專利名稱：能催化吲哚生成靛藍的 p450bm－3變體基因及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物化工中的基因工程菌生產(chǎn)靛藍染料的技術領域，尤其涉及一種能催化吲哚生成靛藍的P450BM-3變體基因及其用途。
背景技術：
酶分子的定向進化技術就是人為的創(chuàng)造特殊的進化條件，模擬天然進化機制，在體外對基因進行隨機突變，從一個或多個人工突變酶庫通過一定篩選或選擇方法最終獲得預先期望的具有某些特性的進化酶。與自然進化相比。酶分子的定向進化過程完全是在人為控制下進化的，使酶分子朝向人們期望的特定目標進行。近年來隨著諸如易錯PCR，DNA改組等技術的應用，在對目的基因表達有高效檢測篩選體統(tǒng)的條件下，盡管尚不清楚酶分子的結構等特性，采用酶分子的定向策略能獲得具有預期特性的新酶，實現(xiàn)酶分子的人為的快速進化。諸多的研究表明，在目前對酶分子認識還不成熟的情況下通過DNA水平上適當修飾來改變酶的氨基酸順序，進而改變酶的性能是可能在重組生物中產(chǎn)生新的酶類，并獲得比天然酶活力更高，穩(wěn)定性和催化性能更好的進化酶，以滿足研究和應用的需要。
P450酶系是廣泛分布于動物，植物和微生物等不同的生物體內的一類代謝酶系.因其主要成分中P450蛋白與CO結合后，在450nm處有特征光吸收峰而得名。研究表明。它可以催化成千上萬的化學反應，參與的主要反應有烷基的羥基化，烷基的環(huán)氧化，羥基的氧化。氨，氧，硫部位上脫烷基化，氨部位上羥基化和氧化，硫部位上的氧化，氧化性脫氨，脫氫和脫鹵素，氧化性的C-C鍵斷裂以及其它一些還原催化反應。有專著甚至指出它可能是自然界中最具有催化多樣性的生物催化劑。由于該酶系的性質和功能以及在生命活動過程中的作用。P450酶系受到廣大研究者的極度重視。P450酶系的作用的重要性已經(jīng)成為當代生物學研究中一個值得注意的領域。國外的研究工作主要分布在該酶系在生物體系中的作用以及利用該酶系的催化作用大規(guī)模生產(chǎn)手性藥物等方面。而在國內。雖然有大量關于該酶系的綜述性和研究性的報道。但研究工作卻只限于該酶系在生物機體中的作用。目前尚未見有該酶系的催化作用制備手性藥物的報道。有學者指出，主要原因是國內目前尚未能獲得適量的酶。
在P450酶系中，P450 BM-3是從巨大芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)的具有脂肪酸羥基化活性的酶，現(xiàn)在已作為哺乳動物微粒體p450單加氧酶重要的模型。P450BM-3是一種可溶解的單加氧酶，分子量117,641Da，不像其它P450酶催化需要額外的蛋白，P450BM-3在NADPH和O2的存在下，它具有快速催化鏈長為C12-C18的飽和脂肪酸的加單氧酶活性。在國外，德國的斯圖加特大學技術生化研究所R.D.Schmid領導的科研小組在1999年利用定點突變定向進化技術獲得具有三個突變位點的P450BM-3(Phe87Val，Leu188Gln，Ala74Gly)，他們意外的發(fā)現(xiàn)這一突變酶竟然能夠催化吲哚生成靛藍。因此，本發(fā)明就在R.D.Schmid領導的科研小組用易錯PCR技術進一步定向進化獲得的具有三個突變位點的P450BM-3(Phe87Val，Leu188Gln，Ala74Gly)變體基因的基礎上，通過易錯PCR技術進一步定向進化P450BM-3(Phe87Val，Leu188Gln，Ala74Gly)變體基因，獲得了一個高于P450BM-3(Phe87Val，Leu188Gln，Ala74Gly)催化吲哚活性的P450BM-3變體酶P450BM-3(Ile39→Val)，從而提高靛藍的產(chǎn)量，使生物轉化合成靛藍更加接近實用化。
靛藍(indigo)是一種顏色鮮艷而又耐久的藍色染料，是最早發(fā)現(xiàn)的天然染料之一，全球對染料的總體需求是800,000t，靛藍就占據(jù)了80,000t。遠古時代主要是從含有靛藍的植物中提取。1897年西德BASF生產(chǎn)的合成靛藍問世，它以生產(chǎn)簡便、原料充足、純度高、易貯運、使用方便等優(yōu)點后來居上，迅速普及，從而使得具有幾千年歷史的植物靛藍黯然失色。本世紀60年代之后，天然靛藍終于銷聲匿跡，退出了歷史舞臺。進入80年代之后，隨著社會現(xiàn)代化程度的日益提高，環(huán)境保護和勞動保護意識逐漸普及，人們開始認識到了合成化學工業(yè)的一系列有損健康、污染環(huán)境的弊病。如合成靛藍中使用的苯胺和鄰苯二甲酸酐能導致人體急性和慢性中毒，對呼吸道和中樞神經(jīng)及肝臟均有一定損害。而生物轉化合成天然靛藍產(chǎn)生的有害廢物比化學方法少，既節(jié)能又廉價，保護自然環(huán)境，維持生態(tài)平衡等方面，無疑都是具有重要意義的。因此很多研究者認為發(fā)展生物法生產(chǎn)生物靛藍染料是極具有前途的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種能催化吲哚生成靛藍的P450BM-3變體基因及其用途。
