專利名稱：尖刺擬菱形藻的檢測(cè)探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組藻類檢測(cè)的寡核苷酸探針，具體是針對(duì)尖刺擬菱形藻定性與定量檢測(cè)的特異性探針。屬于核酸檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
尖刺擬菱形藻(Pseudo-nitzschia pungens)是一種廣溫性近岸種類，我國沿海均有分布，是主要的赤潮生物之一，在我國東海區(qū)，有多次形成有毒赤潮的紀(jì)錄，給海洋漁業(yè)和海水養(yǎng)殖造成一定的影響。因此，及時(shí)、準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)海洋環(huán)境中尖刺擬菱形藻的種群動(dòng)態(tài)，隨時(shí)了解其在海洋中的數(shù)量變化具有重要意義。傳統(tǒng)的利用光學(xué)顯微鏡直接觀察和計(jì)數(shù)的鑒別方法，過程煩瑣、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，并需要有經(jīng)驗(yàn)的分類專家參與其中。當(dāng)樣品量多，生物多樣性豐富，監(jiān)測(cè)范圍廣時(shí)工作量極大，因此主要用于藻的定性和分離，而不適用于藻的定量與大范圍監(jiān)測(cè)研究。所以，發(fā)展用于快速、準(zhǔn)確檢測(cè)尖刺擬菱形藻的新方法和新技術(shù)極具現(xiàn)實(shí)意義。但是，目前國際國內(nèi)關(guān)于這方面的研究進(jìn)展不大，尚未形成非常有效的對(duì)該藻進(jìn)行定性和定量檢測(cè)的成熟技術(shù)。由于rRNA被認(rèn)為是與藻類的系統(tǒng)進(jìn)化密切相關(guān)的序列，而且真核生物細(xì)胞中rRNA含量非常高，可以達(dá)到106～107個(gè)拷貝，rRNA是夾心雜交的很好的靶點(diǎn)。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，Christopher A.Scholin等在《利用rRNA在全細(xì)胞和“三明治”雜交中識(shí)別南方菱形藻》(美國《藻類學(xué)雜志》，1996，35(3)，190～197)一文中將提取的RNA或者藻細(xì)胞裂解液在一定條件下與結(jié)合在96孔板上的寡核苷酸探針雜交后，再用一標(biāo)記的信號(hào)探針與之雜交，最后進(jìn)行酶標(biāo)抗體顯色反應(yīng)，取得了較滿意的結(jié)果。該技術(shù)現(xiàn)在海洋藻類的監(jiān)測(cè)中已經(jīng)有所應(yīng)用。但到目前為止，應(yīng)用該技術(shù)能夠檢測(cè)的微藻只限于有限的幾種(其中包括了尖刺擬菱形藻)。其主要缺點(diǎn)是一，因捕獲探針的長度僅10～30bp，因此能夠有效區(qū)別親緣關(guān)系較近的微藻的捕獲探針數(shù)量極少；二，在整個(gè)檢測(cè)過程中都需要防止RNA降解，然而洗滌、抗體反應(yīng)等各步驟極易造成RNA降解，因此操作難度大、檢測(cè)結(jié)果波動(dòng)性大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一組針對(duì)尖刺擬菱形藻rRNA的特異性的尖刺擬菱形藻的檢測(cè)探針，依據(jù)這組探針對(duì)該藻進(jìn)行S1酶保護(hù)分析和夾心雜交檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)該藻的快速定性和定量。