/v％)加最終濃度20mM醋酸緩沖液(pH6.0)和最終濃度1mM氯化鈣后、按照每1克底物固形物加1單位的通過實(shí)驗(yàn)4方法得到的純化環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶，在40℃、pH6.0下使酶作用24小時(shí)，在100℃下保持10分鐘，使反應(yīng)停止后，采用實(shí)驗(yàn)1所述的TLC法和HPLC法進(jìn)行分析，對生成物進(jìn)行研究，判明主要生成麥芽糖和環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖，確認(rèn)糖X是環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖生成反應(yīng)的中間體。
<實(shí)驗(yàn)9-3-2質(zhì)量分析>
對于采用實(shí)驗(yàn)9-2的方法得到的糖X精制標(biāo)準(zhǔn)品，用實(shí)驗(yàn)2-1所述方法進(jìn)行了質(zhì)量分析，顯著檢測到質(zhì)量數(shù)1013的添加鈉的分子離子，判明糖X的質(zhì)量數(shù)為990，由該質(zhì)量數(shù)可知糖X是由6分子D-葡萄糖構(gòu)成的。
<實(shí)驗(yàn)9-3-3用支鏈淀粉酶進(jìn)行的分解試驗(yàn)>
使支鏈淀粉酶(株式會(huì)社林原生物化學(xué)研究所制造)作用于采用實(shí)驗(yàn)9-2的方法得到的糖X精制標(biāo)準(zhǔn)品的水溶液(最終濃度1w/v％)，進(jìn)行分解試驗(yàn)。按照1克底物固形物加1單位支鏈淀粉酶，在40℃、pH6.0下使酶作用24小時(shí)，在100℃下保持10分鐘停止反應(yīng)后，通過實(shí)驗(yàn)1所述的TLC法和HPLC法進(jìn)行分析，對生成物進(jìn)行了研究，判明生成了麥芽糖和麥芽四糖。即，判明糖X具有麥芽糖分子和麥芽四糖分子通過α-1，6糖苷鍵結(jié)合的結(jié)構(gòu)。
<實(shí)驗(yàn)9-3-4甲基化分析>
用通過實(shí)驗(yàn)9-2的方法得到的糖X標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行甲基化分析，用氣相色譜法對甲基化物進(jìn)行研究。結(jié)果歸納在表7中。


就像表7的結(jié)果所表明的那樣，由于2，3，4-三甲基化物、2，3，6-三甲基化物和2，3，4，6-四甲基化物比率約1∶4∶1，所以判明構(gòu)成糖X的6分子葡萄糖中，1分子是在1位和6位通過糖苷鍵結(jié)合的葡萄糖，4分子是在1位和4位通過糖苷鍵結(jié)合的葡萄糖，另外1分子是僅在1位通過糖苷鍵結(jié)合的葡萄糖。另外，由該結(jié)果判明麥芽糖和麥芽四糖經(jīng)α-1，6結(jié)合得到糖X中的1，6糖苷鍵存在于非還原末端葡萄糖殘基。
由以上結(jié)果判明通過本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶由麥芽四糖生成的糖X是環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖生成反應(yīng)的中間體，其結(jié)構(gòu)是麥芽糖基與麥芽四糖的非還原末端葡萄糖殘基的6位羥基進(jìn)行了α結(jié)合的6糖，是結(jié)構(gòu)式1表示的α-麥芽糖基麥芽四糖(64-α-麥芽糖基麥芽四糖)。
結(jié)構(gòu)式1α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-D-Glcp由以上事實(shí)可以認(rèn)為利用本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖生成的反應(yīng)機(jī)制象以下那樣。
1)本酶作用于作為底物的葡萄糖聚合度為3以上的α-1，4葡聚糖，催化該非還原性末端的麥芽糖基殘基轉(zhuǎn)移到另外的α-1，4葡聚糖分子的非還原性末端葡萄糖殘基的6位羥基的分子間的6-α-麥芽糖基轉(zhuǎn)移，生成在非還原末端具有6-α-麥芽糖基的葡萄糖聚合度增加2的6-α-麥芽糖基-α-1，4葡聚糖以及葡萄糖聚合度減少2的麥芽低聚糖。
2)本酶另外作用于6-α-麥芽糖基-α-1，4葡聚糖，催化環(huán)化反應(yīng)，生成具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖以及根據(jù)6-α-麥芽糖基-α-1，4葡聚糖計(jì)算，葡萄糖聚合度減少4的麥芽低聚糖。
3)本酶也稍微催化分子間的4-α-麥芽糖基轉(zhuǎn)移，由麥芽低聚糖可生成少量的葡萄糖聚合度增加2的麥芽低聚糖和葡萄糖聚合度減少2的麥芽低聚糖。
<實(shí)驗(yàn)10由各種底物生成環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖>
使用各種糖通過本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的作用進(jìn)行環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖生成的試驗(yàn)。制備麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、直鏈淀粉、可溶性淀粉、淀粉部分分解物(商品名パインデックス#100、松谷化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制)、糖原(來自玉米、キュ一ピ一株式會(huì)社制)溶液。
向這些水溶液(最終濃度1.0w/v％)中加最終濃度20mM醋酸緩沖液(pH6.0)和最終濃度1mM氯化鈣后，每1克固形物加1單位的通過實(shí)驗(yàn)4方法得到的純化環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶標(biāo)準(zhǔn)品，使酶在40℃、pH6.0下作用48小時(shí)后，將該反應(yīng)液在100℃下加熱10分鐘使反應(yīng)停止。與實(shí)驗(yàn)1同樣進(jìn)行α-糖苷酶-葡萄糖淀粉酶處理后用HPLC法對環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖進(jìn)行定量，求環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的生成率。這些結(jié)果表示在表8中。


就像表8的結(jié)果所表明的那樣，從試驗(yàn)的任一個(gè)糖都可以通過環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的作用生成環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖。其生成率當(dāng)?shù)孜餅辂溠咳菚r(shí)低到約0.6％，與此相反當(dāng)?shù)孜餅橹辨湹矸蹠r(shí)最高至約42％，然后依次為麥芽六糖、麥芽庚糖。由可溶性淀粉、淀粉部分分解物以及糖原都可以以30％程度的生成率生成環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖。
<實(shí)驗(yàn)11環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖生成反應(yīng)和反應(yīng)產(chǎn)物的還原能力>
向可溶性淀粉的水溶液(最終濃度1.0w/v％)加最終濃度20mM醋酸緩沖液(pH6.0)和最終濃度1mM氯化鈣后、每1克固形物加1單位的通過實(shí)驗(yàn)4方法得到的純化環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶標(biāo)準(zhǔn)品，使它們在40℃、pH6.0下反應(yīng)，酶剛添加后立刻取樣，立即在約100℃下加熱10分鐘停止反應(yīng)，進(jìn)行水冷，得到反應(yīng)0小時(shí)的反應(yīng)液。然后在反應(yīng)1、2、3、4小時(shí)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，立即在約100℃下加熱10分鐘停止反應(yīng)，進(jìn)行水冷，得到反應(yīng)1小時(shí)、反應(yīng)2小時(shí)、反應(yīng)3小時(shí)、反應(yīng)4小時(shí)各個(gè)時(shí)間的反應(yīng)液。對得到的反應(yīng)液的還原糖量用Somogyi糖定量法進(jìn)行測定，總?cè)橇坑幂焱ㄟM(jìn)行測定，將還原糖量占總?cè)橇康谋壤冒俜致?％)表示，作為還原能力。另外對反應(yīng)液與實(shí)驗(yàn)1同樣進(jìn)行α-糖苷酶-葡萄糖淀粉酶處理后，用HPLC法對環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖進(jìn)行定量，求環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的生成率。這些結(jié)果歸納在表9中。
表9

就像表9結(jié)果所表明的那樣，使本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶作用于可溶性淀粉，使環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖生成時(shí)，環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的生成率即使在10％以上時(shí)，判明還原能力的增加也僅僅為0.2％程度。該事實(shí)意味著本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶本質(zhì)上是催化轉(zhuǎn)移-環(huán)化反應(yīng)的酶，在這些反應(yīng)時(shí)幾乎不伴隨著水解。使本酶作用于淀粉或其分解物等，使環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖生成時(shí)，將反應(yīng)前的淀粉或其分解物的還原能力、即DE降低，由于增加的還原能力很少，可知得到了還原能力低的生成物。
<實(shí)驗(yàn)12影響環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖生成的異淀粉酶的添加效果>