它通過易錯PCR技術介導的隨機突變，篩選獲得的P450BM-3變體基因，該P450BM-3變體基因中的第39位的異亮氨酸(Ile)的密碼子ATC突變?yōu)槔i氨酸(Val)的密碼子GTC，所得到的P450BM-3變體基因(Ile39→Val)P450BM-3，該變體基因序列為SEQ ID No.1核苷酸序列，并且編碼細胞色素P450BM-3的單加氧酶。
P450BM-3變體基因表達得到的P450BM-3變體蛋白酶能催化吲哚生成染料靛藍。
本發(fā)明創(chuàng)造了一種對吲哚具有更高催化活力的P450BM-3變體基因，其突變位點為Ile39→Val，該變體基因表達的突變酶能構催化吲哚生成染料靛藍，與R.D.Schmid領導的科研小組獲得的具有三個突變位點P450BM-3(Phe87Val，Leu188Gln，Ala74Gly)變體酶相比較，在測定的一例中活性提高了1.2-1.4倍，為生物轉化生產(chǎn)染料靛藍提供了廣闊的應用前景。


圖1質粒pET28α(+)P450BM-3的基因圖譜；圖2靛藍的TLC定性鑒定，圖中1-標準靛藍 2-催化產(chǎn)生靛藍 3-催化產(chǎn)生靛玉紅；圖3突變位點Ile39→Val在蛋白質三級結構中的位置；圖4定點突變原理示意圖。
具體實施例通過改變傳統(tǒng)PCR反應體系中某些組分的濃度，或使用低保真度TapDNA聚合酶等，使堿基在一定程度上隨機錯誤引入獲得P450BM-3突變基因文庫，并通過一定的篩選方法獲得P450BM-3變體基因，即Ile39→Val，并實現(xiàn)在大腸桿菌中的高效表達，經(jīng)分離純化，創(chuàng)造出對吲哚有較高催化的P450BM-3變體酶，該P450BM-3變體酶能催化吲哚生成靛藍染料。本發(fā)明得到的P450BM-3變體酶生產(chǎn)出靛藍染料可以替代化學合成的靛藍，是一種環(huán)保型染料。。
本發(fā)明的技術內容包括通過改變傳統(tǒng)PCR反應體系中某些組分的濃度，或使用低保真度TapDNA聚合酶等，使堿基在一定程度上隨機錯誤引入獲得突變基因文庫，并通過一定的篩選方法獲得一種變體基因，即，本發(fā)明按照上述的設計思想，通過降低傳統(tǒng)PCR中一種或者兩種dATP dGTP dCTP dTTP的濃度并且加入一定量的MnCl2，同時采用低保真度的TaqDNA聚合酶，使基因在擴增時能隨機的創(chuàng)造突變，然后將易錯PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)NheI-BamHI雙酶切后插入到用同樣的酶雙酶切后的線性質粒pET28α(+)，然后轉化到轉化到E.ColiBL21中，涂布到到含有30μg/ml卡那霉素LB瓊脂平板上，37℃過夜培養(yǎng)。從平板上挑取藍色的克隆，并接種到200μl含有30μg/ml卡那霉素LB液體培養(yǎng)基的96微孔板中，37℃過夜培養(yǎng)，取20μl該過夜培養(yǎng)液加入到一個新的200μl含有30μg/ml卡那霉素LB液體培養(yǎng)基的96微孔板中，在37℃培養(yǎng)至OD6000.5-0.7時加入IPTG(終濃度0.5μM)誘導并在30℃繼續(xù)培養(yǎng)48小時，得到藍色的細胞，用THF提取該藍色物質，在630nm處測定其吸收值，將吸收值高于親本的菌株挑選出來并進行100ml規(guī)模的培養(yǎng)，離心收集菌體，超聲破菌，保留上清液，該上清液含有P450BM-3變體酶，通過測定測定其酶反應動力學曲線，篩選出活力高于原酶的菌株挑選出來并提取質粒進行全自動DNA測序，發(fā)現(xiàn)突變位點為Ile39→Val。
