專利名稱：：包含連接肽的修飾的結(jié)合分子的制作方法相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2003-6-27提交的題為“多肽的純化和優(yōu)選合成，”的USSN60/483877以及2003-10-3提交的題為“抗原結(jié)合多肽的純化和優(yōu)選合成，”的USSN60/508,810的優(yōu)先權(quán)。該申請(qǐng)還要求2003-10-28提交的題為“包含連接肽的修飾的抗體分子，”的USSN60/515,351以及2003-10-30提交的題為“包含連接肽的修飾的抗體分子，”的USSN60/516,030的優(yōu)先權(quán)。該申請(qǐng)還與200406028提交的題為“連接多肽的純化和優(yōu)選合成”的USSNXX/XXXXXX有關(guān)。這些申請(qǐng)的全文內(nèi)容包含在本文作為參考。
背景技術(shù)：
：抗體是二聚體分子；組成該二聚體的每個(gè)單體包含一條輕鏈和一條重鏈?？贵w分子的溶液以兩種與鉸鏈異質(zhì)性相關(guān)的形式存在。利用對(duì)純化的MabMAb的SDS-PAGE分析，通常這兩種形式作為兩條蛋白帶即一條主要帶(MW大約150-160kDa)和一條次要帶(MW大約75-80kDa)而被觀察到。該后一種形式通常在對(duì)純化的IgG4制備物的SDS-PAGE分析之后觀察到，但可在所有IgG同種型包括純化的重組中MAb以低得多的頻率得以鑒定(Angaletal.1993.Mol.Immunol.30105；Norderhaugetal.1990.Eur.J.Immunol.212370)。較大分子量的同種型，稱為A型，含有位于對(duì)應(yīng)Kabat編號(hào)系統(tǒng)位置239和242(位置226和229，EU編號(hào)系統(tǒng))的共價(jià)鏈間二硫鍵(Kabat，E，Wu，TT，Perry，HM，Gottesman，KS，F(xiàn)oeller，CSequencesofProteinsofImmunologicalInterest.Bethesda，USDepartmentofHealth和人Services，NIH，1991)。第二種同種型B型，被認(rèn)為不包含兩條重鏈之間的共價(jià)連接以及兩個(gè)相鄰半胱氨酸殘基之間的鏈間二硫鍵，如非還原性SDS-PAGE電泳中所見的75-80kDa證實(shí)的。推定B型的兩條重鏈由與該分子的CH3結(jié)構(gòu)域區(qū)域相關(guān)的強(qiáng)的非共價(jià)(即離子)相互作用來連接。A型和B型的混合物不存在于Mab片段的溶液中，所述片段含有完整鉸鏈區(qū)，但缺乏CH3區(qū)，諸如F(ab)2片段。通常，遺傳改造的或酶消化的F(ab)2Mab制備物缺乏B型，這是由于該分子缺乏保持非共價(jià)相互作用(例如氫鍵結(jié)合)所需的結(jié)構(gòu)域。然而，它們存在于含有CH3區(qū)的Mab制備物諸如IgG4，CH2區(qū)缺失的Mab片段(例如，如02/060955A2中所述)以及微型抗體(見例如，Huetal.1996.CancerResearch563055)中。將蛋白改造技術(shù)應(yīng)用于治療性抗體設(shè)計(jì)也產(chǎn)生出多種抗體模式，其具有改變的，在一些情況中具有改良的藥效學(xué)、生物分布以及活性圖譜。一些改變的抗體分子中，鉸鏈區(qū)中的許多半胱氨酸殘基被減少到一個(gè)，以促進(jìn)抗體分子的聚集，因?yàn)榘腚装彼釟埢鶅H僅對(duì)于形成單個(gè)二硫鍵是必需的。這還提供了將鉸鏈區(qū)附著于另一鉸鏈區(qū)或者效應(yīng)分子或報(bào)道分子的特異性靶(美國專利5,677,425)?？贵w鉸鏈中的半胱氨酸殘基數(shù)目也增加(美國專利5,677,425)。其它突變的抗體被構(gòu)建，其中IgG1鉸鏈區(qū)和CH2結(jié)構(gòu)域用人IgG3鉸鏈區(qū)替換(WO97/11370)。這些分子含有11個(gè)巰基用于經(jīng)由硫醇基替換多個(gè)半抗原。CH2結(jié)構(gòu)域缺失的抗體的分子量約為120kDa，并且顯示與全長IgG相比，其穿透腫瘤的能力明顯更好。微型抗體，其也缺失CH2結(jié)構(gòu)域，具有相似的性質(zhì)。這些結(jié)構(gòu)域缺失的分子在腫瘤位點(diǎn)的聚集比其它Mab片段諸如F(ab)′2更為有效，但不具有利用完整IgG抗體時(shí)所見的不利藥效學(xué)圖譜。CH2結(jié)構(gòu)域缺失的抗體由以下部分組成VLCL輕鏈和VH1重鏈結(jié)構(gòu)域以及與CH3結(jié)構(gòu)域基因融合(直接和經(jīng)由修飾的肽間隔物)的部分鉸鏈區(qū)(例如，上和中鉸鏈)。例如，重組CH2結(jié)構(gòu)域缺失的ddCC49的合成，識(shí)別各種人癌癥上表達(dá)的腫瘤相關(guān)的TAG72抗原的結(jié)構(gòu)域缺失的抗體，在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生大約50∶50分布的A和B同種型。改造為表達(dá)其它形式的CH2結(jié)構(gòu)域缺失的抗體，所述抗體例如四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域缺失的抗體，微型抗體，或四價(jià)微型抗體的細(xì)胞也表達(dá)A和B同種型和/或單體半-體(mer)分子組成的混合物。即使在Mab純化以后，A型和B型也極難分離，這是由于它們由相同的氨基酸組成，由此具有相同的分子量和類似的物理和化學(xué)性質(zhì)。它們不能通過通常用于純化抗體分子包括重組MAb蛋白的標(biāo)準(zhǔn)凝膠過濾，親和層析，和離子交換層析來分離。目前的生產(chǎn)工藝丟棄所產(chǎn)生總抗體的至少50％，這對(duì)總產(chǎn)率具有負(fù)面影響。此外，兩種同種型的存在增加下游加工所需的努力。因此，分離A型和B型的方法或增加一種或另一種形式的抗體的生物合成的方法非常有益。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明至少部分基于以下發(fā)現(xiàn)在包含含有不同同種型的二聚體多肽分子(包含兩個(gè)重鏈部分的分子，其中部分分子包含經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵(A型)連接的兩個(gè)重鏈部分，部分分子包含不經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接的兩個(gè)重鏈部分(B型))混合物的組合物中，一種形式或另一種可優(yōu)選獲得，例如通過利用疏水作用層析分離或通過包含導(dǎo)致A型或B型的優(yōu)選生物合成的合成連接肽。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子是四價(jià)的。本發(fā)明的連接肽可包含在傾向于形成A型和B型的任何二聚體分子中，例如抗體分子，結(jié)構(gòu)域缺失的抗體分子(例如缺乏所有或部分CH2結(jié)構(gòu)域)，微型抗體，二價(jià)抗體，融合蛋白等。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，A型的形成被增強(qiáng)。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及組合物，其包含含有至少四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和至少兩條多肽鏈的多肽二聚體，其中所述至少兩條多肽鏈包含至少一個(gè)重鏈部分和合成連接肽，其中超過約50％的所述多肽二聚體經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接。另一實(shí)施方案中，超過約90％的所述二聚體經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接。另一實(shí)施方案中，至少一條所述多肽鏈包含經(jīng)由連接肽連接于VL，VH或CH1結(jié)構(gòu)域的CH3結(jié)構(gòu)域。另一實(shí)施方案中，所述多肽鏈缺乏所有或部分CH2結(jié)構(gòu)域。另一實(shí)施方案中，所述二聚體經(jīng)由兩個(gè)或多個(gè)鏈間二硫鍵連接。另一實(shí)施方案中，所述重鏈部分源自選自下組的抗體同種型IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4。另一實(shí)施方案中，所述重鏈部分包含源自選自下組的鉸鏈區(qū)的氨基酸序列γ1鉸鏈，γ2鉸鏈，γ3鉸鏈，或γ4鉸鏈。另一實(shí)施方案中，所述分子是雙特異性的。另一實(shí)施方案中，所述分子包含至少一個(gè)對(duì)可溶配體特異的結(jié)合位點(diǎn)。另一實(shí)施方案中，所述分子包含至少一個(gè)對(duì)細(xì)胞表面分子特異的結(jié)合位點(diǎn)。另一實(shí)施方案中，所述所述分子包含對(duì)腫瘤細(xì)胞抗原特異的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)以及對(duì)前體藥物特異的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。另一實(shí)施方案中，所述對(duì)前體藥物特異的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是催化性的。另一實(shí)施方案中，所述合成連接肽包含位于Kabat編號(hào)系統(tǒng)的位置243的脯氨酸殘基。另一實(shí)施方案中，所述合成連接肽還包含位于Kabat編號(hào)系統(tǒng)的位置244的丙氨酸殘基以及位置245的脯氨酸殘基。另一實(shí)施方案中，所述重鏈部分包含嵌合鉸鏈。另一實(shí)施方案中，所述合成連接肽包含至少部分IgG1鉸鏈結(jié)構(gòu)域，至少部分IgG3鉸鏈結(jié)構(gòu)域。另一實(shí)施方案中，所述連接肽選自包含SEQIDNO8-15和48組成的組的氨基酸序列。第二方面中，本發(fā)明提供了治療受試者的方法，所述受試者將從利用抗體結(jié)合分子的治療獲益，所述方法包括將包含含有不同同種型的二聚體多肽分子混合物的組合物給予受試者，其中一種同種型和另一種優(yōu)選獲得，使得治療發(fā)生。一種實(shí)施方案中，所述受試者患有癌癥。另一實(shí)施方案中，所述受試者患有淋巴瘤。另一實(shí)施方案中，所述受試者患有自身免疫疾病或病癥。另一實(shí)施方案中，所述受試者患有炎性疾病或病癥。第三個(gè)方面中，本發(fā)明提供核酸分子，其包含編碼多肽分子的核苷酸序列，所述多肽分子包含不同同種型(包含兩條重鏈部分的分子，其中一部分分子包含兩個(gè)經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接的兩個(gè)重鏈部分(A型)，且一部分分子包含不經(jīng)由至少一個(gè)連接二硫鍵連接的兩個(gè)重鏈部分(B型))，使得一種形式或另一種可被優(yōu)選獲得。一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽二聚體包含四條多肽鏈，且其中所述多肽鏈中的兩條包含至少一個(gè)重鏈部分和合成連接肽。另一實(shí)施方案中，所述核酸分子包含圖8B所示的核苷酸序列(SEQIDNO17)。另一實(shí)施方案中，所述核酸分子包含圖8C所示的核苷酸序列(SEQIDNO18)。另一實(shí)施方案中，所述核酸分子包含圖10B所示的核苷酸序列(SEQIDNO23)。另一實(shí)施方案中，所述核酸分子包含圖12A所示的核苷酸序列(SEQIDNO26)。另一實(shí)施方案中，所述核酸分子包含圖12B所示的核苷酸序列(SEQIDNO27)。另一實(shí)施方案中，所述核酸分子包含圖14所示的核苷酸序列(SEQIDNO30)。另一實(shí)施方案中，所述核酸分子包含圖15所示的核苷酸序列(SEQIDNO31)。另一實(shí)施方案中，所述核酸分子是載體。另一實(shí)施方案中，所述載體是宿主細(xì)胞。第四方面中，本發(fā)明提供結(jié)合分子，其包含編碼多肽分子的氨基酸序列，所述多肽分子包含不同同種型(包含兩條重鏈部分的分子，其中一部分分子包含兩個(gè)經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接的兩個(gè)重鏈部分(A型)，且一部分分子包含不經(jīng)由至少一個(gè)連接二硫鍵連接的兩個(gè)重鏈部分(B型))，使得一種形式或另一種可被優(yōu)選獲得。一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含圖9B的氨基酸序列(SEQIDNO20)。另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含圖9C的氨基酸序列(SEQIDNO21)。另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含圖11B的氨基酸序列(SEQIDNO25)。另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含圖13A的氨基酸序列(SEQIDNO28)。另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含圖13B的氨基酸序列(SEQIDNO29)。另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含圖16的氨基酸序列(SEQIDNO32)。另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含圖17的氨基酸序列(SEQIDNO33)。第五個(gè)方面中，本發(fā)明提供了組合物，其包含二聚體多肽分子的混合物，所述多肽分子包含不同同種型(包含兩條重鏈部分的分子，其中一部分分子包含兩個(gè)經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接的兩個(gè)重鏈部分(A型)，且一部分分子包含不經(jīng)由至少一個(gè)連接二硫鍵連接的兩個(gè)重鏈部分(B型))，使得一種形式或另一種可被優(yōu)選獲得，其中所述結(jié)合位點(diǎn)獨(dú)立選自抗原結(jié)合位點(diǎn)，受體的配體結(jié)合位點(diǎn)，配體的受體結(jié)合位點(diǎn)組成的組。一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽鏈具有至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其源自選自下組的抗體2B8，Lym1，Lym2，LL2，Her2，B1，MB1，BH3，B4，B72.3，CC49，5E8，B3F6，或5E10。另一實(shí)施方案中，所述多肽二聚體是四價(jià)微型抗體分子。另一實(shí)施方案中，所述多肽二聚體是四價(jià)結(jié)構(gòu)域缺失的抗體分子。另一實(shí)施方案中，所述多肽二聚體是二價(jià)抗體。第六個(gè)方面中，本發(fā)明提供包含微型抗體分子的組合物，所述微型抗體分子包含兩條多肽鏈，其中所述多肽鏈包含重鏈部分和合成連接肽，其中所述多肽鏈缺乏所有或部分CH2結(jié)構(gòu)域，其中超過約50％的分子以所述多肽鏈之一經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接的形式存在。一個(gè)實(shí)施方案中，超過約90％的二聚體經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接。另一實(shí)施方案中，至少一條多肽鏈包含經(jīng)由連接肽基因融合于VL，VH或CH1結(jié)構(gòu)域的CH3結(jié)構(gòu)域。另一實(shí)施方案中，所述多肽鏈缺乏整個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域。另一實(shí)施方案中，所述二聚體經(jīng)由兩個(gè)或多個(gè)鏈間二硫鍵連接。另一實(shí)施方案中，所述重鏈部分源自選自下組的抗體同種型IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4。另一實(shí)施方案中，所述重鏈部分包含源自選自下組的鉸鏈區(qū)的氨基酸序列γ1鉸鏈，γ2鉸鏈，γ3鉸鏈，或γ4鉸鏈。另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合位點(diǎn)獨(dú)立選自以下組抗原結(jié)合位點(diǎn)，受體的配體結(jié)合部分，或配體的受體結(jié)合部分。另一實(shí)施方案中，所述分子是雙特異性的。另一實(shí)施方案中，所述連接肽包含位于Kabat編號(hào)系統(tǒng)的位置243的脯氨酸殘基。另一實(shí)施方案中，所述合成連接肽包含嵌合鉸鏈。另一實(shí)施方案中，所述合成連接肽包含至少部分IgG1鉸鏈區(qū)，至少部分IgG3鉸鏈區(qū)。第七方面，本發(fā)明提供了治療可從利用抗原結(jié)合分子的療法獲益的受試者的方法，包括給予所述受試者包含微型抗體分子的組合物，所述微型抗體包含兩條多肽鏈，其中所述多肽鏈包含重鏈部分和合成連接肽，其中所述多肽鏈缺乏所有或部分CH2結(jié)構(gòu)域，且其中超過約50％的分子以其中一條多肽鏈經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接的形式存在，使得治療出現(xiàn)。另一方面，本發(fā)明提供了包含編碼多肽鏈的核苷酸序列的核酸分子，所述多肽鏈包含重鏈部分和合成連接肽，其中所述多肽鏈缺乏所有或部分CH2結(jié)構(gòu)域，且其中超過約50％的分子以其中一條多肽鏈經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接的形式存在。另一方面，本發(fā)明提供了包含包含多肽二聚體的組合物，其中所述多肽二聚體具有至少四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和至少兩條多肽鏈，其中所述至少兩條多肽鏈包含至少一個(gè)重鏈部分并缺乏所有或部分CH2結(jié)構(gòu)域，且其中超過約50％的分子經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接。附圖簡述圖1顯示結(jié)構(gòu)域缺失的抗體中，作為120kDa二聚體的A型和作為60kDa單體的B型。圖2圖示了示例性的雙鏈二聚體微型抗體和示例性的雙鏈二聚體四價(jià)微型抗體，它們分別包含鉸鏈連接肽(HCP)。其它結(jié)構(gòu)也可能，例如，所述包含連接肽(HCP)的雙鏈二聚體四價(jià)微型抗體也可構(gòu)建成雙特異性的。另一實(shí)施方案中，scFv中VH和VL結(jié)構(gòu)域的方向可改變。圖3圖示了包含鉸鏈連接肽(HCP)的四鏈二聚體二價(jià)抗體。包含鉸鏈連接肽(HCP)的四鏈二聚體二價(jià)抗體也可構(gòu)建成雙特異性的。VH和VL結(jié)構(gòu)域的方向可改變。圖4圖示了四鏈二聚體四價(jià)scFv抗體(C-scFv四價(jià)抗體)和四鏈四價(jià)scFvCH2結(jié)構(gòu)域缺失的抗體(C-scFv四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域缺失的抗體)，它們分別包含附著于CH3羧基末端的scFv以及鉸鏈連接肽。scFv中VH和VL結(jié)構(gòu)域的方向可改變。圖5圖示了包含鉸鏈連接肽(HCP)的四鏈二聚體CH2結(jié)構(gòu)域缺失的四價(jià)(NL-scFvCH2結(jié)構(gòu)域缺失的四價(jià))抗體。包含連接肽(HCP)的四鏈二聚體CH2結(jié)構(gòu)域缺失的四價(jià)抗體也可構(gòu)建成雙特異性的。附著于輕鏈的scFv中VH和VL結(jié)構(gòu)域的方向可改變。圖6圖示了包含鉸鏈連接肽(HCP)的四鏈二聚體CH2結(jié)構(gòu)域缺失的四價(jià)(NH-scFvCH2結(jié)構(gòu)域缺失的四價(jià))抗體。包含連接肽(HCP)的四鏈二聚體CH2結(jié)構(gòu)域缺失的四價(jià)抗體也可構(gòu)建成雙特異性的。附著于重鏈的scFv中VH和VL結(jié)構(gòu)域的方向可改變。圖7圖示了包含鉸鏈連接肽(HCP)的雙鏈二聚體四價(jià)微型抗體(C-scFv四價(jià)微型抗體)。包含連接肽(HCP)的雙鏈二聚體四價(jià)微型抗體也可構(gòu)建成雙特異性的。scFv中VH和VL結(jié)構(gòu)域的方向可改變。圖8A(SEQIDNO16)顯示重鏈CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)(C-scFv四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域缺失的)huCC49基因的單鏈DNA序列。圖8B(SEQIDNO17)顯示含有合成G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的重鏈四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)(C-scFv四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域缺失的)huCC49基因的單鏈DNA序列。圖8C(SEQIDNO18)顯示輕鏈CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)(C-scFv四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域缺失的)huCC49的單鏈DNA序列。圖9A(SEQIDNO19)顯示重鏈CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)(C-scFv四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域缺失的)huCC49的氨基酸序列。圖9B(SEQIDNO20)顯示含有合成G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的重鏈CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)(C-scFv四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域缺失的)huCC49的氨基酸序列。圖9C(SEQIDNO21)顯示輕鏈CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)(C-scFv四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域缺失的)huCC49的氨基酸序列。圖10A(SEQIDNO22)顯示CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的huCC49四價(jià)(N-scFv四價(jià))微型抗體基因的單鏈DNA序列。圖10B(SEQIDNO23)顯示含有合成G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的(N-scFv四價(jià))huCC49四價(jià)微型抗體基因的單鏈DNA序列。圖11A(SEQIDNO24)顯示四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的(N-scFv四價(jià))huCC49微型抗體的氨基酸序列。圖11B(SEQIDNO25)顯示含有合成G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的(N-scFv四價(jià))huCC49微型抗體的氨基酸序列。圖12A(SEQIDNO26)顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的重鏈四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8sc(Fv)2(C-scFv四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域缺失的)抗體基因的單鏈DNA序列。圖12B(SEQIDNO27)顯示輕鏈四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的(C-scFv四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域缺失的)PRIMATIZEDp5E8sc(Fv)2基因的單鏈DNA序列。圖13A(SEQIDNO28)顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的重鏈四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的(C-scFv四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域缺失的)PRIMATIZEDp5E8sc(Fv)2抗體的氨基酸序列。圖13B(SEQIDNO29)顯示輕鏈四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的(C-scFv四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域缺失的)PRIMATIZEDp5E8sc(Fv)2抗體的氨基酸序列。圖14(SEQIDNO30)顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8VL/VH微型抗體基因的單鏈DNA序列。圖15(SEQIDNO31)顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8VH/VL微型抗體基因的單鏈DNA序列。圖16(SEQIDNO32)顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8VL/VH微型抗體的氨基酸序列。圖17(SEQIDNO33)顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8VH/VL微型抗體的氨基酸序列。圖18顯示來自產(chǎn)生huCC49結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)(C-scFv四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域缺失的)抗體的五個(gè)獨(dú)立克隆的上清的Western印跡。每種上清都在還原和非還原條件下進(jìn)行電泳。圖19顯示純化的A型和B型huCC49結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)(C-scFv四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域缺失的)抗體的考馬斯藍(lán)染色的凝膠。每種抗體都在還原和非還原條件下進(jìn)行電泳。圖20純化的A型huCC49結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)(C-scFv四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域缺失的)抗體主要作為單個(gè)峰通過HPLC大小排阻層析洗脫。圖21顯示A型huCC49結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)(C-scFv四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域缺失的)抗體與TAG-72抗原來源牛頜下粘蛋白的競爭結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果，所述試驗(yàn)利用Delphia熒光計(jì)(WallacInc，Gaithersburg，MD)通過時(shí)間分辨的熒光免疫測定法(time-resolvedfluorometicimmunoassay)進(jìn)行。圖22顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的huCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)(C-scFv四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域缺失的)抗體的代表性克隆的上清的Western印跡。圖23顯示純化的、含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的A型huCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)G1/G3/PAP(C-scFv四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域缺失的)抗體的考馬斯藍(lán)染色的凝膠。圖24顯示純化的、含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的A型huCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)G1/G3/PAP(C-scFv四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域缺失的)抗體主要作為單個(gè)峰通過HPLC大小排阻層析洗脫。圖25顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的A型huCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)G1/G3/PAP(C-scFv四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域缺失的)抗體與TAG-72抗原來源牛頜下粘蛋白的競爭結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果，所述試驗(yàn)利用Delphia熒光計(jì)(WallacInc，Gaithersburg，MD)通過時(shí)間分辨的熒光免疫測定法進(jìn)行。圖26顯示來自產(chǎn)生huCC49微型抗體，huCC492sc(Fv)2四價(jià)抗體(N-scFv四價(jià)huCC49微型抗體)，和huCC49CH2結(jié)構(gòu)域缺失的抗體的代表性克隆的上清的Western印跡。Western印跡對(duì)在還原和非還原條件下電泳的上清進(jìn)行。圖27顯示來自產(chǎn)生huCC492sc(Fv)2四價(jià)抗體(N-scFv四價(jià)huCC49微型抗體)和含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的huCC492sc(Fv)2四價(jià)抗體(N-scFv四價(jià)huCC49微型抗體)的代表性克隆的上清的Western印跡。圖28顯示純化的、含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的A型huCC49結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體(N-scFv四價(jià)微型抗體)的考馬斯藍(lán)染色的凝膠。圖29顯示純化的、含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的A型huCC49結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體(N-scFv四價(jià)微型抗體)主要作為單個(gè)峰通過HPLC大小排阻層析洗脫。圖30顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的huCC49結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體(N-scFv四價(jià)微型抗體)，huCC49微型抗體，含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的huCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體(C-scFv四價(jià)抗體)，和對(duì)照親本CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的huCC49(稱為HuCC49或IDEC159)與TAG-72抗原來源牛頜下粘蛋白的競爭結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果，所述試驗(yàn)利用Delphia熒光計(jì)(WallacInc，Gaithersburg，MD)通過時(shí)間分辨的熒光免疫測定法進(jìn)行。圖31顯示產(chǎn)生含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的(C-scFv四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域缺失的)PRIMATIZEDp5E8sc(Fv)2抗體的細(xì)胞系的上清的Western印跡。圖32顯示產(chǎn)生CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的huCC49VL/VH微型抗體的五個(gè)獨(dú)立細(xì)胞系的上清的Western印跡。微型抗體樣品在非還原性變性條件下分析，顯示A型和B型同種型的存在。圖33顯示含有結(jié)合于CD23抗原的G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的PRIMATIZEDp5E8VH/VL和VL/VH微型抗體的ELISA結(jié)合測定的結(jié)果。p5E8G1是完整全長PRIMATIZEDIgG1。圖34顯示產(chǎn)生含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的PRIMATIZEDp5E8VH/VL和VL/VH微型抗體的細(xì)胞系的上清的Western印跡。圖35A顯示對(duì)照親本huCC49和huCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體的腫瘤保留，表示為％ID/gm。圖35B顯示相對(duì)于峰抗體聚集標(biāo)準(zhǔn)化的相同的腫瘤保留數(shù)據(jù)。發(fā)明詳述人(Ig)，包括單克隆抗體(MAb)，可以以兩種與鉸鏈異源性相關(guān)的形式存在。在天然溶液中，這些形式都作為二聚體蛋白(每個(gè)單體包含一條重鏈和一條輕鏈)存在。一個(gè)免疫球蛋白分子包含大約150-160kDa的穩(wěn)定四鏈構(gòu)建體，其中二聚體通過鏈間重鏈二硫鍵(A型)連接在一起，一個(gè)包含其中二聚體不通過鏈間二硫鍵連接的形式(B型)。B型還在天然條件下形成穩(wěn)定二聚體，但可在變性的非還原條件下鑒定，其中重鏈解離產(chǎn)生75-80kDa分子。這些形式非常難于分離，甚至在Mab親和力純化之后還是如此。各種完整IgG同種型中B型出現(xiàn)的頻率是由于但不限于與MAb分子的鉸鏈區(qū)同種型相關(guān)的結(jié)構(gòu)差異。實(shí)際上，人IgG4鉸鏈的鉸鏈區(qū)中的單個(gè)氨基酸取代可明顯減少B型的出現(xiàn)(Angaletal.1993.MolecularImmunology30105)至利用人IgG1鉸鏈通常觀察到的水平。然而，對(duì)其中保留了CH3結(jié)構(gòu)域的MAb片段進(jìn)行相同的氨基酸取代不能消除B型的產(chǎn)生。通常，細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的所有重組CH2結(jié)構(gòu)域缺失的抗體通常導(dǎo)致鉸鏈異源性，其不能經(jīng)由鉸鏈中相似的分子突變來校正。本發(fā)明通過提供例如分離第一種二聚體多肽與第二種二聚體多肽的方法對(duì)現(xiàn)有技術(shù)作出貢獻(xiàn)，其中第一種和第二種多肽包含至少兩條多肽鏈，所述多肽鏈中至少有兩條包含至少一個(gè)重鏈部分。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽缺乏所有或部分CH2結(jié)構(gòu)域。所述單體經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接(本文稱為“A型”)，并且第二種多肽的單體不經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵(本文稱為“B型”)連接。這些形式可利用疏水作用層析互相分離。此外，本發(fā)明涉及包含連接肽的多肽。包含具體的連接肽導(dǎo)致包含經(jīng)由至少一條鏈間二硫鍵連接的多肽鏈或不經(jīng)由至少一條鏈間二硫鍵連接的多肽鏈多肽二聚體的優(yōu)選合成。進(jìn)一步描述本發(fā)明以前，為方便，在下文描述一些術(shù)語I.定義本發(fā)明的多肽是結(jié)合分子，即，多肽分子或編碼它們的核酸分子，其包含至少一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域包含與靶分子(諸如抗原或結(jié)合配偶體)特異性結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)。例如，一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含免疫球蛋白抗原結(jié)合位點(diǎn)或負(fù)責(zé)配體結(jié)合的受體分子部分或負(fù)責(zé)受體結(jié)合的配體分子部分。本發(fā)明的結(jié)合分子是多肽或編碼它們的核酸分子。一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含至少兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明的多肽是多聚體。例如，一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是二聚體。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是同源二聚體，包含兩個(gè)相同的單體亞基。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體是異源二聚體，包含兩個(gè)不相同的單體亞基。所述二聚體的亞基包含一或多條多肽鏈。例如，一個(gè)實(shí)施方案中，所述二聚體包含至少兩條多肽鏈。一個(gè)實(shí)施方案中，所述二聚體包含兩條多肽鏈。另一實(shí)施方案中，所述二聚體包含四條多肽鏈(例如，在抗體分子的情況中)。本發(fā)明的多肽包含來自免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的至少一種氨基酸序列?！霸醋浴敝付ǖ牡鞍踪|(zhì)的多肽或氨基酸序列指多肽的來源。優(yōu)選，來自具體起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列具有與起始序列基本上相同的氨基酸序列，或其一部分，其中所述部分由至少10-20氨基酸，優(yōu)選至少20-30氨基酸，更優(yōu)選至少30-50氨基酸組成，或所述多肽或氨基酸序列可被本領(lǐng)域技術(shù)人員鑒定為其來源于所述起始序列。優(yōu)選的結(jié)合多肽包含來自人氨基酸序列的氨基酸序列。然而，結(jié)合多肽可包含來自另一哺乳動(dòng)物物種的一或多個(gè)氨基酸。例如，靈長類重鏈部分，鉸鏈部分，或結(jié)合位點(diǎn)可包含在受試結(jié)合多肽和/或連接多肽中。可選，一或多個(gè)鼠氨基酸可存在于結(jié)合多肽中，例如，在結(jié)合分子的抗原結(jié)合位點(diǎn)中。本發(fā)明優(yōu)選的結(jié)合分子不是免疫原性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解本發(fā)明的結(jié)合分子(例如，受試多肽的重鏈或輕鏈部分或結(jié)合部分)可被修飾使得它們的氨基酸序列與其所來源的天然存在的免疫球蛋白分子不同。例如，可進(jìn)行導(dǎo)致保守取代的核苷酸或氨基酸取代或在“非必需”氨基酸殘基的改變。編碼源自免疫球蛋白(例如，免疫球蛋白重鏈部分或輕鏈部分)的多肽的非天然變體的分離的核酸分子可通過將一或多個(gè)核苷酸取代，添加或缺失導(dǎo)入免疫球蛋白的核苷酸序列使得一或多種氨基酸取代，添加或缺失被導(dǎo)入編碼的蛋白質(zhì)來產(chǎn)生。突變可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)導(dǎo)入，諸如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變。優(yōu)選，保守氨基酸取代在一或多個(gè)非必需氨基酸殘基進(jìn)行。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族可在本發(fā)明中確定，包括堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸，精氨酸，組氨酸)，酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不帶電的急性側(cè)鏈氨基酸(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)以及芳香側(cè)鏈(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸優(yōu)選被來自相同側(cè)鏈家族的另一氨基酸殘基取代。另一實(shí)施方案中，一串氨基酸可被側(cè)鏈家族成員中順序和/或組成不同但結(jié)構(gòu)類似的氨基酸串取代。可選，另一實(shí)施方案中，突變可沿所有或部分免疫球蛋白編碼序列隨機(jī)引入，諸如通過飽和誘變，產(chǎn)生的突變體可摻入本發(fā)明的多肽，并篩選它們結(jié)合所需抗原的能力。本文術(shù)語“重鏈部分”包括來自免疫球蛋白重鏈的氨基酸序列。包含重聯(lián)部分的多肽包含以下結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)CH1結(jié)構(gòu)域，鉸鏈(例如，上，中，和/或下鉸鏈區(qū))結(jié)構(gòu)域，CH2結(jié)構(gòu)域，CH3結(jié)構(gòu)域，或其變體或片段。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含多肽鏈，所述多肽鏈包含CH1結(jié)構(gòu)域，至少部分鉸鏈結(jié)構(gòu)域，以及CH2結(jié)構(gòu)域。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含多肽鏈，所述多肽鏈包含CH1結(jié)構(gòu)域以及CH3結(jié)構(gòu)域。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含多肽鏈，所述多肽鏈包含CH1結(jié)構(gòu)域，至少部分鉸鏈結(jié)構(gòu)域，以及CH3結(jié)構(gòu)域。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含含有CH3結(jié)構(gòu)域的多肽鏈。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽缺乏至少部分CH2結(jié)構(gòu)域(例如，所有或部分CH2結(jié)構(gòu)域)。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含完整Ig重鏈。如上所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解這些結(jié)構(gòu)域(例如，所述重鏈部分)可被修飾使得它們的氨基酸序列與天然存在的免疫球蛋白分子不同。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合分子的至少兩條多肽鏈包含至少一個(gè)源自抗體或免疫球蛋白分子的重鏈部分。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽的至少兩個(gè)重鏈部分存在于不同多肽鏈上并例如經(jīng)由至少一個(gè)二硫鍵相互作用(A型)或經(jīng)由非共價(jià)相互作用(B型)形成二聚體蛋白，二聚體的每個(gè)單體包含至少一個(gè)重鏈部分。一個(gè)實(shí)施方案中，二聚體一個(gè)多肽鏈的重鏈部分與二聚體另一多肽鏈上的那些相同。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體的單體(或半體)相同。另一實(shí)施方案中，它們不相同。例如，每個(gè)單體可包含不同靶結(jié)合位點(diǎn)。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體通過共價(jià)相互作用例如，二硫鍵連接在一起。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體通過一或多個(gè)二硫鍵連接在一起。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體通過一或多個(gè)，優(yōu)選兩個(gè)二硫鍵連接在一起。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體通過一或多個(gè)，優(yōu)選三個(gè)二硫鍵連接在一起。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體通過一或多個(gè)，優(yōu)選四個(gè)二硫鍵連接在一起。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體通過一或多個(gè)，優(yōu)選五個(gè)二硫鍵連接在一起。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體通過一或多個(gè)，優(yōu)選六個(gè)二硫鍵連接在一起。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體通過一或多個(gè)，優(yōu)選七個(gè)二硫鍵連接在一起。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體通過一或多個(gè)，優(yōu)選八個(gè)二硫鍵連接在一起。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體通過一或多個(gè)，優(yōu)選九個(gè)二硫鍵連接在一起。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體通過一或多個(gè)，優(yōu)選十個(gè)二硫鍵連接在一起。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體不通過二硫鍵，而是例如，通過非共價(jià)反應(yīng)連接在一起。多肽的重鏈部分可來自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重鏈部分可包含源自IgG1分子的CH1結(jié)構(gòu)域和源自IgG3分子的鉸鏈區(qū)。