制備淀粉部分分解物(商品名パインデックス#100、松谷化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制)水溶液(最終濃度1w/v％)，加最終濃度20mM醋酸緩沖液(pH6.0)和最終濃度1mM氯化鈣后，1克固形物加1單位的通過實(shí)驗(yàn)4方法得到的純化環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶標(biāo)準(zhǔn)品，對1克固形物加0、125、250、500、1250或2500單位的異淀粉酶(株式會(huì)社林原生物化學(xué)研究所制)，于40℃、pH6.0下使酶作用48小時(shí)后，在100℃熱處理10分鐘，使酶失活。然后與實(shí)驗(yàn)1同樣用α-糖苷酶以及葡萄糖淀粉酶對反應(yīng)液進(jìn)行處理后，用HPLC法對環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖進(jìn)行定量，求環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖生成率。這些結(jié)果如表10所示。


就像表10結(jié)果所表明的那樣，判明通過添加異淀粉酶，環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的生成率增加。
<實(shí)驗(yàn)12液化淀粉DE對環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖生成的影響>
將玉米淀粉做成濃度2質(zhì)量％淀粉乳，向該淀粉乳加0.1質(zhì)量％碳酸鈣，調(diào)整到pH6.0，每克淀粉加0.2、0.4、0.6、1.0、1.5或2.0質(zhì)量％α-淀粉酶(商品名タ一マミ一ル60L、ノボ社制造)，分別在95℃下使其反應(yīng)10分鐘，然后在120℃下進(jìn)行高壓滅菌，急冷至約40℃，得到DE3.1至20.4的表11表示的6種淀粉液化液。向這些淀粉液化液(最終濃度1質(zhì)量％)按照1克固形物加1單位的通過實(shí)驗(yàn)4方法得到的純化環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶標(biāo)準(zhǔn)品，在40℃、pH6.0下使酶作用48小時(shí)后，對該反應(yīng)液煮沸10分鐘，使反應(yīng)停止。為了研究這些熱失活的反應(yīng)液中的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的生成量，與實(shí)驗(yàn)1同樣添加α-糖苷酶和葡萄糖淀粉酶，使其反應(yīng)后，用HPLC法對環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖進(jìn)行定量，求環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖生成率。表11給出了這些結(jié)果。


就像表11結(jié)果所表明的那樣，判明利用本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的生成率受到液化淀粉的DE的影響，DE越是低值，環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的生成率越高，相反，DE越是高值，環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的生成率越低。具體來說，判明液化淀粉的DE在約20以下、優(yōu)選DE約8以下、更優(yōu)選DE約5以下合適。
<實(shí)驗(yàn)14結(jié)晶環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的制備>
向作為最終濃度分別含有1.25w/v％、20mM、1mM的直鏈淀粉(株式會(huì)社林原生物化學(xué)研究所制)、醋酸緩沖液(pH6.0)以及氯化鈣的水溶液16L中按照1克固形物加1單位的通過實(shí)驗(yàn)4方法得到的純化環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶標(biāo)準(zhǔn)品，使酶在40℃、pH6.0下作用90小時(shí)后，將反應(yīng)液在約98℃下加熱10分鐘，使反應(yīng)停止。用實(shí)驗(yàn)1所述的方法對得到的反應(yīng)液進(jìn)行葡萄糖淀粉酶處理，通過用氫氧化鈉進(jìn)行堿處理，對還原糖進(jìn)行分解后，進(jìn)行過濾脫色、脫鹽、精密過濾、濃縮、真空干燥，得到固形物約80.5g的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖粉末。用HPLC法進(jìn)行分析，環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的純度為98.9％。
將得到的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖粉末(固形物36g)加到144g的水中，加溫到約90℃，使環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖完全溶解后，在約25℃下靜置2天，生成結(jié)晶狀物質(zhì)。對得到的含有結(jié)晶狀物質(zhì)的液體進(jìn)行過濾，將結(jié)晶狀物質(zhì)回收在濾紙上，然后用少量水洗凈后，收集結(jié)晶狀物質(zhì)，于常溫常壓下風(fēng)干，得到21.8g的結(jié)晶狀粉末。用HPLC法進(jìn)行分析，環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的純度在99.9％以上，為極高純度。
對于得到的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的結(jié)晶狀粉末使用X射線衍射裝置RAD-IIX(株式會(huì)社リガク制)進(jìn)行粉末X射線衍射測定，就像圖10所示那樣，得到了作為主要的衍射角(2θ)，特征為5.6°、9.3°、16.5°以及27.1°的粉末X射線衍射圖。另外對該結(jié)晶狀粉末的水分用Karl Fischer法進(jìn)行了測定，可知水分為12.8質(zhì)量％，判明是1分子環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含有5分子水的含水結(jié)晶。
另外，對該環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的結(jié)晶粉末進(jìn)行了熱重量測定，導(dǎo)電率圖11所示的熱重量曲線，由該重量變化與溫度的關(guān)系可以看到在直至溫度約100℃的上升中減少相當(dāng)于5分子水的重量，另外還看到從溫度約280℃附近開始認(rèn)為環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖本身熱分解的重量減少。從這些事實(shí)可判明本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含水結(jié)晶在常壓下，由于使溫度上升至100℃，每一結(jié)晶分子脫去5分子的水，變成了無水物。
<實(shí)驗(yàn)15環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖對水的飽和濃度>
為了研究在溫度25℃下環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖對水的飽和濃度，將10ml水加到帶密封栓的玻璃制容器中，向容器中加通過實(shí)驗(yàn)14的方法得到的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含水結(jié)晶粉末，加的量為完全溶解的量以上的量，將玻璃容器密封，在達(dá)到飽和之前，在溫度25℃下邊保溫邊攪拌2天。將該環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖飽和溶液進(jìn)行精密過濾，除去不溶的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖后，通過乾燥減量法研究該濾液的水分，求飽和濃度，判明在溫度25℃下環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖對水的飽和濃度約8.0質(zhì)量％。
<實(shí)驗(yàn)16環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的甜度>
將通過實(shí)驗(yàn)14的方法得到的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含水結(jié)晶粉末溶于去離子水中，作成固形物濃度5質(zhì)量％的水溶液，將該水溶液作為甜度試驗(yàn)溶液。另外制備蔗糖(市售細(xì)粒糖)0.5至5質(zhì)量％水溶液，作為對照。經(jīng)5名專門人員進(jìn)行官能試驗(yàn)，推定環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的甜度約為蔗糖的20％，判明環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖是低甜味的糖。
<實(shí)驗(yàn)17環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的熱穩(wěn)定性>
將通過實(shí)驗(yàn)14方法得到的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含水結(jié)晶粉末溶解于水中，制備濃度7w/v％的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖水溶液，將該溶液8ml加到玻璃制試管中，密封后在120℃下加熱30至90分鐘。放冷后進(jìn)行這些溶液的著色度測定研究和采用HPLC法的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的純度測定。480nm的1cm池中的吸光度作為著色度。結(jié)果如表12所示。


就像表12的結(jié)果所表明的那樣，環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖水溶液即使加熱到120℃的高溫也不著色，沒有看到由于分解使得純度降低，判明環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖是對熱穩(wěn)定的糖。
<實(shí)驗(yàn)18環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的pH穩(wěn)定性>
