專利名稱：蛋白水解裂解和純化重組蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)和蛋白技術(shù)領(lǐng)域且涉及尤其是由轉(zhuǎn)基因植物材料分離和純化異源蛋白的改進方法。此外，本發(fā)明提供了融合蛋白的蛋白水解裂解的改進的和經(jīng)濟的方式。
背景技術(shù)：
基于生物制藥的蛋白在提供抗嚴(yán)重疾病的更特異性和組織特異性或細胞特異性藥物治療中顯示出重要的前景(參見綜述“RecombinantProtein Drugs”Ed.P.Buckel 2001)。
現(xiàn)有技術(shù)中的很多實例已顯示利用微生物諸如細菌，和動物細胞生產(chǎn)這種生物藥物；其中胰島素是重要的實例。
在文獻中許多實例已顯示利用轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞培養(yǎng)物用于表達和生產(chǎn)高價值的異源多肽或生物藥物。這種基于植物的生產(chǎn)方法可稱作分子耕作。
有價值的蛋白的生產(chǎn)可通過利用植物作為生產(chǎn)生物更經(jīng)濟的產(chǎn)生。與基于生物反應(yīng)器的大多數(shù)生產(chǎn)系統(tǒng)諸如原核生產(chǎn)系統(tǒng)、動物細胞培養(yǎng)物等相比，使用植物作為宿主生物用于蛋白生產(chǎn)的培養(yǎng)成本可顯著地降低。然而，對于上述所有生產(chǎn)系統(tǒng)而言，異源蛋白的純化仍然是必須且昂貴的任務(wù)。因此，對于基于植物的生產(chǎn)系統(tǒng)而言，在高價值異源蛋白的生產(chǎn)中下游加工消耗了大部分的生產(chǎn)成本。
蛋白純化和分離是通過利用基因技術(shù)在各種宿主生物中累積和產(chǎn)生的蛋白的下游加工中的關(guān)鍵過程。由宿主生物純化蛋白可能是十分費力、復(fù)雜和昂貴的。各種色譜分析策略被商業(yè)地使用用于由生產(chǎn)宿主生物分離和純化目的蛋白。色譜分析策略可依賴于污染的或內(nèi)源蛋白和目的異源蛋白之間的物理化學(xué)差異，諸如在大小、溶解度、電荷、疏水性和親合性方面的不同。
色譜分析策略的組合包括多重步驟，需要若干昂貴的層析基質(zhì)和必要的硬件包括柱，控制單位等等，且在每一步驟中伴隨產(chǎn)物產(chǎn)率的損失，且因此導(dǎo)致經(jīng)濟的損失。除包括色譜分析步驟之外，下游加工通常包括多重過濾和離心步驟。結(jié)果，純化和下游加工的成本可能成為純化基于生物技術(shù)產(chǎn)物的蛋白的限制。作為用于大量基于蛋白的較低價值的產(chǎn)物，諸如工業(yè)蛋白，下游加工的成本可能限制它們的使用和銷售，導(dǎo)致產(chǎn)生粗糙的和不適的產(chǎn)物。對于大多數(shù)生物技術(shù)產(chǎn)物而言，純化成本無疑是生產(chǎn)成本的主要部分。
影響由分離污染物分離目的特定層析基質(zhì)的成本由于它們的生產(chǎn)涉及復(fù)雜的結(jié)合化學(xué)作用是昂貴的。這些基質(zhì)的化學(xué)復(fù)雜度可導(dǎo)致在純化方法過程中由基質(zhì)中進行配體及其它物質(zhì)的不必要的瀝濾，其中必要的預(yù)防測定，監(jiān)控或由目的蛋白中去除瀝出物增加了已經(jīng)昂貴的下游加工的成本。
親和層析最有功效的純化方法，因為其基于試劑和特異性配體之間的特異性親合性，通常模擬天然蛋白-配體的相互作用?？衫靡恍┎煌愋偷挠H合性吸附劑，某些對特定蛋白是高度特異性，其它的結(jié)合于除特定蛋白之外的蛋白類型。
多數(shù)情況下，親和層析依賴于通過重組基因技術(shù)連接于目的異源蛋白的特異性標(biāo)記的存在。當(dāng)這些標(biāo)記用于目的異源產(chǎn)物的純化時，需要被裂解掉。該裂解通過利用在特異性切割位點切割蛋白的氨基酸主鏈的高度特異性蛋白酶來實現(xiàn)，也即在克隆階段導(dǎo)入到標(biāo)記和目的蛋白之間。有效地分離蛋白酶的需要和彼此產(chǎn)生的裂解產(chǎn)物增加了所涉及的純化步驟的復(fù)雜性、數(shù)目以及利用這種位點特異性蛋白水解裂解的加工成本。與利用這種特異性蛋白酶有關(guān)的成本常常限制基于標(biāo)記的親和層析的工業(yè)應(yīng)用，因此限制了這些有效純化技術(shù)的利用。更經(jīng)濟和有效利用特異性蛋白酶的方式使得生物工藝工業(yè)成為可能且通?？赡芙档图兓亟M蛋白的生產(chǎn)成本。
在很多情況下，親和層析意味將固定配體用于特異性選擇結(jié)合于配體的蛋白的吸收劑。配體與親合性吸附劑的結(jié)合包括利用結(jié)合化學(xué)作用諸如吸附劑的溴化氰-，甲苯磺酰-，或乙烯砜(vinylsulfone)-激活。結(jié)合于柱基質(zhì)的配體可能是或可能不是蛋白來源的。前者的實例為，但不限于，具有γ-球蛋白親和性的固定化蛋白A或蛋白G，因此對抗體純化是有用的，以及對糖蛋白具有親合性的凝集素。作為后者的實例，結(jié)合于基質(zhì)的固定化谷胱甘肽結(jié)合包含谷胱甘膚S-轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。固定的金屬親和層析(IMAC)基于金屬-螯合配體與基質(zhì)固定化并且依賴于固定在柱上的金屬離子和蛋白上的堿性基團(主要是組氨酸殘基)之間的微弱配價鍵的形成。市售的克隆載體提供了在框中克隆具有一系列組氨酸殘基-His-標(biāo)記的cDNA的可能性，其能夠用IMAC純化生成的融合蛋白。盡管廣泛地用于蛋白的小規(guī)模的純化，IMAC是非特異性的但是選擇性的方法，因為在污染蛋白中的天然組氨酸殘基可能在IMAC中導(dǎo)致結(jié)合(Scopes 1993)。一些不同類型的標(biāo)記或結(jié)合結(jié)構(gòu)域在產(chǎn)生融合蛋白的市售表達載體中是有用的，其中標(biāo)記/結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)⑷诤系鞍捉Y(jié)合于結(jié)合到柱基質(zhì)上的配體。
可用這些基質(zhì)-配體系統(tǒng)獲得蛋白結(jié)合的高度特異性。在上述情況中，包括復(fù)雜的結(jié)合化學(xué)作用將配體固定到惰性基質(zhì)上。因此，親合性基質(zhì)的成本通常成為這些有效技術(shù)的工業(yè)規(guī)模應(yīng)用的限制。
此外，由于對大多數(shù)其它類型的層析方法而言，配體結(jié)合于基質(zhì)的穩(wěn)定性成為難題且瀝濾是尤其考慮的問題。在許多敏感的生物活性蛋白純化過程中，IMAC中的重金屬瀝濾可導(dǎo)致不能接受的和嚴(yán)重的污染，且可能使被純化的蛋白失活(Scopes 1993)。
通常，蛋白與其配體的結(jié)合親合性是如此強烈使得破壞配體-蛋白結(jié)合的洗脫條件需要使被純化的有價值的蛋白部分變性的激烈條件。這些的非-限制性實例是需要在低pH處變性來由柱釋放抗體由蛋白A-親合性基質(zhì)洗脫抗體。由于純化蛋白活性喪失的風(fēng)險，并不希望在蛋白純化過程中包括變性步驟，增加蛋白再折疊的額外步驟，以及對于折疊蛋白產(chǎn)物所需的隨后活性分析，以及增加成本。
