專利名稱：轉(zhuǎn)錄因子jdp2的克隆、表達(dá)及其多克隆抗體的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個命名為pGEX-4T-3-JDP2的原核高效表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)?？稍诖竽c桿菌BL21(DE3)中高效表達(dá)可溶性的GST-JDP2融合蛋白，用該純化蛋白免疫所得的多克隆抗體具有較高的抗體滴度及特異性。雖然該蛋白并非新蛋白，但目前國內(nèi)還沒有相關(guān)的功能報道，也沒有商品化的JDP2抗體出售，因而本發(fā)明填補(bǔ)了國內(nèi)空白，并對深入闡明JDP2的生物學(xué)功能及其在細(xì)胞增殖與分化調(diào)控中的作用具有重要意義。
背景技術(shù)：
隨著大規(guī)?；蚪M測序工作的完成，蛋白質(zhì)組學(xué)及功能基因組學(xué)越來越成為人們關(guān)注的領(lǐng)域，新基因或功能未知基因的克隆及功能鑒定已成為當(dāng)今生命科學(xué)工作者的首要任務(wù)。全長cDNA片段的獲得，原核或真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及相應(yīng)抗體的制備往往是分析和研究一個新基因功能的前提和基礎(chǔ)。
1997年Aronheim等應(yīng)用Sos募集系統(tǒng)篩選出一個與c-Jun相互作用的蛋白，命名為JDP2，即c-Jun dimerization protein 2。該蛋白是一個由163個氨基酸編碼的約18kDa的蛋白，是bZIP蛋白家族中的一個成員，可以與c-Jun、JunB或JunD形成穩(wěn)定的異源二聚體，從而抑制AP-1的功能。
轉(zhuǎn)錄因子AP-1參與許多重要的生物學(xué)過程，如細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)化、凋亡等，因而我們推測作為AP-1抑制蛋白的JDP2，其功能也應(yīng)當(dāng)相當(dāng)廣泛。但目前為止，國際上關(guān)于JDP2蛋白功能研究的報道相當(dāng)有限，國內(nèi)尚未見報道。Piu等報道JDP2可以下調(diào)p53的表達(dá)從而保護(hù)細(xì)胞免受UV誘導(dǎo)的凋亡。Pan等報道JDP2可以與組蛋白相互作用從而抑制p300介導(dǎo)的組蛋白乙?；?。Ostrovsky等報道在成肌細(xì)胞和RD腫瘤細(xì)胞中，JDP2的異位表達(dá)可以強(qiáng)烈提高肌肉細(xì)胞的分化，而Jin等的研究則發(fā)現(xiàn)在F9細(xì)胞中，JDP2可以抑制維甲酸誘導(dǎo)的c-jun基因的轉(zhuǎn)錄從而抑制維甲酸誘導(dǎo)的F9細(xì)胞的分化。有人認(rèn)為JDP2可能是一個組成性表達(dá)的蛋白，但目前為止，真正被檢測的細(xì)胞很少，因而JDP2更詳細(xì)的生理學(xué)功能并不十分清楚，其作用機(jī)制也有待闡明。目前我們發(fā)現(xiàn)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中也存在JDP2蛋白，并且該蛋白的過表達(dá)可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化，抑制細(xì)胞增殖。此結(jié)果在國際和國內(nèi)均屬首次報道。因而本發(fā)明拓寬了JDP2的生物學(xué)功能，并為進(jìn)一步探討該蛋白在多種細(xì)胞的細(xì)胞增殖與分化調(diào)控中的作用奠定了基礎(chǔ)，對腫瘤的臨床治療可能也會發(fā)揮作用。
發(fā)明目的克隆轉(zhuǎn)錄因子JDP2的全長cDNA片段，構(gòu)建其原核表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)其編碼蛋白質(zhì)；用純化的表達(dá)蛋白免疫動物制備其抗體，為深入闡明該基因的功能以及基因表達(dá)調(diào)控規(guī)律奠定基礎(chǔ)。
內(nèi)容與要求應(yīng)用基因組信息學(xué)原理、真核細(xì)胞總RNA提取技術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄PCR、分子克隆、DNA序列測定技術(shù)、蛋白質(zhì)表達(dá)與純化技術(shù)、抗血清制備、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、ELISA分析、Western blot檢測等，克隆編碼JDP2基因的全長cDNA，構(gòu)建JDP2的原核表達(dá)質(zhì)粒，純化原核表達(dá)的目標(biāo)蛋白質(zhì)并免疫家兔制備抗血清，進(jìn)而進(jìn)行ELISA分析和Western blot檢測抗體的滴度和特異性。
