專利名稱：核酸擴(kuò)增反應(yīng)器及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在利用聚合酶鏈反應(yīng)的核酸擴(kuò)增中所使用的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器及其制造方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，有關(guān)基因信息的技術(shù)正在不斷被開發(fā)出來(lái)。特別是通過(guò)對(duì)醫(yī)療領(lǐng)域中的有關(guān)疾病的基因進(jìn)行分析，可以進(jìn)行分子水平的疾病治療。另外，可以通過(guò)基因診斷進(jìn)行針對(duì)患者個(gè)人的量體裁衣式治療。而且，在制藥領(lǐng)域中使用基因信息來(lái)特定抗體或激素等蛋白質(zhì)分子而作為藥品利用。
另外，在農(nóng)業(yè)或食品等領(lǐng)域中制造出許多利用基因信息的產(chǎn)品。
在有關(guān)這種基因信息的技術(shù)中，作為最重要的方法之一有核酸的擴(kuò)增反應(yīng)。其中，聚合酶鏈反應(yīng)是只在基因的某個(gè)特定部分進(jìn)行大量擴(kuò)增的技術(shù)，除了分子生物學(xué)等研究用途之外，還被廣泛應(yīng)用到醫(yī)療微生物學(xué)、遺傳疾病的臨床診斷、法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。特別是臨床基因診斷技術(shù)，有望可以進(jìn)行更快速的分析，即使在聚合酶鏈反應(yīng)法中也要求研發(fā)高速化技術(shù)。
這種聚合酶鏈反應(yīng)法包括下述的三道工序。
(1)熱變性工序是把雙鏈DNA解離成單鏈的工序。
(2)退火工序是接合引物的工序。
(3)延伸反應(yīng)工序是通過(guò)聚合酶延長(zhǎng)DNA的工序。
通常情況下，把上述3個(gè)階段的工序作為1個(gè)循環(huán)，重復(fù)實(shí)施這些工序30～35個(gè)循環(huán)。特開昭62-000281號(hào)公報(bào)中公開這些工序的處理?xiàng)l件分別是(1)熱變性工序94℃×1分鐘，(2)退火工序50～60℃×1分鐘，(3)延伸反應(yīng)工序72℃×1～5分鐘。
另外，特開2002-207031號(hào)公報(bào)提出作為用于進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)的容器或芯片使用下述的構(gòu)件。例如，在上側(cè)基材上形成用于配置毛細(xì)管的溝槽，在該上側(cè)基材和下側(cè)基材之間重疊放置毛細(xì)管并進(jìn)行接合，由此可以把已有想要擴(kuò)增的核酸的樣品放置到毛細(xì)管中，通過(guò)對(duì)該毛細(xì)管進(jìn)行溫度控制，可以使樣品中的核酸擴(kuò)增。
而且，對(duì)可以使上述聚合酶鏈反應(yīng)高速化的裝置的研發(fā)也在進(jìn)行中。例如，羅士(Loche)公司制的輕循環(huán)控制裝置(LightCycler)使用熱風(fēng)作為熱源，通過(guò)向玻璃毛細(xì)管制的容器中提供樣品而嘗試高速化。另外，Cepheid公司制的智能循環(huán)控制裝置(SmartCycler)(R)使用管壁較薄的專用聚丙烯制試管，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)的高速化。
但是，在聚合酶鏈反應(yīng)中，40℃左右的溫度變化也需要重復(fù)30次以上。在以往的進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)的裝置中，在向聚丙烯制試管中提供樣品的同時(shí)使用鋁塊使溫度升高，為了完成聚合酶鏈反應(yīng)需要數(shù)小時(shí)以上的處理時(shí)間。
另外，特開2002-207031號(hào)公報(bào)所公開的方法是通過(guò)把毛細(xì)管封閉在上下基材內(nèi)而有望在某種程度上改善熱傳導(dǎo)性。但是，當(dāng)單獨(dú)構(gòu)成毛細(xì)管、上側(cè)基材、下側(cè)基材之后，采用粘結(jié)技術(shù)以接合它們。此時(shí)，對(duì)于上下基材和毛細(xì)管之間的熱傳導(dǎo)性，形成粘結(jié)材料等構(gòu)成熱阻擋層，有可能妨礙迅速的溫度上升、下降。
另外，可以通過(guò)使用把熱風(fēng)作為熱源的裝置而實(shí)現(xiàn)高速化，但即使這樣仍需要數(shù)十分鐘以上的處理時(shí)間。