為了能利用基于親合性的層析由植物進行大規(guī)模純化，非常希望發(fā)展比目前的商用方法更簡單和更經(jīng)濟的純化過程，其應(yīng)具有較少的結(jié)合化學(xué)作用并與制藥工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量要求不矛盾。
多糖和多糖結(jié)合蛋白可結(jié)合使用用于親和層析步驟的設(shè)計(參見，例如，Boraston等，2001)。
Shani等人的美國專利6,331,416描述了表達具有結(jié)合于宿主植物細胞壁中纖維素的多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重組蛋白的方法，以及利用此蛋白沒有不充分定義的宿主植物纖維素的親合性進行的蛋白純化過程，產(chǎn)生可與可溶性污染蛋白分離的細胞壁-蛋白復(fù)合物。結(jié)合的強度可使得由纖維素宿主植物材料中釋放蛋白可能需要激烈的蛋白變性條件，所述條件對被純化的重組蛋白的活性具有負作用。涉及的復(fù)雜性與上述的抗體-蛋白A洗脫類似。
碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域cbm9-2來自海棲熱袍菌(Thermotogamaritime)木聚糖酶10A(Winterhalter等，1995Mol.Microbiol，15(3)，431-444)。CBM9-2基因組DNA序列可獲自GenBank登錄號Z46264且其屬于CBM-s的IX家族并具有許多用于高分辨率的親和純化的吸引人的特性，包括利用1M葡萄糖作為洗脫液的非-變性洗脫條件，以及用于無定形和結(jié)晶纖維素的高度特異性親合性(Boraston等，2001Biochemistry 40，6240-6247)。
基于植物生產(chǎn)蛋白顯示了以經(jīng)濟的方式大規(guī)模生產(chǎn)蛋白的重要前景，如已被在文獻中的實例所顯示(綜述參見Hammond 1999)。
與用植物分子耕作有關(guān)的培養(yǎng)成本比用傳統(tǒng)的基于生物反應(yīng)器的方法相比顯著地降低。
廣泛公認需要一種有效、簡單和經(jīng)濟地由轉(zhuǎn)基因植物材料純化異源蛋白的下游加工方法。此外，這種下游加工需要包括用于目的蛋白的溫和、非-變性條件(尤其是，具有溫和洗脫條件的特異性親和純化方法)以確保目的蛋白的生物活性并提高產(chǎn)率。不受上述限制的蛋白純化過程可顯著地降低與由植物生產(chǎn)生物藥物有關(guān)的生產(chǎn)成本，并能夠用于純化其下游加工被限制且是復(fù)雜和昂貴并且有價值的異源蛋白。
發(fā)明概述和目的本發(fā)明的主要目的是提供植物、獲自植物的組織或植物細胞中產(chǎn)生高度有價值的異源蛋白的改進蛋白純化方法，以及由融合的親和標(biāo)記諸如例如與蛋白融合的CBM分離目的異源蛋白的有效且經(jīng)濟的蛋白水解方法。
本發(fā)明目的在于減少成本和改進在植物中產(chǎn)生的異源蛋白的下游加工的質(zhì)量。
純化過程的重要特征是由細胞壁片段及得自其它沒有充分定義的植物的固形物內(nèi)在分離目的蛋白作為CBM-融合蛋白，因為本發(fā)明的CBM-融合蛋白不結(jié)合于這些組分。這可以在親和層析之前單獨進行或與親和層析步驟同時進行。
在第一個方面，本發(fā)明提供了用于由表達所述融合蛋白的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細胞生產(chǎn)和純化包含纖維素結(jié)合組件(CBM)的可溶性異源融合蛋白的方法，該方法包括破碎轉(zhuǎn)基因植物材料；將提取液體添加于植物材料，由此產(chǎn)生可溶性和不溶性植物材料的混合物，以便由所述破碎的植物材料提取可溶性融合蛋白至液相中來獲得蛋白提取物；由包含所述目的融合蛋白的所述蛋白提取物分離包括細胞-壁物質(zhì)和固形物的不溶性植物材料；將所述蛋白提取物與結(jié)合于所述融合蛋白的多糖基質(zhì)接觸；用一種或者多種合適的水溶液諸如一或多種緩沖液沖洗具有結(jié)合的融合蛋白的基質(zhì)，即，可利用梯度或一系列不同洗滌液在一個步驟中進行沖洗；和通過調(diào)整影響所述融合蛋白由基質(zhì)釋放的條件由所述多糖基質(zhì)洗脫融合蛋白。
通常，轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞選自雙子葉植物和單子葉植物，且在優(yōu)選的實施方案中，所述植物細胞或轉(zhuǎn)基因植物來自煙草、油菜籽、大豆、苜蓿、萵苣、大麥、玉米、小麥、燕麥和水稻。
在某些實施方案中分離步驟包括選自膨脹床吸附(EBA)，填充式層析，沉淀，過濾，離心或其任意組合的方法。
將融合蛋白結(jié)合于多糖基質(zhì)的親合性結(jié)合步驟優(yōu)選地包括層析步驟。
然而，在特定有用的實施方案中，所述由目的蛋白CBM融合蛋白分離細胞-壁片段及其它沒有充分定義植物來源的固形物，以及CBM融合蛋白親合性與多糖基質(zhì)的親和結(jié)合可以利用具有合適的，廉價的多糖基質(zhì)的膨脹床吸附色譜法(EBA)在單個有效的純化步驟中進行。這些特征革新并改進了下游加工的經(jīng)濟性。
在本發(fā)明有益的實施方案中，多糖基質(zhì)包括纖維素，且優(yōu)選地包括藥學(xué)上相容的纖維素。這種CBM-融合蛋白結(jié)合的明確限定的藥物級纖維素可以允許純化異源蛋白的各種高端應(yīng)用。用作多糖基質(zhì)的有用的藥學(xué)上相容的纖維素物質(zhì)包括AvicelTM(FMC Corporation，PA，美國)。
用于本發(fā)明親和層析的多糖基質(zhì)不需要復(fù)雜的結(jié)合化學(xué)作用或潛在瀝濾配體的固定化。多糖基質(zhì)當(dāng)構(gòu)成親和吸附劑本身時提供了結(jié)構(gòu)的支持和剛性。因此，更經(jīng)濟的和安全的蛋白純化能夠用于獲自植物的異源蛋白。
本發(fā)明的又一優(yōu)點是所述加工能根據(jù)純化的異源蛋白的不同最終用途用于不同質(zhì)量的不同多糖基質(zhì)，例如用在例如農(nóng)業(yè)、化學(xué)工業(yè)或制藥工業(yè)中。由藥物級的多糖制成的親和吸附劑是制藥工業(yè)內(nèi)的散裝材料且價格顯著地低于任何市售的親和層析介質(zhì)。因此，可利用本發(fā)明所述的加工經(jīng)濟地制備非常高質(zhì)量的親合性基質(zhì)，能夠更經(jīng)濟地下游加工來自植物材料的高價值蛋白。
本發(fā)明的進一步優(yōu)點為一旦獲自植物的CBM-融合蛋白結(jié)合于多糖層析基質(zhì)，且沖洗基質(zhì)除去所有污染的內(nèi)源植物蛋白后，可利用非-變性，溫和條件通常為中性的或酸性條件且優(yōu)選地添加可溶性碳水化合物(糖)由柱洗脫融合蛋白，所述條件保持了任何連接于CBM的融合伴侶蛋白的活性和結(jié)構(gòu)。糖與纖維素競爭CBM的結(jié)合位點且合適的濃度將基本上釋放所有結(jié)合CBM的融合蛋白。