序列表(1)SEQ ID NO.1.信息(a) 序列特征長度3150個堿基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性(b)分子類型cDNA(c)最初來源巨大芽孢桿菌(d)序列描述SEQ ID NO.1ATGACAATTAAAGAAATGCCTCAGCCAAAAACGTTTGGAGAGCTTAAAAATTTACCGTTATTAAACACAGATAAACCGGTTCAAGCTTTGATGAAAATTGCGGATGAATTAGGAGAAGTCTTTAAATTCGAGGCGCCTGGTCGTGTAACGCGCTACTTATCAAGTCAGCGTCTAATTAAAGAAGCATGCGATGAATCACGCTTTGATAAAAACTTAAGTCAAGCGCTTAAATTTGTACGTGATTTTGCAGGAGACGGGTTATTTACAAGCTGGACGCATGAAAAAAATTGGAAAAAAGCGCATAATATCTTACTTCCAAGCTTCAGTCAGCAGGCAATGAAAGGCTATCATGCGATGATGGTCGATATCGCCGTGCAGCTTGTTCAAAAGTGGGAGCGTCTAAATGCAGATGAGCATATTGAAGTACCGGAAGACATGACACGTTTAACGCTTGATACAATTGGTCTTTGCGGCTTTAACTATCGCTTTAACAGCTTTTACCGAGATCAGCCTCATCCATTTATTACAAGTATGGTCCGTGCACTGGATGAAGCAATGAACAAGCTGCAGCGAGCAAATCCAGACGACCCAGCTTATGATGAAAACAAGCGCCAGTTTCAAGAAGATATCAAGGTGATGAACGACCTAGTAGATAAAATTATTGCAGATCGCAAAGCAAGCGGTGAACAAAGCGATGATTTATTAACGCATATGCTAAACGGAAAAGATCCAGAAACGGGTGAGCCGCTTGATGACGAGAACATTCGCTATCAAATTATTACATTCTTAATTGCGGGACACGAAACAACAAGTGGTCTTTTATCATTTGCGCTGTATTTCTTAGTGAAAAATCCACATGTATTACAAAAAGCAGCAGAAGAAGCAGCACGAGTTCTAGTA
GATCCTGTTCCAAGCTACAAACAAGTCAAACAGCTTAAATATGTCGGCATGGTCTTAAACGAAGCGCTGCGCTTATGGCCAACTGCTCCTGCGTTTTCCCTATATGCAAAAGAAGATACGGTGCTTGGAGGAGAATATCCTTTAGAAAAAGGCGACGAACTAATGGTTCTGATTCCTCAGCTTCACCGTGATAAAACAATTTGGGGAGACGATGTGGAAGAGTTCCGTCCAGAGCGTTTTGAAAATCCAAGTGCGATTCCGCAGCATGCGTTTAAACCGTTTGGAAACGGTCAGCGTGCGTGTATCGGTCAGCAGTTCGCTCTTCATGAAGCAACGCTGGTACTTGGTATGATGCTAAAACACTTTGACTTTGAAGATCATACAAACTACGAGCTGGATATTAAAGAAACTTTAACGTTAAAACCTGAAGGCTTTGTGGTAAAAGCAAAATCGAAAAAAATTCCGCTTGGCGGTATTCCTTCACCTAGCACTGAACAGTCTGCTAAAAAAGTACGCAAAAAGGCAGAAAACGCTCATAATACGCCGCTGCTTGTGCTATACGGTTCAAATATGGGAACAGCTGAAGGAACGGCGCGTGATTTAGCAGATATTGCAATGAGCAAAGGATTTGCACCGCAGGTCGCAACGCTTGATTCACACGCCGGAAATCTTCCGCGCGAAGGAGCTGTATTAATTGTAACGGCGTCTTATAACGGTCATCCGCCTGATAACGCAAAGCAATTTGTCGACTGGTTAGACCAAGCGTCTGCTGATGAAGTAAAAGGCGTTCGCTACTCCGTATTTGGATGCGGCGATAAAAACTGGGCTACTACGTATCAAAAAGTGCCTGCTTTTATCGATGAAACGCTTGCCGCTAAAGGGGCAGAAAACATCGCTGACCGCGGTGAAGCAGATGCAAGCGACGACTTTGAAGGCACATATGAAGAATGGCGTGAACATATGTGGAGTGACGTAGCAGCCTACTTTAACCTCGACATTGAAAACAGTGAAGATAATAAATCTACTCTTTCACTTCAATTTGTCGACAGCGCCGCGGATATGCCGCTTGCGAAAATGCACGGTGCGTTTTCAACGAACGTCGTAGCAAGCAAAGAACTTCAACAGCCAGGCAGTGCACGAAGCACGCGACATCTTGAAATTGAACTTCCAAAAGAAGCTTCTTATCAAGAAGGAGATCATTTAGGTGTTATTCCTCGCAACTATGAAGGAATAGTAAACCGTGTAACAGCAAGGTTCGGCCTAGATGCATCACAGCAAATCCGTCTGGAAGCAGAAGAAGAAAAATTAGCTCATTTGCCACTCGCTAAAACAGTATCCGTAGAAGAGCTTCTGCAATACGTGGAGCTTCAAGATCCTGTTACGCGCACGCAGCTTCGCGCAATGGCTGCTAAAACGGTCTGCCCGCCGCATAAAGTAGAGCTTGAAGCCTTGCTTGAAAAGCAAGCCTACAAAGAACAAGTGCTGGCAAAACGTTTAACAATGCTTGAACTGCTTGAAAAATACCCGGCGTGTGAAATGAAATTCAGCGAATTTATCGCCCTTCTGCCAAGCATACGCCCGCGCTATTACTCGATTTCTTCATCACCTCGTGTCGATGAAAAACAAGCAAGCATCACGGTCAGCGTTGTCTCAGGAGAAGCGTGGAGCGGATATGGAGAATATAAAGGAATTGCGTCGAACTATCTTGCCGAGCTGCAAGAAGGAGATACGATTACGTGCTTTATTTCCACACCGCAGTCAGAATTTACGCTGCCAAAAGACCCTGAAACGCCGCTTATCATGGTCGGACCGGGAACAGGCGTCGCGCCGTTTAGAGGCTTTGTGCAGGCGCGCAAACAGCTAAAAGAACAAGGACAGTCACTTGGAGAAGCACATTTATACTTCGGCTGCCGTTCACCT
CATGAAGACTATCTGTATCAAGAAGAGCTTGAAAACGCCCAAAGCGAAGGCATCATTACGCTTCATACCGCTTTTTCTCGCATGCCAAATCAGCCGAAAACATACGTTCAGCACGTAATGGAACAAGACGGCAAGAAATTGATTGAACTTCTTGATCAAGGAGCGCACTTCTATATTTGCGGAGACGGAAGCCAAATGGCACCTGCCGTTGAAGCAACGCTTATGAAAAGCTATGCTGACGTTCACCAAGTGAGTGAAGCAGACGCTCGCTTATGGCTGCAGCAGCTAGAAGAAAAAGGCCGATACGCAAAAGACGTGTGGGCTGGGTAA下面是
具體實施例方式1.利用定點突變技術在基因序列第1460-1475位點獲得BamHI酶切位點a)定點突變引物的設計和PCR擴增產(chǎn)物的獲得上游引物B1 5｀-TGTGCTATACGGATCCGAATATGGGAACAGC-3′↑BamHI酶切位點↓下游引物B2 5′-TGTTCCATATTGGATCCGTATAGCACCAAGC-3′選擇P450BM3基因第1469位的A替換為C和1472位的T替換為A，這一替換屬于沉默突變，設計一對突變引物B1和B2，以pET28α(+)P450BM-3為模板，用QuikChangTM定點突變擴增的方法向P450BM-3基因引入點突變，如附圖4所示，向500μl的eppendorf管中加入25pmol的dNTPs，上游引物，下游引物各10pmol，大約1ng質粒pET28α(+)BM3作為模板DNA，2.5u pfuDNA聚合酶，5μl的含有MgCl2(25mM)的PCR緩沖液，然后加無菌的蒸餾水至總體積50μl。PCR反應參數(shù)是通過95℃變性1分鐘后，在95℃30s，55℃1min，每一循環(huán)溫度上升0.7℃，72℃16min，總共14個循環(huán)，然后72℃延伸30s。
b)具有BamHI酶切位點的變體基因的檢測上述PCR擴增產(chǎn)物用1μl DpnI(10u/μl)消化2小時后轉化到E.coli DH5α中并涂布到含有30μg/ml卡那霉素LB瓊脂平板上，37℃過夜培養(yǎng)。大約挑選12個克隆接種到5ml的含有30μg/ml卡那霉素LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)以擴增質粒。提取質粒并用BamHI和EcoRI在37℃酶解后，利用DNA電泳和全自動DNA測序檢測期望的突變位點是否引入.