而且，以前的技術(shù)都使用毛細(xì)管等專用容器來(lái)謀求高速化。因此，例如用于從血液中抽取DNA的聚合酶鏈反應(yīng)的前處理必須成為分批處理，缺點(diǎn)是樣品的處理非常繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器是具備基板、形成在該基板內(nèi)的腔室、用于密封該腔室的蓋板、形成在該蓋板上的樣品注入孔的容器，其特征在于，在腔室內(nèi)設(shè)置連接在蓋板或基板上的柱狀結(jié)構(gòu)體。當(dāng)從構(gòu)成核酸擴(kuò)增反應(yīng)器的蓋板以及基板中任意一方或者它們兩者進(jìn)行加熱、冷卻時(shí)，因?yàn)榫哂兄鶢顦?gòu)造體而促進(jìn)熱傳遞，可以高速改變腔室內(nèi)含有核酸的溶液的溫度。其結(jié)果是能確實(shí)可靠地進(jìn)行高速聚合酶鏈反應(yīng)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器可以得到實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器是腔室的形狀為彎曲形或漩渦形的反應(yīng)器。通過(guò)腔室的形狀為這些形狀之一，相對(duì)于腔室的體積，腔室的表面積增大，所以可以有效進(jìn)行和基板的熱交換。
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器的制造方法是在腔室內(nèi)設(shè)置與蓋板或基板一體化的柱狀構(gòu)造體的反應(yīng)容器的制造方法，是采用陽(yáng)極接合法或直接接合法中的任意一種方法進(jìn)行蓋板和基板之間的接合的制造方法。該制造方法的特征在于，采用陽(yáng)極接合法或直接接合法中的任意一種方法進(jìn)行蓋板和基板之間的接合，通過(guò)在蓋板和基板之間的接合面上不存在這些材料之外的物質(zhì)的接合方法而進(jìn)行接合，可以實(shí)現(xiàn)熱傳導(dǎo)性良好、無(wú)需擔(dān)心在核酸擴(kuò)增反應(yīng)器中使容器內(nèi)剩余的成分會(huì)溶出的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器。
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器的制造方法的特征在于，是腔室的形狀為彎曲形或漩渦形的反應(yīng)器的制造方法。通過(guò)采用陽(yáng)極接合法或直接接合法中的任意一種方法進(jìn)行蓋板和基板之間的接合，通過(guò)在上述蓋板和上述基板之間的接合面上不存在這些材料之外的物質(zhì)的接合方法而進(jìn)行接合。
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器及其制造方法，通過(guò)實(shí)現(xiàn)可以高速加熱、冷卻的結(jié)構(gòu)，可以高精度且高速地對(duì)樣品中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。另外，可以提供樣品處理容易且用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的芯片型核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器及其制造方法。


圖1是表示本發(fā)明的實(shí)施方式1中一例核酸擴(kuò)增反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)的立體圖。
圖2是表示實(shí)施方式1中核酸擴(kuò)增反應(yīng)器分解立體圖。
圖3是表示實(shí)施方式1中其它例核酸擴(kuò)增反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)的主要部分立體圖。
圖4是表示實(shí)施方式1中其它例核酸擴(kuò)增反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)的主要部分立體圖。
圖5是表示本發(fā)明的實(shí)施方式2中一例核酸擴(kuò)增反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)的主要部分立體圖。
圖6是表示實(shí)施方式2中其它例核酸擴(kuò)增反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)的主要部分立體圖。
圖7～圖12是對(duì)實(shí)施方式2中核酸擴(kuò)增反應(yīng)器的制造工序進(jìn)行說(shuō)明的剖面圖。
圖13A、13B、13C、13D是表示實(shí)施方式2的實(shí)驗(yàn)中試用的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器的分解俯視圖。