用于本發(fā)明方法且融合于目的異源蛋白的優(yōu)選的CBM-s是具有目的結(jié)合特性允許充分地強烈結(jié)合于合適的多糖基質(zhì)來獲得高產(chǎn)率的結(jié)合CBM融合蛋白，并且通過如上所述的溫和條件釋放的CBM-s。CBM9-2已被發(fā)現(xiàn)具有這些目的特性。利用其它具有這種特性的CBM-s也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這種CBM-s可通過檢索可獲得的基因數(shù)據(jù)庫中的編碼具有目的特性的CBM的序列，例如被認為與對于結(jié)合特性是重要的CBM9-2中的基序類似的基序來發(fā)現(xiàn)。同時，存在的CBM-s可用本領(lǐng)域眾所周知的點突變技術(shù)修飾來修飾其結(jié)合特性以獲得本發(fā)明合適的CBM-s。
融合蛋白由多糖親合性基質(zhì)洗脫后，其可以任選地進行一或多個進一步的純化或分離步驟，取決于所需的形式和使用的蛋白。
在有用的實施方案中，轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞包括編碼CBM的核酸序列，優(yōu)選CBM是熱穩(wěn)定的且在高溫下保持可溶性。術(shù)語熱穩(wěn)定的在這里表示蛋白在高溫也即約25℃以上的溫度，且通常約37℃以上，包括40℃-100℃范圍溫度下保持可溶性、正確折疊和活性。
編碼這種優(yōu)選的CBM的基因可獲自嗜熱生物，包括嗜熱細菌，藻類和真菌且以表達包含所述CBM的融合蛋白的方式導(dǎo)入到宿主植物或植物細胞中。術(shù)語嗜熱在這里是指生物的最佳生長溫度超過40℃。優(yōu)選CBM通過來自海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)的木聚糖酶10A基因編碼，優(yōu)選編碼CBM的宿主植物或植物細胞內(nèi)的區(qū)域是所述基因的區(qū)域。所述編碼CBM的區(qū)域可在特定的實施方案中包含序列SEQ IDNO1，或編碼相同氨基酸序列的核酸序列，或編碼與所述氨基酸序列具有基本上的序列同一性的氨基酸序列的序列。
本發(fā)明的某些實施方案中加工過程中需要加熱包含可溶性融合蛋白的蛋白提取物到37℃和100℃范圍內(nèi)的溫度，例如，50-80℃范圍內(nèi)的溫度，諸如由1分鐘到120分鐘的范圍內(nèi)的一段時間。對于此目的而言，熱穩(wěn)定的CBM諸如來自嗜熱來源的是尤其有用的。在此種加熱過程中，內(nèi)源性植物蛋白的一部分可能失活和/或變性且可因此容易地與蛋白提取物分離。所述加熱提取可能優(yōu)選進行包括用多糖基質(zhì)的膨脹床吸附由加熱的提取物同時分離固形物和親合性結(jié)合所述CBM融合蛋白的加工步驟。
在本發(fā)明特定的實施方案中，所述異源融合蛋白包括蛋白酶(表示蛋白分解活性的多肽)，其在特定有用的實施方案中為哺乳動物腸激酶(EK)或其腸激酶-活性部分，例如，牛EK或牛EK催化結(jié)構(gòu)域(EKc)。用于此目的的有用的EKc由SEQ ID NO2所示的核酸序列編碼。
在本發(fā)明高度有用的實施方案中，所述融合蛋白包括CBM和通過包含蛋白水解切割位點，優(yōu)選被特異性蛋白酶識別和裂解的蛋白水解的切割位點的氨基酸伸出物截斷的目的異源多肽。由于具有這種位點，CBM可被容易地與融合蛋白中的融合伴侶裂解掉來獲得沒有伴隨CBM的目的異源蛋白。
因此，在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了純化目的異源蛋白的方法，該方法包括(a)提供了包含如以上定義的融合于由蛋白水解切割位點截斷的CBM的融合蛋白，(b)在通過所述蛋白酶促進蛋白水解裂解的條件下，所述融合蛋白與融合于CBM的功能性蛋白酶接觸，來從目的異源蛋白裂解融合的CBM，(c)在其中CBM-蛋白酶和游離的CBM結(jié)合于所述多糖基質(zhì)且其中目的異源蛋白不保持在所述多糖基質(zhì)上的條件下，如在這里限定的，將CBM-蛋白酶，游離的CBM和目的異源蛋白的溶液與多糖基質(zhì)接觸，(d)由多糖基質(zhì)分離未-結(jié)合的目的異源蛋白，(e)用一或多種合適的水溶液沖洗具有結(jié)合的CBM-蛋白酶和CBM的多糖基質(zhì)，(f)通過調(diào)整影響所述CBM-蛋白酶由基質(zhì)釋放的條件由基質(zhì)洗脫CBM-蛋白酶；和(g)任選地復(fù)原所述洗脫的CBM-蛋白酶，來保持其與所述多糖基質(zhì)的親合性，使得復(fù)原的CBM-蛋白酶可再用于隨后方法的重復(fù)。
結(jié)合融合蛋白、沖洗和洗脫的步驟優(yōu)選地如上所述進行。
在優(yōu)選的實施方案中，融合于CBM的蛋白酶為腸激酶，優(yōu)選地如上所述。此種CBM-融合蛋白酶，EK或其它類型可通過在這里所述的方法適當(dāng)?shù)禺a(chǎn)生和純化。
應(yīng)能理解如上所述的方法可有益地與上述方法結(jié)合來制備和純化可溶性異源融合蛋白，從而獲得不含融合CBM的純化形式的最初作為CBM融合蛋白表達和分離的目的異源蛋白。
方法的其它優(yōu)點為復(fù)原所用蛋白酶的可能性，即利用重復(fù)用于表達為CBM融合蛋白的目的蛋白的批量生產(chǎn)的相同蛋白酶，使得在這里所述的方法更加經(jīng)濟。這些很容易被實現(xiàn)，因為CBM-融合蛋白酶被設(shè)計不具有蛋白水解切割位點，使得阻礙CBM由CBM蛋白酶本身裂解。此外，如上文所述，這種復(fù)原通過用于洗脫的溫和條件使其成為可能，由此不損害洗脫的蛋白酶的活性。
由此，本發(fā)明進一步的優(yōu)點是其提供了能夠復(fù)原昂貴的、特異性蛋白水解酶的方法，由此額外降低了異源蛋白諸如尤其是，但不限于獲自基因修飾植物、植物材料和植物細胞的蛋白的下游加工中的親和純化的成本。
本發(fā)明成功地克服了與用于諸如但不限于農(nóng)業(yè)、化學(xué)工業(yè)和基于蛋白的藥物生產(chǎn)的大規(guī)模異源蛋白生產(chǎn)有關(guān)的下游加工的缺點。尤其是，提供了用較少的加工步驟由諸如植物纖維素材料的生物材料分離CBM-融合蛋白的新方法，所述加工步驟利用了可用于制藥工業(yè)的安全和更加經(jīng)濟的親和層析原則，維持高價值異源蛋白的活性的溫和洗脫條件，且包括能夠復(fù)原方法中的特異性高價值蛋白酶的加工步驟。


圖1是CBM蛋白酶純化方法以及CBM融合蛋白的蛋白水解裂解的優(yōu)選實施方案的示意圖。
圖2顯示了獲自實施例1的SDS-PAGE的分析結(jié)果。泳道1分子量大小標(biāo)記，泳道2純化的CBM9-2，泳道3來自碾磨的大麥種子的沖洗的固形物，泳道4生物材料相互作用后的上清液，泳道5用低鹽緩沖液進行的第一次沖洗，泳道6用高鹽緩沖液進行的第5次沖洗。
圖3顯示根據(jù)本發(fā)明方法由碾磨的大麥種子提取物成功純化CBM9-2，如在實施例2中的詳述。該圖顯示了具有200mL纖維素的膨脹床吸收(EBA)柱的洗脫圖。
圖4顯示獲自實施例3的結(jié)果。該圖示顯示了對照樣品的ELISA讀數(shù)以及包含融合于CBM9-2以及根據(jù)在這里所述的純化過程的小規(guī)模純化的目的異源蛋白的樣品的最小讀數(shù)。該柱顯示了(a)洗脫緩沖液，(b)來自轉(zhuǎn)基因種子的融合蛋白提取物，以及(c)由非-轉(zhuǎn)基因種子提取的蛋白測定的ELISA值。
發(fā)明詳述下面將具體描述本發(fā)明。