將通過實(shí)驗(yàn)14方法得到的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含水結(jié)晶粉末溶解于各種緩沖液(20mM)中，制備將環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖調(diào)整到濃度4w/v％、pH調(diào)整到2至9的表13所述的8種環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖水溶液。取各個(gè)溶液8ml分別加到玻璃試管中，密封后在100℃下加熱24小時(shí)。放冷后與實(shí)驗(yàn)17同樣進(jìn)行這些溶液著色度的測定和用HPLC法進(jìn)行環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的純度測定。結(jié)果如表13所示。


就像表13的結(jié)果所表明的那樣，環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖水溶液即使在100℃的高溫下加熱24小時(shí)，在pH2至9很寬的范圍內(nèi)也不著色，只是在pH2，環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖有少量被分解，雖然發(fā)現(xiàn)純度降低，但在pH3至9的范圍內(nèi)沒有完全分解，判明即使環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖在很寬的pH范圍內(nèi)煮沸，也是非常穩(wěn)定的糖。
<實(shí)驗(yàn)19氨基羰基反應(yīng)>
將通過實(shí)驗(yàn)14方法得到的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含水結(jié)晶粉末溶解于水中，再加市售試劑特級的甘氨酸和磷酸緩沖液，制備用50mM磷酸緩沖液調(diào)整到pH8.0的含有0.5w/v％甘氨酸的2.5w/v％環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖水溶液。作為對照，除了取代環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含水結(jié)晶粉末使用麥芽糖以外，與上述同樣操作制備麥芽糖水溶液。將各個(gè)溶液4ml取到玻璃試管中，密封后在100℃下加熱30至90分鐘。于室內(nèi)放冷后、測定它們的著色度，研究氨基羰基反應(yīng)性。著色度為1cm池的480nm的吸光度。結(jié)果如表14所示。


就像表14的結(jié)果所表明的那樣，對照的麥芽糖如果在甘氨酸共存下加熱，著色，引起褐變。而本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖即使在甘氨酸共存下加熱，也不著色，不發(fā)生褐變，判明是難于引起氨基羰基反應(yīng)(美拉德反應(yīng))的穩(wěn)定的糖。
<實(shí)驗(yàn)20氨基羰基反應(yīng)>
將用實(shí)驗(yàn)14方法得到的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含水結(jié)晶粉末和市售聚胨(日本制藥制)溶于去離子水中，制備含有5w/v％聚胨的5w/v％環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖溶液。作為對照，除了使用麥芽糖取代環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含水結(jié)晶粉末以外，其它與上述同樣操作制備麥芽糖水溶液。將各個(gè)溶液4ml加到玻璃試管中，密封后在120℃下加熱30至90分鐘。室內(nèi)放冷后，測定它們的著色度，研究氨基羰基反應(yīng)性。同時(shí)將只含有聚胨的溶液作為空白，同樣進(jìn)行加熱。著色度為480nm的1cm池的吸光度，將空白吸光度作為減去的值。結(jié)果如表15所示。


就像表15的結(jié)果所表明的那樣，對照麥芽糖在聚胨共存下一旦加熱，則著色、發(fā)生褐變。而環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖即使在聚胨共存下加熱也不著色，也不發(fā)生褐變，判明是難于引起氨基羰基反應(yīng)的穩(wěn)定的糖。
<實(shí)驗(yàn)21環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的包合作用>
將通過實(shí)驗(yàn)14的方法得到的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含水結(jié)晶粉末溶于去離子水，制備8質(zhì)量％水溶液。向每100g的該水溶液分別加作為香氣成分的具體例子、甲醇1.2g、乙醇1.7g或醋酸2.2g后進(jìn)行包合。然后分別進(jìn)行過濾，將濾液冷凍干燥，除去未包合物。作為對照，使用已知具有包合能力的支化環(huán)糊精(商品名Isoelite P、マルハ株式會(huì)社銷售)進(jìn)行同樣操作。為了測定冷凍干燥粉末中的包合物量，將各個(gè)冷凍干燥粉末1g溶于5ml水中，然后加入5ml的二乙醚，進(jìn)行提取，再度重復(fù)提取后、用氣相色譜法對二乙醚中的提取物進(jìn)行定量。結(jié)果如表16所示。


就像表16結(jié)果所表明的那樣，判明環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖具有包合能力，其包合能力與分支環(huán)糊精相比，如果用甲醇，每單位重量約強(qiáng)1.3倍、如果用乙醇約強(qiáng)0.5倍、如果用醋酸約強(qiáng)0.8倍。
<實(shí)驗(yàn)22環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的消化性試驗(yàn)>
使用通過實(shí)驗(yàn)14方法得到的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含水結(jié)晶粉末，根據(jù)日本營養(yǎng)糧食學(xué)會(huì)志、第43卷、第23至29頁(1990)所述岡田等人的方法，研究試管內(nèi)的唾液淀粉酶、人工胃液、胰液淀粉酶、小腸粘膜酶對環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的消化性。作為對照，使用已知的難消化糖麥芽糖醇。結(jié)果如表17所示。


就像表17結(jié)果所表明的那樣，可知環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖完全不能被唾液淀粉酶、人工胃液、胰液淀粉酶以及小腸粘膜酶中任一個(gè)酶消化，判明是極難消化的糖。
<實(shí)驗(yàn)23環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的發(fā)酵性試驗(yàn)>
使用通過實(shí)驗(yàn)14方法得到的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含水結(jié)晶粉末，根據(jù)Journal of Nutritional Science and Vitaminology、第37卷、529至544頁(1991年)所述的奧等人的方法，研究大鼠盲腸內(nèi)容物引起的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的發(fā)酵性。盲腸內(nèi)容物使用在乙醚麻醉下處死Wistar系雄大鼠，厭氧條件下采集，懸浮于4倍量的0.1M碳酸氫鈉水溶液的懸濁液。每單位盲腸內(nèi)容物重量添加約7質(zhì)量％環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖，用氣相色譜法對剛添加后和12小時(shí)后殘存的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖量進(jìn)行定量。其結(jié)果表明，剛添加后的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖濃度每1克盲腸內(nèi)容物為68.5mg，12小時(shí)后的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖濃度每1克盲腸內(nèi)容物為63.0mg，可知約92％沒有被發(fā)酵仍然殘存著，判明環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖是極難被發(fā)酵的糖。
<實(shí)驗(yàn)24急性毒性試驗(yàn)>
使用小鼠，將通過實(shí)驗(yàn)14方法得到的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖經(jīng)口給予，進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。其結(jié)果表明環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖是低毒性物質(zhì)，即使是在可給予的最大給予量也沒有看到死亡例，其LD50值在5g/kg-小鼠體重以上。
由以上的實(shí)驗(yàn)22至24的結(jié)果表明，環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖即使經(jīng)口攝取，也難于被消化、吸收，作為無熱量乃至低熱量的可食原料，可以有利地用作飲食甜味料、高甜度甜味料的賦形劑、飲食飲食物的增粘劑、增量劑、賦形劑、以及食物纖維、脂肪替代食品材料等。
以下實(shí)施例1至6給出了本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖以及含有該糖的糖類的制造方法，實(shí)施例7至23給出了含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖以及含有該糖的糖類的組成物。
實(shí)施例1將球形節(jié)桿菌M6(FERM BP-8448)按照實(shí)驗(yàn)3方法進(jìn)行種子培養(yǎng)。然后向容量30L的發(fā)酵罐中加約20L的由淀粉部分分解物(商品名パインデックス#100、松谷化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制造)3.0w/v％、大豆肽(商品名ハイニュ一トSMS、不二制油株式會(huì)社制造)3.6w/v％、磷酸氫二鉀0.1w/v％、磷酸二氫鈉二水鹽0.06w/v％、硫酸鎂七水鹽0.05w/v％、碳酸鈣0.3w/v％以及水構(gòu)成的液體培養(yǎng)基，加熱滅菌，冷卻，達(dá)到溫度27℃后，接種種子培養(yǎng)液1v/v％，保持在溫度27℃、pH5.5至8.0，進(jìn)行96小時(shí)通氣培養(yǎng)。培養(yǎng)后使用SF膜進(jìn)行除菌過濾，回收約18L的培養(yǎng)濾液，再將該濾液用UF膜濃縮，回收得到含有3.8單位/ml的本發(fā)明的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的濃縮酶液約1L。