圖14是表示使用實(shí)施方式2中的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器的聚合酶鏈反應(yīng)的特性比較圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器是用于核酸擴(kuò)增的反應(yīng)器，是具備基板、形成在該基板內(nèi)的腔室、用于密封該腔室的蓋板、形成在該蓋板上的樣品注入孔，且在腔室內(nèi)設(shè)置連接在蓋板或基板上的柱狀結(jié)構(gòu)體的反應(yīng)器。關(guān)于用于利用聚合酶鏈反應(yīng)的核酸擴(kuò)增方法的核酸擴(kuò)增反應(yīng)容器，當(dāng)從蓋板、基板或者它們的兩面進(jìn)行加熱、冷卻時(shí)，熱迅速傳遞至上述柱狀構(gòu)造體，所以可以高速改變腔室內(nèi)含有核酸的溶液的溫度，其結(jié)果是可以實(shí)現(xiàn)能確實(shí)可靠地進(jìn)行高速聚合酶鏈反應(yīng)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器。
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器是柱狀構(gòu)造體的斷面形狀為圓形、橢圓形、彎曲形的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器?？梢酝ㄟ^(guò)選擇這些形狀進(jìn)行有效的熱交換，從而可以實(shí)現(xiàn)能進(jìn)行高速聚合酶鏈反應(yīng)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器。
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器可以具有多個(gè)柱狀構(gòu)造體。通過(guò)具有多個(gè)柱狀構(gòu)造體，使能更有效地進(jìn)行熱交換的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器得到實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器的柱狀構(gòu)造體與蓋板或基板的材料相同，是不存在其接合面的一體化構(gòu)造體反應(yīng)器。作為相同材料而不存在接合面，所以沒(méi)有熱交換的阻擋，所以能更高速地進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器可以得到實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器是基板和柱狀構(gòu)造體直接接合的反應(yīng)器。能進(jìn)行生產(chǎn)率優(yōu)良的高速聚合酶鏈反應(yīng)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器可以得到實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器是蓋和柱狀構(gòu)造體直接接合的反應(yīng)器。能進(jìn)行生產(chǎn)率優(yōu)良的高速聚合酶鏈反應(yīng)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器可以得到實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器是腔室形狀為彎曲形或漩渦形的反應(yīng)器。關(guān)于這些形狀的腔室，可以說(shuō)彎曲形或漩渦形的溝槽的壁自身是柱狀構(gòu)造體。通過(guò)使腔室形狀為彎曲形或漩渦形，相對(duì)于腔室的體積，腔室的表面積增大，從而可以有效地進(jìn)行和基板的熱交換。
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器是用玻璃制造蓋板，基板為硅的反應(yīng)容器。因基板為硅，可以成為具有較高熱傳遞性的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器。另外，通過(guò)用玻璃制造蓋板，可以采用陽(yáng)極接合、直接接合等接合方法與由硅構(gòu)成的基板接合而制造。其結(jié)果使基板和蓋板之間的熱傳遞性變好，在聚合酶鏈反應(yīng)過(guò)程中容器內(nèi)沒(méi)有多余的成分溶出的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器可以較容易地得到實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器的制造方法是在把與蓋板或基板一體化的柱狀構(gòu)造體設(shè)置于腔室內(nèi)的反應(yīng)器的制造中，采用陽(yáng)極接合法或直接接合法中的任意一種方法進(jìn)行蓋板和基板之間的接合的制造方法。通過(guò)蓋板和基板之間的接合面上不存在這些材料之外的物質(zhì)的接合方法進(jìn)行接合，可以實(shí)現(xiàn)熱傳遞性良好并且不用擔(dān)心在核酸擴(kuò)增反應(yīng)器中多余的成分在容器中溶出的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器。