除非另有定義，在這里使用的所有技術(shù)和科學(xué)名詞具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解以及使用的含義相同。
術(shù)語“多肽”在這里是指任何氨基酸的聚合物，單體的或多聚體，且不涉及特定長度的氨基酸的聚合物。由此，例如，術(shù)語肽，寡肽，蛋白，和酶被包括在多肽的定義內(nèi)。此術(shù)語也包括具有表達后修飾諸如例如，糖基化，乙?；?，磷酸化等的多肽。
術(shù)語“目的異源多肽”或“目的多肽”在這里是指用于在植物-細胞或植物組織中利用本發(fā)明的方法或組合物表達的任意多肽。作為非-限制的實例，藥用多肽(例如，用于藥物用途)或工業(yè)多肽(例如，酶)可根據(jù)本發(fā)明來制備。
術(shù)語“下游加工”是指將生物技術(shù)產(chǎn)物分離和純化形成為適于其目的用途的形式。
術(shù)語“融合伴侶”在這里是指與CBM連接的異源蛋白。
術(shù)語“CBM融合蛋白”是指包括連接于異源蛋白的CBM的分子，且在上下文中其被理解為沒有蛋白水解切割位點的分子，除非另有所述。
術(shù)語“可操作連接”是指啟動子(核酸表達控制序列，或系列轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點)和第二核酸序列之間的功能性連接，其中啟動子指導(dǎo)對應(yīng)于第二序列的核酸的轉(zhuǎn)錄。
術(shù)語“變性”是指蛋白的天然結(jié)構(gòu)以及隨后蛋白活性被破壞的狀態(tài)，且蛋白被展開或不正確地折疊改變了其天然的三維結(jié)構(gòu)。
術(shù)語“表達”和“生產(chǎn)”是指基因產(chǎn)物的生物合成，包括所述基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄和翻譯。
“分子耕作”是指利用露天或在封閉設(shè)備中的任何種類植物的操作來在它們的組織中表達和產(chǎn)生異源蛋白。
術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”是指已導(dǎo)入非天然核酸序列且因此改變了其基因型的任何細胞，細胞系，組織植物部分，器官或生物及其存在非天然的核酸的子代。通常，通過遺傳工程方法將非天然核酸序列導(dǎo)入到基因型中或通過這種方法導(dǎo)入到父本細胞或植物的基因型中且隨后通過有性雜交或無性繁殖傳入到子代中。
瞬時表達是指通過瞬間導(dǎo)入的基因在生物中表達，沒有插入到生物的基因組中。因此，瞬時表達常常受時間的限制，且瞬時基因不傳遞給下一子代。
“基本上的序列同一性”在上下文中表示至少50％序列同一性，且更優(yōu)選地至少60％諸如至少70序列同一性，諸如至少80％和優(yōu)選地至少90％的序列同一性，諸如至少95％或99％的序列同一性。用于序列分析的算法是本領(lǐng)域已知的，諸如BLAST，Altschul等在J.Mol.Biol.(1990)215403-10中描述。通常，相對于，例如，“得分矩陣”和“缺口罰分”的默認值設(shè)置將用于比對。
術(shù)語“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)化的”是指將核酸序列導(dǎo)入到宿主生物的DNA基因組中，而與將核酸片段導(dǎo)入到宿主細胞中使用的技術(shù)無關(guān)。
“嗜熱的”是指生物的最佳生長溫度超過45℃。
術(shù)語“GMP”(優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn))是指產(chǎn)生生物藥物及其它藥物和醫(yī)療器材的方式。GMP要求包括標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，無菌條件，物質(zhì)和設(shè)備以及專業(yè)人員的確認。
可遺傳操作的單子葉和雙子葉植物可用于本發(fā)明。優(yōu)選植物為單子葉植物，更優(yōu)選地為大麥，且最優(yōu)選地為大麥(Hordeum vulgaris)?？蛇z傳轉(zhuǎn)化的植物為可導(dǎo)入，表達，穩(wěn)定維持，以及傳遞到隨后產(chǎn)生的子代中非天然DNA序列的植物，非天然DNA序列包括編碼區(qū)的DNA序列。遺傳操作和轉(zhuǎn)化方法已經(jīng)用于利用除草劑包括例如除草肽或basta或抗生素，諸如潮霉素作為選擇性標(biāo)記產(chǎn)生大麥植物。
方法本發(fā)明其它的目的，優(yōu)點，和新特征對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說依據(jù)下列實施例是顯而易見的，其并非用于限制的目的。另外，本發(fā)明如在上文描述的每一不同的實施方案和方面以及如在權(quán)利要求部分所要求的在下列實施例中發(fā)現(xiàn)實驗性的支持。
盡管僅僅具體描述了本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說可預(yù)料能產(chǎn)生本發(fā)明上述實施例所述的大量的改進和變化，只要不背離本發(fā)明的精神和范圍。
圖1說明了CBM-蛋白酶純化過程的示意圖，或在這方面，任何CBM-融合蛋白，該方法描述如下(1)用于該方法的起始材料是轉(zhuǎn)基因植物，獲自轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細胞的材料，包括但不限于，植物細胞的懸浮培養(yǎng)物以及愈傷組織的未分化細胞。在本發(fā)明的多種實施方案中，所述材料可以是瞬間表達異源蛋白的植物組織來源。該材料是以調(diào)控的方式表達可操作地連接于CBM開放閱讀框架的異源基因的轉(zhuǎn)基因材料，其已通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法被導(dǎo)入到植物細胞中，諸如，但不限于，農(nóng)桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或粒子轟擊-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或植物病毒載體-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。起始材料優(yōu)選地基于融合蛋白的令人滿意的表達水平來選擇，在啟動本發(fā)明所述方法之前由通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員進行RNA或蛋白水平的分析判斷。