實(shí)施例2將馬鈴薯淀粉乳做成濃度約1質(zhì)量％淀粉乳，然后按照終濃度為1mM那樣加氯化鈣，調(diào)整到pH6.0，在95℃加熱約20分鐘，進(jìn)行糊化，然后冷卻至約40℃，按照最后每1克淀粉固形物0.26ml(約1單位)的比例加入通過實(shí)施例1方法得到的含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的濃縮酶液，于pH6.0、溫度40℃下反應(yīng)48小時(shí)。將該反應(yīng)液加熱到95℃，保持30分鐘后冷卻，將過濾后得到的濾液按照常規(guī)方法用活性碳脫色，通過H型以及OH型離子交換樹脂進(jìn)行脫鹽、純化和濃縮，以每單位固形物收率約90％得到濃度65質(zhì)量％的含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的糖漿。本品每單位固形物含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖31.4質(zhì)量％、麥芽糖2.2質(zhì)量％、麥芽三糖1.5質(zhì)量％以及其它糖65.9質(zhì)量％，低還原性，具有溫和的甜味、適度的粘度、保濕性、包合性，作為甘味料、呈味改良劑、品質(zhì)改良劑、瀝水防止劑、穩(wěn)定劑、變色防止劑、賦形劑、包合劑、粉末化基材等可在各種飲食物、化妝品、醫(yī)藥品等各種組成物中有效利用。
實(shí)施例3將木薯淀粉做成濃度約1質(zhì)量％淀粉乳，然后按照終濃度為0.1質(zhì)量％加入碳酸鈣，調(diào)整到pH6.0，然后按照每克淀粉固形物終濃度為0.2質(zhì)量％加入α-淀粉酶(ノボ社制造、商品名『タ一マミ一ル60L，在95℃反應(yīng)10分鐘，然后在120℃下進(jìn)行20分鐘高壓滅菌，再急冷至約40℃，得到DE約3的液化溶液，向該液化溶液按照1克淀粉固形物0.26ml(約1單位)加用實(shí)施例1方法得到的含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的濃縮液和按照1克淀粉固形物1000單位的比例加異淀粉酶(株式會(huì)社林原生物化學(xué)研究所制造)，在pH6.0、溫度40℃下反應(yīng)48小時(shí)反應(yīng)。將該反應(yīng)液加熱到95℃，并保持30分鐘后進(jìn)行冷卻，將過濾得到的濾液按照常規(guī)方法用活性碳進(jìn)行脫色，通過H型和OH型離子交換樹脂進(jìn)行脫鹽后進(jìn)行純化，再進(jìn)行濃縮，得到每單位固形物含有41.1％環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的濃度60質(zhì)量％的糖漿。將得到的糖漿作為糖液，使用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂(アンバ一ライトCR-1310、Na型、Organo株式會(huì)社制造)進(jìn)行柱層析分級。將樹脂填充到內(nèi)徑5.4cm的4根帶保溫套的不銹鋼柱，成串聯(lián)排列，樹脂層全長20m。柱內(nèi)溫度維持在60℃，按照對樹脂的5v/v％加糖液，然后使60℃的溫水通過SV0.13流過柱子進(jìn)行分級，用HPLC法監(jiān)測洗脫液的糖組成，收集含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖級分的低分子級分，進(jìn)行純化、濃縮、噴霧干燥，以每單位固形物收率約54％獲得含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的粉末。本品每單位固形物含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖63.2質(zhì)量％、麥芽糖7.4質(zhì)量％、麥芽三糖6.2質(zhì)量％、以及其它糖23.2質(zhì)量％，為低還原性，具有溫和的甜味、適度的粘度、保濕性、包合性，作為甜味料、呈味改良劑、品質(zhì)改良劑、瀝水防止劑、穩(wěn)定劑、變色防止劑、賦形劑、包合劑等可在各種飲食物、化妝品、醫(yī)藥品等各種組成物中有效利用。
實(shí)施例4將玉米淀粉做成濃度約1質(zhì)量％淀粉乳，然后按照終濃度0.1質(zhì)量％加碳酸鈣，調(diào)整到pH6.0，然后按照每克淀粉固形物終濃度0.2質(zhì)量％加入α-淀粉酶(商品名ネオスピタ一ゼ、ナガセ生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制)，在85至90℃反應(yīng)20分鐘，然后在120℃下進(jìn)行20分鐘高壓滅菌，再急冷至約40℃，得到DE約3的液化溶液，向該液化溶液按照1克淀粉固形物0.26ml(約1單位)加用實(shí)施例1方法得到的含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的濃縮液和按照1克淀粉固形物1000單位的比例加異淀粉酶(株式會(huì)社林原生物化學(xué)研究所制造)，在pH6.0、溫度40℃下反應(yīng)48小時(shí)。將該反應(yīng)液加熱到95℃，保持30分鐘后，調(diào)整到pH 5.0、溫度50℃，然后向該反應(yīng)液中按照最終1克淀粉100單位的比例加葡糖淀粉酶(商品名グルコチ一ム、ナガセ生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制)，于pH5.0、溫度50℃下反應(yīng)16小時(shí)。將該反應(yīng)液加熱到95℃，保持30分鐘後，進(jìn)行冷卻，將過濾得到的濾液按照常規(guī)方法用活性碳進(jìn)行脫色，通過H型和OH型離子交換樹脂進(jìn)行脫鹽后進(jìn)行純化，再進(jìn)行濃縮，以每單位固形物收率約95％得到60質(zhì)量％的含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的糖漿。本品每單位固形物含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖42.6質(zhì)量％、葡萄糖53.0質(zhì)量％以及其它糖4.4質(zhì)量％，具有溫和的甜味、適度的粘度、保濕性、包合性，作為甜味料、呈味改良劑、品質(zhì)改良劑、瀝水防止劑、穩(wěn)定劑、變色防止劑、賦形劑、包合劑、粉末化基材等可在各種飲食物、化妝品、醫(yī)藥品等各種組成物中有效利用。
實(shí)施例5將用實(shí)施例4方法得到的含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的糖漿按照常規(guī)方法加氫，對還原性糖進(jìn)行糖醇化、純化、濃縮、真空干燥、粉碎，以每單位固形物收率約90％得到環(huán)含有狀麥芽糖基麥芽糖的粉末。本品每單位固形物含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖42.6質(zhì)量％、山梨糖醇53.2質(zhì)量％、以及其它糖醇4.2質(zhì)量％，實(shí)質(zhì)上沒有表現(xiàn)出還原能力，難于引起氨基羰基反應(yīng)，為低還原性，具有溫和的甜味、適度粘度、保濕性、包合性，可作為甘味料、呈味改良劑、品質(zhì)改良劑、瀝水防止劑、穩(wěn)定劑、變色防止劑、賦形劑、包合劑等在各種飲食物、化妝品、醫(yī)藥品等各種組成物有效利用。
實(shí)施例6將通過實(shí)施例4方法得到的含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的糖漿作為原糖液，為了提高環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的含量，按照實(shí)施例3的方法使用鹽型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂進(jìn)行柱層析，對環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖高含有級分進(jìn)行收集、純化，以每單位固形物收率約40％得到每單位固形物約90質(zhì)量％的含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖高含有液。將本溶液邊濃縮、邊使其連續(xù)析出結(jié)晶，將得到的結(jié)晶漿液用籃型離心分離機(jī)進(jìn)行分蜜，將結(jié)晶用少量水進(jìn)行噴霧、洗滌、溫風(fēng)干燥，以每單位固形物約25％的收率得到高純度的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含水結(jié)晶。本品是純度99％以上的純度極高的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含水結(jié)晶，還原性極低，難引起氨基羰基反應(yīng)，也不表現(xiàn)出吸濕性，處理容易，具有溫和的低甜味、適度的粘度、保濕性、包合性、難消化性，可作為甘味料、低熱量食品素材、呈味改良劑、風(fēng)味改良劑、品質(zhì)改良劑、瀝水防止劑、穩(wěn)定劑、變色防止劑、賦形劑、包合劑、粉末化基材等，可在各種飲食物、化妝品、醫(yī)藥品等各種組成物、以及工業(yè)試藥、化學(xué)原料等中有效利用。
實(shí)施例7<甜味料>
將通過實(shí)施例6方法得到的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含水結(jié)晶0.8質(zhì)量份與海藻糖含水結(jié)晶(株式會(huì)社林原商事銷售，注冊商標(biāo)トレハ)0.2質(zhì)量份、α-葡萄糖基蛇菊甙(東洋精糖株式會(huì)社銷售，商品名αG甜味劑)0.01質(zhì)量份、以及L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲基酯(商品名阿斯巴甜)0.01質(zhì)量份均一混合，經(jīng)顆粒成型機(jī)加工得到顆粒狀甜味料。本品甜味的質(zhì)量優(yōu)越，甜度約為蔗糖的2倍。本品的熱量由于環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖難消化性、難發(fā)酵性，所以實(shí)質(zhì)上為低熱量，甚至無熱量。而且室溫保存下、也不用擔(dān)心變質(zhì)劣化，很穩(wěn)定。因此本品作為高品質(zhì)的低熱量、低蛀齒性甜味料很合適。
實(shí)施例8<硬糖>