該發(fā)明達(dá)到的技術(shù)指標(biāo)為1.根據(jù)網(wǎng)上公布的JDP2序列信息，設(shè)計合成引物，采用RT-PCR的方法，以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板，擴(kuò)增了大小為500bp左右的JDP2全長編碼區(qū)；接著利用基因重組技術(shù)將該PCR擴(kuò)增片段構(gòu)建到原核表達(dá)載體pGEX-4T-3中，最終得到JDP2的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-3-JDP2。本發(fā)明所述原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-3-JDP2(圖譜見圖2)，其大小為5400bp，該載體中啟動子元件、GST標(biāo)簽、多克隆位點及轉(zhuǎn)錄終止密碼子均來源于原核表達(dá)載體pGEX-4T-3，在該載體的多克隆位點的BamHI位點和EcoRI位點插入了包括其起始密碼子和終止密碼子區(qū)域的JDP2的全長編碼區(qū)，此序列大小為500bp(質(zhì)粒酶切鑒定如圖3所示)。并且GST標(biāo)簽的開放閱讀框與JDP2的開放閱讀框完全一致，兩編碼區(qū)之間僅有18bp的間隔。
2.該原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-3-JDP2在IPTG誘導(dǎo)下可在大腸桿菌BL21(DE3)中高效表達(dá)相對表觀分子量為46kDa的GST-JDP2融合蛋白。對該蛋白在大腸桿菌中的分布定位分析表明，該蛋白主要以可溶形式存在于上清中(見圖4和圖5)。親和層析后得到了純化的GST-JDP2融合蛋白(見圖6)。
3.用該質(zhì)粒表達(dá)并經(jīng)親和層析純化后的產(chǎn)物免疫家兔制備的抗JDP2蛋白抗體具有高的滴度及特異性(見表1和圖7)。


圖1.人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中JDP2基因全長cDNA的RT-PCR的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果1JDP2 cDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2DGL2000分子量marker結(jié)果顯示人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中能擴(kuò)增出全長的JDP2 cDNA。
圖2.原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-3-JDP2的構(gòu)建流程3.原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-3-JDP2的酶切鑒定圖1酶切前的pGEX-4T-3-JDP2質(zhì)粒；2pGEX-4T-3-JDP2質(zhì)粒用BamHI酶切；3pGEX-4T-3-JDP2質(zhì)粒用BamHI+EcoRI雙酶切；4λ/HindIII分子量marker；5DGL2000分子量marker。
圖4.pGEX-4T-3-JDP2重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖1低分子量蛋白質(zhì)Marker；2未誘導(dǎo)pGEX-4T-3菌體蛋白；3誘導(dǎo)pGEX-4T-3菌體蛋白；4未誘導(dǎo)pGEX-4T-3-JDP2菌體蛋白(克隆1)；5誘導(dǎo)pGEX-4T-3-JDP2菌體蛋白(克隆1)；6未誘導(dǎo)pGEX-4T-3-JDP2菌體蛋白(克隆2)；7誘導(dǎo)pGEX-4T-3-JDP2菌體蛋白(克隆2)；8未誘導(dǎo)pGEX-4T-3-JDP2菌體蛋白(克隆3)；9誘導(dǎo)pGEX-4T-3-JDP2菌體蛋白(克隆3)。箭頭所指為GST-JDP2融合蛋白。
圖5.JDP2重組蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中的分布定位分析的SDS-PAGE電泳圖1低分子量蛋白質(zhì)Marker；2誘導(dǎo)表達(dá)的全細(xì)胞裂解物；3上清；4沉淀。該結(jié)果表明該重組蛋白主要以可溶形式存在于上清中。
圖6.JDP2重組蛋白經(jīng)GST親和層析后的SDS-PAGE檢測結(jié)果1低分子量蛋白質(zhì)Marker；2誘導(dǎo)表達(dá)的全細(xì)胞裂解物；3，4，5，6GST親和層析后依次收集的洗脫液。
圖7.Western blot檢測抗JDP2抗體的特異性1RD細(xì)胞的全細(xì)胞抽提物；2SH-SY5Y細(xì)胞的全細(xì)胞抽提物。
實施例1.細(xì)胞總RNA的制備實驗采取一步法提取細(xì)胞總RNA。具體步驟簡要如下4℃，1,000g離心5min收集人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞，用5-10倍體積的冰冷PBS緩沖液洗滌細(xì)胞沉淀兩次(PBS配制在400mL蒸餾水中加入4g NaCl、0.1g KCl、0.72g Na2HPO4和0.12g KH2PO4，用HCl調(diào)節(jié)pH至7.4，加水定容至500mL，在15lbf/in2(1.034×105Pa)高壓下蒸汽滅菌20min，保存于室溫)。向細(xì)胞沉淀中加入400μLTrizol細(xì)胞裂解液(Invitrogen)，迅速吹打至不粘為止，加入五分之一體積即80μL氯仿，顛倒數(shù)次混勻，離心取上清。再加入等體積的異丙醇，混勻，置冰水浴15min。4℃，12,000g離心15min沉淀RNA，用1mL冰冷的70％乙醇洗沉淀兩次后將RNA溶于50μL經(jīng)DEPC處理的雙蒸水中，吸取4μL稀釋到400μL測OD260、OD280后保存在-70℃中。