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明用于對(duì)該藻進(jìn)行S1酶保護(hù)分析和夾心雜交檢測(cè)，具體包括三條相互關(guān)聯(lián)的寡核苷酸探針S1酶保護(hù)分析探針、抓捕探針、信號(hào)探針或者連接探針，所述的S1酶保護(hù)分析探針，是指與尖刺擬菱形藻rRNA互補(bǔ)而且用于S1酶保護(hù)分析方法的寡核苷酸探針，所述的抓捕探針，是指與S1酶保護(hù)分析探針的一端結(jié)合，這一端通常為3’端，另外一端標(biāo)記有生物素，從而將經(jīng)過S1酶酶切處理和變性處理后保留在溶液中的S1酶保護(hù)分析探針捕獲下來的探針，所述的信號(hào)探針或者連接探針能夠在抓捕探針捕獲S1酶保護(hù)分析探針后，結(jié)合于S1酶保護(hù)分析探針的另一端的的探針為連接探針，同時(shí)該探針標(biāo)記有可檢測(cè)信號(hào)，或者在一端具有信號(hào)探針結(jié)合區(qū)，能夠與通用信號(hào)探針互補(bǔ)。
所述的S1酶保護(hù)分析探針，在進(jìn)行生物信息學(xué)比對(duì)分析時(shí)，僅與僅與尖刺擬菱形藻核糖體大亞基360～430區(qū)域核苷酸互補(bǔ)，而與其它藻核糖體RNA無同源性，長度為59bp，在一定的條件下可特異性結(jié)合于尖刺擬菱形藻的rRNA上，序列為5’-CCACAAGTGGCCAGGGAAATATGAACAAACAAACACTGGTTTCCTTCGCTTCCGTTTCA。通過測(cè)定尖刺擬菱形藻的rRNA序列，進(jìn)行多序列比較，尋找尖刺擬菱形藻的特征序列，作為該藻的rRNA特異區(qū)域，然后根據(jù)該rRNA特異區(qū)域序列(特征序列)設(shè)計(jì)S1酶保護(hù)分析探針。尋找生物特異性區(qū)域的方法以及根據(jù)特異區(qū)域設(shè)計(jì)探針都采用現(xiàn)有技術(shù)。已有的實(shí)驗(yàn)表明，所述的尖刺擬菱形藻rRNA之間若存在2～3個(gè)以上核苷酸的連續(xù)錯(cuò)配或者缺失可作為特異探針設(shè)計(jì)的靶序列。
抓捕探針特異性結(jié)合于S1酶保護(hù)分析探針一端，長度為22bp，序列特征為5’-TGAAACGGAAGCGAAGGAAACC，在5’端標(biāo)記有生物素、磷酸基團(tuán)，或者氨基基團(tuán)以及其他任何可用來標(biāo)記的用于固定于固體基質(zhì)的標(biāo)記。
信號(hào)探針或者連接探針在另一端具有通用信號(hào)探針互補(bǔ)區(qū)，與通用信號(hào)探針互補(bǔ)結(jié)合，序列為5’-CATATTTCCCTGGCCACTTGTGG；該序列上標(biāo)記各種檢測(cè)的信號(hào)，包括熒光素、地高辛、生物素用于信號(hào)檢測(cè)的序列，或與通用的信號(hào)探針互補(bǔ)的一段序列。
通用信號(hào)探針與連接探針的一端(不同于與S1酶保護(hù)分析探針互補(bǔ)結(jié)合的一端)互補(bǔ)。常用的標(biāo)記物包括(但并不限于)地高辛、熒光素、生物素或者辣根過氧化物酶等。
簡(jiǎn)而言之，本發(fā)明是針對(duì)尖刺擬菱形藻的rRNA特定區(qū)域合成以S1酶保護(hù)分析探針為核心的一組探針，聯(lián)合S1酶保護(hù)分析和夾心雜交技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)尖刺擬菱形藻rRNA的定性定量檢測(cè)。
本發(fā)明的這組探針可用于以S1酶保護(hù)分析和夾心雜交技術(shù)檢測(cè)樣品中是否存在尖刺擬菱形藻及其數(shù)量，所述的檢測(cè)過程包括下列步驟(a)待檢測(cè)樣品和S1酶保護(hù)分析探針的混合在該步驟中，可以將經(jīng)裂解處理已釋放出rRNA的待檢測(cè)的微藻樣品與S1酶保護(hù)分析探針混合。也可以將待檢測(cè)的微藻樣品與S1酶保護(hù)分析探針直接混合，然后再進(jìn)行裂解處理，從而釋放rRNA。一旦釋放出的rRNA包含對(duì)應(yīng)于S1酶保護(hù)分析探針的靶序列，經(jīng)過雜交，則會(huì)與S1酶保護(hù)分析探針形成雙鏈。