2.易錯PCR引物的設計和PCR擴增產(chǎn)物的獲得根據(jù)P450BM-3的cDNA的單加氧酶的編碼區(qū)設計的，為了方便以后的操作，在引物的5′端分別引入BamHI和NheI位點。
上游引物 5′-CTAGCTAGCATGACAATTAAAG-3′↑NheI酶切位點BamHI酶切位點↓下游引物 5′-CATATTGGATCCGTATAGCACAAC-3′向500μl的eppendorf管中加入100pmol的dNTPs，上游引物，下游引物各20pmol，大約1ng pET28α(+)P450BM-3(由定點突變突變在基因序列第1460-1475位點具有BamHI酶切位點的pET28α(±)P450BM-3)作為模板DNA，以及最終濃度范圍為0到0.20mM MnCl2，2.5u TapDNA聚合酶，5μl的的PCR緩沖液，12.5μl 25mM的MgCl2，然后加無菌的蒸餾水至總體積50μl。反應參數(shù)是通過95℃變性3分鐘后，在95℃ 1min，47℃ 2min，72℃ 2min，經(jīng)過25個循環(huán)，然后72℃延伸2min.
3.突變文庫的構建易錯PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)NheI-BamHI雙酶切后插入到用同樣的酶雙酶切后的線性質粒pET28α(±)，然后轉化E.ColiBL21中，涂布到到含有30μg/ml卡那霉素LB瓊脂平板上，37℃過夜培養(yǎng)。
酶切時質粒pET28α(±)P450BM-3以及限制酶的用量比質粒pET28α(±)P450BM-35μlNheI(10u/μl) 1μlBamHI(10u/μl) 1μlBuffer(10X)5μl無菌水 8μl總體積 20μl質粒pET28α(±)-P450BM-3連接時連接酶和質粒的配比質粒DNA pET28α(±)片斷2μl基因P450BM-3片斷 4μlT4DNA連接酶1μlT4DNA連接酶Buffer(10X) 2μl無菌水 11μl總體積 20μl4.一種對吲哚具有高催化活性的變體基因的的篩選從平板上挑取藍色的克隆，并接種到200μl含有30μg/ml卡那霉素LB液體培養(yǎng)基的96微孔板中，37℃過夜培養(yǎng)，取20μl該過夜培養(yǎng)液加入到一個新的200μl含有30μg/ml卡那霉素LB液體培養(yǎng)基的96微孔板中，在37℃培養(yǎng)至OD6000.5-0.7時加入IPTG(終濃度0.5μM)誘導并在30℃繼續(xù)培養(yǎng)48小時，得到藍色的細胞，用THF提取該藍色物質，在630nm處測定其吸收值，將吸收值高于親本的菌株挑選出來并接種到100毫升LB液體培養(yǎng)基中種子液為試管培養(yǎng)液，接種量1％-3％，培養(yǎng)基的體積為100毫升，pH7.0-7.5，搖床轉速為150-200轉\分鐘，在37℃培養(yǎng)至OD0.5-0.7時加入IPTG(0.5-1.0um)誘導，然后將溫度轉為30℃繼續(xù)培養(yǎng)5-8小時，培養(yǎng)液以80000轉\分鐘離心10-20分鐘，去除上清液，收獲離心后的細胞，懸浮于5毫升的pH7.550mM含有0.5MNaCl和微量PMSF的磷酸鹽緩沖液中，在冰浴的條件下超聲破菌10分鐘(超聲60秒，間隙60秒)，再8000rpm離心4℃離心15分鐘，得到含有P450BM-3變體酶的上清液，并用以下方法測定其酶活在1ml緩沖液為pH8.2的磷酸緩沖液反應液中加入10mM-100mM吲哚為底物，加入1.2nmol-2.4nmol P450BM-3變體酶，室溫下培育9分鐘，加入20μl NADPH5mg/ml啟動反應 ，測定其酶反應動力學曲線，篩選出活力高于原酶的菌株挑選出來并提取質粒進行全自動DNA測序，發(fā)現(xiàn)突變位點為Ile39→Val。用蛋白質模擬技術確定該突變位點遠離的底物結合部位的，這種遠離活性中心的突變是在整體上輕微的改變了酶的結構，從而提高了該變體酶的催化活性。通過酶動力學曲線的測定，與R.D.Schmid領導的科研小組獲得的具有三個突變位點的P450BM-3(Phe87Val，Leu188Gln，Ala74Gly)變體酶相比較，在測定的一例中活性提高了1.2-1.4倍。