2.RT-PCR方法擴(kuò)增全長的JDP2 cDNA片段首先將提取的SH-SY5Y細(xì)胞總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為4μL 5x逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、1μL 4x dNTP(各10μmol/L)、20U RNasin、2μL 50μmol/LOligo(dT)18、2μL 0.1mol/L DTT、10μg細(xì)胞總RNA、加DEPC水至19μL，將反應(yīng)體系置于65℃加熱5min后置冰上，然后加200U M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，37℃反應(yīng)1h，94℃加熱5min使M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶滅活。
參照網(wǎng)上公布的JDP2基因cDNA的序列，設(shè)計合成了能擴(kuò)增含有JDP2基因全長cDNA的兩條引物，并在上游引物的5’端摻入BamHI酶切位點，下游引物的5’端摻入EcoRI酶切位點。引物序列如下5’引物序列為5’-ggatccatgatgcctgggcagatcc-3’；3’引物序列為5’-gaattcacttcttctcgagctgct-3’。應(yīng)用此對引物，以SH-SY5Y細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了與預(yù)期一致的約500bp的DNA片段(見圖1)。PCR擴(kuò)增體系為4μL RT產(chǎn)物、2μL 10xPCR緩沖液、1.2μL 25mmol/L MgCl2、10μmol/L 5’及3’引物各2μL、2.5μmol/L dNTP、1U Taq DNA聚合酶。擴(kuò)增條件為94℃5min后，94℃1min，60℃1min，72℃1min，經(jīng)35次循環(huán)后72℃延伸10min。
3.含JDP2全長cDNA片段的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-3-JDP2的構(gòu)建回收所獲得的約500bp的PCR擴(kuò)增片段，用T4 DNA連接酶將該片段與pGEM-T載體(Promega公司)連接。連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆制備質(zhì)粒。經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶譜分析證實JDP2基因全長cDNA片段已被克隆。將該過渡質(zhì)粒測序驗證表明正確后，用BamHI+EcoRI雙酶切，回收500bp片段，同時用BamHI+EcoRI雙酶切原核表達(dá)載體pGEX-4T-3，回收約4.9kb的大片段，將兩片段連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆制備質(zhì)粒。經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定得到目的克隆，命名為pGEX-4T-3-JDP2，該質(zhì)粒的構(gòu)建過程如圖2所示，其酶切鑒定如圖3所示。
4.JDP2融合蛋白的原核表達(dá)及純化將pGEX-4T-3空載體和pGEX-4T-3-JDP2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后分別獲得高效表達(dá)的GST蛋白和GST-JDP2融合蛋白，見圖4。
首先小量培養(yǎng)鑒定GST-JDP2融合蛋白表達(dá)水平及該融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)形式，然后進(jìn)行大量表達(dá)，從經(jīng)過鑒定的質(zhì)粒保存板中挑單菌落放入含有100mL新鮮LB的錐形瓶(含卡那霉素50μg/mL)中。37℃，劇烈搖動，培養(yǎng)過夜。將過夜菌液按1/10比例接種到一個含500mLLB(含卡那霉素)的2L錐形瓶中，37℃，劇烈搖動，培養(yǎng)1-1.5h，使菌液的A600nm值達(dá)0.4-0.6。加入終濃度為0.5mmol/LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)3-4h。收集培養(yǎng)液，5,000rpm離心10min，棄上清。PBS洗菌體沉淀，用PBS按照5mL/g重懸，在冰浴中，按照超聲10s/間隔20s，300W，20次的參數(shù)，超聲破碎細(xì)胞。12,000rpm離心20min，分別取少量上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE檢測，分析蛋白質(zhì)在胞內(nèi)分布部位。其余于-70℃凍存?zhèn)溆?。結(jié)果見圖5所示，表明JDP2融合蛋白主要以可溶形式存在于上清中。
GST融合蛋白的純化應(yīng)用Pharmacia公司純化試劑盒進(jìn)行。用預(yù)冷的3倍柱床體積PBS緩沖液平衡glutathione-Sepharose親和柱后，4℃下將破菌液掛柱。50～80倍柱床體積PBS緩沖液緩慢沖洗層析柱，然后加入1倍柱體積的GST洗脫緩沖液(50mM Tris-HCl pH8.0，10mM glutathione)，室溫孵育10min后，收集流出液。按照上述條件重新洗脫幾次，電泳檢測洗出液，確定蛋白質(zhì)純度(圖6)。