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器的制造方法，是腔室的形狀為彎曲形或渦旋形狀的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器的制造方法，其特征在于，采用陽(yáng)極接合法或直接接合法中的一種方法進(jìn)行蓋板與基板之間的接合。從而可以通過(guò)在基板與蓋板之間的接合面上不存在它們材料之外的材料的接合方法進(jìn)行接合。
(實(shí)施方式1)下面，使用實(shí)施方式1對(duì)本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
圖1和圖2是表示本發(fā)明的實(shí)施方式1中的一例核酸擴(kuò)增反應(yīng)器的構(gòu)造的圖。
本發(fā)明的實(shí)施方式1中的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器具有用于在硅構(gòu)成的基板1中存積樣品液的腔室2，在該腔室2內(nèi)設(shè)置有由硅構(gòu)成的橢圓形柱狀構(gòu)造體6。
在該基板1以及柱狀構(gòu)造體6的上面接合由玻璃等構(gòu)成的蓋板3，從外部遮蔽腔室2。樣品可以通過(guò)設(shè)置在蓋板3上的樣品注入孔4密封于腔室2內(nèi)。這里，對(duì)于基板1和蓋板3的接合不需使用粘合劑，由硅構(gòu)成的基板1和由玻璃構(gòu)成的蓋板3之間通過(guò)分子鍵進(jìn)行接合。
這里，作為基板1和蓋板3的材料，和樣品液不發(fā)生反應(yīng)的材料比較適合。例如，除了硅、玻璃之外，可以使用鍺等半導(dǎo)體，石英，陶瓷，以及鈦酸鋰、鈮酸鋰等單晶體基板。當(dāng)使用這些材料時(shí)，可以使用實(shí)施方式2中說(shuō)明的接合技術(shù)。例如，可以使用作為分子鍵的直接接合或陽(yáng)極接合的接合技術(shù)等。通過(guò)使用這些接合技術(shù)，可以對(duì)本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器進(jìn)行有效加工。
在本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器中，柱狀構(gòu)造體6和基板1使用相同的材料，可以通過(guò)制成一個(gè)構(gòu)造體而減少熱傳遞的阻擋。
而且，蓋板3和基板1通過(guò)分子鍵而直接接合，因不使用粘合劑等異種材料，所以在熱傳遞中幾乎不存在熱阻擋，可以迅速進(jìn)行熱傳遞。
這里，作為柱狀構(gòu)造體6的形狀，除了圖2所示的橢圓形之外，還可以是圓形、彎曲形等形狀。如果有多個(gè)柱狀構(gòu)造體6，則進(jìn)一步增大促進(jìn)熱傳遞的效果。例如，可以形成多個(gè)圖3或圖4所示的圓形柱狀構(gòu)造體7或彎曲形狀的柱狀構(gòu)造體8。通過(guò)形成這些柱狀構(gòu)造體6、7、8，腔室2的容量體積以及壁的表面積發(fā)生改變。特別是當(dāng)這些因素對(duì)核酸的擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生影響時(shí)，除了溫度的上升、特性下降之外，可以通過(guò)使容量體積、壁表面積、柱狀構(gòu)造體6、7、8的個(gè)數(shù)等最優(yōu)化來(lái)控制規(guī)定的性能。
在實(shí)施方式1中，是把這些柱狀構(gòu)造體6、7、8和基板1或蓋板3作為一個(gè)構(gòu)造體進(jìn)行說(shuō)明的。針對(duì)此，可以分開制作這些柱狀構(gòu)造體6、7、8和基板1或蓋板3，然后使用直接接合技術(shù)且使用一體化的方法。通過(guò)這種制造方法，具有與實(shí)施方式1的反應(yīng)器大致相同的熱傳遞性的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器可以得到實(shí)現(xiàn)。
(實(shí)施方式2)使用實(shí)施方式2對(duì)本發(fā)明的其它核酸擴(kuò)增反應(yīng)器進(jìn)行說(shuō)明。
圖5是表示實(shí)施方式2中核酸擴(kuò)增反應(yīng)器的基板9的立體圖。在由硅構(gòu)成的基板9上形成漩渦形狀的腔室10，由此腔室10的隔壁與硅基板9一體化。即，腔室10是基板9或柱狀構(gòu)造體91圍繞而成的形狀。另外，通過(guò)使腔室10形成漩渦形，可以使腔室10集中在基板9內(nèi)狹小的區(qū)域內(nèi)而形成。因此，優(yōu)點(diǎn)是可以在樣品溶液和基板9之間迅速地進(jìn)行熱交換，并設(shè)計(jì)成可具有高均熱性。
圖6是表示在由硅構(gòu)成的基板11上形成彎曲形狀的腔室12的其它例子。即，腔室12的形狀是由基板11或者柱狀構(gòu)造體111圍繞而形成。腔室12為彎曲形狀的優(yōu)點(diǎn)相同于剛才所述的漩渦形狀時(shí)的優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)進(jìn)一步附加而作為彎曲形時(shí)，樣品溶液流向基板11上的一個(gè)方向，所以可以在基板11的端部設(shè)置樣品注入孔(未圖示)。