另一實(shí)例中，重鏈部分可包含鉸鏈區(qū)，其部分源自IgG1分子部分源自IgG3分子。另一實(shí)例中，重鏈部分可包含嵌合鉸鏈，其部分源自IgG1分子，部分源自IgG4分子。本文術(shù)語“輕鏈部分”包括源自免疫球蛋白輕鏈的氨基酸序列。優(yōu)選，所述輕鏈部分包含VL或CL結(jié)構(gòu)域的至少一種。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含氨基酸序列或一或多個(gè)不源自Ig分子的部分。示例性修飾在下文詳細(xì)描述。例如，一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可包含柔性接頭序列。另一實(shí)施方案中，多肽可被修飾以添加功能部分(例如，PEG，藥物，或標(biāo)記)。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽是融合蛋白。融合蛋白是嵌合分子，其包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含至少一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)和至少一個(gè)重鏈部分。一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白還包含合成連接肽。″嵌合″蛋白包含第一氨基酸序列，其與天然不連接的第二氨基酸序列相連。所述氨基酸序列通常存在于一起形成融合蛋白質(zhì)的分離的蛋白質(zhì)中，或者它們通常存在于同一蛋白質(zhì)中但是在融合多肽中重新排列。嵌合蛋白或子可通過例如化學(xué)合成或產(chǎn)生和翻譯新的多核苷酸來產(chǎn)生，其中所述肽區(qū)以所需的關(guān)系編碼。示例性嵌合多肽包括本發(fā)明的融合蛋白以及嵌合鉸鏈連接肽。術(shù)語“異源(heterologous)”用于多核苷酸和多肽，指所述多核苷酸或多肽源自基因型與其相比較的實(shí)體的其余部分的不同的實(shí)體。例如，異源多核苷酸或抗原可源自不同物種來源，不同細(xì)胞類型或不同個(gè)體的相同細(xì)胞類型。本文術(shù)語“配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”或“受體的配體結(jié)合部分”指任何天然受體(例如，細(xì)胞表面受體)或其保持至少定性配體結(jié)合能力的任何區(qū)或衍生物，優(yōu)選相應(yīng)天然受體的生物活性。本文術(shù)語″受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域″或“配體的受體結(jié)合部分”指任何天然配體或其保持至少定性受體結(jié)合能力優(yōu)選相應(yīng)天然配體的生物活性的任何區(qū)或衍生物。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子是融合蛋白。本發(fā)明的融合蛋白是嵌合分子，其包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域(其包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn))和二聚體化結(jié)構(gòu)域(其包含至少一個(gè)重鏈部分)。所述重鏈部分可源自任何免疫球蛋白，諸如IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4亞型，IgA，IgE，IgD或IgM。本發(fā)明另一實(shí)施方案中，結(jié)合分子是“抗體-融合蛋白嵌合體”。所述分子包含結(jié)合抗體的至少一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域與至少一個(gè)融合蛋白結(jié)合的分子。優(yōu)選，兩種多肽之間的界面是免疫球蛋白分子的CH3結(jié)構(gòu)域。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子是“抗體”或“免疫球蛋白”分子，例如，天然存在的抗體或免疫球蛋白分子或遺傳改造的抗體分子，其以類似抗體分子的方式結(jié)合抗原。本文術(shù)語″免疫球蛋白″包括多肽，其具有兩條重鏈和兩條輕鏈的組合，無論其是否具有相關(guān)特異免疫反應(yīng)性?！蹇贵w″指具有對(duì)目的抗原(例如腫瘤相關(guān)抗原)的明顯已知特異性免疫反應(yīng)活性的集合體?？贵w和免疫球蛋白包含輕和重鏈，其間具有和不具有鏈間共價(jià)連接。脊椎動(dòng)物體系中基本的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)是相對(duì)已知的。如將在下文詳述的，遺傳術(shù)語“免疫球蛋白”包含五種不同類型的抗體，其可通過生化方法區(qū)分。所有物種抗體都明顯包含在本發(fā)明范圍內(nèi)，以下討論總體涉及免疫球蛋白分子的IgG種類。對(duì)于IgG，免疫球蛋白包含兩條相同的輕多肽鏈，其分子量大約23,000道爾頓，以及分子量53,000-70,000的兩條相同的重鏈。所述的四條鏈通過二硫鍵以“Y”構(gòu)型連接，其中輕鏈在“Y”的開口處包住重鏈，并延續(xù)到整個(gè)可變區(qū)。將輕鏈和重鏈分成結(jié)構(gòu)和功能同源性的區(qū)。術(shù)語“恒定”和“可變”用于指功能。在這方面，將理解輕鏈(VL)和重鏈(VH)部分的可變區(qū)決定抗原識(shí)別和特異性。反之，輕鏈(CL)和重鏈(CH1，CH2和CH3)的恒定區(qū)顯示重要的生物學(xué)性質(zhì)，諸如分泌，跨胎盤活動(dòng)力，F(xiàn)c受體結(jié)合，補(bǔ)體結(jié)合，等。通常隨恒定區(qū)遠(yuǎn)離抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)或氨基端，恒定區(qū)的數(shù)目增加。N末端是可變區(qū)，C末端是恒定區(qū)；CH3和CL結(jié)構(gòu)域?qū)嶋H分別包含重鏈和輕鏈的羧基末端。輕鏈分類為kappa或lambda(κ，λ)。每個(gè)重鏈種類可與kappa或lambda輕鏈結(jié)合。通常，當(dāng)免疫球蛋白通過雜交瘤，B細(xì)胞和遺傳改造的宿主細(xì)胞產(chǎn)生時(shí)，輕鏈和重鏈互相共價(jià)連接，兩條重鏈的″尾″部分通過共價(jià)二硫鍵和非共價(jià)連接相互結(jié)合。在重鏈中，氨基酸序列從位于Y構(gòu)型的分叉末端的N末端開始到每條鏈底部的C末端。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解重鏈分類為gamma，mu，alpha，delta，或epsilon(γ，μ，α，δ，ε)，其中還有一些亞類(例如，γ1.-γ4)。該鏈的性質(zhì)決定了抗體的“種類”分別為IgG，IgM，IgAIgG或IgE。免疫球蛋白亞類(同種型)例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1等性質(zhì)已知并且已知其使得功能專門化。這些種類以及同種型的每一種的修飾的版本對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，結(jié)合本發(fā)明的教導(dǎo)，是可以輕易理解的，因此，包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。如上所述，可變區(qū)允許抗體選擇性識(shí)別并特異性結(jié)合抗原上的表位。即，抗體的VL結(jié)構(gòu)域和VH結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成限定三維抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)。該四元抗體結(jié)構(gòu)形成存在Y的每個(gè)臂末端的抗原結(jié)合位點(diǎn)。更具體地，所述抗原結(jié)合位點(diǎn)通過VH和VL鏈每一條上的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)限定。本文術(shù)語“結(jié)合位點(diǎn)”或“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”包含負(fù)責(zé)與目的靶分子(例如抗原，配體，受體，底物或抑制物)選擇性結(jié)合的多肽的區(qū)域。示例性結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括抗體可變區(qū)，配體的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或酶結(jié)構(gòu)域。一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子具有至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其對(duì)被靶向減少或消除的分子特異，例如，細(xì)胞表面抗原或可溶抗原。優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域是抗原結(jié)合位點(diǎn)?？乖Y(jié)合位點(diǎn)通過可變區(qū)形成，所述可變區(qū)在一個(gè)多肽中與另一多肽中不同。本發(fā)明的多肽包含至少兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。本文術(shù)語“抗原結(jié)合位點(diǎn)”包括特異性結(jié)合(與之發(fā)生免疫反應(yīng))抗原(例如，細(xì)胞表面或可溶抗原)的位點(diǎn)?？乖Y(jié)合位點(diǎn)包括免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)，這些可變區(qū)形成的結(jié)合位點(diǎn)決定抗體特異性。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合分子包含抗體分子的至少一個(gè)重鏈或輕鏈CDR(例如，其序列是本領(lǐng)域已知的或本文描述的)。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合分子包含一或多個(gè)抗體分子的至少兩個(gè)CDR。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合分子包含一或多個(gè)抗體分子的至少三個(gè)CDR。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合分子包含一或多個(gè)抗體分子的至少四個(gè)CDR。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合分子包含一或多個(gè)抗體分子的至少五個(gè)CDR。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合分子包含一或多個(gè)抗體分子的至少六個(gè)CDR。示例性抗體分子包括至少一個(gè)CDR，其可包含在受試抗原結(jié)合分子中，是本領(lǐng)域已知的，本文所述了示例性分子。所述多肽包含本文公開的兩個(gè)重鏈部分，其可被連接形成兩個(gè)結(jié)合的Y，使得四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)形成“四價(jià)”分子(見例如，WO02/096948A2))。另一實(shí)施方案中，可制備四價(jià)微型抗體或結(jié)構(gòu)域缺失的抗體。術(shù)語“特異性”包括可能的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目，其特異性結(jié)合(例如與之發(fā)生免疫反應(yīng))給定的靶。多肽可為單特異性并包含一或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，所述位點(diǎn)特異性結(jié)合靶，或多肽可為多特異性并含有兩個(gè)或多個(gè)特異性結(jié)合相同或不同靶的結(jié)合位點(diǎn)。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子是雙特異性分子(例如，抗體，微型抗體，結(jié)構(gòu)域缺失的抗體，或融合蛋白，其對(duì)一種以上的分子具有結(jié)合特異性，例如一種以上的抗原或同一抗原上一種以上的表位。一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性分子具有至少一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)，其對(duì)被靶向以被降低或消除的分子以及細(xì)胞上的靶向型分子特異。另一實(shí)施方案中，所述雙特異性分子具有至少一個(gè)特異于被靶向降低或消除的分子的靶結(jié)合位點(diǎn)以及至少一個(gè)特異于藥物的靶結(jié)合位點(diǎn)。另一實(shí)施方案中，所述雙特異性分子具有至少一個(gè)特異于被靶向降低或消除的分子的靶結(jié)合位點(diǎn)以及至少一個(gè)特異于前藥物的靶結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述雙特異性分子是四價(jià)抗體，其具有兩個(gè)特異于一個(gè)靶和兩個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)特異于第二個(gè)靶的靶結(jié)合位點(diǎn)。四價(jià)雙特異性分子對(duì)于每種特異性可為二價(jià)的。雙特異性分子的進(jìn)一步描述如下。本文術(shù)語“價(jià)”指多肽中潛在靶結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目。每個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合一個(gè)靶分子或靶分子上的特異性位點(diǎn)。當(dāng)多肽包含一個(gè)以上的靶結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，每個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)可特異性結(jié)合相同或不同的分子(例如，可結(jié)合不同配體或不同抗原，或相同抗原上的不同表位)。天然存在的抗體中，每個(gè)單體抗體上存在的六個(gè)CDR是短的、非連續(xù)氨基酸序列，其具有特定的位置以形成抗原結(jié)合位點(diǎn)，由于抗體在含水環(huán)境中呈其三維構(gòu)型。重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的其余部分顯示氨基酸序列的分子間變異較小，并稱為框架區(qū)。框架區(qū)大部分采用β-折疊構(gòu)型，CDR形成環(huán)，其連接，一些情況下形成部分β-折疊結(jié)構(gòu)。因此，這些這些框架區(qū)作用以形成框架，其通過鏈間非共價(jià)作用使得六個(gè)CDR定位的方向正確。定位的CDR形成的抗原結(jié)合位點(diǎn)限定了與免疫反應(yīng)性抗原上的表位互補(bǔ)的表面。該互補(bǔ)表面促進(jìn)抗體與免疫反應(yīng)性抗原表位非共價(jià)結(jié)合。該互補(bǔ)表面促進(jìn)抗體與免疫反應(yīng)性抗原表位的非共價(jià)結(jié)合。CDR的位置可由本領(lǐng)域技術(shù)人員輕易鑒定。如前所述，各種免疫球蛋白種類的恒定區(qū)的亞基結(jié)構(gòu)以及三維構(gòu)型是已知的。本文術(shù)語“VH結(jié)構(gòu)域”包括免疫球蛋白重鏈的氨基末端可變結(jié)構(gòu)域，術(shù)語“CH1結(jié)構(gòu)域”包括免疫球蛋白重鏈的第一(大部分氨基末端)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。CH1結(jié)構(gòu)域鄰接VH結(jié)構(gòu)域并位于免疫球蛋白重鏈分子鉸鏈區(qū)的氨基末端。本文術(shù)語“CH2結(jié)構(gòu)域”包括部分重鏈分子，利用常規(guī)編號(hào)方案，其從例如抗體的殘基244擴(kuò)展到殘基360(殘基244-360，Kabat編號(hào)系統(tǒng)；和殘基231-340，EU編號(hào)系統(tǒng)，；和KabatEAetal.SequencesofProteinsofImmunologicalInterest.Bethesda，USDepartmentofHealthandHumanServices，NIH.1991)。CH2結(jié)構(gòu)域的獨(dú)特之處在于其與另一結(jié)構(gòu)域不是緊密配對(duì)的。而兩條N連接的分支碳水化合物鏈置于完整天然IgG分子的兩個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域之間。還已知CH3結(jié)構(gòu)域從CH2結(jié)構(gòu)域延伸到完整天然IgG分子的C末端并包括大約108個(gè)殘基。本文術(shù)語“鉸鏈區(qū)”包括部分重鏈分子，其將CH1結(jié)構(gòu)域連于CH2結(jié)構(gòu)域。該鉸鏈區(qū)包含大約25個(gè)殘基并具有柔性，由此允許兩個(gè)N末端抗原結(jié)合區(qū)獨(dú)立移動(dòng)。鉸鏈區(qū)可細(xì)分為三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域上、中、下鉸鏈結(jié)構(gòu)域(Rouxetal.J.Immunol.19981614083)。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含連接肽。本發(fā)明的連接肽是合成的。涉及多肽的本文術(shù)語“合成的”包括含有非天然存在的氨基酸序列的多肽。例如，為天然多肽的修飾形式的非天然多肽(例如包含突變諸如添加，取代或缺失)或包含通過線性氨基酸序列與其天然不連接的第二氨基酸序列(其可為或可不為天然存在的)相連的第一氨基酸序列(其可為或可不為天然存在的)。本發(fā)明的連接多肽連接本發(fā)明的結(jié)合分子的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(例如，結(jié)合結(jié)構(gòu)域和二聚體化結(jié)構(gòu)域)。例如，連接肽將重鏈部分連接于包含結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。一個(gè)實(shí)施方案中，連接肽連接多肽鏈的線性氨基酸序列中的兩個(gè)重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，諸如CH1和CH2結(jié)構(gòu)域；CH1和CH3結(jié)構(gòu)域；鉸鏈和CH1結(jié)構(gòu)域；鉸鏈和CH3結(jié)構(gòu)域；VH和鉸鏈結(jié)構(gòu)域，或CH3結(jié)構(gòu)域和非-免疫球蛋白多肽)。優(yōu)選，所述連接肽為多肽分子提供柔性并促進(jìn)經(jīng)由二硫鍵的二聚體化。本發(fā)明的連接肽用于取代一或多個(gè)重鏈結(jié)構(gòu)域(例如，結(jié)構(gòu)域缺失的構(gòu)建體中的至少部分恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域(例如，至少部分CH2結(jié)構(gòu)域)和/或至少部分鉸鏈區(qū)(例如，至少部分低鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域))。例如，一個(gè)實(shí)施方案中，VH結(jié)構(gòu)域經(jīng)由連接肽融合于CH3結(jié)構(gòu)域(連接肽C-末端附著于CH3結(jié)構(gòu)域N-末端，連接肽N-末端附著于VH結(jié)構(gòu)域C-末端)。另一實(shí)施方案中，VL結(jié)構(gòu)域經(jīng)由連接肽融合于CH3結(jié)構(gòu)域(連接肽C-末端附著于CH3結(jié)構(gòu)域N-末端，連接肽N-末端附著于VL結(jié)構(gòu)域C-末端)。另一實(shí)施方案中，CH1結(jié)構(gòu)域經(jīng)由連接肽融合于CH3結(jié)構(gòu)域(連接肽C-末端附著于CH3結(jié)構(gòu)域N-末端，連接肽N-末端附著于CH1結(jié)構(gòu)域C-末端)。一個(gè)實(shí)施方案中，合成連接肽包含部分恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。例如，一個(gè)實(shí)施方案中，取代CH2結(jié)構(gòu)域的連接肽可包含部分CH2結(jié)構(gòu)域。一個(gè)實(shí)施方案中，連接肽包含或由gly-ser接頭組成。本文術(shù)語“gly-ser接頭”指一種肽，其由甘氨酸和絲氨酸殘基組成。示例性gly/ser接頭包含氨基酸序列GGGSSGGGSG(SEQIDNO1)。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的連接肽包含至少部分上鉸鏈區(qū)(例如，源自IgG1，IgG3或IgG4分子)，至少部分中鉸鏈區(qū)(例如，源自IgG1，IgG3，或IgG4分子)和一系列g(shù)ly/ser氨基酸殘基(例如，gly/ser接頭諸如GGGSSGGGSG(SEQIDNO1))。一個(gè)實(shí)施方案中，與天然存在的IgG1或IgG3鉸鏈區(qū)相比，所述連接肽包含一或多個(gè)氨基酸取代。另一實(shí)施方案中，該連接肽包含諸如WO02/060955中所述的氨基酸序列。連接肽在下文詳細(xì)描述。本文術(shù)語“二硫鍵”包括兩個(gè)硫原子之間形成的共價(jià)鍵。半胱氨酸包含硫醇基團(tuán)，其可形成二硫鍵或與第二個(gè)硫醇基團(tuán)橋接。大多數(shù)天然存在的IgG分子中，CH1和CL區(qū)通過二硫鍵相連，兩條重鏈通過兩個(gè)二硫鍵相連，利用Kabat編號(hào)系統(tǒng)，所述二硫鍵的位置對(duì)應(yīng)239和242(位置226或229，EU編號(hào)系統(tǒng))。本領(lǐng)域已知，恒定區(qū)介導(dǎo)多種效應(yīng)功能。例如，C1組分與抗體的結(jié)合活化補(bǔ)體系統(tǒng)。補(bǔ)體的活化對(duì)細(xì)胞病原體的調(diào)理和溶解是重要的。補(bǔ)體活化也刺激炎性反應(yīng)并也參與自身超敏性。此外，抗體經(jīng)由Fc區(qū)結(jié)合細(xì)胞，其中抗體Fc區(qū)上的Fc受體位點(diǎn)結(jié)合細(xì)胞上的Fc受體(FcR)。有多種對(duì)不同種類的抗體特異的Fc受體，包括IgG(gamma受體)，IgE(epsilon受體)，IgA(alpha受體)和IgM(mu受體)。抗體與細(xì)胞表面Fc受體的結(jié)合激發(fā)多種重要的且多樣的生物反應(yīng)，包括吞噬和破壞抗體包被的顆粒，清除免疫復(fù)合物，通過殺傷細(xì)胞溶解抗體包被的靶(稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒或ADCC)，釋放免疫介導(dǎo)物，免疫球蛋白的胎盤轉(zhuǎn)移以及生成控制。一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fc部分可利用本領(lǐng)域已知技術(shù)突變以降低效應(yīng)功能。例如恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的缺失或失活(通過點(diǎn)突變或其它方法)可降低循環(huán)的經(jīng)修飾抗體的Fc受體結(jié)合從而增加腫瘤定位。其它情況中，恒定區(qū)修飾可與本發(fā)明的適度補(bǔ)體結(jié)合一致，由此降低血清半壽期以及偶聯(lián)的細(xì)胞毒素的非特異性結(jié)合。恒定區(qū)的其它修飾可用于修飾二硫鍵或寡糖部分，其允許由于抗原特異性或抗體柔性增加導(dǎo)致的定位增加。更通常，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本文的修飾的抗體可顯示多種可或不可輕易認(rèn)識(shí)到的微妙效應(yīng)。然而產(chǎn)生的生理學(xué)圖譜，生物利用度以及修飾的其它生物化學(xué)效應(yīng)，諸如腫瘤定位，生物分布以及血清半壽期，可利用已知的免疫學(xué)技術(shù)定量而無需不適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)輕易測定并定量。一個(gè)實(shí)施方案中，修飾形式的抗體可利用本領(lǐng)域已知技術(shù)制備從完整前體或親本抗體。示例性技術(shù)在下文更詳細(xì)討論。具體優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽的可變區(qū)和恒定區(qū)都是人的。一個(gè)實(shí)施方案中，完全人抗體可利用本領(lǐng)域已知技術(shù)制備。例如抗特異性抗原的完全人抗體可通過將抗原給藥轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來制備，所述動(dòng)物經(jīng)修飾應(yīng)答于抗原攻擊而產(chǎn)生所述抗體，但是其內(nèi)源性基因座是失活的。用于制備抗體的示例性技術(shù)在美國專利6,150,584；6,458,592；6,420,140中描述。其它技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。包含重鏈部分的多肽可包含或不包含不源自免疫球蛋白分子的其它氨基酸序列或部分。所述修飾在下文詳細(xì)描述。例如，一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可包含柔性接頭序列。另一實(shí)施方案中，多肽可被修飾以添加功能部分諸如PEG。本發(fā)明的多肽包含至少兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其使得多肽與所選靶分子結(jié)合。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含抗體分子，例如，完整抗體分子，或抗體分子的片段。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子是修飾的或合成的抗體分子。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含單克隆抗體，人源化的抗體，嵌合抗體，或重組制備的抗體的所有或部分(例如，至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，至少一個(gè)CDR，或至少一個(gè)重鏈部分)。在所述結(jié)合分子是抗體或修飾的抗體的實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合位點(diǎn)以及所述重鏈部分無需源自相同的免疫球蛋白分子。在這方面，可變區(qū)可源自任何類型的動(dòng)物，其可被誘導(dǎo)激發(fā)體液反應(yīng)并產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的免疫球蛋白。由此，多肽的可變區(qū)可例如來自哺乳動(dòng)物，例如可為人，鼠，非人靈長類(諸如食蟹猴，獼猴等)，狼，駱駝?lì)?例如，來自駱駝，駱馬(llamas)以及相關(guān)物種)來源的。另一實(shí)施方案中，所述可變區(qū)可來自軟骨類動(dòng)物(condricthoid)(例如，來自鯊魚)。本發(fā)明的多肽可利用本領(lǐng)域已知技術(shù)制備。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是“重組制備的”抗體分子，即利用重組DNA技術(shù)制備的。制備抗體分子的示例性技術(shù)在下文更為詳細(xì)地描述。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是修飾的抗體。本文術(shù)語“修飾的抗體”包括合成的形式的抗體，其被改變使得它們不是天然存在的。例如包含至少兩個(gè)重鏈部分而不是兩個(gè)完整重鏈的抗體(諸如，結(jié)構(gòu)域缺失的抗體或微型抗體)；多特異性抗體(例如，雙特異性，三特異性等)，其被改變以結(jié)合兩個(gè)或多個(gè)不同抗原或結(jié)合單個(gè)抗原上的不同表位；連接于scFv分子的重鏈分子等。ScFv分子是本領(lǐng)域已知的并在例如，美國專利5,892,019中描述。此外，術(shù)語“修飾的抗體”包括多價(jià)形式的抗體(例如，三價(jià)，四價(jià)等抗體，其結(jié)合三個(gè)或更多個(gè)拷貝的相同抗原)。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子是融合蛋白，其包含至少一個(gè)缺乏CH2結(jié)構(gòu)域的重鏈部分并包含含有配體及其受體的一個(gè)成員的結(jié)合部分的多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明術(shù)語“修飾的抗體”包括免疫球蛋白，抗體，或免疫反應(yīng)性片段或其重組體，其中一或多個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的至少一部分被缺失或改變以提供所需的生物化學(xué)特性，諸如發(fā)生非共價(jià)二聚化的能力，定位于腫瘤位點(diǎn)的增加的能力，或與免疫原性大致相同的完整未改變的抗體相比降低的血清半壽期。優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是結(jié)構(gòu)域缺失的抗體，其包含類似于免疫球蛋白重鏈的多肽鏈，但其缺乏一或多個(gè)重鏈結(jié)構(gòu)域的至少一部分。更優(yōu)選，修飾的抗體恒定區(qū)的一個(gè)完整結(jié)構(gòu)域?qū)⒈蝗笔Р⒏鼉?yōu)選所有或部分CH2結(jié)構(gòu)域?qū)⒈蝗笔А?yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽將激發(fā)人體中的有害免疫反應(yīng)。與本發(fā)明相容的恒定區(qū)修飾包含一或多個(gè)結(jié)構(gòu)域中的一或多個(gè)氨基酸的添加，缺失或取代。即，本發(fā)明的多肽可包含對(duì)三個(gè)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CH1，CH2或CH3)中的一或多個(gè)和/或?qū)p鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域(CL)的改變或修飾。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及修飾的抗體分子，其包含至少一個(gè)CC49結(jié)合位點(diǎn)(特異于Tag72)。例如，圖8A(SEQIDNO16)顯示sc(Fv)2重鏈四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的huCC49基因的單鏈DNA序列。圖8B(SEQIDNO17)顯示含有合成G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的sc(Fv)2重鏈四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的huCC49基因的單鏈DNA序列。圖8C(SEQIDNO18)顯示sc(Fv)2輕鏈CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的huCC49的單鏈DNA序列。圖9A(SEQIDNO19)顯示重鏈sc(Fv)2四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的huCC49的氨基酸序列。圖9B(SEQIDNO20)顯示含有合成G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的重鏈四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2huCC49的氨基酸序列。圖9C(SEQIDNO21)顯示輕鏈CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2huCC49的氨基酸序列。圖10A(SEQIDNO22)顯示四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的2sc(Fv)2huCC49微型抗體基因的單鏈DNA序列。圖10B(SEQIDNO23)顯示含有合成G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2huCC49微型抗體基因的單鏈DNA序列。圖11A(SEQIDNO24)顯示四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2huCC49微型抗體的氨基酸序列。圖11B(SEQIDNO25)顯示含有合成G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2huCC49微型抗體的氨基酸序列。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及修飾的抗體分子，其包含至少一個(gè)p5E8結(jié)合位點(diǎn)(特異于CD23)。圖12A(SEQIDNO26)顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的重鏈四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8sc(Fv)2抗體基因的單鏈DNA序列。圖12B(SEQIDNO27)顯示輕鏈四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8sc(Fv)2基因的單鏈DNA序列。圖13A(SEQIDNO28)顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8sc(Fv)2抗體的氨基酸序列重鏈。圖13B(SEQIDNO29)顯示輕鏈四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8sc(Fv)2抗體的氨基酸序列。圖14(SEQIDNO30)顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8VL/VH微型抗體基因的單鏈DNA序列。圖15(SEQIDNO31)顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8VH/VL微型抗體基因的單鏈DNA序列。圖16(SEQIDNO32)顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8VL/VH微型抗體的氨基酸序列。圖17(SEQIDNO33)顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈連接肽的CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8VH/VL微型抗體的氨基酸序列。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可利用本領(lǐng)域已知技術(shù)修飾以降低它們的免疫原性。例如，本發(fā)明的抗體或多肽可為人源化的，去免疫的，或可制備嵌合抗體。這些類型的抗體源自非-人抗體，通常為鼠抗體，其保持或基本保持親本抗體的抗原-結(jié)合性質(zhì)，但其在人中的免疫原性較低。這可通過各種方法實(shí)現(xiàn)，包括(a)將整個(gè)非-人可變結(jié)構(gòu)域移植到人恒定區(qū)上以生成嵌合抗體；(b)將一或多個(gè)非人互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的至少一部分移植到人框架和恒定區(qū)中，保留或不保留關(guān)鍵框架殘基；或(c)移植整個(gè)非-人可變結(jié)構(gòu)域，但通過取代表面殘基用人樣分泌“覆蓋(cloak)”它們。所述方法公開于Morrisonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.816851-5(1984)；Morrisonetal.，Adv.Immunol.4465-92(1988)；Verhoeyenetal.，Science2391534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.31169-217(1994)，和美國專利5,585,089，5,693,761和5,693,762，其全文內(nèi)容包含在此作為參考。去免疫可用于降低抗體免疫原性。本文術(shù)語“去免疫”包括改變抗體以修飾T細(xì)胞表位(見例如，WO9852976A1，WO0034317A2)。例如，起始抗體的VH和VL序列被分析，每個(gè)V區(qū)的人T細(xì)胞表位“圖譜”顯示與互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)相關(guān)表位的定位，以及所述序列中的其它重要?dú)埢?。分析T細(xì)胞表位圖譜的各個(gè)T細(xì)胞表位以鑒定改變最終抗體活性可能性較小的可選氨基酸取代。多種可選VH和VL序列設(shè)計(jì)為包含氨基酸取代組合，并且這些序列隨后被摻入多種待測定其功能的本發(fā)明的多肽。通常，產(chǎn)生12-24種變體抗體并檢測。包含修飾的V和人C區(qū)的完全重和輕鏈基因隨后被克隆入表達(dá)載體，以及隨后被導(dǎo)入細(xì)胞系用于制備完整抗體的質(zhì)粒。所述抗體隨后在適宜生化和生物測定法種比較，鑒定最佳變體。一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含嵌合抗體。在本發(fā)明的背景中，術(shù)語“嵌合抗體”的指任何其中免疫反應(yīng)性區(qū)域或位點(diǎn)得自或源自第一物種而恒定區(qū)(其可為完整，部分的或根據(jù)本發(fā)明修飾的)獲自第二種物種的抗體。優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述靶結(jié)合區(qū)或位點(diǎn)來自非人來源(例如小鼠)，恒定區(qū)是人恒定區(qū)。優(yōu)選，重鏈和輕鏈恒定區(qū)通過部分取代一或多個(gè)CDR、并且如果需要通過部分框架區(qū)取代和序列改變而改變。盡管CDRs可源自與框架區(qū)來源的抗體同種或甚至同亞種的抗體，預(yù)期CDR將源自不同種類的抗體并優(yōu)選來自源自不同物種的抗體。無需用來自供體可變區(qū)的完整CDR取代所有CDR即可將一個(gè)可變區(qū)的抗原結(jié)合能力轉(zhuǎn)移到另一個(gè)。然而，可能僅僅需要轉(zhuǎn)移維持靶結(jié)合位點(diǎn)活性所需的殘基。根據(jù)美國專利5,585,089,5,693,761和5,693,762的解釋，本領(lǐng)域技術(shù)人員能通過實(shí)施常規(guī)試驗(yàn)或通過試驗(yàn)或錯(cuò)誤檢測來獲得免疫原性降低的功能性抗體。本文術(shù)語“正確折疊的多肽”包括這樣的多肽(例如，抗原結(jié)合分子諸如抗體)，其中包含所述多肽的所有功能結(jié)構(gòu)域的活性不同。本文術(shù)語“不正確折疊的多肽”包括其中多肽的至少一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域無活性的多肽。一個(gè)實(shí)施方案中，正確折疊的多肽包括通過至少一個(gè)二硫鍵連接的多肽鏈，反之，不正確折疊的多肽包含不是通過至少一個(gè)二硫鍵連接的多肽鏈。本文術(shù)語“惡性疾病(malignancy)”指非良性腫瘤或癌癥。本文術(shù)語“癌癥”包括特征在于失調(diào)的或失控的細(xì)胞生長的惡性疾病。示例性癌癥包括癌，肉瘤，白血病和淋巴瘤。術(shù)語“癌癥”包括原發(fā)惡性腫瘤(例如其細(xì)胞不遷移到受試者體內(nèi)除外原始腫瘤位點(diǎn)的位點(diǎn))以及繼發(fā)惡性腫瘤(例如源自轉(zhuǎn)移，腫瘤細(xì)胞遷移入與原始腫瘤位點(diǎn)不同的繼發(fā)位點(diǎn))。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合腫瘤細(xì)胞。包含結(jié)合腫瘤細(xì)胞表達(dá)的抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)的示例性抗體是本領(lǐng)域已知的，所述抗體的一或多個(gè)CDR可包含在本發(fā)明的結(jié)合分子中。示例性抗體包括2B8，Lym1，Lym2，LL2，Her2，B1，MB1，BH3，B4，B72.3，5E8，B3F6和5E10。優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是結(jié)合CD20的C2B8抗體。另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是識(shí)別TAG72的CC49抗體。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合可用于治療自身免疫或炎性疾病或病癥的分子。本文術(shù)語“自身免疫疾病或病癥”指受試者中的疾病，其中免疫系統(tǒng)攻擊機(jī)體自身細(xì)胞，導(dǎo)致組織破壞。自身免疫并包括全身性自身免疫病，即其中自身免疫反應(yīng)同時(shí)出現(xiàn)在多種組織，或器官特異性自身免疫病，即其中自身免疫反應(yīng)靶向單個(gè)器官?？赏ㄟ^本發(fā)明的方法和組合物診斷、預(yù)防或治療的自身免疫病的實(shí)例包括，但不限于克隆氏??；炎性腸病(IBD)；系統(tǒng)性紅斑狼瘡；潰瘍性結(jié)腸炎；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；goodpasture′s綜合征；Grave′s??；橋本氏(Hashimoto′s)甲狀腺炎；尋常天皰瘡；重癥肌無力；硬皮??；自身免疫性溶血性貧血；自身免疫性血小板減少性紫癜；多發(fā)性肌炎和皮肌炎；惡性貧血；干燥綜合征；強(qiáng)硬性脊柱炎；血管炎；I型糖尿?。簧窠?jīng)疾病，多發(fā)性硬化，以及自身免疫病導(dǎo)致的繼發(fā)性疾病。本文術(shù)語“炎性疾病或病癥”包括至少部分由炎癥導(dǎo)致或加重的疾病，例如增加的血流，水腫，免疫細(xì)胞的活化(例如增殖，細(xì)胞因子生成，或增加的吞噬)。示例性疾病包括其中炎癥或炎性因子或(例如，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，一氧化氮(NO)，TNF，白介素，胞漿蛋白質(zhì)，細(xì)胞防御系統(tǒng)，細(xì)胞因子，脂質(zhì)代謝物，蛋白酶，毒性自由基，線粒體，凋亡，粘附分子等)以異常量參與或存在于某一區(qū)域中，例如所述量可有利地改變，例如以便對(duì)受試者有利。炎性過程是活體組織對(duì)損傷的反應(yīng)。炎癥的原因可為物理損傷，化學(xué)物質(zhì)，微生物，組織壞死，癌癥或其它藥劑。急性炎癥持續(xù)時(shí)間短，僅僅持續(xù)數(shù)天。如果其持續(xù)較長時(shí)間，那么可稱其為慢性炎癥。炎性疾病包括急性炎性疾病，慢性炎性疾病和復(fù)發(fā)性炎性疾病。急性炎性疾病通常時(shí)程較短，持續(xù)約數(shù)分鐘到約1-2天，但其也可持續(xù)數(shù)周。急性炎性疾病的主要特征包括血流增加，液體和血漿白蛋白滲出(水腫)，以及白細(xì)胞諸如嗜中性粒細(xì)胞遷出。慢性炎性疾病通常病程較長，例如數(shù)周到數(shù)月到數(shù)年或更長時(shí)間，并在組織學(xué)上與淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的存在以及血管和結(jié)綈組織的增殖相關(guān)。復(fù)發(fā)性炎性疾病包括在一段時(shí)間之后復(fù)發(fā)的疾病以及具有周期性病程的疾病。復(fù)發(fā)性炎性疾病的實(shí)例包括哮喘和多發(fā)性硬化。一些疾病可落入一或多個(gè)種類中。炎性疾病的特征通常在于熱、紅、腫、痛和功能喪失。炎性疾病病因的實(shí)例包括但不限于微生物感染(例如細(xì)菌，病毒和真菌感染)，物理因素(例如燒傷，放射和外傷)，化學(xué)因素(例如毒素和致病性物質(zhì))，組織壞死和各種類型的免疫反應(yīng)。炎性疾病的實(shí)例包括但不限于，骨性關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，急性和慢性感染(細(xì)菌，病毒和真菌)；急性和慢性支氣管炎，鼻竇炎，以及其它呼吸感染，包括普通感冒；急性和慢性胃腸炎以及結(jié)腸炎；急性和慢性膀胱炎和尿道炎；急性呼吸窘迫綜合征，囊性纖維化；急性和慢性皮炎；急性和慢性結(jié)膜炎；急性和慢性漿膜炎(心包炎，腹膜炎，滑膜炎，胸膜炎和肌腱炎)；尿毒癥性心包炎；急性和慢性膽囊炎；急性和慢性陰道炎；急性和慢性葡萄膜炎；藥物反應(yīng)；和燒傷(熱，化學(xué)和電)。本文術(shù)語“基于疏水反應(yīng)分離多肽的介質(zhì)”包括含有共價(jià)連接于基質(zhì)的疏水配體(例如烷基和芳基)的介質(zhì)。所述介質(zhì)可用于基于多肽表面的助溶性且可接近的非極性基團(tuán)與所述介質(zhì)的疏水配體之間的相互作用分離多肽。示例性介質(zhì)是苯基5PW-HR，其可得自TosohBioscience。本文術(shù)語“電導(dǎo)性”包括以microSiemens/cm(以前為micromhos/cm)測定的溶液電導(dǎo)率。溶液的離子含量越高，溶液電導(dǎo)率越高。電導(dǎo)率可利用本領(lǐng)域已知技術(shù)輕易測定(例如通過測定通過兩個(gè)電極之間的電流)。本發(fā)明的分離方法可利用pH范圍為酸性到中性的溶液，例如大約pH3.5到大約中性。本文術(shù)語“大約中性pH”包括大約7的pH。例如，一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離方法可利用具有以下pH的溶液(例如緩沖液)進(jìn)行約3，約4，約5，約6，約7，或約8。優(yōu)選，所述溶液pH為約6或約7。一個(gè)實(shí)施方案中，所述溶液pH為約4.0，約4.1，約4.2，約4.3，約4.4，約4.5，約4.6，約4.7，約4.8，約4.9，約5.0，約5.1，約5.2，約5.3，約5.4，約5.5，約5.6，約5.7，約5.8，約5.9，約6.0，約6.1，約6.2，約6.3，約6.4，約6.5，約6.6，約6.7，約6.8，約6.9，約7.0，約7.1，約7.2，約7.3，約7.4，約7.5，約7.6，約7.7，約7.8，約7.9，或約8.0。本文術(shù)語“親和基質(zhì)”包括這樣的基質(zhì)，諸如附著有親和配體的瓊脂糖，控制的有孔玻璃和多聚(苯乙烯二乙烯基(styrenedivinyl))苯。所述親和配體結(jié)合所需多肽，且污染性多肽不結(jié)合親和配體。所需多肽可利用已知方案從親和基質(zhì)洗脫。