將濃度55％蔗糖溶液100質(zhì)量份和通過實(shí)施例4方法得到的含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的糖漿50質(zhì)量份加熱混合，在減壓下加熱濃縮至水分不足2％，然后與檸檬酸0.6質(zhì)量份和適量的檸檬香料和著色料混和，按照常規(guī)方法進(jìn)行成型，得到制品。本品口感、呈味、味道都很好，也不會(huì)引起蔗糖的析出結(jié)晶，吸濕性少，也不引起滴流，是穩(wěn)定且高品質(zhì)的硬糖。
實(shí)施例9<口香糖>
將口香糖的橡膠基料3質(zhì)量份加熱溶融至變得柔軟的程度，然后加無水麥芽糖醇2質(zhì)量份、木糖醇2質(zhì)量份、通過實(shí)施例6方法得到的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含水結(jié)晶2質(zhì)量份、以及海藻糖含水結(jié)晶1質(zhì)量份和適量的香料以及著色料，并進(jìn)行混合，按照常規(guī)方法，通過軋輥進(jìn)行攪和、成型、包裝后得到制品。本品的質(zhì)感、呈味、味道均良好，優(yōu)選作為低蛀齒性、低熱量的口香糖。
實(shí)施例10<加糖煉乳>
在原乳100質(zhì)量份中溶解通過實(shí)施例2方法得到的含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的糖漿4質(zhì)量份和蔗糖2重量，用板式加熱器加熱殺菌，然后濃縮至濃度70％，在無菌狀態(tài)下進(jìn)行罐裝，得到制品。本品有溫和的甜味，味道也好，可在水果、咖啡、可可、紅茶等調(diào)味之中有效利用。
實(shí)施例11<乳酸菌飲料>
將脫脂奶粉175質(zhì)量份、通過實(shí)施例3方法得到的含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的粉末100質(zhì)量份以及乳糖高含有粉末(株式會(huì)社林原商事銷售，注冊商標(biāo)乳果オリゴ)溶解于水1500質(zhì)量份，于65℃下進(jìn)行30分鐘殺菌，冷卻至40℃后，按照常規(guī)方法，向其中接種乳酸菌的發(fā)酵劑30質(zhì)量份，于37℃下培養(yǎng)8小時(shí)，得到乳酸菌飲料。本品風(fēng)味良好，含有寡糖、環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖，作為使乳酸菌保持穩(wěn)定，而且具有雙尾菌增殖促進(jìn)作用、整腸作用的乳酸菌飲料很合適。
實(shí)施例12<粉末果汁>
將通過噴霧干燥制造的橙汁粉末33質(zhì)量份和相對于橙汁粉末量的通過實(shí)施例6方法得到的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含水結(jié)晶粉末50質(zhì)量份、無水結(jié)晶麥芽糖醇10質(zhì)量份、無水檸檬酸0.65質(zhì)量份、蘋果酸0.1質(zhì)量份、2-O-α-葡萄糖基-L-抗壞血酸0.2質(zhì)量份、檸檬酸蘇打0.1質(zhì)量份、支鏈淀粉0.5質(zhì)量份和粉末香料適量充分混合攪拌，粉碎，做成微粉末，然后加入到流動(dòng)層造粒機(jī)中，將排風(fēng)溫度調(diào)到40℃，將其中通過實(shí)施例2方法得到的含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的糖漿作為粘合劑，適量噴霧，進(jìn)行30分鐘造粒，計(jì)量、包裝后得到制品。本品是果汁含有率約30％的粉末果汁。另外本品無異味、異臭，高品質(zhì)，作為低熱量的果汁商品價(jià)值高。
實(shí)施例13<蛋奶羹>
將玉米淀粉100質(zhì)量份、通過實(shí)施例2方法得到的含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的糖漿100質(zhì)量份、海藻糖含水結(jié)晶60質(zhì)量份、蔗糖40質(zhì)量份、以及食鹽1質(zhì)量份充分混合，加雞蛋280質(zhì)量份后進(jìn)行攪拌，再慢慢加入沸騰的牛奶1000質(zhì)量份，然后加火，繼續(xù)攪拌，在玉米淀粉完全糊化后整體成半透明時(shí)?；穑缓罄鋮s，加適量的香草香料，計(jì)量、充填、包裝后得到制品。本品具有光滑的光澤，風(fēng)味良好，淀粉的老化也被抑制，是高品質(zhì)的蛋奶羹。
實(shí)施例14<米粉糕原料>
在米粉90質(zhì)量份中均一混合玉米淀粉20質(zhì)量份、無水結(jié)晶麥芽糖醇70質(zhì)量份、用實(shí)施例5方法得到的含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的粉末50質(zhì)量份、以及支鏈淀粉4質(zhì)量份，制造米粉糕原料。將米粉糕原料和適量的粉末綠茶與水混揉，然后放入容器中，蒸60分鐘，制造粉末綠茶米粉糕。本品有光澤、口味也良好，風(fēng)味也好。另外淀粉的老化都被抑制、保存時(shí)日也長、作為低熱量的米粉糕也很合適。
實(shí)施例15<豆餡>
根據(jù)常規(guī)方法，向原料小豆10質(zhì)量份中加水，煮沸，除澀味、去辣味、除去水溶性夾雜物，得到豆沙餡約21質(zhì)量份。向該原餡加蔗糖14質(zhì)量份、通過實(shí)施例2方法得到的含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的糖漿5質(zhì)量份和水4質(zhì)量份后煮沸，然后加少量色拉油，要不破壞粒餡那樣混揉，得到制品豆餡約35質(zhì)量份。本品色焦、也無瀝水，穩(wěn)定，味覺、風(fēng)味良好，作為豆餡面包、豆包、丸子、日式豌豆泥、冰點(diǎn)心等做糕點(diǎn)材料最合適。
實(shí)施例16<面包>
將小麥粉100質(zhì)量份、酵母菌2質(zhì)量份、蔗糖5質(zhì)量份、用實(shí)施例3方法得到的含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的粉末1質(zhì)量份以及無機(jī)食物0.1質(zhì)量份按照常規(guī)方法用水和面，使生面團(tuán)在26℃下發(fā)酵2小時(shí)，然后30分鐘熟成、燒烤制成。本品色相、形狀都好，是具有適度彈力、溫和甜味的高品質(zhì)的面包。
實(shí)施例17<火腿>
向豬大腿肉1000質(zhì)量份均一抹上食鹽15質(zhì)量份和硝酸鉀3質(zhì)量份，在冷室中堆積1晝夜。然后在由水500質(zhì)量份、食鹽100質(zhì)量份、硝酸鉀3質(zhì)量份、用實(shí)施例5方法得到的含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖粉末40質(zhì)量份以及香辛料構(gòu)成的鹽漬液中于冷室中腌7天，然后按照常規(guī)方法用冷水清洗，用細(xì)繩卷起來捆緊、煙熏、烹調(diào)、冷卻、包裝后得到制品。本品是配色好、風(fēng)味良好的高品質(zhì)的火腿。
實(shí)施例18<粉末肽>
在40％食品用大豆肽溶液(不二制油株式會(huì)社銷售、商品名ハイニュ一トS)1質(zhì)量份中混合用實(shí)施例6方法得到的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含水結(jié)晶粉末2質(zhì)量份，加入到塑料制桶中，于50℃下進(jìn)行減壓干燥，粉碎后得到粉末肽。本品風(fēng)味良好，不僅作為預(yù)混物、冰點(diǎn)心等低熱量的制點(diǎn)心材料有用，而且作為用于經(jīng)口流動(dòng)食、經(jīng)管流動(dòng)食的難消化性的食物纖維、整腸劑量也有用。
實(shí)施例19<化妝用雪花膏>
將單硬脂酸聚氧乙烯二醇2質(zhì)量份、自體乳化型單硬脂酸甘油酯5質(zhì)量份、用實(shí)施例6方法得到的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含水結(jié)晶粉末2質(zhì)量份、α-葡萄糖基蕓香甙(株式會(huì)社林原銷售、商品名αG蕓香甙)1質(zhì)量份、液體石蠟1質(zhì)量份、三辛酸甘油酯10質(zhì)量份以及防腐劑適量按照常規(guī)方法進(jìn)行加熱溶解，然后加入L-乳酸2質(zhì)量份、1，3-丁醇5質(zhì)量份以及純化水66質(zhì)量份，用勻漿器乳化，再加適量香料后進(jìn)行攪拌混合，制造化妝用雪花膏。本品具有抗氧化性，穩(wěn)定性高，作為高品質(zhì)的防曬霜、美膚劑、美白劑等可有效利用。
實(shí)施例20<牙膏>
將磷酸氫鉀45質(zhì)量份、十二烷基硫酸鈉1.5質(zhì)量份、甘油25質(zhì)量份、聚環(huán)氧乙烷山梨糖醇酐月桂酸酯0.5質(zhì)量份、用實(shí)施例5方法得到的含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的粉末10質(zhì)量份、糖精0.02質(zhì)量份與水18質(zhì)量份混合后得到牙膏。本品不使表面活性劑的清洗能力下降，改善令人討厭的味道，使用后感覺也良好。
實(shí)施例21<流動(dòng)食用固體制劑>
制備由用實(shí)施例3方法得到的含有環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的粉末100質(zhì)量份、海藻糖含水結(jié)晶200質(zhì)量份、麥芽四糖高含有粉末200質(zhì)量份、蛋黃粉末270質(zhì)量份、脫脂奶粉209質(zhì)量份、氯化鈉4.4質(zhì)量份、氯化鉀1.8質(zhì)量份、硫酸鎂4質(zhì)量份、硫胺素0.01質(zhì)量份、L-抗壞血酸鈉0.1質(zhì)量份、維生素E乙酸鹽0.6質(zhì)量份以及尼克酰胺0.04質(zhì)量份構(gòu)成的配合物，將每25克該配合物填充到防濕性層壓塑料小袋中，進(jìn)行熱封，得到制品。本品由于環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖對難消化性的食物纖維進(jìn)行了強(qiáng)化，作為在整腸作用優(yōu)良的流食，可通過經(jīng)口的、或經(jīng)管向鼻腔、胃、腸等輸送的使用方法利用，在向機(jī)體的能量補(bǔ)給用中可有效利用。
實(shí)施例22<片劑>
將通過實(shí)施例6的方法得到的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含水結(jié)晶粉末14質(zhì)量份、玉米淀粉4質(zhì)量份與阿斯匹林50質(zhì)量份充分混合后，按照常規(guī)方法用壓片機(jī)壓片，制造厚5.25mm、1片680mg的片劑。本品由于是利用了環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的賦形性的產(chǎn)品，所以無吸濕性，物理強(qiáng)度也充分，而且在水中的崩解非常良好。