(b)S1酶處理當(dāng)S1酶保護(hù)分析探針與待檢測(cè)生物的rRNA雜交后，用適當(dāng)濃度(通常為0.5U～2U/μl，較佳地為1U/μl)的S1酶消化過量游離的探針；當(dāng)該探針與其他非目標(biāo)rRNA反應(yīng)時(shí)，由于雜交體存在切口或小缺口，S1酶亦能將該探針切斷；最終保留下與完全匹配的S1酶保護(hù)分析探針和尖刺擬菱形藻的rRNA形成的DNA/RNA雙鏈，而且該雙鏈的量代表了樣本中相應(yīng)的rRNA的量。
(c)DNA-RNA雜合體的變性將DNA/RNA雙鏈雜合體變性為DNA單鏈(即S1酶保護(hù)分析探針)和RNA單鏈。合適的變性方法沒有特別限制，可以用本領(lǐng)域常用的各種變性方法，例如熱變性等。例如，加入中和溶液后加熱，使S1酶保護(hù)分析探針和目標(biāo)生物的rRNA形成的雜合體變性，從而釋放出保留下來的S1酶保護(hù)分析探針。由于RNA不穩(wěn)定，解鏈形成的RNA單鏈易被內(nèi)源或外源的RNA酶降解。
(d)捕獲S1酶保護(hù)分析探針將保留有S1酶保護(hù)分析探針的溶液與預(yù)先固定于固相載體上的抓捕探針雜交，將S1酶保護(hù)分析探針特異地抓捕在固相載體上，并洗滌除去非特異的結(jié)合。
(e)結(jié)合帶可檢測(cè)信號(hào)的探針用連接探針與被捕獲的S1酶保護(hù)分析探針雜交，并洗滌除去非特異的結(jié)合，再用信號(hào)探針與連接探針結(jié)合，并洗滌除去非特異的結(jié)合。
(f)信號(hào)檢測(cè)可用本領(lǐng)域常規(guī)方法對(duì)可檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。例如信號(hào)探針上可以標(biāo)記上熒光信號(hào)，這樣通過激發(fā)熒光來讀取數(shù)據(jù)；也可以在信號(hào)探針上標(biāo)記上地高辛、熒光素或者生物素等，然后通過辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體或者親和素與之反應(yīng)；最后加入發(fā)光底物或者顯色底物(TMB或者NPP等)，通過探測(cè)發(fā)光強(qiáng)弱或者吸光度來判讀信號(hào)。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)探針適用性好夾心雜交特異識(shí)別的關(guān)鍵是抓捕探針的特異性，一般情況抓捕探針約長20～30核苷酸，該探針要具有特異性，必須與其他非目標(biāo)生物的rRNA分子要有較大的差異，盡管不同生物的rRNA在進(jìn)化上會(huì)有差異，但在找到并成功驗(yàn)證親緣關(guān)系較近的生物之間的特異性探針并不是一件容易的事，這可能也是夾心雜交技術(shù)發(fā)展到現(xiàn)在只有找到很少量抓捕探針的原因之一。本發(fā)明中涉及的S1酶保護(hù)分析探針，盡管長度在60個(gè)核苷酸左右，但并不要求探針全長都要有特異性，而只要求探針的中間區(qū)域有幾個(gè)核苷酸的差異即可，這大大方便了特異探針的尋找和實(shí)現(xiàn)。
(2)穩(wěn)定性高夾心雜交技術(shù)成功執(zhí)行的關(guān)鍵之一在于保證RNA分子在整個(gè)過程不被降解，特別要保證抓捕探針與信號(hào)探針之間的那段目標(biāo)RNA分子(可能在幾十到幾百個(gè)核苷酸之間)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程的完好無損。但由于實(shí)驗(yàn)過程涉及抗原抗體反應(yīng)和多次洗滌步驟，這為RNA酶對(duì)RNA分子降解提供了較多機(jī)會(huì)，因此要保證目標(biāo)RNA分子不被降解有非常大的難度。即使最終能夠?qū)崿F(xiàn)定性分析，定量分析的可信度也大大打了折扣。而本發(fā)明中直接與rRNA分子相關(guān)的過程只有S1酶保護(hù)分析探針與rRNA分子雜交這一步，只要雜交裂解液加入適當(dāng)?shù)腞NA酶抑制劑就能保證雜交時(shí)rRNA分子不被降解或很少被降解，實(shí)驗(yàn)操作的其他步驟都是針對(duì)穩(wěn)定的DNA分子進(jìn)行的，相對(duì)比較容易執(zhí)行。因此本發(fā)明的穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于夾心雜交技術(shù)。