本文術(shù)語“改造的”包括通過合成方法(例如通過重組技術(shù)，體外肽合成，通過肽的酶促和化學(xué)偶聯(lián)和這些技術(shù)的一些組合)操作核酸或多肽分子。優(yōu)選，本發(fā)明的結(jié)合分子被改造，例如以表達(dá)本發(fā)明的連接肽。本文術(shù)語″連接的，″″融合的″或″融合物″可互換使用。所述術(shù)語指通過包括化學(xué)偶聯(lián)或重組方法的任何方法將兩個(gè)以上元件和組分相連。“框內(nèi)融合“指將兩個(gè)或更多開放讀框(ORF)連接以形成連續(xù)較長的ORF，其方式使得保持原始ORF的正確讀框。因此，產(chǎn)生的重組融合蛋白是含有兩個(gè)或多個(gè)片段的單個(gè)蛋白，所述片段對(duì)應(yīng)原始ORF編碼的多肽(該片段通常不是天然連接的)。盡管讀框在整個(gè)融合的片段中連續(xù)，所述片段可通過例如框內(nèi)接頭序列物理或空間分離。在多肽的背景中，″線性序列″或″序列″是多肽中從氨基到羧基方向的一系列氨基酸，其中序列中相鄰的殘基在多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)中是相鄰的。本文術(shù)語“可從結(jié)合分子的給藥獲益的受試者“包括這樣的受試者，諸如哺乳動(dòng)物受試者，其可從所用結(jié)合分子的給藥獲益，例如用于檢測結(jié)合分子所識(shí)別的抗原的(例如用于診斷方法)，和/或從用于減少或清除所述結(jié)合分子識(shí)別的靶的利用結(jié)合分子的治療獲益。例如，一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者可從可溶性或具體分子(例如毒素或病原體)從循環(huán)或血清的減少或消除獲益，或從表達(dá)所述靶的細(xì)胞群體(例如腫瘤細(xì)胞)的減少或清除獲益。如前具體所述，所述結(jié)合分子可以以非偶聯(lián)的形式使用或偶聯(lián)的形式例如與藥物，前藥，或同種型偶聯(lián)的形式使用。II.合成連接肽本發(fā)明的二聚體的至少一條多肽鏈可包含本發(fā)明的合成連接肽。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體的至少兩條鏈包含連接肽。優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體的兩條鏈包含連接肽。一個(gè)實(shí)施方案中，連接肽可用于在單個(gè)多肽鏈的框內(nèi)連接兩個(gè)重鏈部分。例如，一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的連接肽可用于將CH3結(jié)構(gòu)域(或合成的CH3結(jié)構(gòu)域)融合于鉸鏈區(qū)(或合成鉸鏈區(qū))。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的連接肽可用于將CH3結(jié)構(gòu)域(或合成的CH3結(jié)構(gòu)域)融合于CH1結(jié)構(gòu)域(或合成的CH1結(jié)構(gòu)域)。另一實(shí)施方案中，連接肽可作為鉸鏈區(qū)(或合成鉸鏈區(qū))和CH2結(jié)構(gòu)域(或合成的CH2結(jié)構(gòu)域)之間的間隔物。另一實(shí)施方案中，CH3結(jié)構(gòu)域可融合于細(xì)胞外蛋白結(jié)構(gòu)域(例如，VL結(jié)構(gòu)域(或合成結(jié)構(gòu)域)，VH結(jié)構(gòu)域(或合成結(jié)構(gòu)域)，CH1結(jié)構(gòu)域(或合成結(jié)構(gòu)域)，鉸鏈結(jié)構(gòu)域(或合成鉸鏈)，或融合于受體的配體結(jié)合部分或配體的受體結(jié)合部分)。例如，一個(gè)實(shí)施方案中，VH或VL結(jié)構(gòu)域經(jīng)由連接肽融合于CH3結(jié)構(gòu)域(該連接肽的C-末端附著于CH3結(jié)構(gòu)域的N-末端，該連接肽的N-末端附著于VH或VL結(jié)構(gòu)域的C-末端)。另一實(shí)施方案中，CH1結(jié)構(gòu)域經(jīng)由連接肽融合于CH3結(jié)構(gòu)域(該連接肽的C-末端附著于CH3結(jié)構(gòu)域的N-末端，該連接肽的N-末端附著于CH1結(jié)構(gòu)域的C-末端)。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的連接肽可用于將CH3結(jié)構(gòu)域(或合成的CH3結(jié)構(gòu)域)融合于鉸鏈區(qū)(或合成鉸鏈區(qū))或其一部分。另一實(shí)施方案中，連接肽可作為鉸鏈區(qū)(或合成鉸鏈區(qū))和CH2結(jié)構(gòu)域(或合成的CH2結(jié)構(gòu)域)之間的間隔物。一個(gè)實(shí)施方案中，連接肽可包含或由gly/ser間隔物組成。例如，具有取代CH2結(jié)構(gòu)域的短氨基酸間隔物GGSSGGGGSG(SEQ.IDNo.1)和低級(jí)鉸鏈區(qū)(CC49.ΔCH2[gly/ser])的結(jié)構(gòu)域缺失的CC49構(gòu)建體可被使用。另一實(shí)施方案中，連接肽包含氨基酸序列IGKTISKKAK(SEQIDNO36)。另一實(shí)施方案中，連接肽可包含至少部分免疫球蛋白鉸鏈區(qū)。例如，可構(gòu)建其中鉸鏈元件源自不同抗體同種型的嵌合鉸鏈結(jié)構(gòu)域。一個(gè)實(shí)施方案中，連接肽包含至少部分IgG1鉸鏈區(qū)。另一實(shí)施方案中，連接肽可包含至少部分IgG3鉸鏈區(qū)。另一實(shí)施方案中，連接肽可包含至少部分IgG1鉸鏈區(qū)和至少部分IgG3鉸鏈區(qū)。一個(gè)實(shí)施方案中，連接肽可包含IgG1上和中鉸鏈以及單個(gè)IgG3中鉸鏈重復(fù)基序。由于所述包含來自免疫球蛋白鉸鏈區(qū)的氨基酸序列的連接肽中的單個(gè)氨基酸的編號(hào)可根據(jù)所述連接肽的長度變化，這些分子中氨基酸位置的編號(hào)利用Kabat編號(hào)給出，參見表2。表1顯示IgG1，IgG3，和IgG4分子的天然存在的鉸鏈序列。表2顯示這些鉸鏈分子的一部分的Kabat編號(hào)并且也顯示該表中的連接肽氨基酸殘基的Kabat編號(hào)。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的連接肽包含非-天然存在的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域，例如，不天然存在于包含鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域的多肽中的鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域和/或已經(jīng)被改變從而與天然存在的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列不同的鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域。一個(gè)實(shí)施方案中，可使鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域突變以產(chǎn)生本發(fā)明的連接肽。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的連接肽包括不含天然存在數(shù)目個(gè)半胱氨酸的鉸鏈結(jié)構(gòu)域，即所述連接肽包含的半胱氨酸數(shù)目少于或多余天然存在的鉸鏈分子中的半胱氨酸的數(shù)目。優(yōu)選的實(shí)施方案中，將連接肽(例如包含非天然存在個(gè)數(shù)的半胱氨酸)摻入多肽產(chǎn)生這樣的組合物，其中超過50％，60％，70％，80％或90％的二聚體分子以其中兩個(gè)重鏈部分經(jīng)由連接至少一個(gè)鏈間二硫鍵的形式存在。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，連接肽包含鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域，所述鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域包含脯氨酸殘基，其氨基酸位置相應(yīng)于Kabat編號(hào)系統(tǒng)中的氨基酸位置243(位置230，EU編號(hào)系統(tǒng))。一個(gè)實(shí)施方案中，連接肽包含丙氨酸殘基，其氨基酸位置相應(yīng)于位置244，Kabat編號(hào)系統(tǒng)(位置246，EU編號(hào)系統(tǒng))。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的連接肽包含脯氨酸殘基，其氨基酸位置相應(yīng)于位置245(Kabat編號(hào)系統(tǒng)；位置247，EU編號(hào)系統(tǒng)))。一個(gè)實(shí)施方案中，連接肽包含半胱氨酸殘基，其氨基位置相應(yīng)于位置239，Kabat編號(hào)系統(tǒng)(位置226，EU編號(hào)系統(tǒng))。一個(gè)實(shí)施方案中，連接肽包含絲氨酸殘基，其氨基位置相應(yīng)于位置239，Kabat編號(hào)系統(tǒng)(位置226，EU編號(hào)系統(tǒng))。一個(gè)實(shí)施方案中，連接肽包含半胱氨酸殘基，其氨基位置相應(yīng)于位置242，Kabat編號(hào)系統(tǒng)(位置229，EU編號(hào)系統(tǒng))。一個(gè)實(shí)施方案中，連接肽包含絲氨酸殘基，其氨基位置相應(yīng)于位置242，Kabat編號(hào)系統(tǒng)(位置229，EU編號(hào)系統(tǒng))。一個(gè)實(shí)施方案中，所述連接肽可被選擇為導(dǎo)致多肽具體同種型的優(yōu)先合成，例如，其中兩個(gè)重鏈部分經(jīng)由連接二硫鍵或不經(jīng)由二硫鍵連接。例如，如本發(fā)明實(shí)施例中所述，G1/G3/Pro243+[gly/ser]接頭(SEQIDNO8)，G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[gly/ser]接頭(SEQIDNO9)，Pro243+[gly/ser]接頭(SEQIDNO15)，和Pro243Ala244Pro245+[gly/ser]接頭(SEQIDNO14)，連接肽導(dǎo)致僅僅產(chǎn)生A型CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的抗體而無可檢測的B型。相反，CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的Cys242SerPro243(SEQIDNO12)，和CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的Cys242SerPro243Ala244Pro245(SEQIDNO13)，均導(dǎo)致對(duì)B同種型的偏好。這些合成鉸鏈區(qū)連接肽將由此可用于有利于A或B同種型的合成。這對(duì)于任何抗體同種型(例如，IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4)都如此，其基于所有四種人同種型的CH3結(jié)構(gòu)域之間的高度同源性。(包括相同和保守的氨基酸殘基，IgG1CH3結(jié)構(gòu)域與IgG2CH398.13％同源，與IgG3CH397.20％同源，與IgG4CH396.26％同源)。用于本發(fā)明的連接肽和各種結(jié)合分子的圓括號(hào)代表等同術(shù)語，除非另有說明。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的連接肽包含鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域然后是柔性gly/ser接頭。示例性連接肽顯示于表2和SEQIDNO8-15，48和49。將理解這些示例性連接肽的各種形式可通過導(dǎo)入一或多個(gè)核苷酸取代，添加或缺失到編碼連接肽的核苷酸序列中使得一或多個(gè)氨基酸取代，添加或缺失被導(dǎo)入連接肽而產(chǎn)生。例如，突變可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)導(dǎo)入，諸如定點(diǎn)誘變和PCR-介導(dǎo)的誘變。優(yōu)選，保守氨基酸取代在一或多個(gè)非-必需氨基酸殘基進(jìn)行使得連接肽優(yōu)選提高A型或B型的能力不變。″保守氨基酸取代″是其中的氨基酸殘基被具有類似側(cè)鏈的氨基酸取代的氨基酸。具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族在本文定義，其包括堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸，精氨酸，組氨酸)，酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不帶電的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)，beta-分支的側(cè)鏈(例如，蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的氨基酸殘基優(yōu)選被來自相同側(cè)鏈家族的另一氨基酸取代。另一實(shí)施方案中，一串氨基酸可被結(jié)構(gòu)類似但順序不同的氨基酸串和/或側(cè)鏈家族成員的組合取代。本發(fā)明的連接肽可為多種長度。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的連接肽的長度約15-約50個(gè)氨基酸。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的連接肽的長度為約20-約45個(gè)氨基酸。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的連接肽長度為約25-約40個(gè)氨基酸。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的連接肽的長度為約30-約35個(gè)氨基酸。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的連接肽長度為約24-約27個(gè)氨基酸。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的連接肽長度為約40-約42個(gè)氨基酸。連接肽可利用本領(lǐng)域已知技術(shù)導(dǎo)入多肽序列。例如，一個(gè)實(shí)施方案中，可利用通過OverlapExtension(SOE)法(Horton，R.M.1993MethodsinMolecularBiology，Vol15PCRProtocolsCurrentMethods和applications.Ed.B.A.White)的拼接(Splicing)。修飾可通過DNA序列分析證實(shí)。質(zhì)粒DNA可用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以穩(wěn)定產(chǎn)生生成的多肽。一個(gè)實(shí)施方案中，將目的連接肽之一摻入多肽產(chǎn)生包含多肽分子的組合物，其中所述多肽分子具有至少兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和至少兩條多肽鏈，其中至少兩條所述多肽鏈包含合成連接肽，其中超過50％的分子以其中兩個(gè)重鏈部分經(jīng)由連接至少一個(gè)鏈間二硫鍵的形式存在。另一實(shí)施方案中，超過60％的分子以其中兩個(gè)重鏈部分經(jīng)由連接至少一個(gè)鏈間二硫鍵的形式存在。另一實(shí)施方案中，超過70％的分子以其中兩個(gè)重鏈部分經(jīng)由連接至少一個(gè)鏈間二硫鍵的形式存在。另一實(shí)施方案中，超過80％的分子以其中兩個(gè)重鏈部分經(jīng)由連接至少一個(gè)鏈間二硫鍵的形式存在。另一實(shí)施方案中，超過90％的分子以其中兩個(gè)重鏈部分經(jīng)由連接至少一個(gè)鏈間二硫鍵的形式存在。一個(gè)實(shí)施方案中，將受試連接肽之一摻入IgG4分子產(chǎn)生這樣的組合物，其中超過95％的分子以其中兩個(gè)重鏈部分經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接的形式存在。III.結(jié)合分子本發(fā)明的多肽包含至少兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其結(jié)合目的靶分子。示例性結(jié)合位點(diǎn)包括，例如結(jié)合抗體的位點(diǎn)(抗體結(jié)合位點(diǎn))，結(jié)合受體的位點(diǎn)(受體結(jié)合位點(diǎn))，和結(jié)合配體的位點(diǎn)(配體結(jié)合位點(diǎn))。一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含至少兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子具有至少一個(gè)特異于介導(dǎo)生物效應(yīng)的分子(例如調(diào)節(jié)細(xì)胞活化(例如通過結(jié)合細(xì)胞表面受體并導(dǎo)致活化和抑制信號(hào)的轉(zhuǎn)移和抑制)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡(例如，通過補(bǔ)體固定或暴露于存在結(jié)合分子上的有效負(fù)荷)或調(diào)節(jié)受試者中的疾病或病癥(例如，通過促進(jìn)纖維蛋白凝塊溶解或促進(jìn)凝塊形成)，或通過調(diào)節(jié)生物可利用物質(zhì)的量(例如，通過增加或減少受試者中諸如TNFα的配體的量))的靶結(jié)合位點(diǎn)。一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子具有至少一個(gè)特異于被靶向減少或消除的分子例如細(xì)胞表面抗原或可溶抗原的靶結(jié)合位點(diǎn)。一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合分子與靶的結(jié)合導(dǎo)致靶的減少或消除，例如從組織或循環(huán)減少或消除。另一實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子具有至少一個(gè)特異于用于檢測靶分子存在(例如檢測污染物或診斷疾病或病癥)的結(jié)合位點(diǎn)。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含至少一個(gè)將結(jié)合分子靶向受試者中的特定位點(diǎn)(例如腫瘤細(xì)胞或血液凝塊)的結(jié)合位點(diǎn)?？砂诒景l(fā)明結(jié)合分子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的示例性結(jié)合位點(diǎn)包括配體的受體結(jié)合部分，受體的配體結(jié)合部分，酶的底物結(jié)合部分，底物的酶結(jié)合部分，或抗體的一或多個(gè)抗原結(jié)合部分。一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合分子(例如抗體分子，雙特異性抗體或修飾的抗體)的至少一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)是催化性的(ShokatandSchultz.1990.Annu.Rev.Immunol.8335)。一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合分子的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)存在于相同的多肽中，例如在單鏈抗體或微型抗體中(參見例如，美國專利5,837,821或WO94/09817A1)。另一實(shí)施方案中，多肽的的重鏈部分和輕鏈部分存在于不同多肽鏈中，例如在抗體分子中。本發(fā)明的靶結(jié)合多肽是多聚體分子。一個(gè)實(shí)施方案中，所述靶結(jié)合肽是二聚體。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體是同源二聚體，包含兩個(gè)相同的單體亞基。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體是異源二聚體，包含兩個(gè)不同的單體亞基。所述二聚體包含至少兩條多肽鏈。一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含兩條多肽鏈。另一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含三條多肽鏈。另一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含四條多肽鏈。優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含至少一個(gè)抗體CDR，所述抗體例如本領(lǐng)域已知結(jié)合目的靶的抗體。另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含至少兩個(gè)CDR。另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含至少兩個(gè)CDR。另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含至少兩個(gè)CDR。另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含至少三個(gè)CDR。另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含至少四個(gè)CDR。另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含至少五個(gè)CDR。另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含至少六個(gè)CDR。優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含至少一個(gè)抗體VH結(jié)構(gòu)域，所述抗體例如本領(lǐng)域已知結(jié)合目的靶的抗體。優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含至少一個(gè)VL結(jié)構(gòu)域。另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含抗體的至少一個(gè)VH結(jié)構(gòu)域和一個(gè)VL結(jié)構(gòu)域。一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合位點(diǎn)由VH結(jié)構(gòu)域組成，例如其源自camelid，在缺乏VL鏈?zhǔn)欠€(wěn)定(Hamers-Castermanetal.1993.Nature363446；Desmyteretal.1996.Nat.Struct.Biol.3803；Desmyter，A.，1996.Nat.Struct.Biol.3803；Decanniere，K.，etal.1999.Structure7361；Daviesetal.1996.ProteinEng.9531；Korttetal.1995.J.ProteinChem.14167)。A.融合蛋白本發(fā)明還涉及結(jié)合分子，其包含一或多個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的融合蛋白包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域(其包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn))和二聚體化結(jié)構(gòu)域(其包含至少一個(gè)重鏈部分)。目的融合蛋白可為雙特異性(具有一個(gè)針對(duì)第一個(gè)靶的結(jié)合位和針對(duì)第二個(gè)靶的第二結(jié)合位點(diǎn))或可為多價(jià)的(具有針對(duì)同一靶的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn))。文獻(xiàn)中報(bào)道的示例性融合蛋白包括T細(xì)胞受體融合物(Gascoigneetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA842936-2940(1987))；CD4(Caponetal.，Nature337525-531(1989)；Trauneckeretal.，Nature33968-70(1989)；Zettmeissletal.，DNACellBiol.USA9347-353(1990)；和Byrnetal.，Nature344667-670(1990))；L-selectin(回巢受體)(Watsonetal.，J.Cell.Biol.1102221-2229(1990)；和Watsonetal.，Nature349164-167(1991))；CD44(Aruffoetal.，Cell611303-1313(1990))；CD28和B7(Linsleyetal.，J.Exp.Med.173721-730(1991))；CTLA-4(Lisleyetal.，J.Exp.Med.174561-569(1991))；CD22(Stamenkovicetal.，Cell661133-1144(1991))；TNF受體(Ashkenazietal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8810535-10539(1991)；Lesslaueretal.，Eur.J.Immunol.272883-2886(1991)；和Peppeletal.，J.Exp.Med.1741483-1489(1991))；和IgE受體a(Ridgway和Gorman，J.Cell.Biol.Vol.115，AbstractNo.1448(1991))。一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白將配體或受體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD))與至少一個(gè)重鏈結(jié)構(gòu)域和合成連接肽相結(jié)合。一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)制備本發(fā)明的融合蛋白時(shí)，編碼配體或受體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸的C末端可融合于編碼免疫球蛋白恒定區(qū)序列N-末端的核酸。一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白包括CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。也可在恒定結(jié)構(gòu)域Fc部分的C-末端，或緊鄰重鏈的CH1的N末端處或輕鏈相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行融合。一個(gè)實(shí)施方案中，配體或受體的結(jié)構(gòu)域的序列融合于免疫球蛋白分子Fc結(jié)構(gòu)域的N-末端。也可能將完整重鏈恒定區(qū)融合于配體或受體結(jié)構(gòu)域。一個(gè)實(shí)施方案中，起始于鉸鏈區(qū)內(nèi)恰好位于木瓜蛋白酶裂解位點(diǎn)或其它免疫球蛋白的類似位點(diǎn)上游的序列用于融合中，所述木瓜蛋白酶裂解位點(diǎn)在化學(xué)上限定IgGFc(即殘基216，重鏈的第一個(gè)殘基定義為114)。發(fā)生融合的精確位點(diǎn)并不重要；具體位點(diǎn)是已知的并可被選擇以便優(yōu)化分子的生物活性，分泌或結(jié)合特性。制備融合蛋白的方法是本領(lǐng)域已知的。對(duì)于雙特異性融合蛋白，融合蛋白聚集為多聚體，并具體為異二聚體或異四聚體。通常，這些聚集的免疫球蛋白將具有已知的亞基結(jié)構(gòu)?；镜乃逆溄Y(jié)構(gòu)亞基是其中存在IgG，IgD，和IgE的形式。四鏈亞基在高分子量免疫球蛋白中重復(fù)；IgM通常作為由二硫鍵結(jié)合在一起的四個(gè)基本亞基形成的四聚體。IgA球蛋白，有時(shí)還有IgG球蛋白，也可以多聚體形式存在于血清中。在多聚體的情況下，四個(gè)亞基的每一個(gè)可以是相同或不同的。可包含在融合蛋白中的其它示例性配體及其受體包括細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體細(xì)胞因子對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖，分化和功能活化具有多向性效應(yīng)。各種細(xì)胞因子，或其受體結(jié)合部分可用于本發(fā)明的融合蛋白中。示例性細(xì)胞因子包括白介素(例如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，和IL-18)，集落刺激因子(CSF)(例如粒細(xì)胞CSF(G-CSF)，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞CSF(GM-CSF)，和單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞CSF(M-CSF))，腫瘤壞死因子(TNF)alpha和beta，以及干擾素諸如干擾素-α，β，或γ(美國專利Nos.4,925,793和4,929,554)。細(xì)胞因子受體通常由配體-特異性alpha鏈和共同的beta鏈組成。示例性細(xì)胞因子受體包括GM-CSF受體，IL-3受體(美國專利No.5,639,605)，IL-4受體(美國專利No.5,599,905)，IL-5受體(美國專利No.5,453,491)，IFNγ受體(EP0240975)，和TNF受體家族(例如，TNFα(例如TNFR-1(EP417,563)，TNFR-2(EP417,014)淋巴毒素beta受體)。粘附蛋白粘附分子是膜結(jié)合的蛋白，其允許細(xì)胞相互作用。各種粘附蛋白，包括白細(xì)胞回巢受體和細(xì)胞粘附分子，或其受體結(jié)合部分，可包含在本發(fā)明的融合蛋白中。白細(xì)胞回巢受體在炎癥過程中表達(dá)于細(xì)胞表面，并包括β-1整聯(lián)蛋白(例如VLA-1，2，3，4，5，和6)(其介導(dǎo)與細(xì)胞外基質(zhì)組分的結(jié)合)，以及β2-整聯(lián)蛋白(例如LFA-1，LPAM-1，CR3，和CR4)(其結(jié)合血管內(nèi)皮上的細(xì)胞粘附分子(CAM))。示例性CAM包括ICAM-1，ICAM-2，VCAM-1，和MAdCAM-1。其它CAM包括selectin家族的成員，包括E-selectin，L-selectin，P-selectin。趨化因子趨化因子，刺激白細(xì)胞向感染位點(diǎn)遷移的趨化蛋白，也可包含在本發(fā)明的融合蛋白中。示例性趨化因子包括巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP-1-α和MIP-1-β)，中性粒細(xì)胞趨化因子，和RANTES(調(diào)節(jié)活化，通常為T-細(xì)胞表達(dá)的和分泌的)。生長因子和生長受體生長因子或其受體(或受體結(jié)合或其配體結(jié)合部分)可包含在本發(fā)明的融合蛋白中。示例性生長因子包括血管內(nèi)皮生長(VEGF)及其同種型(美國專利5,194,596)；纖維母細(xì)胞生長因子(FGF)，包括FGF和bFGF；心房鈉利尿因子(ANF)；肝生長因子(HGFs；美國專利Nos.5,227,158和6,099,841)，神經(jīng)營養(yǎng)因子諸如骨來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，neurotrophin-3，-4，-5，或-6(NT-3，NT-4，NT-5，或NT-6)，或神經(jīng)生長因子諸如NGF-β血小板來源的生長因子(PDGF)(美國專利4,889,919，4,845,075，5,910,574，和5,877,016)；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)諸如TGF-alpha和TGF-beta(WO90/14359)，骨誘導(dǎo)因子包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)；胰島素樣生長因子-I和-II(IGF-I和IGF-II；美國專利Nos.6,403,764和6,506,874)；促紅細(xì)胞生成素(EPO)；干細(xì)胞因子(SCF)，血小板生成素(thrombopoietin)(c-Mpl配體)，和Wnt多肽(美國專利No.6,159,462)。示例性生長因子受體，其可用來靶向本發(fā)明的受體結(jié)構(gòu)域，包括EGF受體；VEGF受體(例如Flt1或Flk1/KDR)，PDGF受體(WO90/14425)；HGF受體(美國專利Nos.5,648,273，和5,686,292)，和神經(jīng)營養(yǎng)受體(包括的親和力受體(LNGFR)，也稱為p75NTR或p75，其結(jié)合NGF，BDNF，和NT-3)，和高親和力受體，其為受體酪氨酸激酶trk家族的成員(例如trkA，trkB(EP455,460)，trkC(EP522,530))。激素用作本發(fā)明融合蛋白中的靶試劑的示例性生長激素包括腎素，人生長激素(HGH；美國專利No.5,834,598)，N-甲硫氨酰人生長激素；牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素(PTH)；甲狀腺刺激激素(TSH)；甲狀腺素；原胰島素和胰島素(美國專利Nos.5,157,021和6,576,608)；濾泡刺激激素(FSH)，降鈣素，促黃體(luteinizing)激素(LH)，leptin，胰高血糖素；蛙皮素；生長激素；米勒管(mullerian)-抑制物；松弛素(relaxin)和原松弛素(prorelaxin)；促性腺激素相關(guān)肽；催乳素(prolactin)，胎盤催乳激素(lactogen)；OB蛋白；或米勒管抑制物。凝血因子用作本發(fā)明融合蛋白中的靶向劑的示例性凝血因子包括凝血因子(例如，因子V，VII，VIII，X，IX，XI，XII和XIII，vonWillebrand因子)；組織因子(美國專利5,346,991，5,349,991，5,726,147，和6,596,84)；凝血酶和凝血酶原；血纖維蛋白和血纖維蛋白原；纖溶酶和纖溶酶原；纖溶酶原激活劑，諸如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)。其它示例性融合蛋白在例如，WO0069913A1和WO0040615A2中教導(dǎo)。其它可包含在本發(fā)明融合蛋白的示例性分子是IGSF9。融合蛋白可利用本領(lǐng)域已知方法制備(見例如美國專利5,116,964和5,225,538)。通常，配體或受體結(jié)構(gòu)域的C末端融合于重鏈恒定區(qū)(或重鏈部分)的N末端，并取代可變區(qū)。任何配體結(jié)合受體的跨膜區(qū)或脂質(zhì)或磷脂錨定識(shí)別序列優(yōu)選在融合前是失活的或缺失的。編碼配體或受體結(jié)構(gòu)域的DNA通過限制酶在或臨近編碼所需ORF片段的DNA的5’和3’末端裂解。產(chǎn)生的DNA片段隨后容易地插入編碼重鏈恒定區(qū)的DNA中。進(jìn)行融合的精確位點(diǎn)可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選擇，以優(yōu)化可溶融合蛋白的分泌或結(jié)合性質(zhì)。編碼融合蛋白的DNA隨后轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞用于表達(dá)。B.抗體或其一部分一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子例如抗原結(jié)合分子是抗體分子。利用本領(lǐng)域已知的方案，例如，抗體優(yōu)選通過在哺乳動(dòng)物中多次經(jīng)皮下或腹腔內(nèi)注射相關(guān)抗原(例如，純化的腫瘤相關(guān)抗原或包含所述抗原的細(xì)胞或細(xì)胞提取物)和佐劑來激發(fā)。這樣的免疫通常激發(fā)免疫反應(yīng)，包括從活化的脾細(xì)胞或淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗原反應(yīng)性抗體。雖然所生成的抗體可自動(dòng)物血清收獲以提供多克隆制備物，通常需要從脾、淋巴結(jié)或外周血收獲個(gè)體淋巴細(xì)胞以提供單克隆抗體(MAb)的均質(zhì)制備物。優(yōu)選，所述淋巴細(xì)胞獲自脾。在該已知的方法中(Kohleretal.，Nature，256495(1975))來自注射了抗原的哺乳動(dòng)物的相對(duì)短壽的，或必死的淋巴細(xì)胞與永生化腫瘤細(xì)胞系(例如骨髓瘤細(xì)胞系)融合，由此產(chǎn)生雜合細(xì)胞或“雜交瘤”，其不僅是永生化的而且能夠產(chǎn)生B細(xì)胞的遺傳編碼的抗體。產(chǎn)生的雜合體通過選擇、稀釋和再生長分離成單個(gè)同屬菌株，每個(gè)個(gè)體菌株包含單個(gè)個(gè)體信息的特異性基因。它們產(chǎn)生針對(duì)所需抗原的均質(zhì)抗體，根據(jù)它們的純的同屬來源，稱為“單克隆的”。如此制備的雜交瘤細(xì)胞接種并生長于適宜培養(yǎng)基中，其優(yōu)選含有一或多種抑制未融合、親本骨髓瘤細(xì)胞的生長或存活的物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解用于雜交瘤的形成、選擇、生長的試劑、細(xì)胞系和介質(zhì)可購自多種來源，并且標(biāo)準(zhǔn)化方案是已經(jīng)確定的。通常，測定其中生長有雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中針對(duì)所需抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生。優(yōu)選，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過免疫沉淀或體外測定法諸如放射免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定。將雜交瘤細(xì)胞鑒定為產(chǎn)生具有所需特異性、親和性和/或活性的抗體之后，所述克隆可通過限制稀釋法亞克隆并通過標(biāo)準(zhǔn)方法生長(Goding，MonoclonalAntibodiesPrinciples和Practice，pp59-103(AcademicPress，1986))。應(yīng)進(jìn)一步理解所述亞克隆分泌的單克隆抗體可通過常規(guī)純化法諸如例如蛋白質(zhì)-A，羥磷灰石層析，凝膠電泳，透析或親和層析分離自培養(yǎng)基。另一實(shí)施方案中，編碼所需單克隆抗體的DNA可利用常規(guī)方法輕易分離并測序(例如通過利用能夠特異性結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。分離的且亞克隆的雜交瘤細(xì)胞作為所述DNA的優(yōu)選來源。一旦分離，DNA可置于表達(dá)載體中，隨后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入否則不產(chǎn)生免疫球蛋白的原核或真核宿主細(xì)胞諸如大腸桿菌細(xì)胞，猴COS細(xì)胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞。更具體地，分離的DNA(如本文所述其可為修飾的)可用于克隆恒定和可變區(qū)序列用于如Newmanetal.，1995-1-25提交的美國專利5,658,570所述制備抗體，所述文獻(xiàn)包含在本文作為參考。實(shí)質(zhì)上，這需要從所選細(xì)胞提取RNA，轉(zhuǎn)化成cDNA，以及利用Ig特異性引物通過PCR擴(kuò)增。用于該目的的適宜引物也在美國專利5,658,570中描述。如下文具體所述，表達(dá)所需抗體的經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以以相對(duì)較大的量生長以提供臨床及商業(yè)所需的免疫球蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解編碼抗體或抗體片段的DNA也可源自抗體噬菌體庫，例如利用pd噬菌體或Fd噬粒技術(shù)。示例性方法見例如，EP368684B1；美國專利5,969,108，Hoogenboom，H.R.和Chames.2000.Immunol.Today21371；Nagyetal.2002.Nat.Med.8801；Huieetal.2001.Proc.Natl.Acad.Sci.USA982682；Luietal.2002.J.Mol.Biol.3151063，每一篇都包含在本文作為參考。一些公開文獻(xiàn)(例如，Marksetal.Bio/Technology10779-783(1992))描述了通過鏈改組以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建大的噬菌體文庫的策略來制備高親和力人抗體。另一實(shí)施方案中，核糖體展示可用于取代噬菌體作為展示平臺(tái)(見例如，Hanesetal.2000.Nat.Biotechnol.181287；Wilsonetal.2001.Proc.Natl.AcadSci.USA983750；或Irvingetal.2001J.Immunol.Methods24831.另一實(shí)施方案中，可篩選細(xì)胞表面文庫中的抗體(Boderetal.2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA9710701；Daughertyetal.2000J.Immunol.Methods243211。所述方法提供了單克隆抗體分離和隨后的克隆的常規(guī)雜交瘤技術(shù)的其它選擇。本發(fā)明另一實(shí)施方案包含在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)中產(chǎn)生人抗體或基本上的人抗體，所述動(dòng)物不能產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白(見例如，美國專利6,075,181，5,939,598，5,591,669和5,589,369，每篇文獻(xiàn)都包含在本文作為參考)。例如，描述了抗體重鏈聯(lián)合區(qū)在嵌合和種系突變小鼠中的純合缺失導(dǎo)致內(nèi)源抗體產(chǎn)生的完全抑制。將人免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到所述種系突變小鼠將導(dǎo)致在抗原攻擊下產(chǎn)生人抗體。利用SCID小鼠產(chǎn)生人抗體的另一優(yōu)選方法公開于美國專利5,811,524其包含在本文作為參考。將理解所述與這些人抗體相關(guān)的遺傳物質(zhì)將如本發(fā)明所述分離和操作。用于產(chǎn)生重組抗體的另一種高度有效的方法公開于Newman，Biotechnology，101455-1460(1992)。具體地，該技術(shù)導(dǎo)致靈長類源化抗體的產(chǎn)生，所述抗體含有猴可變結(jié)構(gòu)域和人恒定序列。該文獻(xiàn)全文包含在本文作為參考。此外，該技術(shù)也在美國專利5,658,570，5,693,780和5,756,096中描述，每篇文獻(xiàn)都包含在本文作為參考。另一實(shí)施方案中，淋巴細(xì)胞可通過顯微操作以及分離的可變基因來選擇。例如，外周血單核細(xì)胞可分離自經(jīng)免疫的哺乳動(dòng)物并在體外培養(yǎng)約7天?？珊Y選培養(yǎng)物中滿足篩選標(biāo)準(zhǔn)的特異性IgG。來自陽性孔的細(xì)胞可被分離。個(gè)體Ig產(chǎn)生型B細(xì)胞可通過FACS或通過在補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血噬斑試驗(yàn)中鑒定來分離?？蓪g產(chǎn)生型B細(xì)胞顯微操作到試管中，并利用例如，RT-PCR擴(kuò)增Vh和Vl基因。VH和VL基因可被克隆入抗體表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染入細(xì)胞(例如真核或原核細(xì)胞)用于表達(dá)。此外，用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的遺傳序列可獲自多種不同來源。例如，如上文所述，多種人抗體基因可得自公眾可獲得的保藏。許多抗體序列以及編碼抗體的基因已經(jīng)公開，并且可利用已知技術(shù)從這些序列化學(xué)合成適宜的抗體基因。與本發(fā)明該方面相容的寡核苷酸合成技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并可利用多種可購得的自動(dòng)合成儀進(jìn)行。此外，本文所述編碼多種類型的重鏈和輕鏈的DNA序列可通過商品化DNA合成銷售商的服務(wù)獲得。利用任何前述方法獲得的遺傳物質(zhì)可為改變的或修飾的以獲得本發(fā)明的多肽?？蛇x，抗體生成細(xì)胞系可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)選擇和培養(yǎng)。所述技術(shù)在多種實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)和主要出版物中描述。在該方面中，下述適宜用于本發(fā)明的技術(shù)描述于CurrentProtocolsinImmunology，Coliganetal.，Eds.，GreenPublishingAssociates和Wiley-Interscience，JohnWiley和Sons，NewYork(1991)，其全文及附錄都包含在本發(fā)明中作為參考。將理解本發(fā)明的范圍進(jìn)一步包括所有抗原結(jié)合DNA序列的等位基因，變體和突變體。已知RNA可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離自原始雜交瘤細(xì)胞或其它轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，諸如異硫氰酸胍(guanidiniumisothiocyanate)提取和沉淀然后是離心或?qū)游?。需要時(shí)，mRNA可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)諸如在寡dT纖維素上層析而從總RNA分離。適宜技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的?？勺兒秃愣▍^(qū)結(jié)構(gòu)域可得自任何來源并摻入本發(fā)明的修飾的抗體。