實(shí)施例23<外傷治療用膏藥>
下通過實(shí)施例6的方法得到的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖含水結(jié)晶粉末100質(zhì)量份和麥芽糖300質(zhì)量份加溶解了碘3質(zhì)量份的甲醇50質(zhì)量份，并混合，再加10w/v％的支鏈淀粉水溶液200質(zhì)量份，進(jìn)行混合，得到表現(xiàn)出適度延展、付著性的外傷治療用膏藥。本品是通過環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖防止碘、甲醇的揮散，隨時(shí)間變化少的商品價(jià)值高的膏藥。另外，本品不僅有通過碘的殺菌作用，而且也有通過麥芽糖向細(xì)胞提供能量的能量補(bǔ)給劑的作用，所以可縮短治愈療程，傷口愈合的也很整齊。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性通過本發(fā)明可以提供使用環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶大量制造以往未知的具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的新的環(huán)狀糖，即環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖。由于本糖具有非還原性，與氨基化合物不發(fā)生氨基羰基反應(yīng)(美拉德反應(yīng))和褐變，另外由于是環(huán)狀糖，具有包合能力，可以抑制包合的化合物的揮發(fā)，使其穩(wěn)定?？商峁┬碌沫h(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的本發(fā)明應(yīng)當(dāng)說對飲食物、化妝品、醫(yī)藥品等各個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域有貢獻(xiàn)，其產(chǎn)業(yè)上意義非常大。
序列表<110>株式會(huì)社林原生物化學(xué)研究所<120>環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖以及環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶和它們的制造方法及其用途<130>10102802<160>10<210>1<211>5<212>PRT<213>球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)<400>1Asp Pro Thr Thr Ser1 5<210>2<211>583<212>PRT<213>球形節(jié)桿菌<400>2Asp Pro Thr Thr Ser Pro Gly Pro Leu Ala Glu Gly Asp Val Ile Tyr1 5 10 15Gln Val Leu Val Asp Arg Phe Glu Asp Gly Asp Pro Thr Asn Asn Asp20 25 30Gln Gly Asp Gly Glu Tyr Asp Pro Ser Asp Leu Gly Phe Tyr His Gly35 40 45Gly Asp Trp Ala Gly Leu Thr Asp Arg Leu Asp Tyr Ile Ala Asp Leu50 55 60Gly Val Thr Ala Ile Trp Leu Ser Pro Val Ser Glu Gln Gln Pro Leu65 70 75 80Ser Arg Asp Gly Leu Glu Ala Ser Tyr His Gly Tyr Phe Thr Arg Asp85 90 95Phe Ala Thr Pro Ash Glu His Phe Gly Asp Arg Ala Glu Leu Gln Glu100 105 110Leu Ile Asp Thr Ala His Asp Leu Gly Leu Lys Met Ile Leu Asp Val115 120 125Val Pro Asn His Thr Ala Asp Tyr Leu Ala Gly Thr Ser Thr Thr Tyr130 135 140Ser Pro Ser Thr Tyr Lys Pro Ala Ser Pro Leu Asp Asp Ala Ser Tyr
145 150 155 160Phe His His Ala Gly Asp Cys Leu Phe Asn Gly Leu Glu Thr Gln Thr165 170 175Gln Ile Glu Asn Cys Asp Leu Gly Gly Leu Asp Asp Leu Asp Gln Ser180 185 190Asn Pro Val Val Ser Ser His Leu Met Ser Thr Tyr Lys Asp Trp Val195 200 205Asp Met Gly Phe Asp Gly Ile Arg Val Asp Ala Ala Arg Ser Val Pro210 215 220Lys Pro Trp Leu Ala Asp Phe Glu Ala Glu Met Gly Val Pro Thr Phe225 230 235 240Gly Glu Val Phe Val Gly Asp Val Asp Tyr Val Ser Glu Tyr Gln Asp245 250 255Tyr Glu Trp Gly Val Leu Asp Phe Pro Tyr Phe Phe Thr Val Arg Glu260 265 270Ala Phe Ser Ala Asp Thr Asp Met Asn Lys Leu Gly Asp Leu Phe Asp275 280 285Gln Asp Ser Lys Tyr Ala Asn Pro Asn Arg Leu Glu Thr Phe Leu Asp290 295 300Asn His Asp Arg Ala Arg Phe Leu Thr Trp Ala Asp Asp Asn Tyr Gln305 310 315 320Arg Leu Arg Ser Gly Leu Thr Phe Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro325 330 335Val Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Ala Asp Asp Gly Asn Gly Asn Pro340 345 350Tyr Glu Val Pro Ile Ala Asn Lys Asp Asn Arg Lys Asp Met Glu Ser355 360 365Phe Asp Gln Asn Ser Asn Leu Tyr Lys His Ile Gln Arg Leu Thr Ala370 375 380Ile Lys Ala Ala Tyr Pro Ala Leu Gln Val Gly Thr Gln Arg Glu Met385 390 395 400Trp Ser Asp Thr Ser Val Tyr Gly Phe Ser Arg Arg Val Asp Ser Thr405 410 415Gly Ala Glu Ala Met Thr Phe Ser Ser Asn Ser Trp Thr Thr Gln Thr420 425 430Arg Thr Val Pro Leu Arg Ala Glu Ser Ser Ile Thr Val Gly Thr Thr435 440 445Leu Thr Asn Leu Met Asn Thr Gly Asp Thr Val Thr Val Thr Ala Gly450 455 460Gly Val Thr Gly Lys Gln Ile Thr Val Ser Leu Gly Glu His Glu Ser465 470 475 480Lys Val Tyr Ala Pro Gly Thr Pro Val Ser Ala Tyr Ser Pro Glu Ala485 490 495Arg Asn Thr Thr Lys Ile Arg Val His Tyr Asn Val Gly Leu Gly His
500 505 510Ser Ile Ala Ile Arg Gly Asp Glu Tyr Pro Phe Thr Trp Thr Ser Gly515 520 525Arg Gly Ala Arg Asn Val Ala Ser Asp Val Trp Glu Phe Glu Val Glu530 535 540Arg Ile Pro Asp Gly Glu Thr Phe Gln Phe Lys Pro Leu Ile Asp Asp545 550 555 560Val Thr Trp Ser Thr Gly Gly Asn Phe Thr Gly Thr Gly Gly Asp Val565 570 575Ile Asp Ile Tyr Pro Thr Phe580 583<210>3<211>1749<212>DNA<213>球形節(jié)桿菌<400>3gaccccacca cgtcgcccgg cccgctggcc gagggcgacg tgatctacca ggtgctcgtc 60gaccggttcg aagacggcga ccccaccaac aacgaccagg gcgacggaga gtacgatccg120tccgacctcg gtttctacca cggcggcgac tgggcgggcc tgacggaccg gctcgactac180atcgccgatc tgggtgtgac ggcgatctgg ctctcgcccg tctccgagca gcagccgctc240tcgcgcgacg ggctggaggc cagctaccac ggctacttca ctcgggactt cgcgacgccg300aacgagcatt tcggcgaccg agccgagctg caggagctga tcgacacggc gcacgatctc360ggactcaaga tgatcctcga cgtcgtgccg aaccacacgg ccgactacct cgcgggcaca420tcgacgacct attcgccgag cacctacaag ccggcgagtc cgctcgatga cgcgtcgtac480ttccatcacg ccggcgactg cctgttcaac gggctcgaga cgcagaccca gatcgagaac540tgcgacctcg gcgggctcga cgacctcgat cagtcgaacc cggtcgtctc gtcgcacctg600atgagcacgt acaaggactg ggtcgacatg ggcttcgacg gcatccgggt cgatgcggcg660cgctcggtgc cgaagccgtg gctcgccgac ttcgaagccg agatgggcgt