圖1本發(fā)明各種不同的藻示意2顯示對(duì)不同細(xì)胞數(shù)的尖刺擬菱形藻的檢測(cè)曲線示意圖具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖，在具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例應(yīng)用針對(duì)rRNA的S1酶保護(hù)分析和夾心雜交技術(shù)對(duì)尖刺擬菱形藻定性定量檢測(cè)在本實(shí)施例中，將S1酶保護(hù)分析技術(shù)和夾心雜交技術(shù)聯(lián)合用來實(shí)現(xiàn)對(duì)海洋赤潮生物尖刺擬菱形藻(Pseudo-nitzschia pungens)的定性和定量檢測(cè)，步驟如下1.1 尖刺擬菱形藻rRNA特異區(qū)域的尋找和S1酶保護(hù)分析探針的設(shè)計(jì)與合成通過測(cè)定尖刺擬菱形藻核糖體大亞基28S rRNA序列并與其它藻類的rRNA序列進(jìn)行多序列比較，找到其在大亞基rRNA的360～430區(qū)域與其它藻類不同，確定該區(qū)域序列為特征序列；根據(jù)特征序列設(shè)計(jì)和合成S1酶保護(hù)分析探針PUN_S15’-CCACAAGTGGCCAGGGAAATATGAACAAACAAACACTGGTTTCCTTCGCTTCCGTTTCA(SEQ IDNO.1)。
根據(jù)S1酶保護(hù)分析探針設(shè)計(jì)和合成夾心雜交所需的其他探針抓捕探針PUN_CAPT5’-Biotin-TGAAACGGAAGCGAAGGAAACC(SEQ ID NO.2)，與S1酶保護(hù)分析探針的3’端互補(bǔ)，在5’端有生物素(Biotin)標(biāo)記；連接探針PUN_LINK5’-CATATTTCCCTGGCCACTTGTGGTAACAACTCACCTGCCGAATGAACTAGCCCTG(SEQ IDNO.3)，在5’端的23個(gè)核苷酸與S1酶保護(hù)分析探針的5’端互補(bǔ)，在3’端的32個(gè)核苷酸與通用信號(hào)探針的5’端互補(bǔ)。
1.2 抓捕探針固定于酶標(biāo)板抓捕探針的固定方法在預(yù)先包被有親和素的酶標(biāo)板(Pierce公司)的每一孔中加入100μl溶解于CBS(pH7.2)的40nM抓捕探針，37℃靜置2小時(shí)。用PBS洗三次備用。
1.3 S1酶保護(hù)分析將用f2培養(yǎng)基培養(yǎng)的海藻樣品計(jì)數(shù)后，離心收集于1.5ml塑料管中，棄去上清，加入濃度為50nM S1酶保護(hù)分析探針的1000μl裂解液(0.8％SDS，1.2M Urea，20％Formamide，0.3M NaCl，50mM Tris，pH7.0)。
進(jìn)行尖刺擬菱形藻的特異性驗(yàn)證時(shí)，將塔瑪亞歷山大藻、角毛藻、中肋骨條藻、赤潮異彎藻、共生藻、錐狀斯氏藻、棕囊藻、紅色共生藻、海洋原甲藻、微型原甲藻等各約106個(gè)細(xì)胞分別進(jìn)行上述處理。
進(jìn)行尖刺擬菱形藻的檢測(cè)曲線分析時(shí)，將過濾收集到的尖刺擬菱形藻樣品用含有S1酶保護(hù)分析探針的裂解液10倍逐級(jí)稀釋6次共獲得7個(gè)樣品。
對(duì)于海藻樣品和S1酶保護(hù)分析探針的混合物，超聲波處理兩分鐘，將混合溶液在95℃放置10分鐘，然后70℃雜交2小時(shí)。自然冷卻后加入500μl含有800US1酶(Promega公司)的S1酶解緩沖液(50mM ZnSO4，500mM NaAc，50mM NaClpH4.5)，在50℃酶切處理30分鐘。