為克隆抗體，mRNA可分離自雜交瘤，脾，或淋巴細(xì)胞，反轉(zhuǎn)錄入DNA，以及PCR擴(kuò)增的抗體基因。PCR可通過共有恒定區(qū)因組或更特異的引物基于公開的重鏈和輕鏈DNA以及氨基酸序列來啟動(dòng)。如上所述，PCR也可用于分離編碼抗體輕鏈和重鏈的DNA克隆。在這種情況中，可通過共有序列引物或較大的同源探針諸如小鼠恒定區(qū)探針來篩選文庫。各種適于擴(kuò)增抗體基因的引物組是本領(lǐng)域已知的(例如，基于純化的抗體N末端序列的5’引物(BenharandPastan.1994.ProteinEngineering71509)；cDNA末端的快速擴(kuò)增(Ruberti，F(xiàn).etal.1994.J.Immunol.Methods17333)；抗體前導(dǎo)序列(Larricketal.1989Biochem.Biophys.Res.Commun.1601250)；或基于Kabat的已知可變區(qū)框架氨基酸序列(Kabatetal.1991.SequencesofProteinsofImmunologicalInterest.Bethesda，MDJSDep.HealthHum.Serv.5thed.)或V-堿基數(shù)據(jù)庫(例如，Orlandietal.1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA863833；Sblatteroetal.1998.Immunotechnology3271；orKrebberetal.1997.J.Immunol.Methods20135)?？蛇x擇具有特定效應(yīng)功能(或缺乏特定效應(yīng)功能)或具有降低免疫原性的特定修飾的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域?？勺兒蜋M笛功能結(jié)構(gòu)域可被克隆，例如利用聚合酶鏈反應(yīng)和被選用于擴(kuò)增目的結(jié)構(gòu)域的引物。PCR擴(kuò)增法在U.S.Pat.Nos.4,683,195；4,683,202；4,800,159；4,965,188；和，例如，“PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplications”Innisetal.eds.，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)；Hoetal.1989.Gene7751Hortonetal.1993.MethodsEnzymol.2l7270)中詳述?？蛇x，V結(jié)構(gòu)域可獲自所選動(dòng)物的V基因序列文庫。可利用所需抗原篩選表達(dá)結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合例如，VH和VL結(jié)構(gòu)域的文庫，以鑒定具有所需結(jié)合形式的元件。所述篩選方法是本領(lǐng)域已知的。例如，抗體基因庫可被克隆入細(xì)菌噬菌體表達(dá)載體(Huse，WDetal.1989.Science24761275)。此外，可篩選在其表面表達(dá)抗體細(xì)胞(BoderandWittrup.1997.Nat.Biotechnol.15553；Daugtherty，P.etal.2000.J.Immunol.Methods.243211；Franciscoetal.1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA9010444；Georgiouetal.1997.NatureBiotechnology1529)或病毒(例如，Hoogenboom，HR.1998Immunotechnology41Winteretal.1994.Annu.Rev.Immunol.12433；Griffiths，AD.1998.Curr.Opin.Biotechnol.9102)。核糖體展示也可用于篩選抗體文庫(HanesJ.，etal.1998.Proc.Natl.Acad.Sci.USA9514130；Hanes，J.andPluckthun.1999.Curr.Top.Microbiol.Immunol.243107；He，M.andTaussig.1997.NucleicAcidsResearch255132)。優(yōu)選用于篩選的文庫是人V基因文庫。非人來源的VL和VH結(jié)構(gòu)域也可使用。一個(gè)實(shí)施方案中，所述非人V結(jié)構(gòu)域可利用本領(lǐng)域已知技術(shù)改變以降低它們的免疫原性。文庫可以是初始的()，來自未經(jīng)免疫的受試者，或半合成的(Hoogenboom，H.R.andWinter.1992.J.Mol.Biol.227381；Griffiths，AD，etal.EMBOJ.133245；deKruif，J.etal.1995.J.Mol.Biol.24897；Barbas，C.F.，etal.1992.Proc.Natl.Acad.Sci.USA894457)。此外，許多抗體V和C結(jié)構(gòu)域的序列已知并且所述結(jié)構(gòu)域可利用本領(lǐng)域已知方法合成。一個(gè)實(shí)施方案中，可對(duì)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變以產(chǎn)生具有較高異質(zhì)性的核酸分子文庫(Thompson，J.，etal.1996.J.Mol.Biol.25677；Lamminmaki，U.etal.1999.J.Mol.Biol.291589；Caldwell，R.C.andJoyceGF.1992.PCRMethodsAppl.228；CaldWellRCandJoyceGF.1994.PCRMethodsAppl.3S136。標(biāo)準(zhǔn)篩選法可用于選擇高親和力變體。另一實(shí)施方案中，可改變VH和VL序列以增加抗體親合力，例如利用采用本領(lǐng)域已知技術(shù)從晶體結(jié)構(gòu)獲得的信息。C.修飾的抗體示例性構(gòu)建體包括，例如，微型抗體，二價(jià)抗體，融合于CH3分子的二價(jià)抗體，四價(jià)抗體，intradiabodies(例如，Jendreykoetal.2003.J.Biol.Chem.27847813)，雙特異性抗體，融合蛋白質(zhì)(例如，抗體細(xì)胞因子融合蛋白，融合于至少部分Fc受體的蛋白)，雙特異性抗體。其它免疫球蛋白(Ig)及其特定變體在例如以下文獻(xiàn)中描述美國專利4,745,055；EP256,654；Faulkneretal.，Nature298286(1982)；EP120,694；EP125,023；Morrison，J.Immun.123793(1979)；Kohleretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA772197(1980)；Rasoetal.，CancerRes.412073(1981)；Morrisonetal.，Ann.Rev.Immunol.2239(1984)；Morrison，Science2291202(1985)；Morrisonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA816851(1984)；EP255,694；EP266,663；和WO88/03559。再分類的免疫球蛋白鏈也是已知的。見例如，美國專利4,444,878；WO88/03565；和EP68,763以及本文所引用的文獻(xiàn)。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含免疫球蛋白重鏈，其具有至少一個(gè)氨基酸的缺失或取代。A例如，在CH2結(jié)構(gòu)域的所選區(qū)域中一或多個(gè)單個(gè)氨基的突變對(duì)于基本上降低Fc結(jié)合由此增加腫瘤定位而言是足夠的。類似地，需要簡單消除一或多個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的控制待調(diào)節(jié)的效應(yīng)功能(例如補(bǔ)體結(jié)合)的部分。所述恒定區(qū)的部分缺失可改善抗體的所選特性(血清半壽期)，同時(shí)保持與受試恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域相關(guān)的其它所需功能的完整。因此，一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子缺乏所有或部分CH2結(jié)構(gòu)域。此外，如上所述，本發(fā)明抗體的恒定區(qū)可通過突變或取代一或多個(gè)增強(qiáng)所得構(gòu)建體圖譜的氨基酸來修飾。在這方面，可破壞保守結(jié)合位點(diǎn)(例如Fc結(jié)合)提供的活性，同時(shí)基本保持修飾的抗體的構(gòu)型和免疫原性圖譜。另一優(yōu)選實(shí)施方案可包括將一或多個(gè)氨基酸加入恒定區(qū)以增強(qiáng)所需特征諸如效應(yīng)功能或提供更多的細(xì)胞毒素或碳水化合物的附著。所述實(shí)施方案中，需要插入或復(fù)制來自所選恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的特定序列。另一實(shí)施方案中，可對(duì)天然存在鉸鏈區(qū)進(jìn)行突變。對(duì)本發(fā)明恒定區(qū)的所述突變可輕易利用本領(lǐng)域已知的生物化學(xué)或分子改造技術(shù)進(jìn)行。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含修飾的恒定區(qū)，其中一或多個(gè)結(jié)構(gòu)域被部分或完全缺失(“結(jié)構(gòu)域缺失的抗體”)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，適合的修飾的抗體將包含結(jié)構(gòu)域缺失的構(gòu)建體或變體，其中整個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域被去除。多種修飾的抗體構(gòu)建體在下文詳細(xì)描述。i.微型抗體一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的修飾的抗體是微型抗體。微型抗體是嵌合分子，其由兩條多肽鏈組成，每一條多肽鏈包含ScFv分子(包含一或多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的單個(gè)多肽，例如，經(jīng)由柔性結(jié)構(gòu)連接于經(jīng)由連接肽融合于CH3結(jié)構(gòu)域的VH結(jié)構(gòu)域的VL結(jié)構(gòu)域。示例性微型抗體構(gòu)建體顯示于圖2。圖2中CH3結(jié)構(gòu)域的N末端融合于連接肽，所述連接肽的N末端融合于經(jīng)由其N末端融合于柔性接頭的VH結(jié)構(gòu)域，所述柔性結(jié)構(gòu)的N末端融合于VL結(jié)構(gòu)域。ScFv分子可構(gòu)建為VH-接頭-VL方向或VL-接頭-VH方向。連接組成抗原結(jié)合位點(diǎn)的VL和VH結(jié)構(gòu)域的柔性鉸鏈優(yōu)選包括約10-約50個(gè)氨基酸。用于該目的的示例性連接肽是(Gly4Ser)3(SEQIDNO35)(Hustonetal..1988.Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879)。其它連接肽是本領(lǐng)域已知的。制備單鏈抗體的方法是本領(lǐng)域已知的，例如，Hoetal.1989.Gene7751；Birdetal.1988Science242423；Pantolianoetal.1991.Biochemistry3010117；Milenicetal.1991.CancerResearch516363；Takkinenetal.1991.ProteinEngineering4837。微型抗體可通過構(gòu)建ScFv組分和連接肽-CH3組分利用本領(lǐng)域所述方法來構(gòu)建(見，例如，US專利5,837,821或WO94/09817A1)。這些組分可作為限制片段分離自分離的質(zhì)粒，隨后連接并再克隆入適當(dāng)?shù)妮d體。適宜的組裝可通過限制消化和DNA序列分析證實(shí)。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的微型抗體包含連接肽。一個(gè)實(shí)施方案中，所述連接肽包含gly/ser接頭，例如，GGGSSGGGSGG(SEQIDNO1)。另一實(shí)施方案中，四價(jià)微型抗體可被構(gòu)建。四價(jià)微型抗體可以與微型抗體相同的方式構(gòu)建，但是兩個(gè)ScFv分子經(jīng)由柔性結(jié)構(gòu)連接，例如具有氨基酸序列(G4S)4G3AS(SEQIDNO36)。示例性四價(jià)微型抗體顯示于圖2。ii.缺失的抗體另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的修飾的抗體是CH2結(jié)構(gòu)域缺失的抗體。結(jié)構(gòu)域缺失的構(gòu)建體可源自載體(例如，來自DECPharmaceuticals，SanDiego)，所述載體編碼IgG1人恒定結(jié)構(gòu)域(見，例如，WO02/060955A2和WO02/096948A2)?；旧?，所述載體被改造，以消除CH2結(jié)構(gòu)域，并提供表達(dá)結(jié)構(gòu)域缺失的IgG1恒定區(qū)的修飾的載體。編碼C2B8抗體，5E8抗體，B3F6抗體的鼠可變區(qū)或人源化的CC49抗體的可變區(qū)的基因隨后被插入修飾的載體并被克隆。當(dāng)在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)的時(shí)候，這些載體提供，C2B8.ΔCH2，5E8.ΔCH2，B3F6.ΔCH2或huCC49.ΔCH2，或分別提供。這些構(gòu)建體顯示多種特性，所述的特性使得它們尤其適于作為單體亞基的有吸引力的候選物。除了缺失完整恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域以外，可以理解本發(fā)明的抗體可被改造成部分缺失或取代一些氨基酸或甚至單個(gè)氨基酸的形式。例如，在CH2結(jié)構(gòu)域所選區(qū)域內(nèi)，單個(gè)氨基酸的突變對(duì)于基本上降低Fc結(jié)合以及由此增加腫瘤定位而言是足夠的。類似地，需要簡單缺失一或多個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的控制效應(yīng)功能(例如補(bǔ)體C1Q結(jié)合)的部分。所述恒定區(qū)的部分缺失可改善抗體的所選性質(zhì)(血清半壽期)，同時(shí)保持與受試恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域相關(guān)的其它所需功能完整。CH2結(jié)構(gòu)域缺失的版本的產(chǎn)生可通過重疊PCR誘變的方式來實(shí)現(xiàn)。gamma1恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域從質(zhì)粒編碼的NheI位點(diǎn)開始，其與免疫球蛋白序列一起在翻譯讀框中。構(gòu)建5’PCR引物，其編碼NheI位點(diǎn)以及緊鄰其下游的序列。構(gòu)建了3’PCR引物配對(duì)物，使得其在3’末端與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)退火，并在框內(nèi)編碼gamma1CH3結(jié)構(gòu)域的前幾個(gè)氨基酸。第二個(gè)PCR引物對(duì)由來自第一個(gè)對(duì)(上文)的3’PCR引物的反向互補(bǔ)物作為5’引物，以及在CH3結(jié)構(gòu)域中跨BsrGI限制位點(diǎn)的基因座退火的3’引物組成。每次PCR擴(kuò)增后，所得產(chǎn)物用作模板，并分別利用NheI和BsrGI作為5’和3’引物。擴(kuò)增的產(chǎn)物隨后克隆回N5KG1中以產(chǎn)生質(zhì)粒N5KG1ΔCH2。該構(gòu)建將完整CH3結(jié)構(gòu)域置于緊接的下游，并與完整鉸鏈區(qū)在框內(nèi)?？衫妙愃频姆椒óa(chǎn)生結(jié)構(gòu)域缺失的構(gòu)建體，其中CH3結(jié)構(gòu)域緊鄰連接肽下游。例如，C2B8抗體的結(jié)構(gòu)域缺失的版本以該方式產(chǎn)生如U.S.Pat.Nos.5,648,267和5,736,137所述，每篇文獻(xiàn)都包含在本文作為參考。一個(gè)實(shí)施方案中，四價(jià)結(jié)構(gòu)域-缺失的抗體可通過將編碼結(jié)構(gòu)域缺失的抗體的DNA序列與ScFv分子結(jié)合來制備。例如，一個(gè)實(shí)施方案中，這些序列被組合，使得ScFv分子的N末端經(jīng)由柔性結(jié)構(gòu)連接于結(jié)構(gòu)域缺失的的抗體的CH3結(jié)構(gòu)域(例如，gly/ser接頭，諸如(Gly4Ser)3(SEQIDNO35)。另一實(shí)施方案中，四價(jià)抗體可通過將ScFv分子融合于連接肽制備，所述連接肽融合于CH1結(jié)構(gòu)域，以構(gòu)建ScFv-Fab四價(jià)分子。(ColomaandMorrison.1997.NatureBiotechnology.15159；WO95/09917)。iii.二價(jià)抗體二價(jià)抗體類似于scFv分子，但通常具有短(少于10，優(yōu)選1-5)氨基酸殘基接頭，所述結(jié)構(gòu)連接兩個(gè)V結(jié)構(gòu)域，使得同一多肽鏈上的VL和VH結(jié)構(gòu)域不相互作用。然而，一條多肽鏈上的VL和VH結(jié)構(gòu)域與另一條多肽鏈上的VH和VL結(jié)構(gòu)域(分別)作用(WO02/02781)。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子是融合于至少一個(gè)重鏈部分的二價(jià)抗體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子是融合于CH3結(jié)構(gòu)域的二價(jià)抗體。本發(fā)明的修飾的抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合分子包含具有附著于輕鏈N末端的scFv的四價(jià)或雙特異性四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的抗體。本發(fā)明另一實(shí)施方案中，結(jié)合分子包含具有附著于重鏈N末端的scFv的四價(jià)或雙特異性四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的抗體。一個(gè)實(shí)施方案中，scFv與N末端的連接導(dǎo)致所述分子與其中scFv附著于羧基末端的分子相比，前者的聚集減少。一個(gè)實(shí)施方案中，低于約30％聚集體存在于通過表達(dá)N末端融合構(gòu)建體的細(xì)胞產(chǎn)生的結(jié)合分子的組合物中。一個(gè)實(shí)施方案中，低于約20％聚集體存在于通過表達(dá)N末端融合構(gòu)建體的細(xì)胞產(chǎn)生的結(jié)合分子的組合物中。一個(gè)實(shí)施方案中，低于約10％聚集體存在于通過表達(dá)N末端融合構(gòu)建體的細(xì)胞產(chǎn)生的結(jié)合分子的組合物中。一個(gè)實(shí)施方案中，低于約5％聚集體存在于通過表達(dá)N末端融合構(gòu)建體的細(xì)胞產(chǎn)生的結(jié)合分子的組合物中。其它形式的修飾的抗體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)(例如，WO02/02781A1；5,959,083；6,476,198B1；US2002/0103345A1；WO00/06605；Byrnetal.1990.Nature.344667-70；ChamowandAshkenazi.1996.TrendsBiotechnol.1452)。D.催化抗體一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的修飾的抗體的至少一種結(jié)合特異性是催化性的。催化結(jié)合特異性可通過利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生(見，例如，美國專利6,590,080，美國專利5,658,753)。催化結(jié)合特異性可通過多種基本機(jī)制起作用，所述機(jī)制類似于所鑒定的酶穩(wěn)定過渡態(tài)，由此降低活化的自由能的機(jī)制。例如，大多數(shù)酸性和堿性殘基可任選放置，使得參與催化活性位點(diǎn)內(nèi)的催化；共價(jià)酶-底物中間體可形成；催化抗體可位于適于反應(yīng)的方向中，并將反應(yīng)物的有效濃度增加至少7個(gè)數(shù)量級(jí)(Fersht，A.R.，etal.，Am.Chem.Soc.90(1968)5833)，由此，大大降低化學(xué)反應(yīng)的熵。最后，催化性抗體可轉(zhuǎn)化底物結(jié)合時(shí)獲得的能量，以使得反應(yīng)趨向類似過渡態(tài)的結(jié)構(gòu)。一個(gè)實(shí)施方案中，酸性和堿性氨基酸可通過互補(bǔ)電荷分子諸如免疫原而置于結(jié)合位點(diǎn)中。該技術(shù)對(duì)于利用含有帶正電荷的銨離子的半抗原來激發(fā)抗體是成功的(Shokat，etal.，Chem.Int.Ed.Engl.27(1988)269-271)。另一方法中，抗體可被激發(fā)成穩(wěn)定化合物，起類似于所需反應(yīng)的過渡態(tài)的大小，形狀，以及電荷(即過渡態(tài)類似物)。見，美國專利4,792,446和美國專利4,963,355，它們描述了利用過渡態(tài)類似物來免疫動(dòng)物，以及催化性抗體的制備。這兩篇專利文獻(xiàn)都包含在本文作為參考。一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子作為免疫偶聯(lián)物的一部分例如，具有免疫原性載體分子，諸如KLH給藥。示例性催化結(jié)合特異性可具有，例如脂酶活性(涉及帶電的過渡態(tài)，其靜電特性以及形狀特性可通過膦酸酯結(jié)構(gòu)模擬；Jacobs，etal.，J.Am.Chem.Soc.109(1987)2174-2176；Durfor，etal.，J.Am.Chem.Soc.110(1988)8713-8714；Tramontano，etal.，J.Am.Chem.Soc.110(1988)2282；Pollack，etal.，J.Am.Chem.Soc.111(1989)5961-5962)；肽酶和酰胺酶活性(Janda，etal.，Science241(1988)1188-1191；Iverson，etal.，Science243(1989)1184-1188；Paul，etal.，Science244(1989)1158-1162)；Claisenrearrangement(Jackson，etal.，J.Am.Chem.Soc.110(1988)4841-4842；Hilvert，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(1988)4953-4955；Hilvert，etal.，J.Am.Chem.Soc.110(1988)5593-5594)；氧化還原反應(yīng)(redoxreactions)(Shokat，etal.，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.27(1989)269-271)；胸腺嘧啶二聚體的光化學(xué)裂解(photochemicalcleavage)(Cochran，etal.，J.Am.Chem.Soc.110(1988)7888-7890)；立體特異性酯基轉(zhuǎn)移作用重排(stereospecifictransesterificationrearrangements)(Napper，etal.，Science237(1987)1041-1043)；或雙分子酰胺合成(bimolecularamidesynthesis)(Benkovic，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(1988)5355-5358；Janda，etal.，Science241(1988)1188-1191).另一方法中，常規(guī)結(jié)合特異性可突變，以使得它們稱為催化性的。篩選催化性抗體活性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(例如，Reymond，J.L.2002.JournalofImmunologicalMethods269125；Mouratouetal.2002.J.ofImmunologicalMethods.269147。另一實(shí)施方案中，催化性B細(xì)胞可被選擇，例如，美國專利6,590,080所述，所述選擇利用可被構(gòu)建成促進(jìn)催化性B細(xì)胞選擇的分子來進(jìn)行。另一實(shí)施方案中，催化性結(jié)合特異性可作為兩步法的一個(gè)部分來開發(fā)。催化性抗體僅僅當(dāng)顯示以下結(jié)合特異性時(shí)才能被選擇結(jié)合底物以及反應(yīng)基團(tuán)，使得這兩個(gè)基團(tuán)在互相反應(yīng)的位置中。其次，選擇的抗體可通過共價(jià)結(jié)合反應(yīng)性基團(tuán)到抗體的結(jié)合袋子中而得以化學(xué)改造。JImmunolMethods.2002.26981-98。一個(gè)實(shí)施方案中，催化性結(jié)合特異性特異于前體要去。所述結(jié)合特異性可用于催化前體藥物轉(zhuǎn)化成在體內(nèi)有效的藥物。優(yōu)選，催化的反應(yīng)是不能通過天然酶在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)的反應(yīng)?？贵w對(duì)前體藥物的活化的實(shí)例是本領(lǐng)域已知的(見，例如，Miyashitaetal.1993.Proc.Natl.Acad.Sci.USA905337)。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的修飾的抗體分子包含至少一種對(duì)靶細(xì)胞的結(jié)合特異性，以及至少一種對(duì)前體藥物的結(jié)合特異性。例如，優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的修飾的抗體分子包含至少一種對(duì)腫瘤細(xì)胞的結(jié)合特異性，以及至少一種對(duì)前體藥物的結(jié)合特異性，所述前體藥物不能被轉(zhuǎn)化成細(xì)胞毒藥物。一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的修飾的抗體分子包含對(duì)氨基甲酸酯(carbamate)前體藥物4-[N，N，-雙(2-氯乙基)]氨基苯基-N-[(1S-(1，3-二羧基)丙基]氨基甲酸酯的特異性，并且產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞毒性氮芥(itrogenmustard)(Wentworthetal.1996.ProcNatl.Acad.Sci.USA.93799)。一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的抗體在給藥前體藥物之前給藥，以允許在靶細(xì)胞位點(diǎn)的聚集。示例性前體藥物是本領(lǐng)域已知的。前體藥物也某一部分摻入來合成，所述部分可通過將設(shè)計(jì)為通過催化作用，例如通過具有醛縮酶活性的抗體催化的連續(xù)后-醛醇(retro-aldol)/后(retro)-Michael反應(yīng)來裂解。E.多特異性結(jié)合分子一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子是多特異性的，即具有至少一個(gè)結(jié)合第一分子或分子表位的結(jié)合位點(diǎn)，以及至少一個(gè)結(jié)合第二分子或分子表位的第二結(jié)合位點(diǎn)。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子是雙特異性的。雙特異性分子可結(jié)合兩種不同的靶位點(diǎn)。例如，在相同靶分子或不同靶分子上。例如，對(duì)于抗體的情況，雙特異性分子可結(jié)合兩個(gè)不同表位，例如在相同抗原或不同抗原上。雙特異性分子可用于例如診斷和治療應(yīng)用中。例如，它們可用于固定酶，用于免疫測定法。它們也可用于診斷和治療癌癥，例如通過結(jié)合腫瘤相關(guān)分子以及可檢測標(biāo)記(例如，鰲合劑，其緊密結(jié)合放射性核素)。雙特異性分子也可用于人治療，例如通過將細(xì)胞毒性針對(duì)特定靶(例如通過結(jié)合病原體和腫瘤細(xì)胞，以及結(jié)合細(xì)胞毒性激發(fā)分子，諸如T細(xì)胞受體或Fcγ受體。雙特異性抗體也可，例如用作纖維蛋白溶解劑或疫苗佐劑。雙特異性結(jié)合分子的實(shí)例包括具有至少兩條針對(duì)腫瘤細(xì)胞抗原的臂的那些；具有至少一條針對(duì)腫瘤細(xì)胞抗原的臂和至少一條針對(duì)細(xì)胞毒性激發(fā)分子(諸如抗-Fc.gamma.RI/抗-CD15，抗-p185.sup.HER2/Fc.gamma.RIII(CD16)，抗-CD3/抗-惡性B-細(xì)胞(1D10)，抗-CD3/抗-p185.sup.HER2，抗-CD3/抗-p97，抗-CD3/抗-腎細(xì)胞癌，抗-CD3/抗-OVCAR-3，抗-CD3/L-D1(抗-結(jié)腸癌)，抗-CD3/抗-黑素細(xì)胞刺激激素類似物，抗-EGF受體/抗-CD3，抗-CD3/抗-CAMA1，抗-CD3/抗-CD19，抗-CD3/MoV18，抗-神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(NCAM)/抗-CD3，抗-葉酸結(jié)合蛋白(FBP)/抗-CD3，抗-泛(pan)癌相關(guān)抗原(AMOC-31)/抗-CD3)的臂的雙特異性結(jié)合分子；具有至少一條特異結(jié)合腫瘤抗原的臂以及至少一條結(jié)合毒素(諸如抗-saporin/抗-Id-1，抗-CD22/抗-saporin，抗-CD7/抗-saporin，抗-CD38/抗-saporin，抗-CEA/抗-蓖麻蛋白A鏈，抗-干擾素-.alpha.(IFN-.alpha.)/抗-雜交瘤獨(dú)特型，抗-CEA/抗-長春花生物堿)的臂的雙特異性結(jié)合分子；用于轉(zhuǎn)化酶活化的前體藥物(suchas抗-CD30/抗-堿性磷酸酶(其催化絲裂霉素磷酸鹽前體藥物轉(zhuǎn)化為絲裂霉素醇(mitomycinalcohol)))的雙特異性結(jié)合分子；可用作纖維蛋白裂解劑(諸如抗-纖維蛋白/抗-組織纖維蛋白溶酶原激活物(tPA)，抗-纖維蛋白/抗-尿激酶-型纖維蛋白溶酶原激活物(uPA))的雙特異性結(jié)合分子；將免疫復(fù)合物靶向細(xì)胞表面受體(諸如抗-低密度脂蛋白(LDL)/抗-Fc受體(例如Fc.gamma.RI，F(xiàn)c.gamma.RII或Fc.gamma.RIII))的雙特異性結(jié)合分子；用于治療感染疾病的雙特異性結(jié)合分子(諸如抗-CD3/抗-單純皰疹病毒(HSV)，抗-T-細(xì)胞受體CD3復(fù)合物/抗-流感，抗-Fc.gamma.R/抗-HIV)；用于體外和體內(nèi)腫瘤檢測的的雙特異性結(jié)合分子，諸如抗-CEA/抗-EOTUBE，抗-CEA/抗-DPTA，抗-p185HER2/抗--半抗原)；作為疫苗佐劑的雙特異性結(jié)合分子(見Fangeretal.，supra)；以及作為診斷工具的雙特異性結(jié)合分子(諸如抗-兔IgG/抗-鐵蛋白，抗-辣根過氧化物酶(HRP)/抗-激素，抗-生長激素抑制素/抗-P物質(zhì)，抗-HRP/抗-FITC，抗-CEA/抗-.beta.-半乳糖苷酶(見Nolanetal.，上文))。三特異性抗體的實(shí)例包括抗-CD3/抗-CD4/抗-CD37，抗-CD3/抗-CD5/抗-CD37和抗-CD3/抗-CD8/抗-CD37。一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性分子結(jié)合CRIPTO-I。對(duì)于每種特異性而言，雙特異性分子可為單價(jià)的，或?qū)τ诿糠N特異性而言為多價(jià)的。例如，抗體分子或融合蛋白可包含一個(gè)與第二個(gè)靶分子反應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，或者包含兩個(gè)與第一個(gè)靶分子反應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)以及兩個(gè)與第二個(gè)靶分子反應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)。制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，重組技術(shù)可用于制備雙特異性分子，例如二價(jià)抗體，單鏈二價(jià)抗體，串聯(lián)scFv等。用于制備雙特異性分子的示例性技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(例如，Kontermannetal.MethodsinMolecularBiologyVol.248AntibodyEngineeringMethodsandProtocols.Pp227-242US2003/0207346A1以及本文所述文獻(xiàn))。一個(gè)實(shí)施方案中，多聚體雙特異性抗體可利用諸如例如，US2003/0207346A1或USpatent5,821,333，或US2004/0058400中所述的方法來制備。本文術(shù)語″多特異性融合蛋白″指具有至少兩種結(jié)合特異性(即結(jié)合配體或受體的兩個(gè)或多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的融合蛋白(如上文所述)。多特異性融合蛋白可聚集為異源二聚體，異源三聚體或異源四聚體，基本上如WO89/02922(1989-4-6公開)，EP314,317(1989-5-3公開)，和美國專利5,116,964(1992-5-2公開)所述。優(yōu)選的多特異性融合蛋白是雙特異性的。雙特異性融合蛋白的實(shí)例包括CD4-IgG/TNF受體-IgG和CD4-IgG/L-selectin-IgG。最后述及的分子結(jié)合了淋巴回巢受體(LHR，L-selectin)的淋巴結(jié)結(jié)合功能以及CD4的HIV結(jié)合功能，并且可用于預(yù)防和治療HIV感染，相關(guān)疾病和作為診斷物。本發(fā)明的多特異性結(jié)合分子的靶結(jié)合位點(diǎn)可由本領(lǐng)域技術(shù)人員輕易選擇。不作為任何限制，示例性結(jié)合位點(diǎn)包括一或多個(gè)腫瘤抗原的表位。其它示例性靶分子包括以下物質(zhì)的一或多個(gè)表位例如硫酸肝素，生長因子或其受體(例如表皮生長因子受體，胰島素樣生長因子受體，肝細(xì)胞生長因子(HGF/SF)受體。更多可參見，例如，Caoetal.Proc.Natl.Acad.Sci2001.987443；Luetal.2004.J.Biol.Chem.2792856。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及雙特異性分子，例如抗體，其包含至少一個(gè)結(jié)合已知靶的結(jié)合位點(diǎn)，以及至少一個(gè)識(shí)別未知靶的結(jié)合位點(diǎn)(例如，一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體包含選自半合成抗體噬菌體展示文庫的結(jié)合位點(diǎn))。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可從特異性已知的單鏈抗體開始，利用本領(lǐng)域已知技術(shù)建造Fab文庫，和可選，本領(lǐng)域技術(shù)人員可從特異性已知的Fab片段開始，利用本領(lǐng)域已知技術(shù)建造單鏈文庫。本領(lǐng)域已知，來自非免疫的來源并通過V基因序列合成重組(優(yōu)選VH與DH和JH，VL與JL序列重組)制備的文庫，可用于分離針對(duì)任何抗原的抗體。例如，母案申請(qǐng)WO92/01047教導(dǎo)了抗體片段可在細(xì)菌噬菌體表面展示，并且它們將結(jié)合抗原?？贵w片段(例如，F(xiàn)ab，F(xiàn)v，ScFv和VH)可利用該性質(zhì)直接選擇。其它本領(lǐng)域已知的方法包括例如，美國專利5,698,426；6,291,159；5,658,727；5,667,988；和5,969,108中教導(dǎo)的那些。另一實(shí)施方案中，識(shí)別已知靶的scFv可與分離自半合成人噬菌體抗體展示文庫的scFv二聚化。(見，例如，KruifandLogtenberg1996.J.Biol.Chem.2717630)。一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性分子可表達(dá)于任何用于表達(dá)抗體分子的表達(dá)系統(tǒng)，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，酵母諸如畢赤酵母(Picchia)，大腸桿菌，桿狀病毒等。一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性分子在NEOSPLA載體系統(tǒng)(見，例如，美國專利6,159,730)中表達(dá)。該載體含有巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，小鼠beta球蛋白主要啟動(dòng)子，SV40復(fù)制起點(diǎn)，牛生長激素多腺苷酸序列，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶外顯子1和外顯子2，二氫葉酸還原酶基因以及前導(dǎo)序列。一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性分子包含合成連接肽。這些雙特異性分子具有已知靶的一或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，并在一或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)表達(dá)文庫。所述雙特異性分子可用于，例如鑒定與已知靶非常接近或相關(guān)的分子。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在用于利用本領(lǐng)域已知方法選擇誘導(dǎo)具體反應(yīng)例如凋亡或細(xì)胞活化的實(shí)驗(yàn)中利用受試雙特異性結(jié)合分子。被鑒定為產(chǎn)生被篩選的反應(yīng)的雙特異性分子可隨后被鑒定并測定其特異性。利用所述方法，可鑒定與具體的目的靶非常相關(guān)的分子，例如T細(xì)胞標(biāo)記或其它信號(hào)分子(諸如CRIPTO-I，死亡結(jié)構(gòu)域分子，參與凋亡的分子)。已知靶和新鑒定為“最近鄰居(nearestneighbor)”的分子的接近性可利用免疫沉淀和其它本領(lǐng)域已知的技術(shù)證實(shí)。利用這些方法，可鑒定分子作為用于調(diào)節(jié)具體細(xì)胞反應(yīng)的靶。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽含有包含下圖所示核苷酸序列的核酸序列編碼的氨基酸序列顯示于圖8A(SEQIDNO16)，圖8B(SEQIDNO17)，圖8C(SEQIDNO18)，圖10A(SEQIDNO22)，圖10B(SEQIDNO23)。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含顯示于圖8A(SEQIDNO16)，圖8B(SEQIDNO17)，圖8C(SEQIDNO18)，圖10A(SEQIDNO22)，圖10B(SEQIDNO23)的核苷酸分子。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽分子包含顯示于圖9A(SEQIDNO19)，圖9B(SEQIDNO20)，圖9C(SEQIDNO21)，圖11A(SEQIDNO24)，或圖11B(SEQIDNO25)的氨基酸序列。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是由包含下圖所示核苷酸序列的核酸序列編碼的圖12A(SEQIDNO26)，圖12B(SEQIDNO27)，圖14(SEQIDNO30)，或圖15(SEQIDNO31)。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含顯示于圖12A(SEQIDNO26)，圖12B(SEQIDNO27)，圖14(SEQIDNO30)，或圖15(SEQIDNO31)的核苷酸分子。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽分子包含顯示于圖13A(SEQIDNO28)，圖13B(SEQIDNO29)，圖16(SEQIDNO32)，或圖17(SEQIDNO33)的氨基酸序列。本發(fā)明序列表和附圖中公開的其它核酸和氨基酸序列也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。D.多肽的表達(dá)操作分離的遺傳物質(zhì)以提供本發(fā)明上述的多肽以后，將基因以常規(guī)方式插入表達(dá)載體以導(dǎo)入宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞可用于制備所需量的多肽，從而提供權(quán)利要求的多肽。本文中，為說明書和權(quán)利要求書的目的，術(shù)語“載體”或“表達(dá)載體”，是指根據(jù)本發(fā)明作為載體將所需基因(desiredgene)導(dǎo)入細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá)的載體。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，該載體可以很容易地從質(zhì)粒、噬菌體、病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒組成的組中選擇。總之，適用于本發(fā)明的載體將具有選擇性標(biāo)記、有利于所需基因的克隆的適當(dāng)?shù)南拗泼盖形稽c(diǎn)、進(jìn)入真核細(xì)胞或原核細(xì)胞和/或在其中復(fù)制的能力。為達(dá)到本發(fā)明的目的，可能應(yīng)用許多表達(dá)載體系統(tǒng)。例如，一種類型的載體利用源于動(dòng)物病毒如牛乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、桿狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒的DNA元件。其它涉及具有內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)的多順反子系統(tǒng)的應(yīng)用。示例性載體包括美國專利6,159,730或6,413,777或US20030157641A1中教導(dǎo)的那些。此外，可通過導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)允許選擇轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的標(biāo)記物，選擇那些把DNA整合到自身染色體的細(xì)胞。所述標(biāo)記可為營養(yǎng)缺陷宿主提供原養(yǎng)型，殺菌劑(例如抗生素)抗性或?qū)χ亟饘偃玢~的抗性。選擇性標(biāo)記基因可直接連接(linked)到DNA序列以便表達(dá)，也可通過共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入同一細(xì)胞。一個(gè)實(shí)施方案中，可使用可誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)。其它元件也可是優(yōu)化合成mRNA所需的。這些元件可包括信號(hào)序列拼接信號(hào)，以及轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，增強(qiáng)子和終止信號(hào)。一個(gè)實(shí)施方案中，分泌信號(hào)，例如數(shù)種性質(zhì)已知的細(xì)菌前導(dǎo)肽(例如pelB，phoA，或ompA)中的任意一種，可與本發(fā)明的多肽的N末端在框內(nèi)融合以獲得所述多肽的最佳分泌。(Leietal.1988Nature331543；Betteretal.Science1988.2401041；Mullinaxetal.，1990.Proc.Natl.Acad.Sci.USA878095)。一個(gè)實(shí)施方案中，可利用包含編碼肽接頭的核酸序列的載體。另一實(shí)施方案中，可能需要首先將所需的編碼序列(例如分泌信號(hào)，VL，接頭肽，VH等)組裝入信號(hào)序列，例如通過利用重疊引物的PCR擴(kuò)增，然后連入質(zhì)?；蚱渌d體。在優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，將克隆的可變區(qū)基因，連同前文討論過的修飾的重鏈和輕鏈的恒定區(qū)基因(優(yōu)選人類的)一起，插入表達(dá)載體。優(yōu)選的是，采用IDEC公司的專利表達(dá)載體是有效的，其名稱為NEOSPLA(參見U.S.專利6,159,730)。該載體含有巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子、小鼠β球蛋白主要啟動(dòng)子(majorpromoter)、SV40復(fù)制起點(diǎn)、牛生長激素多腺苷酸化序列、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶外顯子1和外顯子2、二氫葉酸還原酶基因和前導(dǎo)序列。正如下文實(shí)例所見，已發(fā)現(xiàn)該載體在摻入可變區(qū)和恒定區(qū)基因、在CHO細(xì)胞中轉(zhuǎn)染、經(jīng)含有G418的培養(yǎng)基選擇和甲氨喋呤擴(kuò)增后，導(dǎo)致抗體的極高水平的表達(dá)。載體系統(tǒng)在美國專利第5,736,137和5,658,570中也作過講解，上述二者均全文收錄在本文中作為參考。該系統(tǒng)提供了高表達(dá)水平，如＞30pg/細(xì)胞/天。其它具代表性的載體系統(tǒng)也被公開，如美國專利第6,413,777中。其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可利用多順反子構(gòu)建體，所述構(gòu)建體如那些2001年11月16日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)第60/331,481號(hào)公開的那些，該專利也全文收錄在本文中作為參考。