gccgaccttc720ggcgaggtgt tcgtcggcga tgtcgactac gtctcggagt accaggacta cgagtggggc780gtgctcgact tcccctactt cttcacggtg cgcgaggcgt tctcggccga taccgacatg840aacaagctcg gcgacctctt cgaccaggac agcaagtacg cgaacccgaa ccggctggag900acgttcctcg acaaccacga tcgggcgcgg ttcctcacct gggccgatga caactatcag960cggctgcgct caggactgac gttcctccta acctcccggg gcgtgcccgt gatctactac1020ggcaccgagc aggccgacga cggcaacggc aacccctacg aggtaccgat cgcgaacaag1080gacaaccgca aggacatgga gagcttcgat cagaactcga acctctacaa gcacatccag1140cggttgaccg cgatcaaggc cgcttacccg gctctgcagg tcggcacaca gcgcgagatg1200tggtccgaca cctccgtcta cgggttctcg cgacgcgtcg acagcacggg tgccgaggcg1260atgaccttct cgtcgaactc gtggacgacg cagacgcgca cggtgccgct gcgcgccgag1320agctcgatca cggtcggtac gacgctgacg aacctcatga acacgggcga cacggtgacc1380gtgaccgccg gcggtgtcac ggggaagcag atcaccgtct ccctcggcga gcacgagagc1440aaggtctatg cgcccggcac cccggtatcg gcatacagcc ccgaagcgcg caacaccacg1500aagatccgcg tgcactacaa cgtgggcctc gggcacagca tcgcgatccg cggcgacgag1560
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1 5 10cgt acg ggc ctc gcg atg gga gca gcc gtc gcg ctg gcg gcc ggc gcg 999Arg Thr Gly Leu Ala Met Gly Ala Ala Val Ala Leu Ala Ala Gly Ala15 20 25ctc acc tgg ggc acc ggc ccc gca ccc gcg agt gcc gac ccc acc acg1047Leu Thr Trp Gly Thr Gly Pro Ala Pro Ala Ser Ala Asp Pro Thr Thr30 35 40tcg ccc ggc ccg ctg gcc gag ggc gac gtg atc tac cag gtg ctc gtc1095Ser Pro Gly Pro Leu Ala Glu Gly Asp Val Ile Tyr Gln Val Leu Val45 50 55 60gac cgg ttc gaa gac ggc gac ccc acc aac aac gac cag ggc gac gga1143Asp Arg Phe Glu Asp Gly Asp Pro Thr Asn Asn Asp Gln Gly Asp Gly65 70 75gag tac gat ccg tcc gac ctc ggt ttc tac cac ggc ggc gac tgg gcg1191Glu Tyr Asp Pro Ser Asp Leu Gly Phe Tyr His Gly Gly Asp Trp Ala80 85 90ggc ctg acg gac cgg ctc gac tac atc gcc gat ctg ggt gtg acg gcg1239Gly Leu Thr Asp Arg Leu Asp Tyr Ile Ala Asp Leu Gly Val Thr Ala95 100 105atc tgg ctc tcg ccc gtc tcc gag cag cag ccg ctc tcg cgc gac ggg1287Ile Trp Leu Ser Pro Val Ser Glu Gln Gln Pro Leu Ser Arg Asp Gly110 115 120ctg gag gcc agc tac cac ggc tac ttc act cgg gac ttc gcg acg ccg1335Leu Glu Ala Ser Tyr His Gly Tyr Phe Thr Arg Asp Phe Ala Thr Pro125 130 135 140aac gag cat ttc ggc gac cga gcc gag ctg cag gag ctg atc gac acg1383Asn Glu His Phe Gly Asp Arg Ala Glu Leu Gln Glu Leu Ile Asp Thr145 150 155gcg cac gat ctc gga ctc aag atg atc ctc gac gtc gtg ccg aac cac1431Ala His Asp Leu Gly Leu Lys Met Ile Leu Asp Val Val Pro Asn His160 165 170acg gcc gac tac ctc gcg ggc aca tcg acg acc tat tcg ccg agc acc1479Thr Ala Asp Tyr Leu Ala Gly Thr Ser Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Thr
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1.具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖。
2.環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶，是具有作用于葡萄糖聚合度在3以上的α-1，4葡聚糖，生成具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖作用的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶。
3.權(quán)利要求2所述的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶，該酶具有下述理化學(xué)性質(zhì)(1)分子量通過SDS-凝膠電泳法測得72000±20000道爾頓；(2)等電點(diǎn)通過含有兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)電泳法測得pI3.6±0.5；(3)最適溫度在pH6.0、30分鐘反應(yīng)的條件下，最適溫度范圍在50℃至55℃；(4)最適pH在40℃、30分鐘反應(yīng)的條件下，最適pH范圍在pH5.5至6.5；(5)溫度穩(wěn)定性在pH6.0、保持60分鐘的條件下，至30℃穩(wěn)定；在1mM鈣離子存在下，至50℃穩(wěn)定。(6)pH穩(wěn)定性在4℃、保持24小時(shí)的條件下，在pH5.0至9.0穩(wěn)定。
4.權(quán)利要求2或3所述環(huán)的狀麥芽糖基麥芽糖合成酶，其中，作為N末端氨基酸序列，具有序列表中序列編號1所示的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)所述的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶，其中，具有序列表中序列編號2所示的氨基酸序列，或具有在序列表中序列編號2所示的氨基酸序列中，在保持該酶活性的范圍內(nèi)缺失、置換或附加1個(gè)或2個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求2至5中任一項(xiàng)所述的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶，其中，葡萄糖聚合度大于等于3的α-1，4葡聚糖是從麥芽低聚糖、麥芽糖糊精、淀粉糊精、直鏈淀粉、支鏈淀粉、可溶性淀粉、液化淀粉、糊化淀粉以及糖原中選出的1種或2種以上的糖。
7.權(quán)利要求2至6中任一項(xiàng)所述的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶，其中，環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶是來自微生物的酶。
8.權(quán)利要求7所述的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶，其中，微生物是節(jié)桿菌屬的微生物。
9.權(quán)利要求8所述的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶，其中，節(jié)桿菌屬的微生物是球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)M6(獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，保藏編號FERMBP-8448)或其變異株。
10.具有生產(chǎn)環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶能力的微生物，該微生物為球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)M6(獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心、保藏編號FERM BP-8448)或其變異株。
11.編碼權(quán)利要求2至9中任一項(xiàng)所述的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的DNA。
12.權(quán)利要求11所述的DNA，該DNA具有序列表中序列編號3所示的堿基序列，或具有在序列表中序列編號3所示的堿基序列中，在保持編碼的酶的活性的范圍內(nèi)缺失、置換或附加1個(gè)或2個(gè)以上堿基的堿基序列、或與上述序列互補(bǔ)的堿基序列。
13.權(quán)利要求11或12所述的DNA，其中，根據(jù)基因編碼的簡并性，不改變編碼的氨基酸序列，序列表中序列編號3所示的堿基序列中的1個(gè)或2個(gè)以上堿基被其它堿基置換。
14.權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)所述的DNA，是來自于節(jié)桿菌屬的微生物。