1.4 DNA-RNA雜合體的變性加入250μl變性緩沖液(1.5M NaOH，300mM EDTA)，95℃處理10分鐘，自然冷卻后用于夾心雜交。此時(shí)DNA-RNA雜合體變性形成單鏈DNA(即曾結(jié)合于靶序列的S1酶保護(hù)分析探針)和單鏈RNA。與此同時(shí)，單鏈RNA被降解，因此溶液中僅含曾結(jié)合于靶序列的S1酶保護(hù)分析探針。
1.5 夾心雜交抓捕將100μl上述變性后的反應(yīng)混合液分別移入到預(yù)固定有抓捕探針的酶標(biāo)板微孔中，50℃雜交1小時(shí)，用含有0.1％SDS的0.1×SSC洗滌液洗6次。
夾心雜交每孔加入含有100μl 5nM連接探針的雜交緩沖液(2×SSC，0.1％SDS)，于50℃雜交30分鐘，用含有0.1％SDS的0.1×SSC洗滌液洗6次；每孔加入含有100ul 5nM信號(hào)探針的雜交緩沖液(2×SSC，0.5％SDS)于50℃雜交30分鐘，用含有0.1％SDS的0.1×SSC洗滌液洗6次。
1.6 信號(hào)檢測(cè)酶標(biāo)板用磷酸緩沖液(PBS)洗6次；每孔加入含有標(biāo)記了辣根過氧化物酶的抗熒光素抗體(購自Roche公司)，37℃孵育30分鐘，然后用PBS洗6次；每孔加入TMB(購自Pierce公司)顯色液100μl，37℃處理15分鐘后，每孔加入50μl2M硫酸終止反應(yīng)。將酶標(biāo)板置于讀板機(jī)上于450nm測(cè)定光吸收值。
1.7 結(jié)果檢測(cè)結(jié)果如圖1和圖2所示。
圖1顯示了用針對(duì)尖刺擬菱形藻的探針探測(cè)各種不同的藻的檢測(cè)結(jié)果，證明了本發(fā)明方法具有極高的可行性和特異性。
對(duì)數(shù)據(jù)用常規(guī)統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行擬合，獲得如下關(guān)系y＝0.0002x+0.0867；R2＝0.99；x為樣品中尖刺擬菱形藻的細(xì)胞數(shù)，y為實(shí)際測(cè)定的OD.450，R2為相關(guān)系數(shù)。下表列出了用本實(shí)施例方法測(cè)定的尖刺擬菱形藻樣品數(shù)量與顯微計(jì)數(shù)結(jié)果的比較

本發(fā)明涉及的序列及記號(hào)分別如下(1)SEQ ID NO.1的信息<110>上海交通大學(xué)<120>尖刺擬菱形藻S1酶保護(hù)分析探針<160>1<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>59<212>DNA<213>人工序列<400>1CCACAAGTGGCCAGGGAAATATGAACAAACAAACACTGGTTTCCTTCGCTTCCGTTTCA(2)SEQ ID NO.2的信息<110>上海交通大學(xué)<120>尖刺擬菱形藻抓捕探針<160>1<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1TGAAACGGAAGCGAAGGAAACC(3)SEQ ID NO.3的信息<110>上海交通大學(xué)<120>尖刺擬菱形藻信號(hào)探針(連接探針)<160>1<170>PatentIn Version 2.1<210>1
<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>1CATATTTCCCTGGCCACTTGTGG
權(quán)利要求