(2)通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法實現(xiàn)破碎轉(zhuǎn)基因材料，其產(chǎn)生干燥或潤濕的狀態(tài)的均化植物組織和植物細胞?？蛇x自各種適合植物材料來源的方法。因此，對于種子而言，碾磨是破碎轉(zhuǎn)基因植物組織的良好方法，而對于葉和軟的綠色組織而言可采用諸如，但不限于韋林攪拌器，Sorvall Omnimixer或Poltron勻漿器的設(shè)備來實現(xiàn)。葉和較軟的組織還可以被冷凍干燥且隨后用于均化碾磨。用于破碎植物組織和植物細胞的設(shè)備是市售的且容易根據(jù)需要按比例放大。由植物來源提取蛋白的常規(guī)方法描述在S.Roe編輯出版的G.Paul Powell等，Protein purification applications，第2版，(2001)中。由植物來源提取可溶性蛋白的簡單且成功的方法是添加簡單的緩沖液類低鹽緩沖液到破碎的，攪勻的植物組織中，充分混合。為了抗氧化褐華，諸如添加聚乙烯吡咯烷(1％w/v)通常足以優(yōu)化由大多數(shù)植物組織純化以便由植物組織中螯合酚醛樹脂，否則可對待純化的異源蛋白有副作用。蛋白水解并非總是導(dǎo)致植物來源具有的問題。如果，然而，考慮蛋白水解，可將蛋白酶抑制因子，諸如，例如，絲氨酸-，半胱氨酸-和金屬蛋白酶抑制因子添加于提取緩沖液中。植物材料的破碎可在存在或缺少緩沖溶液的情況下進行。提取溶液可包含或不包含還原劑諸如，但不限于2-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)?？扇苄灾参锏鞍缀虲BM-融合蛋白一起存在于液相中(3)液體與植物材料的混合對于提取液相中的水溶性融合蛋白是必需的。添加的液體可包含或不包含調(diào)節(jié)優(yōu)選在約5.2至8.3范圍內(nèi)的pH的緩沖劑，其可包含或不包含任何(2)中所述目的蛋白的還原劑或螯合劑。以其簡單的形式，液體可以是水。液體與破碎和攪勻的植物材料充分混合后，液相現(xiàn)在包含CBM-融合蛋白。
(4)(A)在某種程度上取決于均化水平，破碎的植物材料和提取液體的混合物可以直接應(yīng)用于膨脹床吸附(EBA)柱。在此方法中，混合物被用于柱作為液體流流經(jīng)多糖特性的親合性吸附基質(zhì)的膨脹床。在液體流流經(jīng)柱的過程中，液相中的融合蛋白暴露于多糖基質(zhì)且通過CBM與多糖吸收劑介質(zhì)的選擇性親和力被選擇性吸附。粒子諸如，但不限于，細胞壁片段及其它固形物，與任何可溶性植物蛋白一起在流動液體中流經(jīng)EBA柱。
4(B)任選地，混合物中的大部分固體粒子可利用通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種方法在親合性結(jié)合步驟之前與液體分離，這些方法包括，但不限于沉淀，過濾，離心和沉降。如上文所述，丟棄固體且將包含CBM-融合蛋白的液體用于任選的加熱步驟4(C)或直接應(yīng)用于親合性結(jié)合步驟(5)。
4(C)在親合性步驟(5)之前任選加熱混合物或液體，但在其中CBM-融合蛋白在增加的溫度下保持可溶性的情況下可作為附加的純化步驟，而可溶性植物蛋白可能變性和沉淀且單子葉植物蛋白酶可能通過加熱被失活。為達到此目的，考慮CBM-融合蛋白的特性的加熱方法，可包括在加工過程中50℃到100℃的范圍內(nèi)加熱2分鐘至60分鐘范圍內(nèi)的一段時間。在這些實施方案中，嗜熱來源的CBM是尤其有益的。
(5)基質(zhì)結(jié)合親合性。包含植物來源的CBM-融合蛋白的液體蛋白提取物與和CBM具有親合性的多糖基質(zhì)接觸。接觸可以多種方式實現(xiàn)，諸如，但不限于，用多糖基質(zhì)填充的層析柱，其中液體以填充或膨脹的方式流經(jīng)柱，其是指多糖基質(zhì)的密度，或其可以批量方式實現(xiàn)，其中多糖基質(zhì)與液體在合適的容器中混合，隨后回收基質(zhì)和吸附的CBM-融合蛋白。多糖基質(zhì)可以是纖維素來源，諸如，但不限于，Avicel，或其可以是xylanoic來源，諸如不溶性木聚糖。CBM9-2的結(jié)合特異性和熱力學(xué)已在Boraston等(2001)的最新出版物中具體地研究。然而本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，按照本發(fā)明在這里描述的方法，CBM9-2不結(jié)合于植物細胞壁組分但很容易溶解，而保持對于諸如在親合性吸附步驟(5)使用的多糖基質(zhì)的良好的結(jié)合特異性。如在這里描述的，這種令人驚訝的特性給植物來源的CBM-融合蛋白的下游加工引入了幾個優(yōu)點，從而提供了大大改進了下游加工的方法。
(6)沖洗基質(zhì)。結(jié)合于CBM-融合蛋白的多糖親和吸附劑可以用幾個柱體積(如果親合性基質(zhì)置于層析柱中，相對量的術(shù)語)的水溶液(例如水)或緩沖液，諸如，但不限于磷酸鹽緩沖鹽水或基于Tris-的緩沖液進行沖洗。為提高沖洗步驟的效率，沖洗緩沖液的組合物可通過諸如但不限于，逐步改變解各柱體積的逐步改變或鹽濃度或去污劑的梯度的方式進行調(diào)節(jié)，用于由基質(zhì)釋放微弱但非特異性結(jié)合的污染蛋白。
(7)由基質(zhì)釋放融合蛋白。通過利用具有在這里描述的目的結(jié)合特性的CBM-s，由親合性基質(zhì)洗脫CBM-融合蛋白可以通過將CBM-融合蛋白暴露于競爭糖諸如，但不限于葡萄糖，半乳糖，乳糖，麥芽糖和纖維二糖得以實現(xiàn)。任一這些或其它類似的糖或其組合可以合適的量，諸如在1mM至1M濃度的范圍內(nèi)添加到洗脫緩沖液中諸如例如，磷酸鹽緩沖鹽水或基于Tris-的緩沖液以進行洗脫步驟。糖濃度可以是例如在25mM至1M的范圍內(nèi)，諸如50-500mM的范圍內(nèi)。這些糖是市售的低價散裝化學(xué)制品，進一步降低了本發(fā)明下游加工的總體成本。
(8)融合蛋白的分離/純化。進一步純化/分離CBM-蛋白酶在某些實例中是有益的或所需要的。這種進一步的分離可用任一通常本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的色譜分析法來實現(xiàn)，諸如，但不限于離子交換層析法或空間排阻層析。
(9)最終產(chǎn)物。這種情況下最終產(chǎn)物為是高度純化形式的CBM-蛋白酶，準(zhǔn)備用于必要時其最終形式的配制和包裝。
(10)包含蛋白水解切割位點的融合蛋白的分離。(1-9)描述的純化CBM-蛋白酶的方法可以是用于純化連接于CBM的任何異源蛋白的優(yōu)選方法。這種CBM-融合蛋白在CBM和目的異源蛋白之間可能含有或可能不含有蛋白水解切割位點。在本發(fā)明上文描述的優(yōu)選實施方案中，純化方法可連同CBM-蛋白酶用于裂解CBM-融合蛋白并由CBM-蛋白酶和裂解的CBM有效地分離目的異源蛋白。在蛋白水解裂解步驟(11)之前進一步分離含有蛋白水解切割位點的CBM-融合蛋白可能需要是或可能不需要，或在有些情況下可能是有益的。這些融合蛋白的分離可能對于改變含有具有蛋白水解切割位點的CBM-融合蛋白的緩沖液有用，使得調(diào)整其至有利于步驟(11)的蛋白水解裂解反應(yīng)的條件。這些分離可以用任一通常本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的色譜分析法來實現(xiàn)，諸如，但不限于，離子交換層析法或空間排阻層析。
(11)由異源蛋白融合伴侶來蛋白水解分離CBM。在該方法的這個階段，將含有蛋白水解切割位點的CBM-融合蛋白暴露于融合于CBM但沒有切割位點的特異性蛋白酶，該蛋白酶能夠識別切割位點且由目的異源蛋白分離CBM。連接CBM的特異性蛋白酶優(yōu)選選自切割位點-特異性蛋白酶的組，諸如腸激酶，因子Xa，凝血酶等等。裂解反應(yīng)完成后反應(yīng)溶液包括釋放的CBM，殘留的未裂解的CBM-融合蛋白，CBM-蛋白酶(例如，CBM-EK)，以及釋放的目的異源蛋白。