這些新開發(fā)的表達(dá)系統(tǒng)中，感興趣的多基因產(chǎn)物諸如抗體的重鏈和輕鏈可由單一的多順反子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生。這些系統(tǒng)有利地應(yīng)用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internalribosomeentrysite，IRES)，在真核宿主細(xì)胞中提供相對(duì)高水平的本發(fā)明的多肽。適宜的IRES序列已在美國專利第6,193,980號(hào)中公布，該專利收錄在本文中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解，該表達(dá)系統(tǒng)可用來有效地生產(chǎn)本申請(qǐng)中公開的所有多肽。更為普遍的是，一旦編碼多肽的單體亞基(如一修飾后的抗體)的載體或DNA序列得以制備，表達(dá)載體可被導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞。即，所述宿主細(xì)胞可被轉(zhuǎn)化。將質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞可采用該領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種技術(shù)完成，這些技術(shù)包括轉(zhuǎn)染(包括電泳和電穿孔法)、原生質(zhì)體融合法、磷酸鈣沉淀法、與包被DNA的細(xì)胞融合、顯微注射法和完整病毒感染法，但不限于上述方法。參閱Ridgway，A.A.G.所著″(MammalianExpressionVectors)″第24章第.2節(jié)，470-472頁“載體”，Rodriguez和Denhardt撰寫(Eds)。(Butterworths，Boston，Mass.1988)。更為優(yōu)選的是，通過電穿孔法將質(zhì)粒導(dǎo)入宿主。轉(zhuǎn)化細(xì)胞在適合輕鏈和重鏈生成的條件下生長，測定其重鏈和/或輕鏈蛋白合成(的量)。具代表性的分析技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)、熒光激活的細(xì)胞分選分析法(flourescence-activatedcellsorteranalysis，F(xiàn)ACS)、免疫組織化學(xué)法等。此處所用術(shù)語“轉(zhuǎn)化”廣義上涉及將DNA導(dǎo)入受體宿主細(xì)胞、改變其基因型并因此引發(fā)受體細(xì)胞改變的任意導(dǎo)入。同理(Alongthosesamelines)，“宿主細(xì)胞”涉及已被利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化，并至少編碼一個(gè)外源基因的細(xì)胞。在說明抗體從重組宿主分離的過程時(shí)，術(shù)語“細(xì)胞”和“細(xì)胞培養(yǎng)”可交替應(yīng)用，均表示抗體來源，除非明確強(qiáng)調(diào)另有所指。換言之，從“細(xì)胞”回收多肽可以指從離心所得的(spundown)完整細(xì)胞回收，也可指從包含培養(yǎng)基或混懸的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)中回收。用于蛋白表達(dá)的宿主細(xì)胞首選哺乳動(dòng)物來源的細(xì)胞，確信本領(lǐng)域技術(shù)人員有優(yōu)選決定最適合將在其中表達(dá)所需基因產(chǎn)物的具體細(xì)胞系的能力。具代表性的宿主細(xì)胞株包括DG44和DUXB11(中國倉鼠卵巢細(xì)胞系，DHFR-)、HELA(人宮頸癌)、CVI(猴腎細(xì)胞系)、COS(用SV40T抗原由CVI衍生的細(xì)胞系)、R1610(中國倉鼠纖維母細(xì)胞)、BALBC/3T3(小鼠纖維母細(xì)胞)、HAK(倉鼠腎細(xì)胞株)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3.times.63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛內(nèi)皮細(xì)胞)、RAJI(人淋巴細(xì)胞)及293(人腎細(xì)胞)。優(yōu)選CHO細(xì)胞。宿主細(xì)胞株通常獲自商業(yè)服務(wù)，美國典型培養(yǎng)物保藏中心或已發(fā)表的文章。另一實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，例如允許二巰基腱形成的細(xì)胞株(Derman，AIetal，1993.Science.2621744；Bessette，PH.Etal.1999.Proc.Natl.Acad.Sci.USA9613703)。體外實(shí)驗(yàn)允許擴(kuò)大規(guī)模以產(chǎn)生大量預(yù)期的多肽。組織培養(yǎng)條件下的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，其中包括均質(zhì)混懸液培養(yǎng)(homogeneoussuspensionculture)如在空運(yùn)反應(yīng)器或持續(xù)攪拌反應(yīng)器中，或固定化(immobilized)或捕獲的(entrapped)細(xì)胞培養(yǎng)如在中空纖維、微膠囊(microcapsules)中，在瓊脂糖珠(microbeads)或陶瓷筒上。如果必要和/或需要，多肽溶液可通過常用的層析法純化，如凝膠過濾法、離子交換層析法、DEAE層析法或(免疫-)親和層析法，例如，在修飾的鉸鏈區(qū)多肽的優(yōu)選生物合成之后，或在本文描述的HIC層析步驟之前或之后。編碼本發(fā)明多肽的基因也可在非哺乳動(dòng)物細(xì)胞如細(xì)菌、酵母菌或植物細(xì)胞中表達(dá)。從這點(diǎn)上可以理解不同的非哺乳動(dòng)物單細(xì)胞微生物如細(xì)菌也可被轉(zhuǎn)化，即那些可在培養(yǎng)物和發(fā)酵物中生長的微生物。易于轉(zhuǎn)化的細(xì)菌包括腸桿菌科成員例如大腸桿菌或沙門氏菌的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)如枯草芽孢桿菌；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)。也可進(jìn)一步理解，當(dāng)在細(xì)菌中表達(dá)時(shí)，多肽通常成為包涵體的一部分。該多肽必須被分離、純化然后組裝成有功能的分子。如果想得到抗體的四價(jià)形式，亞單位會(huì)自我組裝成四價(jià)抗體(WO02/096948A2)。除原核生物外，也可利用真核微生物。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或普通面包酵母(commonbaker’syeast)是最常應(yīng)用的真核微生物，盡管其它一些菌株也通?？捎谩?duì)于在糖酵母(Saccharomyces)中表達(dá)，常用的載體如質(zhì)粒YRp7(Stinchcombetal.，Nature，28239(1979)；Kingsmanetal.，Gene，7141(1979)；Tschemperetal.，Gene，10157(1980))。該質(zhì)粒已具有TRP1基因，該基因給缺乏在色氨酸中生長的能力的酵母菌突變株提供選擇性標(biāo)記，所述菌株例如ATCCNo.44076或PEP4-1(Jones，Genetics，8512(1977))。trpl損害的存在作為該酵母菌宿主細(xì)胞基因組的特性，通過在缺乏色氨酸的條件下生長，為檢測轉(zhuǎn)化提供有效的環(huán)境。IV.從缺乏鏈間二硫鍵的多肽中分離至少含有一個(gè)鏈間二硫鍵的多肽一方面，本發(fā)明涉及采用疏水作用層析hydrophobicinteractionchromatography)從混合物中分離帶兩個(gè)重鏈部分的分子，該混合物中部分分子的兩個(gè)重鏈以至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接，也有部分分子沒有通過至少一個(gè)二硫鍵連接。疏水作用層析最早是在觀察到含有碳?xì)浠衔镩g隔臂(hydrocarbonspacerarms)但缺乏親和配體的蛋白質(zhì)可被固定在親和力凝膠上之后發(fā)展起來的。從HIC支持物的洗脫可在改變?nèi)軇?、pH、離子強(qiáng)度或添加離液序列高的物質(zhì)或有機(jī)物改性劑(organicmodifier)如乙二醇或丙二醇后實(shí)現(xiàn)。關(guān)于疏水作用層析的一般原則的說明可在美國專利如3,917,527和4,000,098中找到。高效液相層析(HPLC)背景中的HIC用于在一單步驟方案中，用于從完整的抗體分子分離缺乏重鏈部分的抗體片段(如，F(xiàn)(ab′)2)。本發(fā)明的分離方法可應(yīng)用于未經(jīng)純化的多肽(如培養(yǎng)物上清或制備物或從原核生物包涵體分離制備的多肽制劑)。作為選擇之一，本分離方法也可用于經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)初始純化步驟獲取的多肽混合物，例如在包含A型和B型的制備物已從親和基質(zhì)洗脫后。一種實(shí)施方案中，應(yīng)用HIC層析的結(jié)合分子包含本發(fā)明的連接肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，HIC可用于已經(jīng)過其它蛋白質(zhì)純化方法部分純化的混合物。此處所用術(shù)語“部分純化”包括這樣的蛋白制備物，其中目的蛋白至少占5％重量，更優(yōu)選至少占10％重量，最好優(yōu)選至少占45％重量。初始或后續(xù)純化步驟可用于去除下列物質(zhì)，如免疫球蛋白聚集物、錯(cuò)折疊種類(misfoldedspecies)、宿主細(xì)胞蛋白，以及來自之前的層析分離步驟的殘留物質(zhì)(諸如蛋白質(zhì)A，條件是應(yīng)用到該蛋白時(shí))。一種實(shí)施方案中，HIC可對(duì)分離包含本發(fā)明連接肽的多肽進(jìn)行。相應(yīng)地，也可以理解于完整的純化方案(protocol)的背景下應(yīng)用HIC。可先于HIC或繼HIC之后應(yīng)用的舉例性的純化步驟包括親和層析法(例如，包含與受控的有孔玻璃共價(jià)偶聯(lián)的蛋白A的PROSEP-A(BioProcessingLtd.，U.K.)，或蛋白AEPHAROSEFastFlow(Pharmacia)或TOYOPEARL650M蛋白A(TosoHaas))。對(duì)人γ1，γ2，或γ4重鏈優(yōu)選蛋白A，對(duì)小鼠同種型優(yōu)選蛋白G。如果所述分子含有CH3區(qū)域(結(jié)構(gòu)域)則可應(yīng)用BakerbondABXtm樹脂。也可應(yīng)用離子交換層析法作為補(bǔ)充或替代選擇。這種考慮下，各種陰離子或陽離子取代基可被吸附于基質(zhì)以形成層析所需的陰離子或陽離子支持物。陰離子交換取代基包括二乙基氨基乙基(diethylaminoethyl，DEAE)、季銨基乙基(quaternaryaminoethyl，QAE)和季胺(quaternaryamine，Q)等。陽離子置換取代基包括羧甲基(carboxymethyl，CM)、磺乙基(sulfoethyl，SE)、磺丙基(sulfopropyl，SP)、磷酸基(phosphate，P)和磺酸基(sulfonate，S)。纖維素離子交換樹脂如DE23、DE32、DE52、CM-23、CM-32和CM-52可購自英國Maidstone，Kent，的華特門有限公司(WhatmanLtd.Maidstone，Kent，U.K.)，基于SEPHADEX和-locross-連接的離子交換物(-locross-linkedionexchangers)也是已知的。例如，DEAE-、QAE-、CM-、SP-SEPHADEX、DEAE-、Q-、CM-、S-SEPHAROSE和SEPHAROSEFastFlow的購自PharmaciaAB。此外，DEAE和CM衍生的乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物(ethyleneglycol-methacrylatecopolymer)如TOYOPEARLDEAE-650S或M以及TOYOPEARLCM-650S或M都可得自TosoHaasCo.，Philadelphia，Pa。因?yàn)閺碾x子交換支持物上洗脫通常需要添加鹽，且由于HIC在增加的鹽濃度的情況下得以增強(qiáng)，所以在離子交換層析步驟或其它以鹽為介質(zhì)的純化步驟之后采用HIC步驟是優(yōu)選的。附加的純化方案可包括如下步驟，但不必局限于此進(jìn)一步的離子交換層析、大小排阻層析、病毒滅活、濃縮、冷凍干燥、羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅層析、肝素SEQHAROSETM層析、層析聚焦或硫酸銨沉淀。在采用所述方法純化之前，含有要分離的多肽混合物的組合物最好放置在酸性或近中性PH值的緩沖液中。例如，可通過如下步驟完成加入濃縮的緩沖液，將樣品重懸在緩沖液中，更換緩沖液(如采用透析或超濾)。也可簡單地調(diào)整樣品緩沖液的pH使之保持在所需范圍。在高離子濃度時(shí)疏水作用達(dá)到最強(qiáng)，因此，這種分離形式在鹽沉淀或離子交換步驟之后方便地進(jìn)行。高鹽濃度使得蛋白更易吸附于HIC層析柱，但根據(jù)蛋白的特性及所選HIC配體的不同，實(shí)際的鹽濃度會(huì)在一個(gè)很寬的范圍內(nèi)變化。各種離子可以以所謂的soluphobic系列排列，這它們根據(jù)是否增強(qiáng)疏水作用(鹽析效應(yīng))或破壞水結(jié)構(gòu)(離液序列高的效應(yīng))并導(dǎo)致疏水作用的衰減，準(zhǔn)備不同的離子。根據(jù)鹽析效應(yīng)增強(qiáng)的順序排列的陽離子為Ba++＜Ca++＜Mg++＜Li+＜Cs+＜Na+＜K+＜Rb+＜NH4+，根據(jù)離液序列高的效應(yīng)增強(qiáng)的順序排列的陰離子為P0---＜S04--＜CH3COOO-＜Cl-＜Br-＜NO3-＜ClO4-＜I-＜SCN-。一般來說，Na，K或NH4的硫酸鹽可有效地增強(qiáng)HIC中配體-蛋白的相互作用。鹽類對(duì)相互作用強(qiáng)度的影響通過如下所列關(guān)系闡明(NH4)2SO4＞Na2SO4＞NaCl＞NH4Cl＞NaBr＞NaSCN。一般說來，約0.75到約2M之間的硫酸銨濃度和約1到4M之間的NaCL濃度是有用的。在制備HIC層析柱時(shí)要用到一些層析支持物，應(yīng)用最廣泛的是瓊脂糖、二氧化硅、有機(jī)聚合物或共聚體樹脂。疏水作用材料通常為基礎(chǔ)基質(zhì)(如疏水碳水化合物(如交聯(lián)的瓊脂糖)或合成的共聚體材料)，其偶聯(lián)有疏水配體。優(yōu)選的HIC材料包含由苯基團(tuán)取代的瓊脂糖樹脂。具代表性的HIC材料包括苯基SEPHAROSETM，具有低或高取代的FASTFLOW(PharmaciaLKBBiotechnology，AB，Sweden)；苯基SEPHAROSETM高效柱；苯基或丁基-SEPHAROSECL-4B，丁基-SEPHAROSEFF，辛基-SEPHAROSEFF和苯基-SEPHAROSEFF(PharmaciaLKBBiotechnologyAB，Sweden)；FractogelTMEMD丙基或FRACTOGELTMEMC苯基柱(E.Merck，Germany)；MACROPREPTMMethylorMACRO-PREPTMt-丁基支持物(Bio-Rad，California)；WPHI-Propyl(C3)TM柱(J.T.Baker，NewJersey)示例性HIC材料也可得自日本東京Tosoh公司、產(chǎn)品名稱為TOYOPEARL醚650，苯基650，丁基650(Fractogel)，醚-5PW-HR，或苯基-5PW-HR；來自Miles-Yeda，Rehovot，Israel、產(chǎn)品名稱為烷基-瓊脂糖，其中烷基類包含2-10個(gè)碳原子，以及J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.、產(chǎn)品名稱為BakerbondWP-HI-丙基。采用常規(guī)的化學(xué)方法制備所需的HIC層析柱也是可能的。(Sa例如，Er-el.Z.glall，Biochem.Biophys.Res.Comm.49383(1972)或Ulbrich，V.rdgLColl.Czech.Chem.Commum.91466(1964))。具體凝膠的選擇可由熟練的技術(shù)人員決定。一般來說，蛋白和HIC配體之間的作用強(qiáng)度隨著該烷基配體的鏈長增加而增加，但含有約4到約8個(gè)碳原子的配體對(duì)大多數(shù)分離多肽而言是合適的。苯基團(tuán)與戊基具有相似的疏水性，但其選擇性可由于與蛋白質(zhì)芳香基團(tuán)之間可能存在pi-pi軌道相互作用而不同。選擇性也可能受到支撐樹脂的化學(xué)性質(zhì)的影響。配體密度是一重要參數(shù)，不僅影響相互作用強(qiáng)度，還影響層析柱的容量。商業(yè)化的苯基或辛基苯基凝膠的配體密度一般為40皮摩爾/毫升(pmoles/ml)凝膠床。凝膠容量是具體目的蛋白以及PH值、溫度以及鹽的種類和濃度的函數(shù)，但一般預(yù)期在3-20mg/ml凝膠的范圍內(nèi)。一般說來，溫度的降低會(huì)導(dǎo)致HIC材料間相互作用的下降。然而，升高溫度獲得的任何益處也必須與其可能對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性存在的不利作用相權(quán)衡。一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可被同步(isocratically)洗脫。在同步洗脫中，所有化合物從起始端開始遷移通過柱。然而，每種化合物以不同的速度遷移，造成較快或較慢的洗脫速度，例如，正如本文實(shí)例中所作說明，A型蛋白可隨著液流通過層析柱而被洗脫。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種或多種多肽可結(jié)合于層析柱并洗脫，例如采用逐步洗脫(stepwiseelution)或梯度洗脫(gradientelution)。不管是逐步洗脫還是梯度洗脫，均可通過不同途徑完成。(a)通過改變鹽濃度，(b)通過改變?nèi)軇O性或(c)通過加入去污劑。通過降低鹽濃度，吸附的蛋白質(zhì)按照疏水性增加的順序被洗脫。極性的改變可受到添加溶劑如乙二醇、丙二醇或(異)丙醇的影響，因而降低疏水作用的強(qiáng)度。去污劑的功能是作為蛋白質(zhì)的置換劑，主要應(yīng)用于膜蛋白的純化。進(jìn)行分離的過程中，多肽混合物可與HIC材料接觸，例如采用成批純化技術(shù)或采用柱。HIC純化前，可能希望去除任何離液序列高的試劑或疏水性強(qiáng)的物質(zhì)，例如通過使混合物通過預(yù)層析柱(precolumn)來進(jìn)行。例如，對(duì)于成批純化(batchpurification)，HIC材料在所需的起始緩沖液中制備或平衡。獲得HIC材料的漿(slurry)。多肽溶液與漿接觸，使至少一種待分離的多肽吸附在HIC材料上。含未與HIC材料結(jié)合的多肽的溶液從所述漿中分離，例如，通過允許所述漿沉淀而移除上清液。對(duì)所述漿采用一或多道洗滌步驟。如果需要，填充材料可與電導(dǎo)率較低的溶液結(jié)合，以使與HIC材料結(jié)合的多肽解吸附。為洗脫結(jié)合的多肽，可降低鹽濃度。一種實(shí)施方案中，HIC材料可被填充在層析柱中?？蓪⒑写蛛x多肽的混合物上樣于層析柱，允許至少一種待分離多肽吸附到層析柱上。未吸附到層析柱上的多肽流經(jīng)層析柱并被收集起來。為洗脫結(jié)合的多肽，可降低鹽濃度，例如采用逐步方式或利用鹽濃度梯度。由于B型較A型疏水性強(qiáng)，它不可逆地吸附于固定相(stationaryphase)，采用約0.7M(如0.73M)硫酸銨/20mM磷酸鈉，PH值4到8作為流動(dòng)相(mobilephase)。A型在這些條件下與固定相結(jié)合的程度低，因此被同步洗脫，即與流經(jīng)層析柱的部分一起離開層析柱。同步洗脫A型后，從流動(dòng)相去除硫酸銨使B型解吸附。在示例性純化方案中，HIC材料在所含鹽濃度使得電導(dǎo)率在約160到約110Ms/cm之間，更優(yōu)選約140到約110Ms/cm之間，更優(yōu)選在約130或約120Ms/cm到約117Ms/cm的緩沖液中達(dá)到平衡。例如，具代表性的起始溶液含鹽濃度為約1M到0.7M，如1M到0.7M硫酸銨。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，含有待分離的多肽混合物的溶液也具有相同或大致相同的電導(dǎo)率(如采用濃縮的鹽母液)。在這些條件下，A型在電導(dǎo)率約為120mS/cm時(shí)從層析柱洗脫。為洗脫B型，將逐級(jí)或線性梯度下降的硫酸銨內(nèi)含物加至層析柱。B型在電導(dǎo)率約為115到約100mS/cm時(shí)洗脫。一種實(shí)施方案中，所述純化方法產(chǎn)生含有多肽分子的組合物，該多肽分子含有至少兩個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)和兩個(gè)重鏈部分，但重鏈部分缺少CH2區(qū)域，其中超過約50％以上的分子的存在形式是兩個(gè)重鏈部分以至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接。另一種實(shí)施方案中，超過約60％以上的分子的存在形式是兩個(gè)重鏈部分以至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接。另一種實(shí)施方案中，超過約70％以上的分子的存在形式是兩個(gè)重鏈部分以至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接。另一種實(shí)施方案中，超過約80％以上的分子的存在形式是兩個(gè)重鏈部分以至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接。另一種實(shí)施方案中，超過約90％以上的分子的存在形式是兩個(gè)重鏈部分以至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接。一種實(shí)施方案中，該物質(zhì)純化方法產(chǎn)生含有重組多肽分子的組合物，該重組多肽分子含有至少兩個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)和兩個(gè)重鏈部分，其中約99％以上的分子的存在形式是兩個(gè)重鏈部分以至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接。一種實(shí)施方案中，該物質(zhì)純化方法產(chǎn)生含有多肽分子的組合物，該多肽分子含有至少兩個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)和兩個(gè)重鏈部分，其中約95％以上的分子的存在形式是兩個(gè)重鏈部分以至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接，而多肽的重鏈部分來自IgG4同種型(isotype)抗體。一種實(shí)施方案中，該物質(zhì)純化方法產(chǎn)生含有多肽分子的組合物，該多肽分子含有兩個(gè)輕鏈部分和兩個(gè)重鏈部分，但重鏈部分缺少CH2區(qū)域，其中約80％以上的分子的存在形式是兩個(gè)重鏈部分沒有以至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接。另一方面，本發(fā)明也提供測定純化和/或優(yōu)選生物合成的結(jié)果的方法，包括測定組合物中A型和B型的相對(duì)量。A型和B型的可通過下列方法測定例如本文描述的非還原SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳或質(zhì)譜分析法。V.多肽的標(biāo)記或偶聯(lián)本發(fā)明中的多肽分子可以非偶聯(lián)的形式應(yīng)用，也可與至少一種分子偶聯(lián)，例如，易化抗原檢測或用于患者的顯像或治療。本發(fā)明的多肽可在純化之前或之后被標(biāo)記或偶聯(lián)。具體地說，本發(fā)明的多肽可偶聯(lián)于細(xì)胞毒素(如放射性同位素、細(xì)胞毒藥物或毒素)治療劑、細(xì)胞增殖抑制劑、生物毒素、前體藥物、肽、蛋白質(zhì)、酶、病毒、脂質(zhì)、生物學(xué)應(yīng)答調(diào)節(jié)物、藥學(xué)制劑、免疫活性配體(如淋巴因子或抗體，其中所得分子既可偶聯(lián)于腫瘤細(xì)胞，也可偶聯(lián)于效應(yīng)細(xì)胞如T細(xì)胞)或PEG。另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可偶聯(lián)于降低腫瘤血管形成的分子。其它實(shí)施方案中，公開的組合物可包含與藥物或藥物前體偶聯(lián)的本發(fā)明的多肽。本發(fā)明的其它實(shí)施方案包括與具體生物毒素或其細(xì)胞毒片段如蓖麻毒素、白樹毒素、假單胞菌外毒素或白喉毒素偶聯(lián)的本發(fā)明的多肽的用途。偶聯(lián)或非偶聯(lián)的多肽的選擇取決于癌的類型和分期、輔助治療的應(yīng)用(如化療或外部放療)以及患者的狀況?？梢岳斫?，考慮到本文所教導(dǎo)的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以輕易地做出這種選擇。也可以理解，先前的研究中，在動(dòng)物模型和部分人類病例中，同位素標(biāo)記的抗腫瘤抗體已成功地用于破壞實(shí)體瘤和淋巴瘤/白血病的瘤細(xì)胞。常見的同位素包括90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re和188Re。放射性核素通過產(chǎn)生電離輻射起作用，電離輻射可導(dǎo)致核DNA鏈多處斷裂，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。用于產(chǎn)生治療偶聯(lián)物的同位素通常可產(chǎn)生高能量α-或β-粒子，該粒子具有短路徑長度(shortpathlength)。這種放射性核素殺死近距離的細(xì)胞，例如偶聯(lián)物已附著或進(jìn)入其中的腫瘤細(xì)胞。它們對(duì)非局部細(xì)胞很少或沒有作用。放射性核素基本上是非免疫原性的。關(guān)于與本發(fā)明有關(guān)的放射標(biāo)記的偶聯(lián)物的應(yīng)用，本發(fā)明的多肽可被直接標(biāo)記(如通過碘化作用)，或通過應(yīng)用螯合劑間接標(biāo)記。此處所用術(shù)語“間接標(biāo)記”和“間接標(biāo)記途徑”均指螯合劑與分子共價(jià)結(jié)合，而至少一種放射性核素與該螯合劑相連。這種螯合劑通常指雙功能螯合物，它們既與多肽結(jié)合也與放射性同位素結(jié)合。具體優(yōu)選的螯合劑包括1-異硫氰酸根合芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(1-isothiocycmatobenzyl-3-methyldiothelenetriaminepentaaceticacid)(″MX-DTPA″)和環(huán)己基二亞乙基三胺五乙酸(cyclohexyldiethylenetriaminepentaaceticacid)(″CHX-DTPA″)衍生物。其它螯合劑包括P-DOTA和EDTA衍生物。具體優(yōu)選用于間接標(biāo)記的放射性核素包括111In和90Y。本文術(shù)語“直接標(biāo)記”和“直接標(biāo)記途徑”均指螯合物與多肽直接共價(jià)結(jié)合(典型的是通過氨基酸殘基)。更具體地，這些結(jié)合方法學(xué)包括隨機(jī)標(biāo)記和位點(diǎn)定向標(biāo)記(site-directedlabeling)。對(duì)于后者，標(biāo)記針對(duì)多肽的特異位點(diǎn)，如僅存在于偶聯(lián)物Fc部分的N端連接的糖殘基。此外，不同的直接標(biāo)記技術(shù)和方案適用于本發(fā)明。例如，锝-99m標(biāo)記的多肽可通過以下方法制備配體交換方法，通過用含二價(jià)錫離子的溶液還原高锝酸鈉(TcO4)，將還原的锝螯合在Sephadex柱上，并將多肽加載于該柱；或批量標(biāo)記技術(shù)(batchlabelingtechniques)，例如，通過將高锝酸鈉、還原劑諸如SnCL2、緩沖液如鄰苯二甲酸鈉-鉀和分子一起保溫。無論如何，優(yōu)選用于直接標(biāo)記多肽的放射性核素在本領(lǐng)域是眾所周知的，具體優(yōu)選用于直接標(biāo)記的放射性核素是通過酪氨酸殘基共價(jià)連接的131I。根據(jù)本發(fā)明的多肽可，例如，利用以下物質(zhì)衍生放射性碘化鈉或碘化鉀以及化學(xué)氧化劑如次氯酸鈉、氯胺-T等，或酶氧化劑如乳酸過氧化物酶(lactoperoxidase)、葡萄糖氧化酶和葡萄糖。然而，為達(dá)到本發(fā)明的目的，間接標(biāo)記方法是特別優(yōu)選的。與螯合劑和螯合劑偶聯(lián)物有關(guān)的專利在本領(lǐng)域中是已知的。例如，Gansow的美國專利第4,831,175號(hào)是關(guān)于多取代的二亞乙基三胺五乙酸螯合物，含有二乙撐三胺五乙酸的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，以及這些物質(zhì)的制備方法。Gansow的美國專利第5,099,069、5,246,692、5,286,850、5,434,287及5,124,471號(hào)也是關(guān)于多取代的DTPA螯合物。這些專利全文收錄在本文中作為參考。適用的金屬螯合劑的其它實(shí)例是依地酸鈣鈉酸(ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA)、二乙撐三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaaceticacid，DPTA)、1，4，8，11-四氮雜四癸烷(tetraazatetradecane)、1，4，8，11-四氮雜四癸烷-1，4，8，11-四乙酸、1-(oxa)-4，7，12，15-四氮雜十七烷(tetraazaheptadecane)-4，7，12，15-四乙酸等。環(huán)己基-DTPA或CHX-DTPA是具體優(yōu)選的。還有其它適用的螯合劑，包括那些尚未發(fā)現(xiàn)的，熟練的技術(shù)人員可輕易地辨別出來，它們明顯屬于本發(fā)明的范圍。適用的螯合劑，包括在共同未決申請(qǐng)系列第08/475,813、08/475,815和08/478,967號(hào)中用于促進(jìn)螯合作用的具體的雙功能螯合劑，優(yōu)選被選擇以為三價(jià)金屬提供高親和力，顯示增加的腫瘤-非腫瘤比率(tumor-to-non-tumorratios)、降低的骨骼攝取、以及放射性核素在靶位點(diǎn)即B細(xì)胞淋巴瘤位點(diǎn)的更多的體內(nèi)貯留。然而，其它具有或不具所有這些特性的雙功能螯合劑在本領(lǐng)域是已知的，它們也可能對(duì)腫瘤治療有益。也可以理解，根據(jù)本文的技術(shù)，多肽可與不同放射性標(biāo)記物偶聯(lián)以用于診斷和治療目的。為此目的，全文均收錄在本文的參考文獻(xiàn)中的、前述的待定申請(qǐng)，公開了在給藥治療性分子之前，用于腫瘤診斷性“顯像”的放射標(biāo)記的治療偶聯(lián)物?！癐n2B8”偶聯(lián)物含有特異性針對(duì)人CD20的鼠單克隆抗體2B8，該單克隆抗體通過雙功能螯合劑即MX-DTPA(diethylenetriaminepentaaceticacid)與111In結(jié)合，MX-DTPA是1-異硫氰酸根合芐基-3-甲基-DTPA(1-isothiocyanatobenzyl-3-methyl-DTPA)和1-甲基-3-異硫氰酸根合芐基-DTPA(1-methyl-3-isothiocyanatobenzyl-DTPA)按1∶1的比例的混合物。具體優(yōu)選111In作為診斷用放射性核素，因?yàn)槠湓诖蠹s1到10mCi范圍之間可安全施用而無可檢出的毒性，且影像資料對(duì)隨后的90Y-標(biāo)記抗體的分布通常有預(yù)示意義。多數(shù)影像學(xué)研究利用5mCi111In-標(biāo)記的抗體，因?yàn)樵搫┝考劝踩?，且與較低的劑量相比有增加的顯像效果，給予抗體三到六天后出現(xiàn)最佳的顯像。請(qǐng)參閱，例如，Murray，J.Nuc.Med.263328(1985)及Carraguilloetal.，J.Nuc.Med.2667(1985)。67(1985)。正如上文所示，不同的放射性核素可應(yīng)用于本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易辨別在不同情況下哪種放射性核素最適合。例如，131I是廣為人知的用于靶向的免疫治療的放射性核素。然而，131I的臨床應(yīng)用可被如下幾個(gè)因素所限八天的物理半衰期、碘化的抗體在血液中和腫瘤位點(diǎn)的脫鹵化作用、放射特性(例如大量的gamma成分)，其對(duì)于在腫瘤內(nèi)的局部劑量堆積(deposition)可能是次最佳的。隨著更好的螯合劑的出現(xiàn)，將金屬螯合基團(tuán)與蛋白質(zhì)結(jié)合的機(jī)會(huì)，增加了應(yīng)用其它放射性核素如111In和90Y的可能性。在放射免疫治療應(yīng)用中利用90Y有幾點(diǎn)好處90Y64小時(shí)的半衰期長到足以在腫瘤中蓄積，而且不像131I，90Y是高能量的純的β放射源，衰減過程中不伴有g(shù)amma輻射，在組織中的范圍是100到1000細(xì)胞直徑。此外，最小量的貫穿輻射允許對(duì)門診患者施用90Y-標(biāo)記的分子。此外，不需標(biāo)記的多肽的內(nèi)化來殺死細(xì)胞，電離輻射的局部放射對(duì)缺乏靶抗原的臨近腫瘤細(xì)胞應(yīng)該是致命的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，這些無放射活性的偶聯(lián)物，也可根據(jù)所選的要偶聯(lián)的物質(zhì)，采用不同的技術(shù)組合起來。例如，帶生物素的偶聯(lián)物可通過如下方法制備例如，使多肽與生物素的活性酯如生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯起反應(yīng)。同樣，帶熒光標(biāo)記的偶聯(lián)物可在偶聯(lián)劑存在的情況下制備，例如所述偶聯(lián)劑如上文所列那些；或者與異硫氰酸酯優(yōu)選異硫氰酸熒光素反應(yīng)。本發(fā)明的多肽與細(xì)胞生長抑制/細(xì)胞毒性物質(zhì)的偶聯(lián)物及金屬螯合物可采取類似的方式制備。本發(fā)明中應(yīng)用的制劑優(yōu)選是細(xì)胞毒藥物，具體指那些應(yīng)用于癌癥治療的藥物。此處，所用“細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性物質(zhì)”是指對(duì)細(xì)胞生長和增殖有害，并可能減少、抑制或破壞細(xì)胞或惡性腫瘤的任何物質(zhì)。具代表性的細(xì)胞毒素包括但不限于放射性核素、生物毒素、酶活性毒素、細(xì)胞生長抑制或細(xì)胞毒治療物質(zhì)、前體藥物、免疫活性配體和生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑如細(xì)胞因子。任何可阻止或延緩免疫活性細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞生長的細(xì)胞毒素均在本發(fā)明的范疇內(nèi)。一般來說，示例性細(xì)胞毒素包括細(xì)胞生長抑制劑、烷化劑、抗代謝物、抗增殖劑、微管蛋白結(jié)合物、激素類和激素拮抗劑等。適用于本發(fā)明的具代表性的細(xì)胞生長抑制劑包括烷化劑如氮芥(mechlorethamine)、三乙撐磷酰胺(triethylenephosphoramide)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulfan)、美法侖(melphalan)或三亞胺醌(triaziquone)，以及亞硝基脲化合物(nitrosoureacompounds)如亞硝脲氮芥(carmustine)、環(huán)己亞硝脲(lomustine)或甲基環(huán)己亞硝脲(semustine)。細(xì)胞毒性物質(zhì)的其它優(yōu)選類別包括，例如美登素類(maytosinoid)家族的藥物。細(xì)胞毒性物質(zhì)的其它優(yōu)選類別包括例如蒽環(huán)類抗生素(anthracycline)家族的藥物、長春花類(vinca)藥物、絲裂霉素(mitomycins)、博來霉素(bleomycins)、細(xì)胞毒性核苷、蝶啶類藥物、二炔基類(diynenes)和鬼臼毒素(podophyllotoxins)。這些類別中具體有用的成分包括例如，阿霉素(adriamycin)、去甲柔紅霉素(carminomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)(道諾霉素(daunomycin))、多柔比星(doxorubicin)、氨基蝶呤(aminopterin)、氨甲喋呤(methotrexate)、甲喋呤(methopterin)、光輝霉素(mithramycin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、二氯甲氨喋呤(dichloromethotrexate)、絲裂霉素C(mitomycinC)、放線菌素D(actinomycin-D)、泊非霉素(porfiromycin)、5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil)、氟尿嘧啶脫氧核苷(floxuridine)、呋喃氟尿嘧啶(ftorafur)、6-巰基嘌呤(mercaptopurine)、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞苷胞嘧啶(cytosinearabinoside)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)或鬼臼毒素衍生物如依托泊甙(etoposide)或磷酸依托泊苷、美法侖、長春花堿(vinblastin)、長春新堿(vincristine)、異長春堿(leurosidine)、長春酰胺(vindesine)和長春羅新(leurosine)等。適用于本發(fā)明教導(dǎo)的還有其它細(xì)胞毒素，包括紫杉醇(taxol)、紫杉烷(taxane)、松胞菌素B(cytochalasinB)、短桿菌肽D(gramicidinD)、溴乙錠(ethidiumbromide)、依米丁(emetine)、tenoposide、秋水仙堿(colchicin)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracindione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普奈洛爾(propranolol)、嘌呤霉素(puromycin)及其類似物或同系物。激素和激素拮抗劑也適用于本發(fā)明的教導(dǎo)，例如皮質(zhì)激素如強(qiáng)的松(prednisone)，黃體酮(progestin)如羥孕酮(hydroxyprogesterone)或美托孕酮(medroprogesterone)，雌激素如己烯雌酚(diethylstilbestrol)，抗雌激素藥如它莫西芬(tamoxifen)，雄激素如睪酮及芳香酶抑制劑如aminogluthetimide。正如上文所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)所需化合物進(jìn)行化學(xué)修飾，使該化合物的反應(yīng)更利于制備本發(fā)明的偶聯(lián)物。優(yōu)選的細(xì)胞毒素的具體實(shí)例包括抗腫瘤抗生素中enediyne家族的成員或衍生物，包括刺孢霉素(calicheamicin)、esperamicins或蒽環(huán)類抗生素(dynemicins)。這些毒素極其強(qiáng)效，通過使核DNA斷裂導(dǎo)致細(xì)胞死亡。不象蛋白質(zhì)毒素，在體內(nèi)可被裂解生成許多無活性但有免疫原性的多肽片段，毒素如刺孢霉素、esperamicins和其它enediynes都是小分子，基本上無免疫原性。這些非肽類毒素通過先前曾被用于標(biāo)記單克隆抗體和其它分子的技術(shù)化學(xué)連接于二聚體和四聚體。這些連接技術(shù)學(xué)包括通過僅存在于構(gòu)建體Fc部分的N端連接的糖殘基的位點(diǎn)特異性連接。這種定點(diǎn)連接方法的優(yōu)勢是降低了連接對(duì)該結(jié)構(gòu)的結(jié)合特性可能產(chǎn)生的影響。如前文所述，適用的細(xì)胞毒素可包括前體藥物(prodrug)。此處所用術(shù)語“前體藥物”是指藥物活性物質(zhì)的前體或衍生物，其相對(duì)于親本藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小，并能被酶激活或轉(zhuǎn)化為活性更強(qiáng)的親本形式(parentform)。適用于本發(fā)明的前體藥物包括但不限于含磷酸鹽(酯)的前體藥物、含硫代磷酸鹽(酯)的前體藥物、含硫酸鹽(酯)的前體藥物、含肽的前體藥物、含β-內(nèi)酰胺的前體藥物、任意取代的含苯氧基乙酰胺(phenoxyacetamide)的前體藥物、任意取代的含苯乙酰胺的前體藥物、5-氟胞嘧啶和其它5-氟脲嘧啶前體藥物，這些前體藥物可被轉(zhuǎn)化為活性更強(qiáng)的無細(xì)胞毒性的藥物?？杀谎苌鸀閼?yīng)用于本發(fā)明的前體藥物形式的細(xì)胞毒性藥物的其它實(shí)例包括上述那些化療藥物。其它細(xì)胞毒素中，可以理解，多肽也可與生物毒素如蓖麻毒素亞單位A、相思豆毒素(abrin)、白喉毒素、肉毒素(botulinum)、cyanginosins、海藻毒素(saxitoxin)、志賀氏菌毒素(shigatoxin)、破傷風(fēng)毒素(tetanus)、河豚毒素(tetrodotoxin)、單端孢霉烯(trichothecene)、verrucologen或毒性酶連接。優(yōu)選的是，采用允許結(jié)合分子-毒素構(gòu)建體直接表達(dá)的基因改造技術(shù)來制備這種構(gòu)建體。其它可與本發(fā)明的多肽連接的生物學(xué)應(yīng)答調(diào)節(jié)物包括細(xì)胞因子如淋巴因子和干擾素。根據(jù)本發(fā)明的公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用常規(guī)技術(shù)輕易合成這種結(jié)構(gòu)?？膳c本發(fā)明公開的多肽連接的、適宜的細(xì)胞毒素的其它類別是放射增敏劑，該放射增敏劑可被有效地針對(duì)腫瘤或免疫反應(yīng)性細(xì)胞。這種藥物增強(qiáng)了對(duì)電離輻射的敏感性，因此增加了放療的效果。被腫瘤細(xì)胞內(nèi)化的偶聯(lián)物在細(xì)胞核附近釋放放射增敏劑，該部位的放射敏化作用會(huì)達(dá)到最大。本發(fā)明非結(jié)合的放射增敏劑連接的多肽，可很快從血液中清除，其余的放射增敏劑定位在靶腫瘤中，使得正常組織的攝取最少。從血液中快速清除后，輔助放療會(huì)以下列三種途徑之一進(jìn)行1)特異性針對(duì)腫瘤的外部射線束，2)直接植入腫瘤的放射活性，3)利用相同靶向型分子的全身放免治療。這種途徑的一種有潛在吸引力的變化將是把治療用放射性同位素與放射增敏劑的免疫偶聯(lián)物結(jié)合起來，因此提供只需給患者施用單一藥物的便利。一種實(shí)施方案中，增強(qiáng)多肽穩(wěn)定性或效能的部分(moiety)可被偶聯(lián)。例如，一種實(shí)施方案中，PEG可偶聯(lián)于本發(fā)明的多肽上以延長其在體內(nèi)的半衰期。Leong，S.R.，etal.2001.Cytokine16106；2002；Adv.inDrugDeliv.Rev.54531；或Weiretal.2002.Biochem.Soc.Transactions30512.VI.多肽的施用制備本發(fā)明的多肽并給患者施用的方法，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是熟知且容易確定的。本發(fā)明的多肽的施用途徑包括經(jīng)口服、通過吸入或局部應(yīng)用的胃腸外給藥。此處所用術(shù)語“胃腸外”包括經(jīng)靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、直腸內(nèi)或陰道內(nèi)施用。通常優(yōu)選的非腸道施用劑型是經(jīng)靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下和肌內(nèi)施用劑型。對(duì)于本發(fā)明范疇內(nèi)的所有這些劑型，施用劑型將是注射用溶液，具體地說是經(jīng)靜脈或動(dòng)脈內(nèi)注射或滴注的劑型。通常，適用于注射的藥物組合物包含緩沖液(如醋酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖液)、表面活性劑(如多山梨醇酯(polysorbate))、任選的穩(wěn)定劑(如人白蛋白)等。然而，在適用于本文所講的其它方法中，該多肽可被直接遞送到有害細(xì)胞群所在部位，因此增加患病組織對(duì)治療藥物的暴露。非腸道施用劑型的制備物包括無菌水或非水溶液、懸浮液和乳劑。非水溶劑的實(shí)例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油及可注射的有機(jī)酯如油酸乙酯。含水載體包括水、含乙醇/水的溶液、乳劑或混懸液，包括鹽和緩沖介質(zhì)。本發(fā)明中，藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于0.01-0.1M并優(yōu)選0.05M磷酸鹽緩沖液或0.8％鹽水。其它常見的胃腸外載體包括磷酸鹽溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏液或不揮發(fā)性油。靜脈內(nèi)載體包括液體、營養(yǎng)補(bǔ)充物、電解質(zhì)補(bǔ)充物如那些基于林格氏葡萄糖的等等。也可能有防腐劑和其它添加劑，如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。更為具體地說，適用于注射用的藥學(xué)組合物包括無菌水溶液(水溶的)或膠體溶液和用于即時(shí)制備無菌注射溶液或膠體溶液的無菌粉末。這些情況中，該組合物必須是無菌的，且為易注射的液體。其在加工和貯藏條件下應(yīng)該是穩(wěn)定的，優(yōu)選在抗微生物如細(xì)菌和真菌污染的容器中保存。載體可為溶劑或分散介質(zhì)，含有，例如水、乙醇、多羥基化合物(如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及適宜的上述混合物。適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性可通過如下方法保持，例如，通過利用卵磷脂包被、保持分散體系中所需的微粒大小及表面活性劑的應(yīng)用。