5.全細胞生產(chǎn)染料靛藍a)挑取含有該P450BM-3變體基因Ile39→Val的陽性克隆接種到LB液體培養(yǎng)基中種子液為試管培養(yǎng)液，接種量1％-2％，培養(yǎng)基的體積為100毫升，pH7.0-7.5，搖床轉速為150-200轉\分鐘，在37℃培養(yǎng)至OD0.5-0.7時加入IPTG(0.5-1.0um)誘導，然后將溫度轉為30℃繼續(xù)培養(yǎng)48小時.
b)將培養(yǎng)液以4000-80000轉\分鐘離心10-20分鐘，放棄上清液，收獲離心后的細胞。離心后的細胞用適量的水沖洗2-3次，，加入適量的四氫呋喃(THF)提取藍色物質，1000-2000轉\分鐘離心保留上清液，用旋轉蒸發(fā)儀干燥，然后在干燥好的藍色沉淀中加入無水乙醇提取數(shù)次，直到最后一次提取液沒有紅色為止，將剩下的藍色物質再用THF溶解。
c)TLC薄層色譜定性分析產(chǎn)生的靛藍色譜條件預涂硅膠TLC板西德E.MERCK公司生產(chǎn)的硅膠60F25TLC板10cm×10cm×2cm，使用前在120℃活化1小時溶劑系統(tǒng) 四氫呋喃∶汽油醚＝1∶2，無水乙醇均為分析純展開方法上行法展開前飽和5分鐘展距7.5cm溫度室溫試驗方法用毛細血管吸取適量的提取液距TLC板底邊1.5cm處點樣，待溶劑揮發(fā)后立即放入存有展開劑的層析缸中分別進行展開，待至前沿7.5cm時取出涼干，并立即掃描，如附圖2所示。
掃描條件掃描條件228nm單波長反射矩齒掃描，狹縫0 4mm×0 41 1從圖2中看出從發(fā)酵液中提取的藍色物質和商業(yè)出售的標準靛藍有相同的RF值都為0.78，因此我們獲得的這一變體基因產(chǎn)生的藍色物質是靛藍。
權利要求
1.一種能催化吲哚生成靛藍的P450BM-3變體基因，其特征在于通過易錯PCR技術介導的隨機突變，篩選獲得的P450BM-3變體基因，該P450BM-3變體基因中的第39位的異亮氨酸(Ile)的密碼子ATC突變?yōu)槔i氨酸(Val)的密碼子GTC，所得到的P450BM-3變體基因(Ile39→Val)P450BM-3，該變體基因序列為SEQ ID No.1核苷酸序列，并且編碼細胞色素P450BM-3的單加氧酶。
2.一種如權利要求1所述能催化吲哚生成靛藍的P450BM-3變體基因的用途，其特征在于，表達所得到P450BM-3變體蛋白酶能催化吲哚生成染料靛藍。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能催化吲哚生成靛藍的P450BM－3變體基因及其用途。它通過易錯PCR技術介導的隨機突變，篩選獲得的P450BM－3變體基因，該P450BM－3變體基因中的第39位的異亮氨酸(Ile)的密碼子ATC突變?yōu)槔i氨酸(Val)的密碼子GTC，所得到的P450BM－3變體基因(Ile
文檔編號C12N15/53GK1644695SQ20041008917
公開日2005年7月27日 申請日期2004年11月29日 優(yōu)先權日2004年11月29日
發(fā)明者梅樂和, 李紅梅, 姚善涇 申請人:浙江大學