(12)CBM-蛋白酶和游離CBM與基質(zhì)的結(jié)合親合性。如上文步驟(5)中所述將含有所有這些組分的溶液與和CBM具有親合性的多糖基質(zhì)接觸。所有含有CBM的組分將吸附至親合性基質(zhì)上而釋放的高度純化的目的異源蛋白回收在液流中。
(13)異源蛋白的進一步分離。盡管目的異源蛋白已經(jīng)高度純化，在有些情況下進一步純化/分離可能是需要的或是有益的。這些進一步的分離可以是層析步驟，諸如，例如，離子交換層析法或空間排阻層析。
(14)最終產(chǎn)物。最終產(chǎn)物為是高度純化形式的CBM異源蛋白，準(zhǔn)備用于必要時其最終形式的配制(例如，冷凍干燥)和包裝。
(15)沖洗基質(zhì)此步驟可以如步驟(6)所述來進行。
(16)CBM-蛋白酶和CBM的釋放。利用上述步驟(7)所描述的洗脫條件，從溶液中回收CBM-蛋白酶。這些溶液的復(fù)原包括條件的中和和/或除去試劑(例如糖)，其影響由多糖親合性基質(zhì)釋放CBM。所述試劑可以由具有CBM蛋白酶的溶液中例如用超濾，透析，空間排阻層析以及在一定條件下的離子交換層析除去。如果需要，諸如空間排阻層析的某些這些方法還可以由殘留的CBM和CBM-融合蛋白純化CBM-蛋白酶。
(17)CBM-蛋白酶的復(fù)原。一旦CBM-蛋白酶復(fù)原回復(fù)到對所述多糖基質(zhì)重獲親合性的狀態(tài)，其可以被再次引入該方法中來如步驟(11)用于含有蛋白水解切割位點的CBM-融合蛋白的新一輪的蛋白水解裂解。盡管重構(gòu)的CBM-蛋白酶溶液可能含有來自前一反應(yīng)的殘留CBM和痕量的未裂解CBM-融合蛋白，它們將不干擾裂解的異源蛋白融合伴侶的純化，因為它們將與CBM-蛋白酶一起共-純化。因此，高價值特異性CBM-蛋白酶的有效復(fù)原提高了本發(fā)明的新方法的效率和經(jīng)濟性且能夠大規(guī)模生產(chǎn)和純化重組產(chǎn)生的蛋白，由此限制了以前下游加工的過高成本。
本發(fā)明其它的目的，優(yōu)點，和新特征對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說依據(jù)下列實施例是顯而易見的，其并非用于限制的目的。另外，本發(fā)明如在上文描述的每一不同的實施方案和方面以及如在權(quán)利要求部分所要求的在下列實施例中發(fā)現(xiàn)實驗性的支持。
實施例實施例1生物材料相互作用研究CBM9-2和碾磨的大麥種子在Retsch磨中將干燥的大麥種子細致地研磨成細粉末。將1g的碾磨種子用于通過5ml的低鹽緩沖液(pH7.02的50mM磷酸鉀緩沖液)從種子中提取水溶性組分，作為除去樣品的所有水溶性組分的方法，所述水溶性組分可能干擾生物材料相互作用的研究。渦旋混合物且翻轉(zhuǎn)5分鐘來確保液體和碾磨的大麥種子材料的充分混合。
混合之后，在5000×g離心樣品4分鐘來對固形物造粒。離心后，丟棄上清液。此過程用低鹽緩沖液重復(fù)3次，每次離心后丟棄上清液。然后用高鹽緩沖液(50mM磷酸鉀緩沖液pH7.02，1M NaCl)重復(fù)沖洗過程3次，如前所述丟棄上清液。產(chǎn)生的沖洗固形物為大部分的植物細胞-壁片段和不溶性淀粉。用低鹽緩沖液如上所述進行3次沖洗平衡沖洗的固形物，來獲得有助于親和層析中CBM9-2親合性結(jié)合于纖維素基質(zhì)的相同條件。將生物材料相互作用研究之前的固形物的典型樣本用于SDS-PAGE分析(泳道3)。將通過纖維素(AvicelTM)-親和柱(O.D.@280nm 0,394)純化的10μl細菌產(chǎn)生的CBM9-2，用于隨后的SDS-PAGE(泳道2)。將純化的CBM9-2預(yù)先重復(fù)(4x)稀釋且在超濾組件濃縮作為從CBM9-2脫附任何結(jié)合的葡萄糖的證明方法，以便恢復(fù)蛋白的纖維素結(jié)合親合特性。
將2ml的純化的CBM9-2添加于獲自碾磨大麥種子的沖洗、平衡的固形物且混合物在室溫下振蕩溫育60分鐘。溫育后，以5000×g旋轉(zhuǎn)混合物10分鐘，且隨后以13.000×g離心澄清上清液5分鐘。將來自生物材料相互作用的10μL澄清上清液用于SDS-PAGE分析(泳道4)。隨后將包括碾磨的大麥種子固形物的沉淀如上所述用低鹽緩沖液沖洗5次以及隨后用高鹽緩沖液沖洗5次。10μL的第1次低鹽緩沖液沖洗(泳道5)和第5次低鹽緩沖液沖洗(泳道6)，用于隨后的SDS-PAGE分析。為了由碾磨大麥種子固形物洗脫所有結(jié)合的CBM9-2，在以5000×g離心5分鐘和除去上清液(洗脫物)之前將1ml的洗脫緩沖液(50mMKPO4中的1M葡萄糖的，pH7.02)添加于固形物且混合溫育15分鐘。準(zhǔn)備10μl的洗脫物樣品用于SDS-PAGE分析(泳道7)。將生物材料相互作用研究和洗脫后的固形物的典型樣本用于SDS-PAGE分析(泳道8)。將制備用于SDS-PAGE的生物材料相互作用測定的樣品在12.5％SDS-PAGE凝膠(PhastGels同質(zhì)的12，5)上利用PhastSystem(AmershamPharmacia Biotech)進行SDS-PAGE。電泳完成后用考馬斯藍R-250對凝膠染色，以及脫色。結(jié)果顯示于圖2。
這些結(jié)果顯示CBM9-2沒有顯著地結(jié)合于獲自植物的細胞-壁或其它來自碾磨的大麥種子的不溶性固形物。
實施例2來自碾磨大麥種子的提取物的CBM9-2的純化利用市售的研磨機(Aarslev Maskinfabrik，Erhvervsvangen 11，5792Aarslev，DK)將大麥種子碾磨成精細的粉末。將產(chǎn)生的大麥粉以大麥粉∶緩沖液分別為2∶3的體積比在低鹽緩沖液(50mM磷酸鉀緩沖液pH7.02)中浸濕。將液體與粉末在容器中徹底混合并允許在4℃過夜沉淀。由細菌純化的CBM9-2添加至大麥種子-上清液中。第二天，將含有CBM9-2峰值的上清液(100ml)提供給含有纖維素(AvicelTM)的Streamline 25(Amersham Biotech)層析柱。以184cm/h的流速，膨脹床的方式進料，然后用5柱體積高鹽緩沖液(1MNaCl的50mM KPO4溶液，pH7.02)，然后5柱體積的低鹽緩沖液(50mM KPO4，pH7.02)進行沖洗。允許膨脹柱床沉淀(沉淀床＝20cm)并以92cm/h的300ml洗脫緩沖液(1M葡萄糖的50mM KPO4溶液，pH7.02)進行洗脫。洗脫條件產(chǎn)生含有CBM9-2蛋白的小峰(參見圖3)。
這表明利用上文描述的方法；首先，CBM9-2保持在溶液中與來自碾磨大麥種子的細胞-壁片段及其它未充分定義的固形物脫吸附，其次；利用本發(fā)明所述的多糖親和層析由碾磨的大麥種子提取物捕獲CBM9-2是可能的，第三；可通過利用較好限定的藥物級纖維素(Avicel)作為基質(zhì)來進行，和第四；可通過本發(fā)明所述的膨脹床方式進行親和層析步驟，第五；由大麥種子-提取物純化的CBM9-2可在本發(fā)明所述的溫和條件下由基質(zhì)洗脫而避免任何變性步驟。與如上文所述完全相同的條件和方法可用于由轉(zhuǎn)基因碾磨種子純化CBM9-2-融合蛋白。合適的方法描述在申請人同時申請的懸而未決的“由植物純化重組蛋白的非-變性方法”且在這里全文引入作為參考。
所述的多糖親和層析也有效的用于在如本發(fā)明所述的蛋白水解裂解反應(yīng)后由目的蛋白分離蛋白酶-CBM和切割的CBM。