預(yù)防微生物污染可通過應(yīng)用各種抗菌藥和抗真菌藥實(shí)現(xiàn)，所述抗菌藥和抗真菌藥例如對(duì)羥苯甲酸酯(parabens)、三氯叔丁醇(chlorobutanol)、苯酚(phenol)、抗壞血酸、鄰乙汞硫基苯酸鈉(thimerosal)等。許多情況中，所述組合物中優(yōu)選包括等張劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化鈉?？赏ㄟ^在組合物中含有延長吸收的藥劑諸如單硬脂酸鋁和白明膠，從而延長可注射組合物的吸收。在任何情況中，無菌注射溶液可通過如下方法制備將所需劑量的活性化合物(多肽本身或其與其它活性物質(zhì)結(jié)合)，在適當(dāng)?shù)娜軇┲信c此處列舉的一種成分或多種成分的組合混合，按照需要隨后進(jìn)行過濾滅菌。通常情況下，分散系統(tǒng)通過如下方法制備將活性化合物與含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)的無菌載體及上文列舉的其它所需成分混合。對(duì)用于制備無菌注射液的無菌粉末，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，使得從其先前無菌過濾的溶液，產(chǎn)生活性成分加附加所需成分的粉末。注射制備物經(jīng)處理，根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法在無菌條件下裝入容器如安瓿、袋子、瓶、注射器或管形瓶中并封口。下一步，制備品可以以諸如共同未決申請(qǐng)U.S.S.N.09/259,337和U.S.S.N.09/259,338中說明的試劑盒的形式包裝并出售，上述兩篇文獻(xiàn)收錄在本文參考文獻(xiàn)中。這種制品優(yōu)選具有商標(biāo)或包裝插頁(packageinserts)，提示相關(guān)的組合物可用于治療患有或易患自身免疫疾病或腫瘤的患者。本發(fā)明的組合物治療上述情況的有效劑量，根據(jù)許多不同的因素會(huì)有差別，這些因素包括給藥方法、靶位點(diǎn)、患者的生理狀態(tài)、患者是人或動(dòng)物、所用的其它藥物，以及處理是預(yù)防性還是治療性的。通常，患者是人類，但非人類哺乳動(dòng)物包括轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物也可被治療。治療劑量可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法滴定，以使安全性和有效性達(dá)到最優(yōu)化。對(duì)于用抗體被動(dòng)免疫，劑量范圍可在，例如，0.0001到100mg/kg宿主體重之間，更常見是在0.01到5mg/kg宿主體重之間(0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)。例如，劑量可為1mg/kg體重或10mg/kg體重或在1-10mg/kg體重的范圍內(nèi)，優(yōu)選至少1mg/kg體重。介于上述范圍之間的劑量也意圖在本發(fā)明的范圍以內(nèi)。患者可每日，或隔日(alternativeday)，或每周，或根據(jù)經(jīng)驗(yàn)分析決定的其它時(shí)間表接受所述劑量。具代表性的治療是在延長的時(shí)期，如至少六個(gè)月內(nèi)給藥多個(gè)劑量。另一具代表性的治療方案(regimes)是每兩周給藥一次，或每月一次，或每3到6月一次。具代表性的給藥計(jì)劃表包括1-10mg/kg或15mg/kg每日連續(xù)給藥，30mg/kg隔日給藥或60mg/kg每周一次。某些方法中，可同時(shí)施用兩種或多種具不同結(jié)合特異性的單克隆抗體，其中每種抗體的給藥劑量均在指示范圍以內(nèi)。本發(fā)明的多肽可在多種情況下施用。單劑給藥的間期可為每周一次、每月一次或每年一次。根據(jù)患者血中多肽或抗原水平的測定提示，給藥間隔可為不定期的。某些方法中，調(diào)整劑量以使血漿多肽濃度達(dá)到1-1000μg/ml，某些方法則可達(dá)到25-300μg/ml。可選，結(jié)合分子可作為持續(xù)釋放制劑施用，其中所需的給藥頻率降低。給藥劑量和頻率根據(jù)分子在患者體內(nèi)的半衰期不同而不同。一般來說，人抗體的半衰期最長，其次是嵌合體抗體和非人抗體。一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子可以非偶聯(lián)的形式施用，另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可以偶聯(lián)的形式多次施用。再一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子可先以非偶聯(lián)的形式施用，然后以偶聯(lián)的形式施用，或以相反的順序施用。給藥劑量和頻率可根據(jù)該治療是預(yù)防性或治療性而有所不同。預(yù)防性應(yīng)用中，含有本發(fā)明多肽或其混合成分的組合物，給予尚未在疾病狀態(tài)中的患者以增加其抵抗力。這種量定義為“預(yù)防有效劑量”。這種用法中，精確劑量也依賴于患者健康狀態(tài)和全身免疫力，但一般每個(gè)劑量的范圍為0.1到25mg，具體是0.5到2.5mg。在長時(shí)間內(nèi)，以相對(duì)頻繁的間隔施用相對(duì)較低的劑量。某些患者在其余生中持續(xù)接受治療。治療性應(yīng)用中，有時(shí)需要以相對(duì)較短的間期施用相對(duì)較高的劑量(例如，約1到400mg/kg抗體每劑，通常對(duì)于放射免疫偶聯(lián)物物更常用5到25mg的劑量，對(duì)于細(xì)胞毒素藥物偶聯(lián)的分子而言劑量則更高)，直到疾病進(jìn)展減慢或終止，優(yōu)選持續(xù)到患者顯示疾病癥狀部分或完全緩解。此后，可給藥還患者預(yù)防方案。一種實(shí)施方案中，可應(yīng)用編碼本發(fā)明多肽的核酸分子治療受試者。編碼多肽的核酸的劑量范圍為每位患者約10ng到1g，、100ng到100mg、1μg到10mg或30-300μgDNA。感染性表達(dá)載體的劑量為每劑10到100病毒粒不等、或更多。治療劑可通過非胃腸道、局部、靜脈內(nèi)、口服、皮下、動(dòng)脈內(nèi)、顱內(nèi)、腹腔內(nèi)、鼻內(nèi)或肌內(nèi)途徑給藥，用于預(yù)防性或治療性治療。免疫原性藥物最常見的施用途徑是經(jīng)皮下，但其它途徑同樣有效。次常用的途徑是肌內(nèi)注射。這種類型的注射多在手臂或腿的肌肉中進(jìn)行。某些方法中，藥物直接注入沉積物(deposit)聚集的具體組織，例如顱內(nèi)注射。分子的施用優(yōu)選肌內(nèi)注射或靜脈輸注。某些方法中，特定的治療分子直接注射入顱。某些方法中，分子作為持續(xù)釋放的組合物或裝置諸如MedipadTM裝置施用。本發(fā)明的藥劑可任選與其它對(duì)需要治療(例如，預(yù)防性或治療性)的疾病或病癥有效的藥劑聯(lián)用。本發(fā)明的90Y-標(biāo)記的多肽的單次有效劑量(即治療有效劑量)范圍在約5到約75mCi之間，優(yōu)選在約10到約40mCi之間。131I-標(biāo)記抗體的無骨髓破壞作用的(non-marrowablative)單次有效治療劑量范圍在約5到約70mCi之間，優(yōu)選在約5到約40mCi之間。131I-標(biāo)記抗體的有骨髓破壞作用的(ablative)單次有效治療劑量(即可能需要自體骨髓移值)范圍在約30到約600mCi之間，優(yōu)選在約50到小于約500mCi之間。對(duì)于嵌合抗體，由于鼠抗體循環(huán)半衰期較長，131I-標(biāo)記的嵌合抗體的無骨髓破壞作用的單次有效治療劑量范圍在約5到約40mCi之間，優(yōu)選小于約30mCi。例如131I-標(biāo)記的成像標(biāo)準(zhǔn)通常低于約5mCi。當(dāng)131I和90Y的應(yīng)用取得了大量臨床經(jīng)驗(yàn)后，其它本領(lǐng)域已知的放射性標(biāo)記被用于類似目的。還有其它放射性同位素被用于成像。例如，適用于本發(fā)明的其它放射性同位素包括但不限于123I、125I、32P、57Co、64Cu、67Cu、77Br、81Rb、81Kr、87Sr、113In、127Cs、129Cs、132I、197Hg、203Pb、206Bi、177Lu、186Re、212Pb、212Bi、47Sc、105Rh、109Pd、153Sm、188Re、199Au、225Ac、211At及213Bi。在這點(diǎn)上，α、γ和β放射源均適用于本發(fā)明。此外，根據(jù)本發(fā)明的公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易決定哪種放射性核素適用于治療所選的病程，而不需不恰當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)。為此目的，已應(yīng)用于臨床診斷的其它放射性核素包括125I、123I、99Tc、43K、52Fe、67Ga、68Ga及111In?？贵w也已經(jīng)用有應(yīng)用于可能用于靶向的免疫治療的不同放射性同位素標(biāo)記(Peirerszetal.Immunol.CellBiol.65111-125(1987))。這些放射性核素在較小的范圍內(nèi)包括188Re、186Re、199Au、67Cu，美國專利5,460,785給出了這些放射性同位素的附加資料，該專利收錄在本文中作為參考。不管本發(fā)明的多肽是否以偶聯(lián)或非偶聯(lián)的形式應(yīng)用，可以理解本發(fā)明的一個(gè)主要優(yōu)勢是這些多肽可用于骨髓抑制的患者，即那些正在接受或已經(jīng)接受了輔助治療如放療或化療的患者。即，該多肽的有益的遞送圖譜(beneficialdeliveryprofile)(即相對(duì)短的血清停留時(shí)間、高結(jié)合親和力和增強(qiáng)的局部化)使得它們對(duì)于治療紅骨髓儲(chǔ)備下降并對(duì)骨髓毒性敏感的患者更為有益。在這點(diǎn)上，該多肽獨(dú)特的遞送圖譜，使得它們對(duì)于向骨髓抑制的癌癥患者施用放射標(biāo)記的偶聯(lián)物非常有效。同樣，本發(fā)明的多肽可以以偶聯(lián)或非偶聯(lián)的形式用于先前接受過輔助治療如外部射線放射治療或化療的患者中。在優(yōu)選的其它實(shí)施方案中，該多肽(以偶聯(lián)或非偶聯(lián)的形式)可用于與化療藥劑的聯(lián)合治療方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，這種治療方案可包括續(xù)貫給藥、同時(shí)(simultaneous)、并存(concurrent)或同延(coextensive)給藥公開的分子以及一或多種化療劑。本發(fā)明在這方面具體的優(yōu)選實(shí)施方案將包括放射標(biāo)記的多肽的施用。雖然該多肽可按上文剛剛所述的方式施用，但必須強(qiáng)調(diào)在其它實(shí)施方案中，偶聯(lián)或非偶聯(lián)的多肽可作為一線治療藥物施用于否則為健康的患者。在這些實(shí)施方案中，該多肽可施用于具有正常或平均水平的紅骨髓儲(chǔ)備、和/或未接受過或不是正在接受輔助治療如外部射線放射治療或化療的患者。然而，正如上文所討論，本發(fā)明選擇的實(shí)施方案包括對(duì)骨髓抑制患者施用多肽，或在與一種或多種輔助治療諸如放療或化療組合或聯(lián)用(即聯(lián)用的治療方案)。本文中與輔助治療結(jié)合或聯(lián)用給予多肽是指該療法與公開的多肽的續(xù)貫、同時(shí)、同延、并存、伴隨(concomitant)或同期(contemporaneous)給予或應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，聯(lián)用治療方案的不同組成部分可被定時(shí)施用或應(yīng)用以增強(qiáng)治療的整體有效性。例如，可在標(biāo)準(zhǔn)的已知療程中施用化療藥劑，然后在幾周之內(nèi)施用本發(fā)明的放射免疫偶聯(lián)物。相反，細(xì)胞毒素聯(lián)合的多肽可經(jīng)靜脈內(nèi)給藥，然后應(yīng)用腫瘤定向外部射線放射。然而在其它實(shí)施方案中，該多肽可與所選擇的一種或多種化療藥劑在一次就診時(shí)同時(shí)施用。熟練的技術(shù)人員(例如有經(jīng)驗(yàn)的腫瘤學(xué)家)，可根據(jù)所選擇的輔助治療和本說明書的指導(dǎo)，輕易辨別有效的聯(lián)合治療方案而不需過多的實(shí)驗(yàn)。從這點(diǎn)上可以理解，該多肽(帶有或不帶有細(xì)胞毒素)和化療藥劑的組合，可按任何順序或在任意對(duì)患者提供治療益處的時(shí)間窗內(nèi)給藥。換句話說，化療藥劑和多肽可按任意順序給藥或同時(shí)給藥。在選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可施用于先前已接受化療的患者。在另一實(shí)施方案中，該多肽和化療治療可基本同時(shí)或并存給藥。例如，可在患者接受化療的過程中給予結(jié)合分子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合分子應(yīng)在任何化療藥劑或治療的1年內(nèi)給藥施用。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，該多肽應(yīng)在任何化療藥物或治療的10、8、6、4、或2月內(nèi)施用。而在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，該多肽應(yīng)在任何化療藥劑或治療的4、3、2或1周內(nèi)施用。在其它實(shí)施方案中，該多肽應(yīng)在所選擇的化療藥物或治療的5、4、3、2或1天內(nèi)施用?？梢赃M(jìn)一步理解，這兩種藥劑或治療可在數(shù)小時(shí)或數(shù)分鐘內(nèi)(即基本同時(shí))施用于患者。此外，根據(jù)本發(fā)明，骨髓抑制患者應(yīng)指血細(xì)胞計(jì)數(shù)降低的任何患者。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，有幾種血細(xì)胞計(jì)數(shù)參數(shù)常規(guī)用作骨髓抑制的臨床指標(biāo)，可據(jù)此輕易測定患者中骨髓抑制的程度。本領(lǐng)域接受的骨髓抑制測定的實(shí)例是絕對(duì)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(AbsoluteNeutrophilCount，ANC)或血小板計(jì)數(shù)。這種骨髓抑制或部分骨髓破壞(myeloablation)可以是各種生化病癥或疾病的結(jié)果，所述病癥和疾病是先前化療或放療的結(jié)果。在這方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，接受過常規(guī)化療的患者通?？沙霈F(xiàn)紅骨髓儲(chǔ)備下降。如上文所討論，由于可導(dǎo)致死亡率或發(fā)病率增加的、難以接受的副反應(yīng)如貧血或免疫抑制，這種患者經(jīng)常無法應(yīng)用最佳水平的細(xì)胞毒素(即放射性核素)治療。更為具體地說，本發(fā)明的偶聯(lián)或非偶聯(lián)的多肽，可用于有效治療ANC低于約2000/mm3或血小板計(jì)數(shù)低于約150,000/mm3的患者。更優(yōu)選，本發(fā)明的多肽，可用于治療ANC低于約1500/mm3、低于約1000/mm3的患者，更優(yōu)選低于約500/mm3的患者。同樣，本發(fā)明的多肽，可用于治療血小板計(jì)數(shù)低于約75,000/mm3、低于約50,000/mm3、甚至低于約10,000/mm3的患者。更為普遍地說，本領(lǐng)域技術(shù)人員可應(yīng)用政府制定的指南或方法輕易確定存在骨髓抑制的患者。如上文所示，許多骨髓抑制患者已接受多種療程，包括化療、植入放療或外部射線放射治療。對(duì)于后者，外部放射源是為了對(duì)惡性腫瘤進(jìn)行局部照射。對(duì)于植入放療法，放射活性的反應(yīng)物通過手術(shù)植入惡性腫瘤中，因此選擇性照射疾病的部位。不管如何，本發(fā)明公布的多肽可用于治療存在骨髓抑制的患者的疾患，而不管導(dǎo)致骨髓抑制的原因如何。從這點(diǎn)上可進(jìn)一步理解，本發(fā)明的多肽可與用于消除、降低、抑制或控制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長的任意化療藥劑的聯(lián)合或組合治療(即提供聯(lián)用治療方案)。如上文所討論的，這種藥物經(jīng)常導(dǎo)致紅骨髓儲(chǔ)備的下降。這種下降可被本發(fā)明的化合物降低了的骨髓毒性完全或部分彌補(bǔ)，這對(duì)這種患者的腫瘤的進(jìn)一步治療有利。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文公開的放射標(biāo)記的免疫偶聯(lián)物，可與增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放射性核素的敏感性的放射增敏劑一起應(yīng)用。例如，可在放射標(biāo)記結(jié)合分子已從血流中被大量清除、但在腫瘤或腫瘤部位仍保留治療有效水平時(shí)，施用放射增敏化合物?？紤]到本發(fā)明的這些方面，適用于本發(fā)明的具代表性的化療藥物包括烷化劑、長春花堿類(例如長春新堿(vincristine)和長春花堿(vinblastine))、甲基芐肼(procarbazine)、氨甲喋呤(methotrexate)和強(qiáng)的松(prednisone)。四藥聯(lián)合的MOPP方案(二氯甲基二乙胺(mechlethamine)(氮芥)、長春新堿(Oncovin)、甲基芐肼和強(qiáng)的松(prednisone))對(duì)于治療各種類型的淋巴瘤非常有效，且含有本發(fā)明優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方案。對(duì)MOPP-耐藥的患者，可應(yīng)用ABVD(即阿霉素(adriamycin)、博來霉素(bleomycin)、長春花堿和氮烯唑胺(dacarbazine))、ChlVPP(苯丁酸氮芥(chlorambucil)、長春花堿、甲基芐肼和強(qiáng)的松)、CABS(洛莫司汀(lomustine)、阿霉素(doxorubicin)、博來霉素(bleomycin)和鏈唑霉素(streptozotocin))、MOPP加ABVD、MOPP加ABV(阿霉素、博來霉素和長春花堿)或BCVPP(卡莫司汀(carmustine)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、長春花堿、甲基芐肼和強(qiáng)的松)的組合。ArnoldS.Freedman和LeeM.Nadler，MalignantLymphomas，inHarrison′sPrinciplesofInternalMedicine1774-1788(KurtJ.Isselbacheretal.，eds.，13thed.1994)和V.T.DeVitaetal.(1997)。其中引用的參考文獻(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)劑量和治療計(jì)劃表。正如本文所述，這些治療方案可不加任何更改或者按具體患者需要更改，而與本發(fā)明的一種或多種多肽聯(lián)用。本發(fā)明的背景(context)中有用的其它方案包括單個(gè)烷化劑如環(huán)磷酰胺或苯丁酸氮芥的應(yīng)用，組合諸如CVP(環(huán)磷酰胺，長春新堿和強(qiáng)的松)、CHOP(CVP和阿霉素(doxorubicin))、C-MOPP(環(huán)磷酰胺，長春新堿，強(qiáng)的松和甲基芐肼)，環(huán)磷酰胺、長春新堿、強(qiáng)的松和甲基芐肼)、CAP-BOP(CHOP加甲基芐肼和博來霉素)、m-BACOD(CHOP加氨甲喋呤，博來霉素和甲酰四氫葉酸(leucovorin))，ProMACE-MOPP(強(qiáng)的松、甲氨喋呤、阿霉素、環(huán)磷酰胺、依托泊甙和甲酰四氫葉酸加標(biāo)準(zhǔn)MOPP)、ProMACE-CytaBOM(強(qiáng)的松、阿霉素、環(huán)磷酰胺、依托泊甙、阿糖胞苷(cytarabine)、博來霉素、長春新堿、氨甲喋呤和甲酰四氫葉酸)及MACOP-B(氨甲喋呤、阿霉素、環(huán)磷酰胺、長春新堿、固定劑量的強(qiáng)的松、博來霉素和甲酰四氫葉酸)的應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易決定上述每種用藥法的劑量和治療計(jì)劃。CHOP也可與博來霉素、氨甲喋呤、甲基芐肼、氮芥、胞嘧啶阿糖胞苷(cytosinearabinoside)和依托泊甙組合應(yīng)用。其它適用的化療藥物包括但不限于2-氯脫氧腺苷(2-chlorodeoxyadenosine，2-CDA)、2′-脫氧考福霉素(2′-deoxycoformycin)和氟達(dá)拉濱(fludarabine)。對(duì)患有中等或高級(jí)NHL而未實(shí)現(xiàn)緩解或復(fù)發(fā)的患者，可采用補(bǔ)救治療。補(bǔ)救治療所用藥物如胞嘧啶阿糖胞苷(cytosinearabinoside)、順鉑(cisplatin)、依托泊甙(etoposide)和異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)。對(duì)于一定瘤性病變的復(fù)發(fā)或進(jìn)展形式，常采用下述治療計(jì)劃IMVP-16(異環(huán)磷酰胺、氨甲喋呤和依托泊甙)、MIME(丙米腙(methyl-gag)、異環(huán)磷酰胺、氨甲喋呤和依托泊甙)、DHAP(地塞米松(dexamethasone)、高劑量的阿糖胞苷和順鉑)、ESHAP(依托泊甙、地塞米松(methylpredisolone)、HD阿糖胞苷、順鉑)、CEPP(B)(環(huán)磷酰胺、依托泊甙、甲基芐肼、強(qiáng)的松和博來霉素)及CAMP(洛莫司汀、氨甲喋呤、阿糖胞苷和強(qiáng)的松)，其中每種的劑量比例和方案都是已知的。與本發(fā)明的多肽聯(lián)合用藥時(shí)化療藥劑的用量，可隨不同患者而不同，或根據(jù)本領(lǐng)域已知的劑量給藥。例如可參閱BruceAChabneretal.，AntineoplasticAgents，inGoodman&amp;Gilman′sThePharmacologicalBasisofTherapeutics1233-1287((JoelG.Hardmanetal.，eds.，9thed.1996)。如前文所討論，本發(fā)明的多肽，其免疫反應(yīng)性片段或重組體可按照藥學(xué)有效劑量施用，以用于哺乳動(dòng)物疾病的體內(nèi)治療。從這點(diǎn)上可以理解，本發(fā)明公開的結(jié)合分子可配制成可方便給藥并增加活性劑的穩(wěn)定性。優(yōu)選的是，依照本發(fā)明的藥學(xué)組合物，含有藥學(xué)上可接受的、無毒的無菌載體例如生理鹽水、無毒緩沖液、防腐劑等。為達(dá)到本申請(qǐng)的目的，偶聯(lián)或不偶聯(lián)于治療藥物的多肽的、其免疫活性片段或重組體的藥學(xué)有效劑量，指足以獲得與靶的有效結(jié)合并獲益的劑量，例如改善疾病和病癥的癥狀或檢測物質(zhì)或細(xì)胞。對(duì)于腫瘤細(xì)胞，該多肽優(yōu)選能夠與腫瘤或免疫反應(yīng)性細(xì)胞上選定的免疫反應(yīng)抗原相互作用，并使得那些細(xì)胞的死亡增加。當(dāng)然，本發(fā)明的藥學(xué)組合物可以以單個(gè)或多個(gè)劑量給藥，以提供該多肽的藥學(xué)有效劑量。與本發(fā)明的范圍一致，本發(fā)明的多肽，可依照前述治療方法，以充足的劑量施用于人或動(dòng)物，以提供治療或預(yù)防效果。本發(fā)明的結(jié)合分子可按常規(guī)劑型(dosageform)用于這些人類和其它動(dòng)物，該常規(guī)劑型可根據(jù)已知技術(shù)，通過將本發(fā)明的抗體與常規(guī)的、藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑組合而制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可，藥學(xué)上可接受載體和稀釋劑的形式和特性由與其結(jié)合的活性成分的量、給藥途徑及其它已知的變量決定。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)進(jìn)一步理解，含有一種或多種依照本發(fā)明的多肽的混合物將被證實(shí)特別有效。VII.應(yīng)用方法本發(fā)明的多肽可用于診斷或治療目的。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案提供用于診斷和治療疾患的化合物、組合物、試劑盒和方法，例如需要該治療的哺乳動(dòng)物受試者的腫瘤性疾病。優(yōu)選的受試者是人。本發(fā)明的多肽會(huì)在一些不同應(yīng)用中是有益的。例如，一種實(shí)施方案中，受試結(jié)合分子將對(duì)降低或清除具有被本發(fā)明的結(jié)合分子識(shí)別的靶的細(xì)胞有用。另一實(shí)施方案中，受試結(jié)合分子對(duì)降低循環(huán)中可溶性靶分子的濃度或清除該抗原有效。一種實(shí)施方案中，腫瘤大小、抑制腫瘤生長和/或延長荷瘤動(dòng)物的生存期。相應(yīng)地，本發(fā)明也涉及在人或其它動(dòng)物中，通過給該人或動(dòng)物施用有效且無毒劑量的多肽治療腫瘤的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)能夠憑借常規(guī)實(shí)驗(yàn)，決定該多肽用于治療惡性腫瘤目的的、有效且無毒的劑量。例如，多肽的治療有效劑量會(huì)根據(jù)諸如疾病分期(例如I期對(duì)IV期)、年齡、性別、醫(yī)學(xué)并發(fā)癥(如免疫抑制的病癥或疾病)、患者體重和該分子在患者中激發(fā)所需反應(yīng)的能力之類的因素而有所不同。可調(diào)整劑量方案以提供最佳的治療反應(yīng)。例如，每日劑量可分幾次給藥，或根據(jù)治療情況的緊急程度所提示，按比例降低劑量。然而，一般來說，預(yù)期有效劑量范圍在約0.05到100毫克每公斤體重每天，更優(yōu)選約0.5到10毫克每公斤體重每天。為澄清起見，“哺乳動(dòng)物”涉及任何分類為哺乳動(dòng)物者，包括人、家養(yǎng)和農(nóng)場動(dòng)物、動(dòng)物園飼養(yǎng)動(dòng)物、運(yùn)動(dòng)用動(dòng)物或?qū)櫸镱悇?dòng)物，例如狗、馬、貓、牛等。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物是人?！爸委煛鄙婕爸委熜灾委熀皖A(yù)防性治療兩種。需要治療者包括已患疾病或病癥者，也包括預(yù)防疾病或病癥者。因此，該哺乳動(dòng)物可已被診斷患該病或病癥，或者有患該疾病傾向或?qū)υ摷膊∫赘?。如上文所討論，本發(fā)明的多肽可與一種或多種腫瘤抗原或與免疫異常有關(guān)的抗原發(fā)生免疫反應(yīng)。例如，對(duì)于腫瘤性疾病，本發(fā)明公開的多肽的抗原結(jié)合位點(diǎn)(即其可變區(qū)或免疫反應(yīng)性片段或重組體)，在惡性腫瘤部位與所選擇的腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合。同樣，在免疫(包括自身免疫)疾病中，本發(fā)明公開的多肽會(huì)與入侵細(xì)胞(offendingcells)的所選標(biāo)記結(jié)合。根據(jù)已報(bào)道的與腫瘤或免疫異常有關(guān)的分子的數(shù)目，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，本發(fā)明公開的多肽可源自多種完整抗體的任意一種。更為普遍地說，本發(fā)明中有用的多肽可得自或起源于與所選擇的條件有關(guān)的靶或標(biāo)記起反應(yīng)的任意抗體(包括先前文獻(xiàn)報(bào)道過的)。此外，用于產(chǎn)生本發(fā)明公開的多肽的親本抗體或前體抗體、其片段，可為鼠、人、嵌合的、人源化的、非人類靈長類或靈長源化的。其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的多肽可含有如本文所述、具已被改變的恒定區(qū)的單鏈抗體構(gòu)建體(諸如美國專利5,892,019所公開的，包含在本文作為參考)。因此，按照本文教導(dǎo)的這些類型的修飾的抗體中的任意一種，均適用于本發(fā)明。此處所用的“腫瘤相關(guān)抗原”是指通常與腫瘤細(xì)胞相關(guān)的任意抗原，即與正常細(xì)胞相比出現(xiàn)在相同或更大范圍。更常見地，腫瘤相關(guān)抗原包括使免疫反應(yīng)性抗體定位在腫瘤細(xì)胞的任意抗原，而不考慮其在非惡性細(xì)胞上的表達(dá)。這種抗原是相對(duì)腫瘤特異性的，且其表達(dá)限于惡性細(xì)胞表面。作為一種選擇，這種抗原在惡性和非惡性細(xì)胞上均可被發(fā)現(xiàn)。例如，CD20是在惡性和非惡性B細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的泛(pan)B抗原，它已被證實(shí)是治療非霍奇金淋巴瘤的免疫治療抗體的極為有效的靶目標(biāo)。從這方面看，泛T細(xì)胞抗原如CD2、CD3、CD5、CD6和CD7也含有本發(fā)明定義范圍內(nèi)的腫瘤相關(guān)抗原。其它具代表性的腫瘤相關(guān)抗原包括但不限于MAGE-1、MAGE-3、MUC-1、HPV16、HPVE6&amp;E7、TAG-72、CEA、L6-抗原、CD19、CD22、CD37、CD52、HLA-DR、EGF受體和HER2受體。許多情況中，這些抗原中任意一種的免疫反應(yīng)性抗體已有文獻(xiàn)報(bào)道過。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，根據(jù)本發(fā)明，這些抗體的任意一種均可作為本發(fā)明的多肽的前體。本發(fā)明多肽優(yōu)選與上述腫瘤或免疫相關(guān)抗原相連或結(jié)合。因此，如下文一些部分具體詳述的，本發(fā)明的多肽可源自，產(chǎn)生自，制備自多種與腫瘤相關(guān)抗原反應(yīng)的抗體中的任何一種。優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽是修飾的或結(jié)構(gòu)域缺失的抗體，其可利用遺傳改造技術(shù)衍生，由此一或多種恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的至少一部分被缺失或改變，以提供所需的生化性質(zhì)諸如縮短的半壽期。更具體地，如下所示，本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易分離對(duì)應(yīng)目的抗體的可變和/或恒定區(qū)的遺傳序列并缺失或改變適宜核苷酸以提供本發(fā)明多肽，其根據(jù)本發(fā)明用作單體亞基。將理解本發(fā)明的相容多肽可在臨床或商品范圍內(nèi)利用已經(jīng)確立的方案表達(dá)或制備。以前報(bào)道的與腫瘤相關(guān)分子反應(yīng)的抗體可如本文所述而被改變，以提供本發(fā)明的多肽。可用于提供抗原結(jié)合區(qū)以產(chǎn)生或驅(qū)動(dòng)公開的多肽的示例性抗體包括，但不限于2B8和C2B8(Zevalin和Rituxan，IDECPharmaceuticalsCorp.，SanDiego)，Lym1和Lym2(Techniclone)，LL2(ImmunomedicsCorp.，NewJersey)，HER2(Herceptin，GenentechInc.，SouthSanFrancisco)，B1(Bexxar，CoulterPharm.，SanFrancisco)，Campath(MillenniumPharmaceuticals，Cambridge)MB1，BH3，B4，B72.3(CytogenCorp.)，CC49(NationalCanerInstitute)和5E10(UniversityofIowa)?？蓳饺胧茉嚱Y(jié)合分子的其它抗體結(jié)合位點(diǎn)包括OrthocloneOKT3(CD3)，ReoPro(GpIIb/gIIa)，Zenapax(C25)，Remicade(TNF-a)，Simulect(CD25)，Synagis(RSV)，Mylotarg(CD33)，和Campath(CD52)。優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽將結(jié)合于上文列舉的抗體相同的腫瘤結(jié)合抗原。具體優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽將源自或結(jié)合相同的抗原如2B8，C2B8，CC49和C5E10，甚至更優(yōu)選，將缺乏所有和部分CH2結(jié)構(gòu)域。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合CD23(美國專利6,011,138)。優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合的表位與5E8抗體結(jié)合的表位相同。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含來自抗-CD23抗體，例如，5E8抗體的至少一個(gè)CDR。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合CRIPTO-I抗原(WO02/088170A2或WO03/083041A2)。優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合的表位與B3F6抗體結(jié)合的表位相同。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含來自抗-CRIPTO-I抗體，例如，theB3F6抗體的至少一個(gè)CDR。第一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽將結(jié)合相同的腫瘤相關(guān)抗原如Rituxan。Rituxan(也已知為rituximab，IDEC-C2B8和C2B8)是第一種FDA認(rèn)可用于治療人B細(xì)胞淋巴瘤的單克隆抗體(見美國專利Nos.5,843,439；5,776,456和5,736,137，每篇文獻(xiàn)都包含在本文作為參考)。Y2B8(90Y標(biāo)記的2B8；Zevalin；ibritumomabtiuxetan)是鼠C2B8親本。Rituxan是嵌合抗-CD20單克隆抗體，其抑制生長并據(jù)報(bào)道致敏特定的淋巴瘤細(xì)胞系，以在體外通過化學(xué)藥劑的凋亡。所述抗體有效結(jié)合人補(bǔ)體，具有強(qiáng)FcR結(jié)合，并可經(jīng)由補(bǔ)體依賴性(CDC)和抗體-依賴性(ADCC)機(jī)制在體外有效殺死人淋巴細(xì)胞(Reffetal.，血液83435-445(1994))。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解根據(jù)本發(fā)明修飾的C2B8或2B8的二聚體變體(同源二聚體或異源二聚體)，可以以偶聯(lián)的或非偶聯(lián)的形式使用以有效治療患有CD20+惡性疾病的患者。更常見地，必須重申本發(fā)明的多肽可以以“裸露的”或非偶聯(lián)的狀態(tài)或與細(xì)胞毒藥劑偶聯(lián)的狀態(tài)使用以有效治療多種疾病中的任何一種。本發(fā)明其它優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽將源自或結(jié)合于與CC49相同的腫瘤相關(guān)抗原。如以前所述，CC49結(jié)合人腫瘤相關(guān)抗原TAG-72，其與人源特定腫瘤細(xì)胞表面相關(guān)，具體是LS174T腫瘤細(xì)胞系。LS174T[美國典型培養(yǎng)物保藏中心(本文ATCC)No.CL188]是LS180(ATCCNo.CL187)結(jié)腸腺癌細(xì)胞系的變體。將進(jìn)一步理解，多種鼠單克隆抗體已經(jīng)開發(fā)，其特異性結(jié)合TAG-72。一種這樣的單克隆抗體B72.3，是雜交瘤B72.3(ATCCNo.HB-8108)產(chǎn)生的鼠IgG1。B72.3是利用人乳腺癌提取物作為免疫原開發(fā)的第一代單克隆抗體(見Colcheretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，783199-3203(1981)；和美國專利4,522,918和4,612,282，每篇文獻(xiàn)都包含在本文作為參考)。其它針對(duì)TAG-72的單克隆抗體稱為″CC″(對(duì)于結(jié)腸癌癥)。如Schlometal.(美國專利5,512,443其包含在本文作為參考)所述，CC單克隆抗體是利用由B72.3純化的TAG-72制備的第二代鼠單克隆抗體。由于它們相對(duì)較好的TAG-72結(jié)合親和力，以下CC抗體被保藏在ATCC，可要求有限制地獲取CC49(ATCCNo.HB9459)；CC83(ATCCNo.HB9453)；CC46(ATCCNo.HB9458)；CC92(ATTCCNo.HB9454)；CC30(ATCCNo.HB9457)；CC11(ATCCNo.9455)；和CC15(ATCCNo.HB9460)。U.S.P.N.5,512,443進(jìn)一步教導(dǎo)了公開的抗體可通過利用技術(shù)本領(lǐng)域已知的重組DNA，用例如人恒定區(qū)(Fc)結(jié)構(gòu)域取代小鼠恒定區(qū)來改變成所述抗體的嵌合形式。除了公開鼠和嵌合抗抗-TAG-72抗體，Schlometal.也制備了如PCT/US99/25552中公開的人源化的CC49抗體的變體以及美國專利5,892,019公開的單鏈構(gòu)建體，每一篇都包含在本文作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解每種前述的抗體，構(gòu)建體或重組體，以及它們的變體可被修飾并用于提供本發(fā)明的多肽。除了上述抗-TAG-72抗體，各個(gè)小組已經(jīng)報(bào)道了結(jié)構(gòu)域缺失的CC49和B72.3抗體的構(gòu)建和部分定性(例如，Calvoetal.CancerBiotherapy，8(1)95-109(1993)，Slavin-Chiorinietal.Int.J.Cancer5397-103(1993)andSlavin-Chiorinietal.Cancer.Res.555957-5967(1995)。本發(fā)明其它優(yōu)選的實(shí)施方案包含修飾的抗體，其源自或結(jié)合與C5E10相同的腫瘤相關(guān)抗原。如共同未決申請(qǐng)09/104,717所述，C5E10是識(shí)別大約115kDa的糖蛋白決定簇的抗體，其顯示對(duì)前列腺腫瘤細(xì)胞系(例如DU145，PC3，或ND1)特異。因此，結(jié)合本發(fā)明，特異性結(jié)合C5E10抗體所識(shí)別的腫瘤相關(guān)抗原的多肽(例如CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的抗體)可被制備并以偶聯(lián)或非偶聯(lián)的形式使用以治療腫瘤疾病。具體優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述修飾的抗體將源自或包含自ATCC保藏號(hào)PTA-865的雜交瘤細(xì)胞系分泌的C5E10抗體的所有或部分抗原結(jié)合區(qū)。產(chǎn)生的修飾的抗體將如下所述偶聯(lián)于放射性核素，并根據(jù)本發(fā)明的方法給予患有前列腺癌的患者?？偠灾?，公開的發(fā)明可用于預(yù)防或治病性治療任何包含允許所述結(jié)合分子靶向癌性細(xì)胞的抗原型標(biāo)記的任何腫瘤。可治療的示例性癌癥包括，但不限于，前列腺癌，胃腫癌諸如結(jié)腸癌，皮膚癌，乳腺癌，卵巢癌，肺癌和胰腺癌。更具體地，本發(fā)明的結(jié)合分子可用于治療卡波奇肉瘤(Kaposi′ssarcoma)，CNS腫瘤(毛細(xì)管成血管細(xì)胞瘤(capillaryhemangioblastomas)，腦膜瘤和腦轉(zhuǎn)移)，黑素瘤，胃腸和腎肉瘤，橫紋肌肉瘤，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(優(yōu)選多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastomamultiforme))，平滑肌肉瘤，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，卵巢乳頭狀囊腺癌(papillarycystadenocarcinomaoftheovary)，Wilm′s瘤或小細(xì)胞肺癌。將理解適宜的多肽可源自于前述腫瘤的每一種相關(guān)的腫瘤相關(guān)分子，而且根據(jù)本發(fā)明的公開無需不恰當(dāng)?shù)脑囼?yàn)?？筛鶕?jù)本發(fā)明的公開治療的示例性血液惡性疾病包括何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤以及白血病，包括ALL-L3(Burkitt型白血病)，慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)以及單核細(xì)胞白血病。將理解本發(fā)明的化合物和方法對(duì)于治療多種B-細(xì)胞淋巴瘤尤其有效，包括低級(jí)/濾泡非-何杰金氏淋巴瘤(NHL)，細(xì)胞淋巴瘤(FCC)，套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)，彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤(DLCL)，小淋巴細(xì)胞(SL)NHL，中間級(jí)/濾泡NHL，中間級(jí)彌漫性NHL，高級(jí)免疫母細(xì)胞性(highgradeimmunoblastic)NHL，高級(jí)淋巴母細(xì)胞性(highgradelymphoblastic)NHL，高級(jí)小非凹陷細(xì)胞(highgradesmallnon-cleavedcell)NHL，bulky病NHL和Waldenstrom’s巨球蛋白血癥。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚由于分類系統(tǒng)的改變這些淋巴瘤通常具有不同的名稱，患有分類為不同名稱的淋巴瘤的患者可從本發(fā)明的聯(lián)合治療方案獲益。除了上述腫瘤疾病，應(yīng)理解本發(fā)明可優(yōu)選治療攜帶適合的腫瘤相關(guān)抗原的其它惡性疾病。除了腫瘤疾病，本發(fā)明的多肽對(duì)于治療自身免疫疾病和異常免疫反應(yīng)尤其有效。在此方面，將理解本發(fā)明的多肽可用于控制，抑制，調(diào)節(jié)或消除對(duì)外部和自體抗原的不需要的免疫反應(yīng)。例如，一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原是自身抗原。另一實(shí)施方案中，所述抗原是過敏原。另一實(shí)施方案中，所述抗原是同種抗原或異種抗原。利用公開的多肽降低對(duì)同種或異種抗原的免疫反應(yīng)在移植中特別有用，例如用于抑制移植受體對(duì)受體移植物例如組織或器官移植物或骨髓移植物的排斥。此外，骨髓移植物內(nèi)的受體T細(xì)胞的抑制或消除可用于抑制移植物抗宿主疾病。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽可用于治療免疫疾病，包括但不限于，過敏性支氣管肺曲霉病(allergicbronchopulmonaryaspergillosis)；過敏性鼻炎；自身免疫性溶血性貧血；黑棘皮病(Acanthosisnigricans)；過敏性接觸性皮炎(Allergiccontactdermatitis)；Addison氏??；異位性皮炎；斑禿(Alopeciaareata)；普禿(Alopeciauniversalis)；淀粉樣變(Amyloidosis)；過敏性紫癜(Anaphylactoidpurpura)；類過敏性反應(yīng)(Anaphylactoidreaction)；再生障礙性貧血；遺傳性血管性水腫(Angioedema，hereditary)；特發(fā)性血管性水腫(Angioedema，idiopathic)；強(qiáng)直性脊柱炎(Ankylosingspondylitis)；腦動(dòng)脈炎(Arteritis，cranial)；巨細(xì)胞動(dòng)脈炎(Arteritis，giantcell)；Takayasu動(dòng)脈炎；顳動(dòng)脈炎；哮喘；濟(jì)失調(diào)毛細(xì)管擴(kuò)張(Ataxia-telangiectasia)；自身免疫性卵巢炎(Autoimmuneoophoritis)；自身免疫性睪丸炎(Autoimmuneorchitis)；自身免疫性多內(nèi)分泌衰竭(Autoimmunepolyendocrinefailure)；白塞病(Behcet′sdisease)；Berger?。籅uerger??；支氣管炎(bronchitis)；大皰性天皰瘡(Bullouspemphigus)；慢性粘膜皮膚性念珠菌病(candidiasis，chronicmucocutaneous)；Caplan綜合征；心肌梗死后綜合征；心包切開術(shù)后綜合征(Post-pericardiotomysyndrome)；心臟炎(Carditis)；口炎性腹瀉(Celiacsprue)；Chagas??；Chediak-Higashi綜合征；Churg-Strauss??；Cogan綜合征；冷凝集素病(Coldagglutinindisease)；CREST綜合征；Crohn氏病；冷球蛋白血癥；隱原性纖維化肺泡炎(Cryptogenicfibrosingalveolitis)；Dermatitisherpetifomis；皮肌炎；糖尿??