對(duì)此，當(dāng)為漩渦形狀時(shí)，樣品注入孔位于一端為渦形的中心。關(guān)于腔室形成漩渦形還形成彎曲形，可以根據(jù)樣品或處理方案來(lái)確定。
接著，根據(jù)圖7～圖12對(duì)用于獲得本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器的制造方法進(jìn)行說(shuō)明。
這里，把厚度為500μm的硅單晶板用作基板13，使用制作用于聚合酶鏈反應(yīng)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器的例子進(jìn)行說(shuō)明。
首先，準(zhǔn)備表面進(jìn)行了鏡面處理的厚度為500μm的硅構(gòu)成的基板13和厚度為400μm的玻璃構(gòu)成的蓋板16。如圖7所示，在由硅構(gòu)成的基板13上按規(guī)定的圖形形成抗蝕劑掩模14，然后如圖8所示，采用使用了SF6的干式蝕刻法以形成腔室15。作為該蝕刻的深度，根據(jù)需要的樣品容量而發(fā)生變化，但優(yōu)選150～400μm左右。然后，可以通過(guò)形成該腔室15而設(shè)置柱狀構(gòu)造體20。
這里，作為在由硅構(gòu)成的基板13內(nèi)形成腔室15的形成方法，如果基板13是硅等半導(dǎo)體，可以使用RIE等干式蝕刻法或使用了強(qiáng)堿性蝕刻液等的濕式蝕刻法。另一方面，如果基板13是玻璃，也可以使用利用氟酸的濕式蝕刻法。
特別是，如果把硅等半導(dǎo)體用于基板13，可以利用半導(dǎo)體領(lǐng)域中公知的微細(xì)加工技術(shù)，以良好的精度對(duì)微小腔室15以及高密度配置的柱狀構(gòu)造體20進(jìn)行加工，所以優(yōu)選。
接著，如圖9所示，在成為蓋板16的玻璃基板上形成抗蝕劑掩模17之后，如圖10所示，采用噴砂法形成樣品注入孔18而成為蓋板16。此時(shí)，作為形成樣品注入孔18的方法，除了噴砂法之外，也可以使用利用氟酸等的濕式蝕刻法，也可以使用利用SF6氣體、CF4氣體、C3F8氣體、C4F8氣體等的干式蝕刻法。
當(dāng)選擇樣品注入孔18的形成方法時(shí)，可以根據(jù)樣品注入孔18所要求的加工精度選擇最佳方法。
接著，如圖11所示，使用酸性洗滌劑清洗由硅構(gòu)成的基板13和由玻璃構(gòu)成的蓋板16的表面，然后以相互之間不進(jìn)入空氣的方式進(jìn)行密接。在密接狀態(tài)下，300℃加熱3小時(shí)，由此無(wú)需使用粘合劑而通過(guò)直接接合以接合基板13和蓋板16，得到如圖所示的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器19。然后，必要時(shí)切成芯片狀而得到小型核酸擴(kuò)增反應(yīng)器。
由此，通過(guò)使用直接接合技術(shù)，由硅構(gòu)成的基板13和由玻璃構(gòu)成的蓋板16的接合面是分子間成鍵的牢固接合，由此在溶液能接觸的位置不存在粘合劑等多余的成分，所以在聚合酶鏈反應(yīng)過(guò)程中不必?fù)?dān)心容器內(nèi)有這些成分溶出。
其中，采用本實(shí)施方式2中說(shuō)明的直接接合法，使密接時(shí)的加熱溫度為300℃而加熱3小時(shí)，但可以根據(jù)玻璃的材質(zhì)改變加熱時(shí)的溫度。如果是含有鈉、鉀等的玻璃材料，則250℃左右已經(jīng)足夠，如果是不含鈉、鉀等的玻璃材料，則溫度需要升高至400℃左右才能進(jìn)行直接接合。另外，玻璃材質(zhì)也可以是類似石英玻璃而不含雜質(zhì)的材質(zhì)，此時(shí)需要進(jìn)一步使接合溫度上升至500℃以上。而且，也可以把硅用于蓋板16的材料。此時(shí)，形成了腔室15的由硅構(gòu)成的基板13和形成樣品注入孔18且由硅構(gòu)成的蓋板16通過(guò)直接接合而進(jìn)行貼合，由此而可以形成。此時(shí)的直接接合溫度有必要為500℃以上。
另外，作為除此之外可以形成分子鍵的接合方法，也可以使用在基板13和蓋板16之間邊施加電壓邊進(jìn)行加熱的陽(yáng)極接合法、在真空中對(duì)基板13和蓋板16進(jìn)行等離子照射之后而接合的常溫直接接合法等方法。
接著，使用實(shí)施方式1和實(shí)施方式2中說(shuō)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器對(duì)核酸擴(kuò)增的步驟進(jìn)行說(shuō)明。