實施例3從碾磨的，單一的大麥種子提取物純化連接于CBM9-2的異源蛋白。
在上文所述純化方法的小規(guī)模形式中，將表達連接于CBM9-2的目的異源蛋白的轉(zhuǎn)基因大麥植物的單一種子分別地均質(zhì)化為精細粉末。將產(chǎn)生的種子粉末以大麥粉末∶緩沖液分別為1∶7的體積比在低鹽萃取緩沖液(50mM磷酸鉀緩沖液pH7.02，0,01％聚乙烯吡咯烷)中浸濕。液體與單一種子粉末徹底混合1小時，且在室溫下以5分鐘的間隔振蕩將水溶性蛋白提取到液相中。
在離心機中以6000rpm旋轉(zhuǎn)提取物混合物10分鐘。收集來自個體種子的上清液(提取物)并應(yīng)用到充滿纖維素(AvicelTM)的微孔濾板(MSHVN45，MilliporeTM)上。將提取物添加于相應(yīng)微孔的纖維素中在室溫下以每3分鐘間隔攪拌持續(xù)15分鐘。15分鐘后，通過真空歧管(Multiscreen resist vacuum manifold-MAVM0960R，MilliporeTM)將真空將應(yīng)用于微孔板以排出每一孔中的來自纖維素(流經(jīng))的液體。如上文所描述的將纖維素進行沖洗步驟5柱(即填充纖維素的微孔)體積高鹽緩沖液(1M NaCl的50mM KPO4溶液，pH7.02)，然后5柱體積的低鹽緩沖液(50mM KPO4，pH7.02)。用250μl的洗脫緩沖液(1M葡萄糖的50mM KPO4溶液，pH7.02)進行洗脫。通過應(yīng)用真空到新鮮微孔板的微孔上來收集洗脫物。將洗脫物用于高度特異性ELISA CBM9-2分析，也即基于抗CBM9-2的特異性多克隆抗體。ELISA如下進行；將50μL適當(dāng)稀釋的抗原溶液(0.1-5ng蛋白)應(yīng)用于Nunc-Immuno 96微孔板的每一孔(Cat.no.442404)。微孔用透明膠帶覆蓋并在37℃溫育1小時。將抗原溶液移出微孔并用100μl TBS沖洗3次。用100μl每孔的封閉溶液封閉微孔，用透明膠帶覆蓋微孔并在37℃溫育1小時。丟棄封閉溶液后，用含有0.01％吐溫的100μlTBS沖洗微孔5次。將抗CBM9-2的初級抗體適當(dāng)?shù)叵♂屘砑?例如1/3000)在1％BSA的TBS(每孔50μL)中并用透明膠帶覆蓋且在37℃進一步溫育1小時。移出抗體溶液并用含有0.01％吐溫的TBS沖洗微孔10次。次級抗體(與辣根過氧化酶結(jié)合的)在1％BSA的TBS(50μl每孔)中1/3000稀釋。微孔用透明膠帶覆蓋并在37℃溫育1小時。棄去溶液后并用100μl含有0.01％吐溫的TBS沖洗8x以及用無吐溫的TBS沖洗2x，將100μl TMB One溶液(PromegaTM)添加至每孔并在室溫下溫育微孔板30秒-5分鐘。當(dāng)藍顏色展開時，添加100μl的0.2M硫酸。顏色變黃，并在微孔板讀數(shù)器中450nm處測定吸光度。
來自個體轉(zhuǎn)基因大麥種子的單一種子提取物的ELISA分析結(jié)果顯示于圖4中。以前用于證明CBM9-2特異性的ELISA分析表明，首先；可獲得和證明個體種子中異源融合蛋白的累積；上文所述的分離的具有切割位點的異源融合蛋白的工作，甚至小規(guī)模時依然支持了純化過程的規(guī)模能力；其表明異源融合蛋白在層析方法過程中沒有暴露于變性作用，由于洗脫后被特異性抗體識別而沒有涉及任何復(fù)性步驟，突出了如在上文討論的本發(fā)明相對于一些其它苛刻親和層析方法的優(yōu)點；在上文描述的純化方法適用于任何連接于CBM9-2的異源融合蛋白且不局限于捕獲CBM-蛋白酶。
實施例4CBM-蛋白酶的純化和活性測定為了產(chǎn)生具有連接CBM9-2標(biāo)記的位點特異性蛋白酶，方法如下構(gòu)建根癌農(nóng)桿菌菌株AGLO，使其含有攜帶由腸激酶cDNA之前的組成性啟動子，靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的信號序列以及將蛋白維持在ER中的保留信號組成的表達構(gòu)建體的二元質(zhì)粒，其中腸激酶cDNA被連接相當(dāng)于CBM9-2的cDNA。此農(nóng)桿菌菌株在選擇條件下培養(yǎng)在YEB培養(yǎng)基中，首先在10ml中28℃培養(yǎng)2天直至OD600為0.8。在28℃2-3天將少量的培養(yǎng)物1∶50稀釋為含有20μM乙酰丁香酮的500ml培養(yǎng)物并強烈振蕩至OD600nm為2.5。以6000rpm旋轉(zhuǎn)細菌10分鐘并再懸浮在MS-溶液中(含有55g/l蔗糖)至OD600為2.5。添加乙酰丁香酮(10mM)，終濃度為20uM。細菌懸液維持在室溫1小時并添加吐溫-20(10％)，終濃度為0.005％。
為了在萵苣植物中瞬時表達CBM-蛋白酶，將萵苣植物浸沒到含有農(nóng)桿菌細菌懸液的碗中15秒。隨后植物置于真空并施加0.4大氣壓力20分鐘，開放進氣口迅速地補償壓力。通過連續(xù)浸漬到裝有自來水的碗中來洗掉葉面上的過量細菌。萵苣植物置于培養(yǎng)箱中22℃以白天16小時/夜間8小時培養(yǎng)4天。
通過切除葉組織收獲植物并且隨后冷凍并保持在-86℃。利用研缽和液氮均化植物直至獲得非常精細的粉末。通過分別添加1.2∶1(體積∶體積)低-鹽萃取緩沖液和萵苣粉末提取粉狀萵苣葉材料，蛋白提取物在室溫下間或攪拌30分鐘。
提取物隨后以6000rpm離心20分鐘由液相分離固體物質(zhì)和細胞壁片段。丟棄上清液并如上所述再次旋轉(zhuǎn)。如上所述將澄清上清液填充到含有纖維素基質(zhì)(AvicelTM)的填充床柱上。CBM-蛋白酶特異性連接于纖維素基質(zhì)并且用5柱體積的高鹽和低鹽沖洗緩沖液分別沖洗后，在溫和，非-變性條件下用單一峰值的1M葡萄糖溶液由柱洗脫CBM-蛋白酶。
隨后利用微孔濃縮器(Ultrafree-15-Biomax-5)濃縮峰產(chǎn)物。
利用特定合成的底物根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Grant & Hermon-Taylor，1979)測定腸激酶活性合成的底物Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-萘酰胺(GD4K-na)；測定條件37℃。反應(yīng)體積為1.5ml。反應(yīng)混合物包括25μl 10mM GD4K-na(0.5mM)，125μl的100mMTris-HCl，pH8.4(25mM)，50μl 100％DMSO(10％)，50μl的100mM CaCl2(10mM)，(20-100)μl腸激酶，250μl蒸餾水-(20-100)μl。由λex＝337nm和λem＝420nm之間的熒光的增加測定β-萘胺形成的速率。連續(xù)地監(jiān)控5分鐘。
活性測定的結(jié)果表明所述產(chǎn)生和純化的CBM-腸激酶是活性的；腸激酶活性與空白0,0001cps/min/μg比較被測定為442,7cps/min/μg。