；Diamond-Blackfan綜合征；DiGeorge綜合征；盤狀紅斑狼瘡(Discoidlupuserythematosus)；嗜酸細(xì)胞性筋膜炎(Eosinophilicfasciitis)；鞏膜外層炎(Episcleritis)；Drythemaelevatumdiutinum；邊緣性紅斑(Erythemamarginatum)；多形性紅斑(Erythemamultiforme)；結(jié)節(jié)性紅斑(Erythemanodosum)；家族性地中海熱(FamilialMediterraneanfever)；Felty′s綜合征；肺纖維化；過敏樣腎小球腎炎(Glomerulonephritis，anaphylactoid)；自身免疫性腎小球腎炎(Glomerulonephritis，autoimmune)；鏈球菌后腎小球腎炎(Glomerulonephritis，post-streptococcal)；移植后腎小球腎炎(Glomerulonephritis，post-transplantation)；膜性腎小球腎病(Glomerulopathy，membranous)；Goodpasture′s綜合征；免疫介導(dǎo)的粒細(xì)胞缺乏癥(Granulocytopenia，immune-mediated)；環(huán)狀肉芽腫(Granulomaannulare)；過敏性肉芽腫(Granulomatosis，allergic)；肉芽腫性皮肌炎(Granulomatousmyositis)；Grave病；橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto′sthyroiditis)；新生兒溶血性疾病(Hemolyticdiseaseofthenewborn)；特發(fā)性血色素病(Hemochromatosis，idiopathic)；Henoch-Schoenlein紫癜；慢性活性肝炎和慢性進(jìn)展性肝炎；組織細(xì)胞增多病X；高嗜酸性(Hypereosinophilic)綜合征；特發(fā)性血小板減少性紫癜(Idiopathicthrombocytopenicpurpura)；Job′s綜合征；青少年型皮肌炎(Juveniledermatomyositis)；幼年型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Juvenilerheumatoidarthritis)(幼年型慢性關(guān)節(jié)炎)；Kawasaki病；角膜炎；干燥性角結(jié)膜炎；Landry-Guillain-Barre-Strohl綜合征；結(jié)節(jié)性麻風(fēng)病(Leprosy，lepromatous)；Loeffler′s綜合征；狼瘡；Lyell′s綜合征；萊姆病(Lymedisease)；淋巴瘤樣肉芽腫??；系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增多癥(Mastocytosis，systemic)；混合型結(jié)締組織??；多發(fā)性單神經(jīng)炎(Mononeuritismultiplex)；Muckle-Wells綜合征；粘膜皮膚淋巴結(jié)(Mucocutaneouslymphnode)綜合征；粘膜皮膚淋巴結(jié)(Mucocutaneouslymphnode)綜合征；多中心網(wǎng)狀組織細(xì)胞增多癥(Multicentricreticulohistiocytosis)；多發(fā)性硬化；重癥肌無力；蕈樣肉芽腫病(Mycosisfungoides)；系統(tǒng)性壞死性血管炎(Necrotizingvasculitis，systemic)；腎病綜合征；重疊(Overlap)綜合征；脂膜炎(Panniculitis)；陣發(fā)性冷性血紅蛋白尿癥(Paroxysmalcoldhemoglobinuria)；陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(Paroxysmalnocturnalhemoglobinuria)；類天皰瘡(Pemphigoid)；天皰瘡(Pemphigus)；紅斑性天皰瘡(Pemphiguserythematosus)；落葉性天皰瘡(Pemphigusfoliaceus)；尋常型天皰瘡(Pemphigusvulgaris)；鴿子喂食者病(Pigeonbreeder′sdisease)；超敏性肺炎(Pneumonitis，hypersensitivity)；結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎(Polyarteritisnodosa)；風(fēng)濕性多肌炎(Polymyalgiarheumatic)；多發(fā)性肌炎(Polymyositis)；特發(fā)性多神經(jīng)炎(Polyneuritis，idiopathic)；葡萄牙家族性多神經(jīng)病(Portuguesefamilialpolyneuropathies)；先兆子癇(Pre-eclampsia)/子癇(eclampsia)；原發(fā)性膽汁性肝硬化(Primarybiliarycirrhosis)；進(jìn)展性系統(tǒng)性硬皮病(Progressivesystemicsclerosis)(硬皮病)；銀屑?。汇y屑病關(guān)節(jié)炎；肺泡蛋白沉積癥(Pulmonaryalveolarproteinosis)；肺纖維化(Pulmonaryfibrosis)，雷諾現(xiàn)象(Raynaud′sphenomenon)/綜合征；Reidel′s甲狀腺炎；Reiter′s綜合征，復(fù)發(fā)性多發(fā)性軟骨炎(Relapsingpolychrondritis)；風(fēng)濕熱(Rheumaticfever)；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoidarthritis)；結(jié)節(jié)病(Sarcoidosis)；鞏膜炎(Scleritis)；硬化性膽管炎(Sclerosingcholangitis)；血清病(Serumsickness)；Sezary綜合征；Sjogren′s綜合征；Stevens-Johnson綜合征；Still??；亞急性硬化性全腦炎(Subacutesclerosingpanencephalitis)；交感性眼炎(Sympatheticophthalmia)；系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemiclupuserythematosus)；移植物排斥(Transplantrejection)；潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerativecolitis)；非分化的結(jié)締組織病(Undifferentiatedconnectivetissuedisease)；慢性蕁麻疹(Urticaria，chronic)；Urticaria，cold；葡萄膜炎(Uveitis)；白癜風(fēng)(Vitiligo)；Weber-Christian?。籛egener肉芽腫病和Wiskott-Aldrich綜合征。本發(fā)明還通過以下實(shí)施例說明，所述實(shí)施例不應(yīng)被解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。本文引用的所有參考文獻(xiàn)，專利，公開的專利申請(qǐng)的內(nèi)容包含在本文作為參考。實(shí)施例實(shí)施例1鑒定A和B同種型抗體分子溶液包含兩種不同的同種型。其中的一種A型包含經(jīng)由至少一個(gè)二硫鍵連接的重鏈分子。另一種B型，包含不經(jīng)由至少一個(gè)二硫鍵連接的重鏈分子。在完整gamma1MAb，諸如Rituxan中，B型不出現(xiàn)或頻率非常低。然而與具有相似鉸鏈的結(jié)構(gòu)域缺失的(dd)構(gòu)建體相比，B型的頻率高得多。這些形式可利用變性型非還原SDSpage區(qū)分。在結(jié)構(gòu)域缺失的抗體制備物中，A型為120kDa二聚體而B型為60kDa單體(圖1)。實(shí)施例2鑒定CH2結(jié)構(gòu)域缺失的Mab片段中的鉸鏈區(qū)異源性鉸鏈結(jié)構(gòu)域可再分成三個(gè)不同的區(qū)上，中，和下鉸鏈區(qū)(Rouxetal.J.Immunol.19981614083)。對(duì)于IgG1和IgG3鉸鏈，包含這些區(qū)的多肽序列顯示于表1。IgG3鉸鏈中區(qū)除了含有兩個(gè)保守的半胱氨酸殘基以外，還含有重復(fù)三次的15個(gè)氨基酸的基序。來自這些區(qū)的氨基酸序列被用于設(shè)計(jì)合成的IgG1/IgG3連接肽。這些由以下成分組成相應(yīng)于位置226-238的IgG1上鉸鏈殘基，相應(yīng)于位置239-241的IgG1中鉸鏈，和相應(yīng)于位置241EE-242的單個(gè)IgG3中鉸鏈重復(fù)基序，其結(jié)合位置243的另外的脯氨酸或分別位于位置243，244，和245(Kabat編號(hào)系統(tǒng))的加入的脯氨酸，丙氨酸、脯氨酸，然后是柔性Gly/Ser間隔物(表2)。此外，新的連接肽被設(shè)計(jì)為由以下部分組成取代位置239或242的半胱氨酸的絲氨酸殘基結(jié)合位置243的添加的脯氨酸，和分別位于位置243，244，245的添加的脯氨酸，丙氨酸，脯氨酸(Kabat編號(hào)系統(tǒng))。也制備了Pro243Ala244Pro245和Pro243連接肽。親本CH2結(jié)構(gòu)域缺失的人源化的CC49連接肽的氨基酸序列開始于IgG1鉸鏈的第一個(gè)殘基(位置226，Kabat編號(hào)系統(tǒng))，并延續(xù)到鉸鏈/GlySer連接肽的第二個(gè)殘基，所述氨基酸序列顯示于表2。通過與具有Kabat編號(hào)系統(tǒng)中所示半胱氨酸殘基位置的CC49進(jìn)行比對(duì)，還顯示了各種連接肽設(shè)計(jì)。表1IgG1，IgG3和IgG4鉸鏈區(qū)<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="807">IgG上鉸鏈中鉸鏈下鉸鏈IgG1IgG3IgG4EPKSCDKTHT(SEQIDNO2)ELKTPLGDTTHT(SEQIDNO5)ESKYGPP(SEQIDNO45)CPPCP(SEQIDNO3)CPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQIDNO6)CPSCP(SEQIDNO46)APELLGGP(SEQIDNO4)APELLGGP(SEQIDNO4)APEFLGGP(SEQIDNO47)</table></tables>表2鉸鏈區(qū)連接肽序列實(shí)施例3.連接多肽的構(gòu)建以及同種型的優(yōu)選合成利用通過重疊延伸的拼接(SOE)方法(Horton，R.M.1993MethodsinMolecularBiology，Vol15PCRProtocolsCurrentMethodsandapplications.Ed.B.A.White)，將編碼顯示于表2的鉸鏈區(qū)連接肽的核酸序列導(dǎo)入CH2結(jié)構(gòu)域缺失的huCC49基因序列。對(duì)鉸鏈區(qū)的正確修飾通過DNA序列分析證實(shí)。質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)化CHODG44細(xì)胞，以穩(wěn)定制備抗體蛋白。構(gòu)建含有表2所示的8種設(shè)計(jì)的合成連接肽的CH2結(jié)構(gòu)域缺失的huCC49抗體，并在CHODG44細(xì)胞中產(chǎn)生抗體。上清液收集自分離的細(xì)胞系，培養(yǎng)上清中的抗體濃度通過免疫測定法確定。含有0-30ng總抗體蛋白的抗體的每種細(xì)胞系的上清利用非還原SDS-PAGE電泳分析，然后利用抗-人kappaHRP偶聯(lián)的抗體進(jìn)行Western印跡以檢測CH2結(jié)構(gòu)域缺失的huCC49A型和B型同種型。在這些條件下，A型作為單個(gè)120kDa同源二聚體遷移，B型作為60kDa雙體(doublet)遷移。還可見kappa鏈單體和二聚體。SEQIDNO8，9，14，和15的連接肽都增加A型的比例。表3.親和層析(蛋白質(zhì)G)之后且HIC純化之后A型抗體的百分比<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="751">CH2結(jié)構(gòu)域缺失的抗體％A型抗體蛋白G之后HIC純化之后HuCC49(連接肽SEQIDNO7)6098HuCC49PAP(連接肽SEQIDNO14)8398HuCC49V2PAP(連接肽SEQIDNO14)9099HuCC49G1/G3/PAP(連接肽SEQIDNO9)98未進(jìn)行HuCC49V2G1/G3/PAP(連接肽SEQIDNO9)96未進(jìn)行</table></tables>表4改造的HuCC49ΔCH2抗體鉸鏈區(qū)肽的肽繪圖<tablesid="table3"num="003"><tablewidth="786">樣品片段#A.A#理論理論連MW接的MW觀察分子量還原的觀察分子量非還原的HuCC49ΔCH2PAPG1/G3PAPHuCC49ΔCH2PAPG1/G3PAP內(nèi)切Lys-C片段29(H221-257)3711.77419.4THTCPPCGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTK內(nèi)切Lys-C片段29(H221-260)3976.97949.8THTCPPCPAPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTK內(nèi)切Lys-C片段29(H221-231)1208.52413.0THTCPPCPEPK內(nèi)切Lys-C片段30(H232-275)4394.08782.0SCDTPPPCPRCPAPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTK胰蛋白酶片段39(H221-241)1971.8NATHTCPPCGGGSSGGGSGGQPR胰蛋白酶片段39(H221-244)2237.9NATHTCPPCPAPGGGSSGGGSGGQPR胰蛋白酶片段39(H221-231)1324.5NATHTCPPCPEPK胰蛋白酶片段40(H232-241)1187.5NASCDTPPPCPR胰蛋白酶片段41(H242-259)1542.6NACPAPGGGSSGGGSGGQPR3711.53976.81208.94394.41972.62237.81325.11187.51542.97419.17949.72414.38782.6NANANANANA</table></tables>這些數(shù)據(jù)顯示，新的改造的合成鉸鏈區(qū)連接肽可用于優(yōu)選促進(jìn)形成A或B同種型。這些研究還揭示了位置242(Kabat編號(hào)系統(tǒng))的半胱氨酸殘基在合成CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的抗體A型同種型中的重要性。用絲氨酸取代位置239或242的半胱氨酸(例如，利用顯示于SEQIDNO0，11，12，或13的連接肽)使得CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的抗體的生物合成移動(dòng)到B型同種型。因此，一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的連接肽包含位置239和242的半胱氨酸。增加A型比例的連接肽的使用導(dǎo)致加工，產(chǎn)量和/或穩(wěn)定性的有利的改善。這些合成鉸鏈區(qū)連接肽的使用有利于合成任何抗體同種型例如，IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4的CH2結(jié)構(gòu)域缺失的抗體A型同種型，其基于所有四種人同種型CH3結(jié)構(gòu)域的極高同源性。包括相同和保守的氨基酸殘基，IgG1CH3結(jié)構(gòu)域與IgG2CH3有98.13％同源，與IgG3CH3有97.20％同源，與IgG4CH3有96.26％同源。實(shí)施例4從含有兩種同種型的單克隆抗體混合物純化A型和B型10mLddCC49上清用1MTrispH9.0滴定至終pH7.5。該物質(zhì)經(jīng)一系列Sol-Vac0.8μ和0.4μ的膜過濾。100mLXK50蛋白G柱用1xPBS以流速80ml/min預(yù)平衡。滴定的過濾的上清以80ml/min上樣到柱上。結(jié)合的蛋白利用兩倍柱體積的平衡緩沖液洗滌，然后用100mM甘氨酸、pH3.0洗脫。收集含有ddCC49峰的級(jí)分并立刻用1MTrispH9.0滴度至終pH7.0。TosoBiosep苯基5PW-HR柱用20mM磷酸鹽pH7.2；1M硫酸鹽預(yù)平衡。蛋白G洗脫物利用3.5M硫酸銨pH7.2母液滴定到1M硫酸銨并以濃度2mg/ml凝膠床上樣。結(jié)合的蛋白利用20mM磷酸鹽pH4或7.2硫酸銨洗脫以調(diào)節(jié)電導(dǎo)性至116.4mS/cm。自此條件洗脫的物質(zhì)在非還原SDS-PAGE上的表觀分子量約120kD(A型)。余下的結(jié)合的抗體用磷酸鹽緩沖液中的還原硫酸銨物質(zhì)線性梯度洗脫。該方法將A型和B型分離成兩個(gè)分離的峰。后一種洗脫的抗體明顯缺乏重鏈之間的二硫鍵并且其分子量為約60kDa(B型)。以上純化的物質(zhì)均可通過將硫酸銨濃度調(diào)節(jié)為1M并將其重新上樣到清潔的苯基5PW-HR柱來再捕獲。結(jié)合的蛋白利用20mM磷酸鹽pH7.2洗脫并透析入1xPBS。實(shí)施例5.比較A型和B型的穩(wěn)定性A和B型的生物活性(如在預(yù)試驗(yàn)中測定的例如，利用直接結(jié)合或競爭研究)揭示A型和B型具有相似的生物活性。比較A型和B型的穩(wěn)定性。純化的ddCC49分子通過配有YM30膜(Millipore)的Amicon濃縮儀濃縮到約5mg/ml。對(duì)于每個(gè)同種型，濃縮的物質(zhì)等分成四個(gè)部分，每個(gè)級(jí)分被置于10K透析盒(Pierce，cat#66410)中16h，在以下緩沖液中透析1)10mM磷酸鈉，pH3；2)10mM乙酸鈉，pH5；3)10mM磷酸鈉，pH7；和4)10mM硼酸鈉，pH9。透析后，每種溶液的蛋白濃度調(diào)節(jié)到3mg/ml。除了純的A和B同種型溶液之外，混合每種pH的部分A和B溶液以產(chǎn)生含有50％每種同種型的混合物?？偣伯a(chǎn)生12種配制劑(四種pH水平乘以3種抗體溶液)。過濾所述溶液并灌裝入具有灰色丁基塞子的3ml1型玻璃血清小瓶(WestPharmaceuticals)中。選擇三種溫度，2-8℃，20-25℃和38-42℃來保存蛋白以檢測穩(wěn)定性。保存之前，從每種配制劑中取出500μl樣品用于物理和化學(xué)分子，這些0時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)用作對(duì)照。一旦保存，在以下時(shí)間取樣2周，1個(gè)月，2個(gè)月，3個(gè)月，并立即送檢。為了評(píng)估兩種同種型的物理和化學(xué)穩(wěn)定性，采用以下方法在OD320測定濁度，非-還原SDS-PAGE，和大小排阻層析。于不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)保存在2-8℃，20-25℃和38-42℃的樣品進(jìn)行非-還原SDS-PAGE。在2-8℃保存時(shí)，A型和B型都相對(duì)穩(wěn)定。然而，但在pH7和9配制時(shí)，A型和B型顯示降解，如小于原始主要帶(A型的為120kDa，B型的為60kDa)的帶的數(shù)目增加所示。注意到，具體對(duì)于保存在低溫和中間溫度的pH7和9的樣品而言，低于55kDa的帶的強(qiáng)度和數(shù)量在B型中高于A型。這表明在這些條件下A同種型比B同種型更穩(wěn)定。然而，對(duì)于pH5并保存在20-25℃的A同種型而言并非如此。該樣品具有的片段似乎多于B同種型的。這看上去是由于微生物污染(在下文詳述)導(dǎo)致的人工現(xiàn)象。在高保存溫度下，pH9時(shí)兩種形式都明顯降解，并且樣品的凝膠模式幾乎沒有差異。在該條件下，在凝膠頂部出現(xiàn)痕量的污染帶，其表明形成了聚集物。由于聚集物可通過SDS溶解，所述聚集物利用本發(fā)明以下部分描述的方法研究。表4A-表4C列出了保存在三種不同溫度的ddCC49的濁度數(shù)據(jù)。濁度測定了可溶和非-可溶聚集物，并且其基于這些顆粒散射的光的量。當(dāng)存在時(shí)，聚集物將散射光并導(dǎo)致A320增加。如表4A-C所示，對(duì)于A和B同種型，保存在2-8℃的ddCC49分子的濁度隨pH的增加而增加，前者的濁度低于后者的濁度。該趨勢對(duì)于在更高溫度(20-25℃和38-40℃)保存少于一個(gè)月時(shí)間的樣品而言是正確的。保存時(shí)間達(dá)到3個(gè)月時(shí)，高pH和溫度的樣品的濁度明顯增加，A同種型與B同種型之間的差異減小。這些結(jié)果與SDS-PAGE的結(jié)果平行，表明兩種同種型在pH3和5都相對(duì)穩(wěn)定(就不形成聚集物而言)，A同種型對(duì)于聚集的易感性低于B同種型。表3表3中的簡寫具有與上面相同的含義。表5A.保存在2-8℃的ddCC49的單體百分比<tablesid="table8"num="008"><tablewidth="824">A-同種型B-同種型混合物時(shí)間(月)pH＝357935793579098.8199.1398.1697.9397.0297.7096.8893.5197.8398.2797.4495.8198.9899.1698.2598.0097.1597.8796.9691.9598.1598.4997.6895.59198.8099.2097.9997.1197.0297.8196.6288.9998.0498.4597.4194.45298.7499.0198.0095.6797.1597.6995.5084.8498.0698.3496.8192.17398.2898.8997.8895.3196.6998.1495.3785.9897.6198.1596.6589.90</table></tables>表5B.保存在20-25℃的ddCC49的單體百分比<tablesid="table9"num="009"><tablewidth="824">A-同種型B-同種型混合物時(shí)間(月)pH＝35793579357997.8399.0497.1293.6595.8497.6293.7179.6196.7598.3095.3787.67196.6096.6395.6588.0994.3897.2390.6972.2695.3697.9993.0580.92293.6292.7993.1780.0691.7196.9685.5166.5392.7897.5189.3373.91392.8189.56x74.3189.3096.0482.5763.2590.4697.0286.8069.36</table></tables>表5C.保存在38-42℃的ddCC49的單體百分比<tablesid="table10"num="010"><tablewidth="823">A-同種型B-同種型混合物時(shí)間(月)pH＝357935793579</table></tables>實(shí)施例7.A型和B型的制備純化IDEC-159(ddCC49)是針對(duì)表達(dá)于腫瘤表面的TAG-72抗原的CH2結(jié)構(gòu)域缺失的單克隆抗體。IDEC-159含有兩種抗體同種型，稱為A型和B型。目前用于IDEC-159產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)方法產(chǎn)生的A型與B型的比例為大約50∶50。A型同種型是重鏈FC部分中具有缺失的CH2區(qū)的抗體。除了具有缺失的CH2結(jié)構(gòu)域，B型也缺乏跨Fc區(qū)的二硫鍵連接，并僅僅通過疏水反應(yīng)和鹽橋連接。IDEC-159純化法中的第三步和最后的層析步驟被開發(fā)用于分離IDEC-159的兩個(gè)同種型。所述分離通過疏水反應(yīng)層析(HIC)，利用苯基TSKgel5PW-HR吸附劑進(jìn)行。由于B型的疏水性高于A型，其不可逆吸附于固定相，其中利用大約0.73M硫酸銨/20mM磷酸鈉，pH4.0-pH7.0作為流動(dòng)相。A型在這些條件下與固定相的結(jié)合力較低，并由此可同步洗脫，即其與流過柱的級(jí)分一起離開柱子。A型的同步洗脫之后，從固定相去除硫酸銨可使得B型解吸附。以下方法用于分離IDEC-159的兩個(gè)同種型·所述柱利用≥3CV0.5NNaOH，以≤150cm/hr消毒?！に鲋谩?CV0.73M硫酸銨/20mM磷酸鈉，pH4.0，以≤150cm/hr平衡?！に鲋蠘佑谑覝豑MAEFlowthrough，其被調(diào)節(jié)為包括0.43體積的2.5M硫酸銨/20mM磷酸鈉，pH4.0液體母液，5mg每ml樹脂。所述抗體在pH4.0，以≤100cm/hr上樣于所述柱?？贵w的收集開始于流出物280nmO.D.達(dá)到10mAU時(shí)?！に鲋?5CV0.73M硫酸銨/20mM磷酸鈉，pH4.0，以≤100cm/hr洗滌。在整個(gè)15CV洗滌持續(xù)抗體收集，流出物被廢棄。·所述柱利用≥5CVs20mM磷酸鈉，pH4.0，以≤100cm/hr剝離6.所述柱≥3CVs0.5NNaOH，以≤150cm/hr清洗。·所述柱用≥3CVs0.73M硫酸銨/20mM磷酸鈉，pH4.0，以≤150cm/hr洗滌。·所述柱保存在≥3CV20％乙醇，以≥150cm/hr。兩種形式在制備水平的分離(5L柱體積，總IDEC-159負(fù)載大約20g)顯示于圖13(A和B)。第一個(gè)峰包含A型的同步洗脫物，第二個(gè)峰顯示洗脫的B型，第三個(gè)峰含有雜質(zhì)，其在清洗過程中從固定相去除。該方法在制備水平分離A型和B型的能力也通過SDSPAGE證實(shí)。實(shí)施例8.制備CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的四價(jià)抗體HuCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體設(shè)計(jì)基于將huCC49單鏈Fv(scFv)附著于HuCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的抗體CH3結(jié)構(gòu)域的羧基末端。HuCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體的示意圖顯示于圖4。該設(shè)計(jì)的對(duì)等參照是C-scFv四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域缺失的抗體。Fv區(qū)，單鏈Fv分子的單個(gè)多肽鏈結(jié)合分子的制備描述于美國專利4,946,778。CC49scFv免疫球蛋白-樣抗體描述于美國專利5,892,019。huCC49scFv包含VL和VH區(qū)序列，其通過短合成接頭(VL→(Gly4Ser)3接頭→VH方向)連接，并通過PCR擴(kuò)增合成。5′VLPCR引物包括BamHI限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)然后是編碼(Gly4Ser)2接頭肽的序列。3′VLPCR引物包括部分編碼用于連接兩個(gè)VL和VH區(qū)的(Gly4Ser)3接頭肽的序列。5′VHPCR引物也包括部分編碼用于連接VL和VH區(qū)的(Gly4Ser)3接頭肽的序列。最后，3′VHPCR引物包括終止密碼子然后是BamHI位點(diǎn)。兩個(gè)V區(qū)利用兩組PCR引物擴(kuò)增，所述引物來自含有huCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的抗體的質(zhì)粒DNA底物，scFv的組裝在第二次PCR反應(yīng)中通過編碼(Gly4Ser)3接頭的共同重疊序列完成。huCC49scFv基因片段通過凝膠分離，用BamHI限制核酸內(nèi)切酶消化，并克隆入單個(gè)BamHI位點(diǎn)，所述位點(diǎn)已被導(dǎo)入huCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的抗體多順反子表達(dá)載體。(見US20030157641A1.)。簡而言之，所述載體通過去除存在于CH3結(jié)構(gòu)域編碼基因的3’末端的終止密碼子并用編碼氨基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly的核苷酸取代，然后緊接著BamHI限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)(編碼Gly-Ser)來修飾。BamHI消化的huCC49scFv片段克隆入所述載體的BamHI位點(diǎn)導(dǎo)致經(jīng)由16氨基酸Ser(Gly4Ser)3接頭連接的的huCC49scFv與huCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的抗體CH3結(jié)構(gòu)域的羧基末端的融合產(chǎn)物。正確的序列通過DNA序列分析證實(shí)。質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)化CHODG44細(xì)胞以穩(wěn)定產(chǎn)生抗體蛋白。改造的抗體稱為huCC49結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體。圖8A顯示重鏈huCC49結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體的DNA序列。圖8C顯示輕鏈huCC49結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體的DNA序列。圖9A顯示重鏈huCC49結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體的氨基酸序列。圖9C輕鏈huCC49結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體的氨基酸序列。上清收集自分離的細(xì)胞系，培養(yǎng)上清中的抗體濃度通過免疫測定法確定。上清通過非還原SDS-PAGE電泳然后通過Western印跡分析，其中利用抗人kappa-HRP偶聯(lián)的抗體檢測huCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體A型和B型同種型。在這些條件下，A型作為單個(gè)～170kDa同源二聚體遷移，B型作為～85kDa雙體(doublet)遷移，A同種型與B同種型之比為約50∶50。如圖18所示，發(fā)現(xiàn)五個(gè)獨(dú)立分離的克隆都產(chǎn)生A和BCH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體同種型。這些克隆之一被選用于抗體制備，以及如實(shí)施例4所述利用HIC層析進(jìn)行純化。純化的huCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體A型和B型通過非還原和還原SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示于圖19。A型huCC49結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體以超過95％的純度與B型有效分離。如所預(yù)料那樣，兩種純化的形式在還原SDS-PAGE條件下的表現(xiàn)一樣。HuCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體A型通過大小排阻層析檢測并發(fā)現(xiàn)主要作為單個(gè)峰洗脫(96％)，表明抗體產(chǎn)物沒有明顯的聚集和分解(圖20)。實(shí)施例9.HuCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的四價(jià)抗體的生物分布圖譜在競爭結(jié)合試驗(yàn)中檢測HuCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體A型與TAG-72抗原來源牛頜下粘蛋白結(jié)合的能力，所述檢測通過時(shí)間-分辨熒光免疫測定法利用Delphia熒光計(jì)(WallacInc.，Gaithersburg，MD)進(jìn)行。競爭結(jié)合曲線顯示于圖21。評(píng)估HuCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體A型和對(duì)照親本CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的huCC49(稱為HuCC49或IDEC159)抗體。四價(jià)抗體的相對(duì)結(jié)合活性的親和力高于對(duì)照親本CC49抗體5-倍(GraphPadPrism4.0forWindows，GraphPad，Software，SanDiegoCaliforniaUSA.www.graphpad.com)，與預(yù)期的抗原結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量增加一致。在攜帶LS-174T人腫瘤異種移植物的無胸腺裸小鼠中，比較90Y-放射標(biāo)記的huCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體的生物分布與以前利用對(duì)照親本huCC49抗體產(chǎn)生的結(jié)果。HuCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體偶聯(lián)于螯合劑Chx-DTPA，評(píng)估結(jié)合活性。偶聯(lián)的huCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體顯示的親和力高于偶聯(lián)的對(duì)照親本huCC495-6倍，顯示所述四價(jià)抗體可在不明顯損失結(jié)合活性的條件下衍生化。HuCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體用90Y標(biāo)記，并經(jīng)尾靜脈iv注射給予攜帶預(yù)確立的大約250mm3的腫瘤的小鼠單劑量放射標(biāo)記的抗體。收集樣品，并進(jìn)行beta計(jì)數(shù)。測定從3-72小時(shí)的90Y放射標(biāo)記的抗體每克腫瘤或正常組織的百分比注射的劑量(％ID)，并顯示于表6。表6.<tablesid="table12"num="012"><tablewidth="662">5-7小鼠/組％ID/gm-組織血液脾腎肝腫瘤HuCC49(結(jié)構(gòu)域缺失的)3-5hrs18.245.399.158.8313.6612hrs3.215.0115.5014.2017.3324hrs1.036.2114.0910.8420.5348hrs0.176.9211.1511.8513.1772hrs0.106.229.0110.5910.55</table></tables><tablesid="table13"num="013"><tablewidth="662">四價(jià)HuCC493hrs20.312.607.609.6010.806hrs15.412.206.7012.4012.1012hrs7.2015.105.1013.9013.1024hrs2.409.503.9012.1014.0048hrs0.5010.002.6011.9011.5072hrs0.10**1.9012.706.40</table></tables>數(shù)據(jù)表示平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差**樣品的技術(shù)問題HuCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)(C-scFv四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域缺失的)抗體顯示在腎中的聚集低于對(duì)照huCC49抗體，很可能是由于抗體的分子量增加。huCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體的腫瘤聚集類似利用對(duì)照親本huCC49所產(chǎn)生的(表6)。然而，如所述，這兩個(gè)生物分布研究不是同時(shí)進(jìn)行的，并存在試驗(yàn)差異。圖35顯示對(duì)照親本huCC49和huCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體的腫瘤保留，其被測定為％ID/gm。圖35也顯示相對(duì)于放射活性的峰值聚集進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的同樣的腫瘤保留數(shù)據(jù)。圖35中的兩條標(biāo)準(zhǔn)化保留曲線的AUC分析利用GraphPadPrism4.0forWindows，GraphPad，Software，SanDiegoCaliforniaUSA.www.graphpad.com計(jì)算。對(duì)照親本huCC49的總峰面積為2037單位，huCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體的總峰面積為2562單位，代表四價(jià)蛋白的面積的25.8％的增加。該模式表示的數(shù)據(jù)提示腫瘤隔室中四價(jià)抗體的保留與親本二價(jià)分析相比有所改善。四價(jià)HuCC49構(gòu)建體提供一些預(yù)靶向的優(yōu)勢，例如，放射免疫治療(RIT)預(yù)靶向。該優(yōu)勢通過來自表6的三個(gè)觀察定義。首先，四聚體HuCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的構(gòu)建體的血液清除率與目前的CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的HuCC49構(gòu)建體的相當(dāng)。這種快速血液清除可避免需要“清潔劑”來加速在給予局部化到腫瘤結(jié)合的抗體的放射標(biāo)記的配體之前抗體從血液的清除。清潔劑的消除明顯降低該治療形態(tài)在臨床環(huán)境中的復(fù)雜性。其次，四價(jià)構(gòu)建體的腫瘤清除與目前的二價(jià)構(gòu)建體的可比。因此，遞送的放射劑量對(duì)于兩種構(gòu)建體而言是可比的(表6)。第三，與CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的HuCC49相比，較低的腎和肝吸收能夠使得在到達(dá)器官限制性毒性以前放射標(biāo)記的配體的輸入劑量更高。實(shí)施例10.包含新的連接肽的HuCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的四價(jià)抗體的制備以及A同種型的優(yōu)選合成構(gòu)建類似于圖4下半部分的設(shè)計(jì)但含有表2所示G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]合成連接肽的huCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體。簡而言之，編碼部分G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的基因序列通過PCR擴(kuò)增合成，利用編碼SalI限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的5′連接肽PCR引物和編碼XhoI位點(diǎn)的3′連接肽PCR引物。含有編碼G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的基因序列的質(zhì)粒DNA用作底物。PCR產(chǎn)物編碼所有G1/G3/Pro243Ala244Pro245和部分[Gly/Ser]連接肽。G1/G3/Pro243Ala244Pro245鉸鏈片段經(jīng)凝膠純化，用SalI和XhoI限制核酸內(nèi)切酶消化并克隆入SalI和XhoI載體位點(diǎn)，產(chǎn)生全長G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽。正確的序列通過DNA序列分析證實(shí)。質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)化CHODG44細(xì)胞以穩(wěn)定生成抗體蛋白。圖8B顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的重鏈huCC49結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體的DNA序列。圖8C顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的輕鏈huCC49結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體的DNA序列。圖9B顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的重鏈huCC49結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體的氨基酸序列。圖9C含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的輕鏈huCC49結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體的氨基酸序列。上清收集自分離的細(xì)胞系，培養(yǎng)上清中的抗體濃度通過免疫測定法確定。上清通過非還原SDS-PAGE電泳然后通過Western印跡分析，其中利用抗人kappa-HRP偶聯(lián)的抗體檢測huCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)(C-scFv四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的)抗體A型和B型同種型。在這些條件下，A型作為單個(gè)～170kDa同源二聚體遷移，B型作為～85kDa雙體(doublet)遷移，A同種型與B同種型之比為約50∶50。如圖22所示，代表性含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體產(chǎn)生所有A型四價(jià)抗體同種型。含有導(dǎo)入huCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體序列的G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQIDNO9)連接肽的細(xì)胞系用于抗體制備。產(chǎn)生抗體并如實(shí)施例4所述純化。含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQIDNO9)連接肽的HuCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體僅僅利用蛋白質(zhì)G柱純化，作為基本上單個(gè)峰以純度96％洗脫而無需進(jìn)一步HIC純化。還原的和非還原的純化的蛋白樣品通過SDS-PAGE電泳分析。在非還原條件下，A型被預(yù)期作為單個(gè)170kDa同源二聚體、B型作為85kDa的雙體遷移。SEQIDNO9的連接肽基本上增加產(chǎn)生的A型的比例。示例性結(jié)果顯示于圖23。該結(jié)果顯示G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈(SEQIDNO9)導(dǎo)致基本上產(chǎn)生所有A型huCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)(C-scFv四價(jià)CH2結(jié)構(gòu)域缺失的)抗體而B型很少或不可檢測，證實(shí)了用于制備A型同種型的該鉸鏈通?？捎糜趶?fù)合抗體諸如多價(jià)抗體。很明顯，本發(fā)明也可用于雙特異性四價(jià)抗體模式。HuCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)G1/G3/Pro243Ala244Pro245抗體通過大小排阻層析檢驗(yàn)并基本上作為含有84％單體的單個(gè)峰洗脫。含有殘余聚集物的級(jí)分通過制備型大小排阻層析去除，產(chǎn)生含有基本上95％單體的制備物(圖24)。在競爭結(jié)合試驗(yàn)中檢測HuCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)G1/G3/Pro243Ala244Pro245抗體與TAG-72抗原來源牛頜下粘蛋白結(jié)合的能力，所述檢測通過時(shí)間-分辨熒光免疫測定法利用Delphia熒光計(jì)(WallacInc.，Gaithersburg，MD)進(jìn)行。競爭結(jié)合曲線顯示于圖25。評(píng)估HuCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體A型和對(duì)照親本CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的huCC49(稱為HuCC49或IDEC159)抗體。四價(jià)抗體的相對(duì)結(jié)合活性的親和力高于對(duì)照親本HuCC49抗體8倍(GraphPadPrism4.0forWindows，GraphPad，Software，SanDiegoCaliforniaUSA.www.graphpad.com)，與預(yù)期的抗原結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量增加一致。這些結(jié)果顯示G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽(SEQIDNO9)導(dǎo)致產(chǎn)生基本上所有A型huCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體而B型不可檢出。純化的抗體證實(shí)了對(duì)抗原的親和力增加。實(shí)施例11.制備CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的四價(jià)抗體構(gòu)建圖2所示huCC49微型抗體和huCC492sc(Fv)2四價(jià)抗體(N-scFv四價(jià)微型抗體)。簡而言之，huCC492sc(Fv)2四價(jià)抗體(N-scFv四價(jià)微型抗體)設(shè)計(jì)基于將huCC49單鏈Fv(scFv)插入huCC49微型抗體中第一個(gè)scFv結(jié)構(gòu)域的羧基末端以及鉸鏈連接肽的氨基末端之間。Fv區(qū)，單鏈Fv分子的單個(gè)多肽鏈結(jié)合分子的制備描述于美國專利4,946,778。CC49scFv免疫球蛋白-樣抗體描述于美國專利5,892,019。微型抗體的制備描述于美國專利5,837,821。huCC49scFv包含VL和VH區(qū)序列，其通過短合成接頭(VL→(Gly4Ser)3接頭→VH方向)連接，并通過PCR擴(kuò)增合成，用于構(gòu)建huCC49微型抗體。其次，所述微型抗體載體通過利用PCR擴(kuò)增將修飾的(Gly4Ser)5接頭加入huCC49微型抗體氨基末端scFv結(jié)構(gòu)域的羧基末端來修飾，以利用NheI限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)取代編碼所述接頭的最后兩個(gè)氨基酸殘基的核苷酸。這導(dǎo)致(Gly4Ser)4-Gly3-Ala-Ser接頭然后是SalI限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，其通過數(shù)個(gè)核苷酸分離。第二個(gè)huCC49scFv利用PCR從含有huCC49scFv基因的質(zhì)粒DNA底物，利用編碼NheI限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的5′VLPCR引物和編碼SalI位點(diǎn)的3′VHPCR引物擴(kuò)增。huCC49scFv片段經(jīng)凝膠純化，用NheI和SalI限制性核酸內(nèi)切酶消化并克隆入第一scFv和鉸鏈連接肽之間的NheI和SalI位點(diǎn)。產(chǎn)生由前導(dǎo)肽與兩個(gè)連續(xù)huCC49scFv與鉸鏈連接肽與CH3結(jié)構(gòu)域融合的產(chǎn)物。正確的序列通過DNA序列分析證實(shí)。質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)化CHODG44細(xì)胞以穩(wěn)定產(chǎn)生抗體蛋白。