其中，這里對(duì)用于本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器的溫度上升、下降的機(jī)構(gòu)沒(méi)有特別限制。可以使用利用鋁塊的以往的方式?；蛘撸缤谝酝夹g(shù)一欄中所說(shuō)明的，可以使用作為類似輕循環(huán)控制裝置的熱源而利用熱風(fēng)的方式、作為紅外線放射源而利用鎢絲燈的方式(R.P.Oda et al.、Infrared-Mediated Thermocycling for Ultrafast Polymerase Chain ReactionAmplification of DNA、Analytical Chemistry、1998、70、4361-4368)、利用電磁感應(yīng)加熱的方式等。
試用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的容器的腔室形狀如圖13A～13D所示。
(比較例)腔室201為圓形且沒(méi)有柱狀構(gòu)造體的以往的容器13a如圖13A所示。
(實(shí)施例1)腔室202內(nèi)有橢圓形的柱狀構(gòu)造體602的反應(yīng)器13b如圖13B所示。
(實(shí)施例2)腔室203內(nèi)有多個(gè)彎曲形的柱狀構(gòu)造體603的反應(yīng)器13c如圖13C所示。
(實(shí)施例3)腔室204內(nèi)有多個(gè)圓形的柱狀構(gòu)造體604的反應(yīng)器13d如圖13D所示。
其中，在該比較實(shí)驗(yàn)中，作為用于聚合酶鏈反應(yīng)用的熱循環(huán)控制裝置使用Roche公司的輕循環(huán)控制裝置。
作為使用本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器而擴(kuò)增核酸的反應(yīng)，使用聚合酶鏈反應(yīng)。實(shí)施該聚合酶鏈反應(yīng)的方案都是一般的方案，所以省略對(duì)其的詳細(xì)說(shuō)明。這里，對(duì)用于實(shí)施該聚合酶鏈反應(yīng)的材料進(jìn)行說(shuō)明。
首先，作為使用的模板，使用λDNA(賓酒造制)(關(guān)于λDNA的堿基序列，參照Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)的Accession No.V00636，J02459，M17233，X00906)。另外，作為引物，使用TaKaRa聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增試劑盒(賓酒造制)的控制引物1(5’-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-3’)以及引物3(5’-GAATCACGGTATCCGGCTGCGCTGA-3’)(擴(kuò)增300bp用)。
另外，關(guān)于含有想要擴(kuò)增的核酸的聚合酶鏈反應(yīng)用樣品，在聚丙烯制試管中對(duì)2.5U/μl的TaKaRa Z-Taq 0.5μl、10×Z-Taq緩沖液5μl、2.5mM的各dNTP混合物4μl、20pmol/μl的引物1以及引物3各2.25μl、0.25μg/μl的牛血清白蛋白2μl進(jìn)行混合之后，加入10ng/μl的λDNA5μl，最后加入蒸餾水29μl，采用吸移法緩慢混合而進(jìn)行調(diào)制(總量50μl)。
接著，將如上所述調(diào)制的聚合酶鏈反應(yīng)用樣品分別注入比較例、實(shí)施例1、2、3的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器13a、13b、13c、13d中。每個(gè)核酸擴(kuò)增反應(yīng)器都通過(guò)使用耐熱帶密封注入孔4而密封樣品。由此，把密封了樣品的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器設(shè)置在Roche公司制的輕循環(huán)控制裝置，在初期變性反應(yīng)為98℃/1秒、變性反應(yīng)98℃/1秒、退火和延伸反應(yīng)66℃/4秒的各反應(yīng)條件下重復(fù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)?？偡磻?yīng)時(shí)間為522秒。
在實(shí)施該溫度上升、下降循環(huán)之后，把核酸擴(kuò)增反應(yīng)器插入離心試管內(nèi)，以10krpm的旋轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)各反應(yīng)器進(jìn)行離心分離處理1分鐘，由此從核酸擴(kuò)增反應(yīng)器對(duì)用于聚合酶鏈反應(yīng)的樣品進(jìn)行回收。
接著，使用Agilent技術(shù)公司制的Agilent 2100生物分析儀對(duì)回收的樣品進(jìn)行分析，對(duì)作為擴(kuò)增目標(biāo)的300bp的核酸進(jìn)行定量。
核酸擴(kuò)增反應(yīng)的評(píng)價(jià)結(jié)果如圖14所示。