該實施例表明首先；CMB-蛋白酶可在植物中產(chǎn)生，在情況下在萵苣中瞬間產(chǎn)生，而且可利用上述所述純化方法成功地分離和純化CBM-蛋白酶。其進一步表明融合蛋白的CBM9-2親和性標(biāo)記具有完全的功能性；CBM-蛋白酶有效連接于纖維素基質(zhì)且其可以在本發(fā)明描述的溫和洗脫條件下由基質(zhì)洗脫下來，并且洗脫的蛋白酶被證明是具有完全活性的。酶促活性的純化產(chǎn)物本身提供了純化過程的非-變性特性的證據(jù)，如對部分或完全變性作用尤其敏感的酶活性，其容易導(dǎo)致活性的損失。此有效地表明本發(fā)明的所有組件是功能性的且它們的特性和性能使其可被容易地以本發(fā)明上述的方法應(yīng)用，產(chǎn)生改進了主要特異性、任何來源的異源蛋白的下游加工經(jīng)濟性和效率的方法。
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1.純化目的異源蛋白的方法，包括(a)提供了包含融合于由蛋白水解切割位點截斷的CBM的融合蛋白，(b)在促進所述蛋白酶蛋白水解裂解的條件下，將所述融合蛋白與融合于CBM的功能性蛋白酶接觸，從目的異源蛋白裂解CBM，(c)在其中CBM-蛋白酶和游離的CBM結(jié)合于所述多糖基質(zhì)且其中目的異源蛋白不保持在所述多糖基質(zhì)上的條件下，將CBM-蛋白酶，游離的CBM和目的異源蛋白的溶液與多糖基質(zhì)接觸，(d)由多糖基質(zhì)分離未-結(jié)合的目的異源蛋白，(e)用一或多種合適的水溶液沖洗具有結(jié)合的CBM-蛋白酶和CBM的多糖基質(zhì)，(f)通過調(diào)整影響所述CBM-蛋白酶由基質(zhì)釋放的條件由基質(zhì)洗脫CBM-蛋白酶；和(g)任選地復(fù)原所述洗脫的CBM-蛋白酶，來保持其與所述多糖基質(zhì)的親合性，使得復(fù)原的CBM-蛋白酶可再用于隨后步驟(a)-(b)方法的重復(fù)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述融合于CBM的蛋白酶來自腸激酶，煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶，因子X和凝血酶。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述蛋白酶為哺乳動物腸激酶(EK)或其腸激酶活性部分。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述EK包括牛EK的催化結(jié)構(gòu)域(EKc)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述牛EKc由SEQ ID NO2所示的核酸序列編碼。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述融合于CBM的蛋白酶和所述融合于通過蛋白水解切割位點截斷的CBM的異源蛋白單獨地通過生產(chǎn)和純化包含纖維素結(jié)合組件(CBM)的可溶性異源融合蛋白的方法由表達所述融合蛋白的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細胞獲得，包括步驟(a)破碎轉(zhuǎn)基因植物材料；(b)將提取液體添加于植物材料，由此產(chǎn)生可溶性和不溶性植物材料的混合物，以便由所述破碎的植物材料提取可溶性的融合蛋白至液相中來獲得蛋白提取物；(c)由包含所述目的融合蛋白的所述蛋白提取物中分離不溶性植物材料，包括細胞-壁物質(zhì)和固形物；(d)將所述蛋白提取物與結(jié)合于所述融合蛋白的多糖基質(zhì)接觸；(e)用一或多種合適的水溶液沖洗具有結(jié)合的融合蛋白的基質(zhì)，和(f)通過調(diào)整影響所述融合蛋白由基質(zhì)釋放的條件由所述多糖基質(zhì)洗脫融合蛋白。因此獲得大體上純化的可溶性異源融合蛋白。
7.權(quán)利要求6的方法，其中分離步驟(c)包括選自膨脹床吸附(EBA)，填充式層析，沉淀，過濾，離心或其任意組合的方法。
8.權(quán)利要求6的方法，其中在步驟(d)中親和性結(jié)合于所述多糖基質(zhì)包括層析步驟。
9.權(quán)利要求6的方法，其中步驟(c)和步驟(d)在組合的單一步驟中同時進行。
10.權(quán)利要求6的方法，在包括用多糖基質(zhì)的膨脹床吸附的工藝步驟中將步驟(c)和(d)結(jié)合，作為由所述蛋白提取物同時分離細胞-壁物質(zhì)和固形物以及將所述CBM-融合蛋白親和結(jié)合到多糖基質(zhì)上的方法。
11.權(quán)利要求1-10任一項的方法，其中所述多糖基質(zhì)包括纖維素。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述纖維素是藥學(xué)上相容的纖維素。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述纖維素為AvicelTM。
14.權(quán)利要求1-12任一項的方法，其中所述洗脫的CBM-蛋白酶的復(fù)原包括中和，和/或由CBM-蛋白酶洗脫液中除去影響CBM從所述多糖基質(zhì)中釋放的試劑。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述復(fù)原包括中和或從洗脫液除去諸如糖的碳水化合物。
16.權(quán)利要求1-15任一項的方法，其中包含所述目的異源蛋白的所述融合蛋白由轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞表達和回收或在植物，植物組織或植物細胞中瞬時表達。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞選自雙子葉植物和單子葉植物。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述植物細胞或轉(zhuǎn)基因植物選自煙草，油菜籽，大豆，苜蓿，萵苣，大麥，玉米，小麥，燕麥和水稻。
19.權(quán)利要求1的方法，其中融合于所述異源蛋白的所述CBM和融合于所述蛋白酶的所述CBM是熱穩(wěn)定的并且在升高的溫度下保持可溶性。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述CBMs之一或二者是由來自海棲熱袍菌的木聚糖酶10A基因的區(qū)域編碼的CBM。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述CBMs之一或二者是由包含序列SEQ ID NO1的序列，或編碼相同氨基酸序列的序列，或編碼與所述序列具有基本上的序列同一性的氨基酸序列的序列編碼。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過提供適于親和純化的融合蛋白的高價值異源蛋白的蛋白純化的改進方法以及融合蛋白的蛋白水解裂解的改進和經(jīng)濟的方法。這些方法可用于由植物、獲自植物的組織或植物細胞大規(guī)模生產(chǎn)純化的重組蛋白。本發(fā)明目的在于減少成本和改進在植物及其它生物生產(chǎn)系統(tǒng)產(chǎn)生的異源蛋白的下游加工的質(zhì)量。
文檔編號C12P21/06GK1842600SQ200480024617
公開日2006年10月4日 申請日期2004年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月27日
發(fā)明者埃納爾·門蒂萊, 比約登·拉魯斯·奧瓦爾 申請人:奧夫萊夫塔埃克尼公司