1.一種尖刺擬菱形藻的檢測(cè)探針，其特征在于，用于對(duì)該藻進(jìn)行S1酶保護(hù)分析和夾心雜交檢測(cè)，具體包括三條相互關(guān)聯(lián)的寡核苷酸探針S1酶保護(hù)分析探針、抓捕探針、信號(hào)探針或者連接探針，所述的S1酶保護(hù)分析探針，是指與尖刺擬菱形藻rRNA互補(bǔ)而且用于S1酶保護(hù)分析方法的寡核苷酸探針，所述的抓捕探針，是指與S1酶保護(hù)分析探針的一端結(jié)合，這一端通常為3’端，另外一端標(biāo)記有生物素，從而將經(jīng)過S1酶酶切處理和變性處理后保留在溶液中的S1酶保護(hù)分析探針捕獲下來的探針，所述的信號(hào)探針或者連接探針能夠在抓捕探針捕獲S1酶保護(hù)分析探針后，結(jié)合于S1酶保護(hù)分析探針的另一端的的探針為連接探針，同時(shí)該探針標(biāo)記有可檢測(cè)信號(hào)，或者在一端具有信號(hào)探針結(jié)合區(qū)，能夠與通用信號(hào)探針互補(bǔ)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖刺擬菱形藻的檢測(cè)探針，其特征是，所述的尖刺擬菱形藻rRNA之間若存在2～3個(gè)以上核苷酸的連續(xù)錯(cuò)配或者缺失可作為特異探針設(shè)計(jì)的靶序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖刺擬菱形藻的檢測(cè)探針，其特征是，所述的S1酶保護(hù)分析探針，在進(jìn)行生物信息學(xué)比對(duì)分析時(shí)，僅與僅與尖刺擬菱形藻核糖體大亞基360～430區(qū)域核苷酸互補(bǔ)，而與其它藻核糖體RNA無同源性，長度為59bp，在一定的條件下可特異性結(jié)合于尖刺擬菱形藻的rRNA上，序列為5’-CCACAAGTGGCCAGGGAAATATGAACAAACAAACACTGGTTTCCTTCGCTTCCGTTTCA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖刺擬菱形藻的檢測(cè)探針，其特征是，所述的抓捕探針特異性結(jié)合于S1酶保護(hù)分析探針一端，長度為22bp，序列特征為5’-TGAAACGGAAGCGAAGGAAACC，在5’端標(biāo)記有生物素、磷酸基團(tuán)，或者氨基基團(tuán)以及其他任何可用來標(biāo)記的用于固定于固體基質(zhì)的標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖刺擬菱形藻的檢測(cè)探針，其特征是，所述的信號(hào)探針或者連接探針在另一端具有通用信號(hào)探針互補(bǔ)區(qū)，與通用信號(hào)探針互補(bǔ)結(jié)合，序列為5’-CATATTTCCCTGGCCACTTGTGG；該序列上標(biāo)記各種檢測(cè)的信號(hào)，包括熒光素、地高辛、生物素用于信號(hào)檢測(cè)的序列，或與通用的信號(hào)探針互補(bǔ)的一段序列。
全文摘要
一種尖刺擬菱形藻的檢測(cè)探針，屬于核酸檢測(cè)領(lǐng)域。用于對(duì)該藻進(jìn)行S1酶保護(hù)分析和夾心雜交檢測(cè)，具體包括三條相互關(guān)聯(lián)的寡核苷酸探針S1酶保護(hù)分析探針，在進(jìn)行生物信息學(xué)比對(duì)分析時(shí)，僅與尖刺擬菱形藻核糖體小亞基360～430區(qū)域核苷酸互補(bǔ)，而與其它藻核糖體RNA無同源性，長度為59bp，在一定的條件下可特異性結(jié)合于尖刺擬菱形藻的rRNA上，序列為5’－CCACAAGTGGCCAGGGAAATATGAACAAACAAACACTGGTTTCCTTCGCTTCCGTTTCA。本發(fā)明探針適用性好，大大方便了特異探針的尋找和實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于夾心雜交技術(shù)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1661099SQ20041009309
公開日2005年8月31日 申請(qǐng)日期2004年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月16日
發(fā)明者李榮秀, 于志剛, 蔡青松, 米鐵柱, 甄毓 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)