15.含有權(quán)利要求11至14中任一項(xiàng)所述的DNA和可自我復(fù)制載體的可復(fù)制的重組DNA。
16.權(quán)利要求15所述的重組DNA，其中，可自我復(fù)制的載體是質(zhì)粒載體Bluescript IISK(+)。
17.將權(quán)利要求15或16所述的重組DNA導(dǎo)入適當(dāng)宿主后構(gòu)成的轉(zhuǎn)化體。
18.權(quán)利要求17所述的轉(zhuǎn)化體，其中，宿主是大腸桿菌。
19.環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的制造方法，其特征是將具有權(quán)利要求2至9中任一項(xiàng)所述的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的產(chǎn)生能力的微生物在營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，從得到的培養(yǎng)物提取權(quán)利要求2至9中任一項(xiàng)所述的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶。
20權(quán)利要求19所述的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的制造方法，其中，微生物是節(jié)桿菌屬的微生物。
21.權(quán)利要求20所述環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的制造方法，其中，節(jié)桿菌屬的微生物是球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)M6(獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心、保藏編號FERM BP-8448)或其變異株。
22.重組型環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶的制造方法，其特征是對權(quán)利要求17或18所述的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)物中獲取重組型環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶。
23.具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的生成方法，其特征是使權(quán)利要求2至9任一項(xiàng)中所述的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶作用于含有葡萄糖聚合度在3以上的α-1，4葡聚糖的溶液。
24.權(quán)利要求23所述的具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的生成方法，其中，葡萄糖聚合度在3以上的α-1，4葡聚糖是從麥芽低聚糖、麥芽糖糊精、淀粉糊精、直鏈淀粉、支鏈淀粉、可溶性淀粉、液化淀粉、糊化淀粉以及糖原中選出的1種或2種以上的糖。
25.使權(quán)利要求2至9任一項(xiàng)中所述的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶作用于含有葡萄糖聚合度在3以上的α-1，4葡聚糖的溶液得到的具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖、或含有該糖的糖類。
26.權(quán)利要求25所述的具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖、或含有該糖的糖類，其中，葡萄糖聚合度在3以上的α-1，4葡聚糖是從麥芽低聚糖、麥芽糖糊精、淀粉糊精、直鏈淀粉、支鏈淀粉、可溶性淀粉、液化淀粉、糊化淀粉和糖原中選出的1種或2種以上的糖。
27.具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖、或含有該糖的糖類，是使權(quán)利要求2至9任一項(xiàng)中所述的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶作用于含有葡萄糖聚合度在3以上的α-1，4葡聚糖的溶液，制備成含有具有環(huán){→6}-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→)結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖和其它糖的溶液，將該溶液進(jìn)行使用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂的柱層析后得到的。
28.含有具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖的糖，其特征是每單位固形物含有1質(zhì)量％以上具有環(huán){→6}-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→)結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖。
29.具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖，或含有該糖的糖類，其特征是其形態(tài)是糖漿、結(jié)晶漿液、非晶質(zhì)粉末、非晶質(zhì)固形物、結(jié)晶或結(jié)晶固形物的任一種。
30.具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖，或含有該糖的糖類的制造方法，其特征是使權(quán)利要求2至9任一項(xiàng)中所述的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶作用于已經(jīng)將淀粉糊化和/或液化的溶液。
31.權(quán)利要求30所述的具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖，或含有該糖的糖類的制造方法，其中，已經(jīng)使淀粉糊化和/或液化的溶液是DE20以下的溶液。
32.權(quán)利要求30或31所述的具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖，或含有該糖的糖類的制造方法，其特征是使權(quán)利要求2至9任一項(xiàng)中所述的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶與異淀粉酶一起作用于已經(jīng)將淀粉糊化和/或液化的溶液，根據(jù)需要，再使從α-淀粉酶、β-淀粉酶、環(huán)麥芽糖糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖淀粉酶、α-糖苷酶中選出的1種或2種以上的酶作用。
33.權(quán)利要求30至32中任一項(xiàng)所述的具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖，或含有該糖的糖的制造方法，其特征是使權(quán)利要求2至9任一項(xiàng)中所述的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶與異淀粉酶一起作用于已經(jīng)將淀粉糊化和/或液化的溶液，根據(jù)需要，再使從α-淀粉酶、β-淀粉酶、環(huán)麥芽糖糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖淀粉酶、α-糖苷酶中選出的1種或2種以上的酶作用后，使用從柱層析級分、膜分離、微生物發(fā)酵處理和堿處理進(jìn)行分解除去中選出1種或2種以上的純化方法。
34.權(quán)利要求30至33中任一項(xiàng)所述的具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖，或含有該糖的糖類的制造方法，其特征是每單位固形物含有1質(zhì)量％以上的具有環(huán){→6}-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→)結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖。
35.權(quán)利要求30至34任一項(xiàng)中所述的具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖、或含有該糖的糖的制造方法，其中形態(tài)是糖漿、結(jié)晶漿液、非晶質(zhì)粉末、非晶質(zhì)固形物、結(jié)晶或結(jié)晶固形物。
36.組合物，該組合物含有具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖、或含有該糖的糖類的組成物。
37.權(quán)利要求36所述的組成物，其中，組成物是飲食物、化妝品或醫(yī)藥品。
38.權(quán)利要求36或37所述的組成物，其中，每單位固形物含有0.1質(zhì)量％以上的具有環(huán){→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖。
全文摘要
本發(fā)明將提供以葡萄糖作為構(gòu)成糖的新型非還原性糖，在擴(kuò)展非還原性糖選擇范圍的同時(shí)，提供生成該非還原性糖的新酶，以及它們的生成方法和制造方法、編碼該酶的DNA、含有該DNA的重組DNA和轉(zhuǎn)化體、以及含有該非還原性糖的組成物及其用途作為課題，通過提供具有環(huán){→6)－α－D－吡喃葡萄糖基－(1→4)－α－D－吡喃葡萄糖基－(1→6)－α－D－吡喃葡萄糖基－(1→4)－α－D－吡喃葡萄糖基－(1→}結(jié)構(gòu)的新的環(huán)狀糖、即環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖和生成該糖的新的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖合成酶和它們的生成方法和制造方法、編碼該酶的DNA和含有該DNA的重組DNA和轉(zhuǎn)化體、以及環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖或含有該糖的糖類的組成物及其用途，解決上述課題。
文檔編號C12N1/20GK1845931SQ20048002488
公開日2006年10月11日 申請日期2004年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月28日
發(fā)明者向井和久, 渡邊光, 西本友之, 久保田倫夫, 福田惠溫, 三宅俊雄 申請人:株式會(huì)社 林原生物化學(xué)研究所