由圖14的結(jié)果可知，和比較例相比，實(shí)施例1、2和3中目標(biāo)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物都比較多。即，和使用沒(méi)有柱狀構(gòu)造體的比較例的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器13a的情況相比，通過(guò)使用腔室內(nèi)由柱狀構(gòu)造體的本實(shí)施方式2的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器13b、13c、13d，發(fā)現(xiàn)可以進(jìn)行有效且良好的核酸擴(kuò)增反應(yīng)。
如上所述，本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器可以高速進(jìn)行樣品液的溫度上升、下降，作為使核酸發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)的容器，例如聚合酶鏈反應(yīng)容器是有用的。
權(quán)利要求
1.一種用于核酸擴(kuò)增的反應(yīng)器，其特征在于，具有形成了可收容樣品的腔室的基板和形成有通向所述腔室的樣品注入孔且覆蓋所述腔室并與所述基板接合的蓋板，在所述腔室中具有露出表面的柱狀構(gòu)造體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)器，其特征在于，所述柱狀構(gòu)造體的斷面形狀是圓形、橢圓形或彎曲形中的任意一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)器，其特征在于，所述腔室內(nèi)有多個(gè)所述柱狀構(gòu)造體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)器，其特征在于，所述柱狀構(gòu)造體與所述蓋板或者所述基板形成一體結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)器，其特征在于，所述柱狀構(gòu)造體是通過(guò)直接接合法與所述蓋板或者所述基板相接合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)器，其特征在于，所述腔室是彎曲形或者漩渦形的溝槽，所述柱狀構(gòu)造體構(gòu)成所述溝槽的壁面。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)器，其特征在于，所述基板的材料是硅，所述蓋板的材料是玻璃。
8.一種用于核酸擴(kuò)增的反應(yīng)器，其特征在于，具有形成了可收容樣品的腔室的基板和形成有通向所述腔室的樣品注入孔且覆蓋所述腔室并與所述基板接合的蓋板，所述腔室是彎曲形或者漩渦形的溝槽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的反應(yīng)器，其特征在于，所述基板的材料是硅，所述蓋板的材料是玻璃。
10.一種用于核酸擴(kuò)增的反應(yīng)器的制造方法，其特征在于，具有在基板上形成腔室和柱狀構(gòu)造體的基板加工工序、在蓋板的規(guī)定位置上形成通孔的蓋板形成工序、以所述通孔和所述腔室互相重疊的方式使所述基板和所述蓋板密接的工序、采用陽(yáng)極接合法或直接接合法中任意一種方法對(duì)密接后的所述蓋板與所述基板進(jìn)行接合的工序。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器的制造方法，其特征在于，是在所述蓋板上具有所述柱狀構(gòu)造體的反應(yīng)器的制造方法，所述基板加工工序是在基板上形成腔室的工序，所述蓋板形成工序還包括所述柱狀構(gòu)造體的形成工序，所述密接工序中包括使所述腔室的位置和所述柱狀構(gòu)造體的位置匹配的操作。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器的制造方法，其特征在于，所述基板加工工序是形成彎曲形或者漩渦形的腔室的工序。
全文摘要
本發(fā)明提供一種核酸擴(kuò)增反應(yīng)器，其特征在于，具備基板(1)、形成在基板(1)內(nèi)的腔室(2)、用于密封腔室(2)的蓋板(3)、形成在蓋板(3)上的樣品注入孔(4)，在腔室(2)內(nèi)具有連接在蓋板(3)或基板(1)上的柱狀構(gòu)造體(6)。使用本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)器，可以高速進(jìn)行樣品液的溫度上升、下降。
文檔編號(hào)C12M1/00GK1637147SQ20041009258
公開日2005年7月13日 申請(qǐng)日期2004年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月17日
發(fā)明者中谷將也, 行政哲男 申請(qǐng)人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社