圖10A顯示huCC49四價(jià)(N-scFv四價(jià))微型抗體基因的DNA序列。圖11A顯示huCC49四價(jià)(N-scFv四價(jià))微型抗體的氨基酸序列。上清收集自分離的細(xì)胞系，培養(yǎng)上清中的抗體濃度通過免疫測定法確定。上清通過非還原SDS-PAGE電泳然后通過Western印跡分析，其中利用抗-IgG-HRP偶聯(lián)的抗體檢測A型和B型同種型中的重鏈恒定序列。在這些條件下，預(yù)期A型作為單個(gè)～82kDa同源二聚體遷移，半分子或B型作為～41kDa雙體(doublet)遷移。預(yù)期HuCC492sc(Fv)2四價(jià)微型抗體A型作為單個(gè)～138kDa同源二聚體遷移，B型作為～69kDa雙體(doublet)遷移，A同種型與B同種型之比為約50∶50。通過比較，huCC49CH2結(jié)構(gòu)域缺失的抗體(預(yù)期作為～120kDa同源二聚體遷移，B型作為～60kDa雙體(doublet)遷移，A同種型與B同種型之比為約50∶50)用作對(duì)照。如圖26所示，發(fā)現(xiàn)代表性分離的微型抗體和2sc(Fv)2四價(jià)微型抗體克隆分泌A和B同種型，與在非還原和還原SDS-PAGE條件下預(yù)期的分子量一致。實(shí)施例12.制備包含新連接肽的HuCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的四價(jià)抗體以及A同種型的優(yōu)選合成構(gòu)建類似于顯示于圖2底部的設(shè)計(jì)、但是含有表2所示G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的huCC492sc(Fv)2四價(jià)抗體(N-scFv四價(jià)微型抗體)。簡而言之，編碼部分G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的基因序列利用編碼SalI限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的5′連接肽PCR引物和編碼XhoI位點(diǎn)的3′連接肽PCR引物通過PCR擴(kuò)增合成。含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽編碼基因序列的質(zhì)粒DNA用作底物。PCR產(chǎn)物編碼所有G1/G3/Pro243Ala244Pro245和部分[Gly/Ser]連接肽。G1/G3/Pro243Ala244Pro245鉸鏈片段通過凝膠分離，利用SalI和XhoI限制性核酸內(nèi)切酶消化，克隆入SalI和XhoI載體位點(diǎn)，重構(gòu)全長G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽。正確的序列通過DNA序列分析證實(shí)。質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)化CHODG44細(xì)胞以穩(wěn)定產(chǎn)生抗體蛋白。圖10B顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的huCC492sc(Fv)2四價(jià)抗體(N-scFv四價(jià)微型抗體)基因的DNA序列。圖11B顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的huCC492sc(Fv)2四價(jià)抗體(N-scFv四價(jià)微型抗體)基因的氨基酸序列。上清收集自分離的細(xì)胞系，培養(yǎng)上清中的抗體濃度通過免疫測定法確定。上清通過非還原SDS-PAGE電泳然后通過Western印跡分析，其中利用抗-IgG-HRP偶聯(lián)的抗體檢測huCC492sc(Fv)2四價(jià)微型抗體(N-scFv四價(jià)微型抗體)A型和B型同種型。在這些條件下，預(yù)期huCC492sc(Fv)2四價(jià)微型抗體A型作為單個(gè)～138kDakDa同源二聚體遷移，B型作為～69kDa雙體(doublet)遷移，A同種型與B同種型之比為約50∶50。如圖27所示，代表性含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的huCC492sc(Fv)2四價(jià)微型抗體產(chǎn)生基本上所有A型四價(jià)微型抗體同種型。導(dǎo)入huCC492sc(Fv)2四價(jià)微型抗體序列的、含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQIDNO9)連接肽的細(xì)胞系用于抗體制備。由于huCC492sc(Fv)2四價(jià)微型抗體缺乏CH1結(jié)構(gòu)域，蛋白質(zhì)不能利用蛋白G層析純化?？贵w隨后利用陰離子交換，疏水反應(yīng)和大小排阻層析法的組合純化。含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQIDNO9)連接肽的HuCC492sc(Fv)2四價(jià)微型抗體主要作為單個(gè)峰以純度97.6％純化。還原的和非還原的蛋白樣品通過SDS-PAGE電泳分析。在非還原條件下，預(yù)期A型作為單個(gè)～138kDakDa同源二聚體遷移，B型作為～69kDa雙體(doublet)遷移。SEQIDNO9的連接肽基本上增加生成的A型的比例。示例性結(jié)果顯示于圖28。該結(jié)果顯示，G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]鉸鏈(SEQIDNO9)導(dǎo)致產(chǎn)生基本上所有A型huCC492sc(Fv)2四價(jià)微型抗體(N-scFv四價(jià)微型抗體)而B型幾乎沒有或不可檢出，證實(shí)了該鉸鏈產(chǎn)生A型同種型的用途通?？捎糜趶?fù)合抗體諸如多價(jià)抗體。很明顯，本發(fā)明也可用于雙特異性四價(jià)抗體模式。純化的huCC492sc(Fv)2四價(jià)G1/G3/Pro243Ala244Pro245微型抗體通過大小排阻層析檢測，發(fā)現(xiàn)基本上作為含有97.6％的單體的單個(gè)峰洗脫(圖29)。在競爭結(jié)合試驗(yàn)中檢測純化的huCC492sc(Fv)2四價(jià)G1/G3/Pro243Ala244Pro245微型抗體與TAG-72抗原來源牛頜下粘蛋白結(jié)合的能力，所述檢測通過時(shí)間-分辨熒光免疫測定法利用Delphia熒光計(jì)(WallacInc.，Gaithersburg，MD)進(jìn)行。競爭結(jié)合曲線顯示于圖30。評(píng)估HuCC492sc(Fv)2四價(jià)G1/G3/Pro243Ala244Pro245微型抗體，huCC49微型抗體，huCC49CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)G1/G3/Pro243Ala244Pro245抗體，和對(duì)照親本CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的huCC49(稱為HuCC49或IDEC159)抗體。四價(jià)抗體的相對(duì)結(jié)合活性的親和力高于對(duì)照親本huCC49抗體或微型抗體(GraphPadPrism4.0forWindows，GraphPad，Software，SanDiegoCaliforniaUSA.www.graphpad.com)，與預(yù)期的抗原結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量增加一致。實(shí)施例13.制備包含新的連接肽的PRIMATIZEDp5E8CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的四價(jià)抗體和以及A同種型的優(yōu)選合成PRIMATIZEDp5E8G1是嵌合獼猴/人(PRIMATIZED)單克隆抗體含有分別融合于人gamma1和kappa恒定區(qū)的獼猴重和輕可變區(qū)。PRIMATIZEDp5E8G1結(jié)合人CD23，IgE(FcεRII)的低親和力受體(Mavromatis和Cheson.2003.J.Clin.Oncol.211874；美國專利申請(qǐng)20030059424)。含有表2所示的G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]合成連接肽(SEQIDNO9)的CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8sc(Fv)2四價(jià)抗體利用類似實(shí)施例10所述的策略構(gòu)建。用于構(gòu)建sc(Fv)2四價(jià)抗體的PRIMATIZEDp5E8scFv由通過短合成接頭以VL→(Gly4Ser)3接頭→VH方向連接的p5E8VL和aVH區(qū)序列組成，并在實(shí)施例12中詳述。正確的序列通過DNA序列分析證實(shí)。質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)化CHODG44細(xì)胞以穩(wěn)定產(chǎn)生抗體蛋白。圖12A顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的重鏈CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8sc(Fv)2四價(jià)抗體的DNA序列。圖12B顯示輕鏈CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8sc(Fv)2四價(jià)抗體的DNA序列。圖13A顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的重鏈CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8sc(Fv)2四價(jià)抗體的氨基酸序列。圖13B顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的輕鏈CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8sc(Fv)2四價(jià)抗體的氨基酸序列。上清收集自分離的細(xì)胞系，培養(yǎng)上清中的抗體濃度通過免疫測定法確定。上清通過非還原SDS-PAGE電泳然后通過Western印跡分析，其中利用抗人-IgG-HRP偶聯(lián)的抗體檢測含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8sc(Fv)2四價(jià)抗體的A型和B型同種型。在這些條件下，預(yù)期A型作為單個(gè)～170kDa同源二聚體遷移，B型作為～85kDa雙體遷移。SEQIDNO9的連接肽基本上增加A型的比例。示例性結(jié)果顯示于圖31。這些結(jié)果顯示，G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽(SEQIDNO9)導(dǎo)致產(chǎn)生基本上所有A型CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8sc(Fv)2四價(jià)抗體而無可檢測的B型，證書了該鉸鏈用于制備A型同種型CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的sc(Fv)2四價(jià)抗體的用途通?？捎糜谔禺愋愿鳟惖目贵w。實(shí)施例14.制備包含新的連接肽的PRIMATIZEDp5E8微型抗體以及A同種型的優(yōu)選合成微型抗體是由融合于免疫球蛋白鉸鏈區(qū)和CH3結(jié)構(gòu)域的scFv組成的單鏈多肽。微型抗體單個(gè)多肽鏈結(jié)合分子的制備描述于美國專利5,837,821。通常，完整IgG分子中，鉸鏈區(qū)位置230的半胱氨酸殘基與位置214的羧基末端輕鏈恒定區(qū)半胱氨酸形成共價(jià)二硫鍵，連接重和輕鏈多肽(Kabat編號(hào)系統(tǒng))。微型抗體設(shè)計(jì)中，輕鏈恒定區(qū)缺失，消除了參與二硫鍵形成的兩個(gè)半胱氨酸之一。然而，鉸鏈區(qū)中位置230的單個(gè)殘余半胱氨酸據(jù)稱參與同型鏈間二硫鍵，其可能對(duì)鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)有貢獻(xiàn)并由此保持在原位。缺乏CH2結(jié)構(gòu)域的微型抗體自細(xì)胞分泌，并在培養(yǎng)上清中作為含有A型和B型同種型的混合物以及有可能作為未組裝的半分子累積，如圖32所示。這些形式的比例高度可變，并且對(duì)可重復(fù)制備的純產(chǎn)物提出了挑戰(zhàn)。缺乏免疫球蛋白CH1/CL結(jié)構(gòu)域防止了利用蛋白G免疫親和基質(zhì)分離所有微型抗體。雖然未組裝的半分子(MW～40-45kD)可利用多種層析策略分離自同源二聚體(MW～80-90kD)，余下的完整A和B同種型不能利用諸如HIC層析(本文所述)的技術(shù)有效互相分離，這也是由于缺乏CH1/CL結(jié)構(gòu)域。這些同種型也不能通過大小排阻層析分離，因?yàn)閮煞N同種型的分子量非常接近，從而阻止了基于該特征的分離。由此微型抗體制備物的組成可實(shí)際上是復(fù)合的，由A和B同種型的混合物組成。檢測了經(jīng)改造含有表2所示G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽(SEQIDNO9)的CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8微型抗體的產(chǎn)生。PRIMATIZEDp5E8scFvs通過PCR擴(kuò)增構(gòu)建。ScFvs以兩種方向(VL→(Gly4Ser)3接頭→VH(VL/VH)和VH→(Gly4Ser)3接頭→VL(VH/VL))構(gòu)建。用于構(gòu)建的寡核苷酸顯示于下表表7.用于構(gòu)建含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8VL/VH微型抗體的PCR引物。在SEQIDNO37中，BspLU11I限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)加有下劃線。在SEQIDNO40中SalI限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)加有下劃線。N-23VL-1F(SEQIDNO37)5’-AGAGAGACATGTGGCGACATCCAGATGACCCAGTC-3’23-VL-1R(SEQIDNO38)5’-GGAGCCACCCCCACCGGACCCGCCACCGCCTTTGATTTCCACCTTGGTCC-3’23-VH-2F(SEQIDNO39)5’-GGGTCCGGTGGGGGTGGCTCCGGGGGCGGTGGCTCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC-3’N-23-VH-2R(SEQIDNO40)5’-AGAGAGGTCGACTGAGGAGACGGTGACCAGGAC-3’表8.用于構(gòu)建含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8VH/VL微型抗體的PCR引物。SEQIDNO41中的BspLU11I限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)加有下劃線。SEQIDNO44中的SalI限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)加有下劃線。N-23VH-1F(SEQIDNO41)5’-AGAGAGACATGTGGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC-3’23-VH-1R(SEQIDNO42)5’-GGAGCCACCCCCACCGGACCCGCCACCGCCTGAGGAGACGGTGACCAGGAC-3’23-VL-2F(SEQIDNO43)5’-GGGTCCGGTGGGGGTGGCTCCGGGGGCGGTGGCTCCGACATCCAGATGACCCAGTC-3’N-23-VL-2R(SEQIDNO44)5’-AGAGAGGTCGACTTTGATTTCCACCTTGGTCC-3VL/VHscFv在兩步中構(gòu)建。5′VLPCR正向引物N-23VL-1F(SEQIDNO37)包括BspLU11I限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)以允許將scFv連接于表達(dá)載體中的免疫球蛋白信號(hào)肽。3′VLPCR反向引物23-VL-1R(SEQIDNO38)包括部分編碼用于連接VL和VH區(qū)的(Gly4Ser)3接頭肽的序列。5′正向VHPCR引物23-VH-2F(SEQIDNO30)也包括部分編碼用于連接VL和VH區(qū)的(Gly4Ser)3接頭肽的序列，3′VHPCR反向引物N-23-VH-2R(SEQIDNO40)包括SalI限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)以將scFv連于鉸鏈區(qū)。兩個(gè)V區(qū)利用兩組PCR引物自含有PRIMATIZEDp5E8G1抗體的質(zhì)粒DNA底物擴(kuò)增，并在兩步PCR反應(yīng)中通過編碼(Gly4Ser)3接頭的共同重疊序列進(jìn)行scFv的組裝。PRIMATIZEDp5E8scFv基因片段利用凝膠分離，用BspLU11I和SalI限制性核酸內(nèi)切酶消化，并克隆入BspLU11I和SalI雙消化的、含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的抗體雙順反子表達(dá)載體。PRIMATIZEDp5E8VH/VLscFv以類似方式利用PCR引物對(duì)N-23VH-1F(SEQIDNO41)和23-VH-1R(SEQIDNO36)和23-VL-2F(SEQIDNO43)和N-23-VL-2R(SEQIDNO44)構(gòu)建，所述引物對(duì)顯示于表7和8。兩種完整構(gòu)建體的正確序列通過DNA分析確證。質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)化CHODG44細(xì)胞以瞬時(shí)(transient)產(chǎn)生抗體蛋白。圖14顯示含有VL→VH方向(VL/VH)的G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8VL/VH微型抗體的DNA序列。圖15顯示含有VH→VL方向(VH/VL)的G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8VH/VL微型抗體的DNA序列。圖16顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8VL/VH微型抗體的氨基酸序列。圖17顯示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8VH/VL微型抗體的氨基酸序列。上清收集自轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，通過ELISA分析培養(yǎng)上清中的微型抗體分子與固定在塑料微量滴定板的可溶CD23抗原的結(jié)合。結(jié)果顯示于圖33，證實(shí)了PRIMATIZEDp5E8VH/VL和含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的VL/VH微型抗體均以劑量反應(yīng)方式同等結(jié)合CD23抗原。上清通過非還原SDS-PAGE電泳然后通過Western印跡分析，利用抗人IgG-HRP偶聯(lián)的抗體檢測含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽的CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8微型抗體的A型和B型同種型。在這些條件下，預(yù)期A型作為單個(gè)～80-90kDa同源二聚體遷移，B型作為～40-45kDa雙體遷移。SEQIDNO9的連接肽基本上增加A型的比例。示例性結(jié)果顯示于圖34。這些結(jié)果顯示，G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]連接肽(SEQIDNO9)導(dǎo)致產(chǎn)生基本上所有A型CH2結(jié)構(gòu)域-缺失的PRIMATIZEDp5E8微型抗體而無可檢測的B型。等同物本領(lǐng)域技術(shù)人員利用不超過常規(guī)試驗(yàn)將認(rèn)識(shí)到，或能確定本發(fā)明具體實(shí)施方案的許多等同物。所述等同物意圖包含在以下權(quán)利要求中。序列表序列表SEQIDNO1GGGSSGGGSGSEQIDNO2EPKSCDKTHTSEQIDNO3CPPCPSEQIDNO4APELLGGPSEQIDNO5ELKTPLGDTTHTSEQIDNO6CPRCPEPKSCDTPPPCPRCPSEQIDNO7EPKSCDKTHTCPPCGGGSSGGGSGSEQIDNO8EPKSCDKTHTCPPCPEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGSEQIDNO9EPKSCDKTHTCPPCPEPKSCDTPPPCPRCPAPGGGSSGGGSGSEQIDNO10EPKSCDKTHTSPPCPGGGSSGGGSGSEQIDNO11EPKSCDKTHTSPPCPAPGGGSSGGGSGSEQIDNO12EPKSCDKTHTCPPSPGGGSSGGGSGSEQIDNO13EPKSCDKTHTCPPSPAPGGGSSGGGSGSEQIDNO14EPKSCDKTHTCPPCPAPGGGSSGGGSGSEQIDNO15EPKSCDKTHTCPPCPGGGSSGGGSGSEQIDNO16CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCTGAGGTGGTGAAACCTGGGGCTTCCGTGAAGATTTCCTGCAAGGCAAGCGGCTACACCTTCACTGATCACGCAATCCACTGGGTGAAACAGAATCCTGGACAGCGCCTGGAGTGGATTGGATATTTCTCTCCCGGAAACGATGATTTTAAGTACAATGAGAGGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCTGCCAGCACTGCCTACGTGGAGCTCTCCAGCCTGAGATCCGAGGATACTGCAGTGTACTTCTGCACAAGATCCCTGAATATGGCCTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCGGAGGTGGCTCGAGTGGAGGCGGTTCCGGAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATCCGGCGGGGGTGGATCCGGTGGAGGGGGCTCCGGCGGTGGCGGGTCCGACATCGTGATGAGCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGGGTGACTCTGAATTGCAAGTCCAGCCAGTCCCTGCTCTATAGCGGAAATCAGAAGAACTATCTCGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGAGCCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCGCTAGGGAATCCGGCGTGCCTGATCGCTTCAGCGGCAGCGGATCTGGGACAGACTTCACTCTGACAATCAGCAGCGTGCAGGCAGAAGACGTGGCAGTCTATTATTGTCAGCAGTATTATAGCTATCCCCTCACATTCGGCGCTGGCACCAAGCTGGAACTTAAGGGCGGTGGCGGGTCCGGTGGGGGTGGCTCCGGGGGCGGTGGCTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCTGAGGTGGTGAAACCTGGGGCTTCCGTGAAGATTTCCTGCAAGGCAAGCGGCTACACCTTCACTGATCACGCAATCCACTGGGTGAAACAGAATCCTGGACAGCGCCTGGAGTGGATTGGATATTTCTCTCCCGGAAACGATGATTTTAAGTACAATGAGAGGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCTGCCAGCACTGCCTACGTGGAGCTCTCCAGCCTGAGATCCGAGGATACTGCAGTGTACTTCTGCACAAGATCCCTGAATATGGCCTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGCSEQIDNO17CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCTGAGGTGGTGAAACCTGGGGCTTCCGTGAAGATTTCCTGCAAGGCAAGCGGCTACACCTTCACTGATCACGCAATCCACTGGGTGAAACAGAATCCTGGACAGCGCCTGGAGTGGATTGGATATTTCTCTCCCGGAAACGATGATTTTAAGTACAATGAGAGGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCTGCCAGCACTGCCTACGTGGAGCTCTCCAGCCTGAGATCCGAGGATACTGCAGTGTACTTCTGCACAAGATCCCTGAATATGGCCTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCATGCCCACGGTGCCCAGGAGGTGGCTCGAGTGGAGGCGGTTCCGGAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATCCGGCGGGGGTGGATCCGGTGGAGGGGGCTCCGGCGGTGGCGGGTCCGACATCGTGATGAGCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGGGTGACTCTGAATTGCAAGTCCAGCCAGTCCCTGCTCTATAGCGGAAATCAGAAGAACTATCTCGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGAGCCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCGCTAGGGAATCCGGCGTGCCTGATCGCTTCAGCGGCAGCGGATCTGGGACAGACTTCACTCTGACAATCAGCAGCGTGCAGGCAGAAGACGTGGCAGTCTATTATTGTCAGCAGTATTATAGCTATCCCCTCACATTCGGCGCTGGCACCAAGCTGGAACTTAAGGGCGGTGGCGGGTCCGGTGGGGGTGGCTCCGGGGGCGGTGGCTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCTGAGGTGGTGAAACCTGGGGCTTCCGTGAAGATTTCCTGCAAGGCAAGCGGCTACACCTTCACTGATCACGCAATCCACTGGGTGAAACAGAATCCTGGACAGCGCCTGGAGTGGATTGGATATTTCTCTCCCGGAAACGATGATTTTAAGTACAATGAGAGGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCTGCCAGCACTGCCTACGTGGAGCTCTCCAGCCTGAGATCCGAGGATACTGCAGTGTACTTCTGCACAAGATCCCTGAATATGGCCTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGCSEQIDNO18GACATCGTGATGAGCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGGGTGACTCTGAATTGCAAGTCCAGCCAGTCCCTGCTCTATAGCGGAAATCAGAAGAACTATCTCGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGAGCCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCGCTAGGGAATCCGGCGTGCCTGATCGCTTCAGCGGCAGCGGATCTGGGACAGACTTCACTCTGACAATCAGCAGCGTGCAGGCAGAAGACGTGGCAGTCTATTATTGTCAGCAGTATTATAGCTATCCCCTCACATTCGGCGCTGGCACCAAGCTGGAACTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGASEQIDNO19QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQNPGQRLEWIGYFSPGNDDFKYNERFKGKATLTADTSASTAYVELSSLRSEDTAVYFCTRSLNMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTETCPPCGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMSQSPDSLAVSLGERVTLNCKSSQSLLYSGNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASARESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQNPGQRLEWIGYFSPGNDDFKYNERFKGKATLTADTSASTAYVELSSLRSEDTAVYFCTRSLNMAYWGQGTLVTVSSSEQIDNO20QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTDEAIHWVKQNPGQRLEWIGYFSPGNDDFKYNERFKGKATLTADTSASTAYVELSSLRSEDTAVYFCTRSLNMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPEPKSCDTPPPCPRCPAPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMSQSPDSLAVSLGERVTLNCKSSQSLLYSGNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASARESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQNPGQRLEWIGYFSPGNDDFKYNERFKGKATLTADTSASTAYVELSSLRSEDTAVYFCTRSLNMAYWGQGTLVTVSSSEQIDNO21DIVMSQSPDSLAVSLGERVTLNCKSSQSLLYSGNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASARESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY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GTCTCACGTATTAGTAGTAGTGGTGATCCCACATGGTACGCAGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGAGAACGCCAAGAACACACTGTTTCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTCTATTACTGTGCGAGCTTGACTACAGGGTCTGACTCCTGGGGCCAGGGAGTCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGTGGCGGGTCCGGTGGGGGTGGCTCCGGGGGCGGTGGCTCCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGGGACAGAGTCACCATCACTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGGTATTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGTTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCGTCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCGACTTATTACTGTCTACAGGTTTATAGTACCCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGTCGACCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCATGCCCACGGTGCCCAGCACCTGGAGGTGGCTCGAGTGGAGGCGGATCCGGAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGASEQIDNO32DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRYYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTVSSLQPEDFATYYCLQVYSTPRTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLAKPGGSLRLSCAASGFRFTFNNYYMDWVRQAPGQGLEWVSRISSSGDPTWYADSVKGRPTISRENAKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCASLTTGSDSWGQGVLVTVSSVDPKSCDKTHTCPPCPEPKSCDTPPPCPRCPAPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQIDNO33EVQLVESGGGLAKPGGSLRLSCAASGFRFTFNNYYMDWVRQAPGQGLEWVSRISSSGDPTWYADSVKGRFTISRENAKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCASLTTGSDSWGQGVLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRYYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTVSSLQPEDFATYYCLQVYSTPRTFGQGTKVEIKVDPKSCDKTHTCPPCPEPKSCDTPPPCPRCPAPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQIDNO34IGKTISKKAKSEQIDNO35GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerSEQIDNO36GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyAlaSerSEQIDNO37AGAGAGACATGTGGCGACATCCAGATGACCCAGTCSEQIDNO38GGAGCCACCCCCACCGGACCCGCCACCGCCTTTGATTTCCACCTTGGTCCSEQIDNO39GGGTCCGGTGGGGGTGGCTCCGGGGGCGGTGGCTCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCSEQIDNO40AGASAGGTCGACTGAGGAGACGGTTGACCAGGACSEQIDNO41AGAGAGACATGTGGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCGGAGCCACCCCCACCGGACCCGCCACCGCCTGAGGAGACGGTGACCAGGACSEQIDNO43GGGTCCGGTGGGGGTGGCTCCGGGGGCGGTGGCTCCGACATCCAGATGACCCAGTCSEQIDNO44AGAGAGGTCGACTTTGATTTCCACCTTGGTCCSEQIDNO45ESKYGPPSEQIDNO46CPSCPSEQIDNO47APEFLGGPSEQIDNO48ESKYGPPCPSCPEPKSCDTPPPCPRCPAPSEQIDNO49CPEPKSCDTPPPCPR權(quán)利要求1.組合物，其包含含有至少四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和至少兩條多肽鏈的多肽二聚體，其中所述至少兩條多肽鏈包含至少一個(gè)重鏈部分和合成連接肽，其中超過約50％的二聚體包含經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接的多肽鏈。2.權(quán)利要求1的組合物，其中超過約90％的二聚體經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接。3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述多肽鏈的至少一條包含經(jīng)由所述連接肽與VL，VH或CH1結(jié)構(gòu)域連接的CH3結(jié)構(gòu)域。4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述多肽鏈缺乏所有或部分CH2結(jié)構(gòu)域。5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述二聚體經(jīng)由兩個(gè)或更多個(gè)鏈間二硫鍵連接。6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述重鏈部分源自選自IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4組成的組的抗體同種型。7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述重鏈部分包含源自選自γ1鉸鏈，γ2鉸鏈，γ3鉸鏈和γ4鉸鏈組成的組的鉸鏈區(qū)的氨基酸序列。8.權(quán)利要求1的組合物，其中所述分子是雙特異性的。9.權(quán)利要求1的組合物，其中所述分子包含至少一個(gè)特異于可溶配體的結(jié)合位點(diǎn)。10.權(quán)利要求1的組合物，其中所述分子包含至少一個(gè)特異于細(xì)胞表面分子的結(jié)合位點(diǎn)。11.權(quán)利要求1的組合物，其中所述分子包含兩個(gè)特異于腫瘤細(xì)胞抗原的結(jié)合位點(diǎn)以及兩個(gè)特異于前體藥物的結(jié)合位點(diǎn)。12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述特異于前體藥物的結(jié)合位點(diǎn)是催化性的。13.權(quán)利要求1的組合物，其中所述合成連接肽包含位于Kabat編號(hào)系統(tǒng)的位置243的脯氨酸殘基。14.權(quán)利要求13的組合物，其中所述合成連接肽還包括位于Kabat編號(hào)系統(tǒng)的位置244的丙氨酸殘基以及位于位置245的脯氨酸殘基。15.權(quán)利要求1的組合物，其中所述重鏈部分包含嵌合鉸鏈。16.權(quán)利要求1的組合物，其中所述合成連接肽包含至少部分IgG1鉸鏈結(jié)構(gòu)域，至少部分IgG3鉸鏈結(jié)構(gòu)域。17.權(quán)利要求1的組合物，其中所述連接肽包含選自SEQIDNO8-15，和48組成的組的氨基酸序列。18.治療可從利用抗原結(jié)合分子的療法獲益的受試者的方法，包括將權(quán)利要求1的組合物給予所述受試者，使得治療發(fā)生。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述受試者患有癌癥。20.權(quán)利要求18的方法，其中所述受試者患有淋巴瘤。21.權(quán)利要求18的方法，其中所述受試者患有自身免疫疾病或病癥。22.權(quán)利要求18的方法，其中所述受試者患有炎性疾病或病癥。23.核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求1的多肽鏈的核苷酸序列。24.權(quán)利要求1的組合物，其中所述多肽二聚體包含四條多肽鏈，且其中的兩條多肽鏈包含至少一個(gè)重鏈部分以及合成連接肽。25.核酸分子，包含圖8B所示的核苷酸序列(SEQIDNO17)。26.核酸分子，包含圖8C所示的核苷酸序列(SEQIDNO18)。27.核酸分子，包含圖10B所示的核苷酸序列(SEQIDNO23)。28.核酸分子，包含圖12A所示的核苷酸序列(SEQIDNO26)。29.核酸分子，包含圖12B所示的核苷酸序列(SEQIDNO27)。30.核酸分子，包含圖14所示的核苷酸序列(SEQIDNO30)。31.核酸分子，包含圖15所示的核苷酸序列(SEQIDNO31)。32.權(quán)利要求24-30之一的核酸分子，其是載體。33.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求32的載體。34.結(jié)合分子，其包含圖9B的氨基酸序列(SEQIDNO20)。35.結(jié)合分子，其包含圖9C的氨基酸序列(SEQIDNO21)。36.結(jié)合分子，其包含圖11B的氨基酸序列(SEQIDNO25)。37.結(jié)合分子，其包含圖13A的氨基酸序列(SEQIDNO28)。38.結(jié)合分子，其包含圖13B的氨基酸序列(SEQIDNO29)。39.結(jié)合分子，其包含圖16的氨基酸序列(SEQIDNO32)。40.結(jié)合分子，其包含圖17的氨基酸序列(SEQIDNO33)。41.權(quán)利要求1的組合物，其中所述結(jié)合位點(diǎn)獨(dú)立選自抗原結(jié)合位點(diǎn)，受體的配體結(jié)合部分，或配體的受體結(jié)合部分組成的組。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述多肽鏈具有至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其源自選自以下抗體組成的組的抗體2B8，Lym1，Lym2，LL2，Her2，B1，MB1，BH3，B4，B72.3，CC49，5E8，B3F6，和5E10。43.權(quán)利要求1的組合物，其中所述多肽二聚體是四價(jià)微型抗體分子。44.權(quán)利要求1的組合物，其中所述多肽二聚體是四價(jià)結(jié)構(gòu)域缺失的抗體分子。45.權(quán)利要求1的組合物，其中所述多肽二聚體是二價(jià)抗體。46.包含微型抗體分子的組合物，所述微型抗體分子包含兩條多肽鏈，其中所述多肽鏈包含重鏈部分和合成連接肽，其中所述多肽鏈缺乏所有或部分CH2結(jié)構(gòu)域，且其中超過約50％的微型抗體分子以其中的多肽鏈之一經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接的形式存在。47.權(quán)利要求46的組合物，其中超過約90％的二聚體經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接。48.權(quán)利要求46的組合物，其中至少一條多肽鏈包含經(jīng)由連接肽基因融合于VL，VH或CH1結(jié)構(gòu)域的CH3結(jié)構(gòu)域。49.權(quán)利要求46的組合物，其中所述多肽鏈缺乏整個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域。50.權(quán)利要求46的組合物，其中所述二聚體經(jīng)由兩個(gè)或多個(gè)鏈間二硫鍵連接。51.權(quán)利要求46的組合物，其中所述重鏈部分源自選自IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4組成的組的抗體同種型。52.權(quán)利要求46的組合物，其中所述重鏈部分包含源自選自γ1鉸鏈，γ2鉸鏈，γ3鉸鏈，和γ4鉸鏈組成的組的鉸鏈區(qū)的氨基酸序列。53.權(quán)利要求46的組合物，其中所述結(jié)合位點(diǎn)獨(dú)立選自抗原結(jié)合位點(diǎn)，受體的配體結(jié)合部分，和配體的受體結(jié)合部分組成的組。54.權(quán)利要求46的組合物，其中所述分子是雙特異性的。55.權(quán)利要求46的組合物，其中所述連接肽包含位于Kabat編號(hào)系統(tǒng)的位置243的脯氨酸殘基。56.權(quán)利要求46的組合物，其中所述合成連接肽包含嵌合鉸鏈。57.權(quán)利要求46的組合物，其中所述合成連接肽包含至少部分IgG1鉸鏈結(jié)構(gòu)域，至少部分IgG3鉸鏈結(jié)構(gòu)域。58.治療可從利用抗原結(jié)合分子的療法獲益的受試者的方法，包括給予所述受試者權(quán)利要求45的組合物，使得治療出現(xiàn)。59.核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求46所述多肽鏈的核苷酸序列。60.包含多肽二聚體的組合物，其中所述多肽二聚體具有至少四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和至少兩條多肽鏈，其中所述至少兩條多肽鏈包含至少一個(gè)重鏈部分并缺乏所有或部分CH2結(jié)構(gòu)域，且其中超過約50％的多肽二聚體包含經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接的多肽鏈。全文摘要本發(fā)明描述了從包含兩種類型的多肽二聚體的混合物分離或優(yōu)選合成經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接的二聚體與不經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接的二聚體的方法。這些形式可利用疏水反應(yīng)層析相互分離。此外，本發(fā)明涉及導(dǎo)致經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接或不經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接的二聚體的優(yōu)先生物合成的連接肽。本發(fā)明還涉及組合物，其中大部分二聚體經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接或不經(jīng)由至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接。本發(fā)明還涉及新的結(jié)合分子，例如，其包含本發(fā)明的連接肽。文檔編號(hào)C12N15/62GK1842538SQ200480024454公開日2006年10月4日申請(qǐng)日期2004年6月28日優(yōu)先權(quán)日2003年6月27日發(fā)明者斯科特·格拉澤,米切爾·雷夫,楊祖宏,吳秀峰,保羅·欽申請(qǐng)人:比奧根艾迪克Ma公司