5.JDP2抗血清的制備三只2kg左右重的新西蘭大白兔。兩只作為實驗組，一只為對照。免疫前從耳緣靜脈取0.5ml正常血清做對照。
將純化的GST-JDP2蛋白與福氏完全佐劑混合，采用背部皮內(nèi)多點注射，約20-30點。對照組取洗脫液與佐劑混合。初始免疫后2、4、8周采用抗原和福氏不完全佐劑混合進(jìn)行加強(qiáng)免疫。酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)測定抗體滴度，Western blot檢測抗體特異性。
6.酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)測定抗體滴度具體實驗步驟如下1)抗原包被用包被緩沖液(0.1M Na2CO3，0.1M NaHCO3，pH9.6)將免疫所用蛋白稀釋至所需濃度(1000ng/mL)。在酶標(biāo)板每孔中加入100μL，37℃保溫4h。2)傾盡酶標(biāo)板孔中的液體，用PBS-T(8.0g NaCl，2.9gNa2HPO4.12H2O，0.2g KH2PO4，0.5mL Tween-20，加去離子水至100mL，調(diào)整pH值至7.4)洗滌三次。3)封閉每孔加入200μL封閉液(PBS-T配制的1％BSA)，于37℃保溫1h。4)傾盡酶標(biāo)板孔中的封閉液，用PBS-T洗滌三次。5)一抗反應(yīng)將生理鹽水梯度稀釋的血清(每孔100μL)加入，4℃過夜。6)傾盡酶標(biāo)板孔中的液體，用PBS-T洗滌三次。7)二抗結(jié)合每孔中加入100μL以PBS-T(1∶1000)稀釋過的羊抗兔二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記)，37℃保溫2h。8)傾盡酶標(biāo)板孔中的二抗稀釋液，用PBS-T洗滌三次。9)顯色反應(yīng)每孔中加入100μL底物反應(yīng)液(30％H2O215μL，鄰苯二胺4mg，磷酸一檸檬酸緩沖液9.985mL，新鮮配制)，37℃保溫30min后，加入50μL 2M的HCL(或H2SO4)終止反應(yīng)。10)光密度測定酶標(biāo)儀(Ceres 900micro titer plate reader，Bio-tek Instruments Inc.)測定490nm波長的酶標(biāo)儀光密度。實驗結(jié)果表明，JDP2抗血清的抗體滴度達(dá)到了1∶64萬(見表1)。
表1.ELISA測定抗JDP2抗體滴度 Note*.***表示OD值過高，超過酶標(biāo)儀測定范圍。λ＝490nm，陰性對照用免疫前血清作為一抗，陽性對照包被正常兔血清。
一般認(rèn)為吸光度達(dá)到陰性對照兩倍以上為有效效價分析。
7.Western blot檢測抗體特異性首先進(jìn)行全細(xì)胞抽提物(WCE)的提取和蛋白濃度測定?；景次墨I(xiàn)(Xiao L等Cancer Res，(2000)60400-408)的方法進(jìn)行。室溫1,000rpm離心收集1-2×107細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌二次，4℃2,000rpm離心5min。細(xì)胞沉淀重懸于300μL冰預(yù)冷的RIPA緩沖液(50mM HEPES，pH7.5，150mM NaCl，2mM EDTA，2mM EGTA，1％TritonX-100，50mM NaF，5mM Sodium Pyriphosphate，50mM Sodium β-glycerophosphate，1mMSodium Ortho-vanadate，1mM DTT，1mM PMSF，10μg/mL Leupeptin，10μg/mLAprotinin)。在旋轉(zhuǎn)儀上4℃混勻1h后，12,000rpm離心10min。取上清分裝于-70℃儲存。另取一小份用BCA蛋白分析試劑盒測定蛋白濃度。接著進(jìn)行Western印跡-ECL分析。將50-100μg WCE經(jīng)15％SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后用含有5％脫脂奶粉的TBST(20mM Tris-HCl，pH7.5，500mM NaCl，0.2％Tween-20)在室溫下將硝酸纖維素膜封閉60min后，TBST洗滌1次，繼而與1∶4000稀釋的抗JDP2抗血清室溫孵育60min，再用TBST洗滌3次，每次5min，然后再與1∶2000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔的IgG(北京中山生物技術(shù)公司)室溫孵育60min，經(jīng)TBST洗滌3次，每次5min，再與增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑ECL(Amersham公司)進(jìn)行反應(yīng)，然后在X光片上曝光30sec-5min后顯影，定影。結(jié)果如圖7所示。
8.全長JDP2 cDNA序列1 ATGATGCCTG GACAGATCCC GGACCCTTCG GTGACCACAG GCTCCCTGCC AGGGCTTGGC61 CCCCTGACCG GGCTCCCCAG CTCGGCCCTG ACTGTGGAGG AGCTGAAATA CGCTGACATC121 CGCAACCTCG GGGCCATGAT TGCACCCTTG CACTTCCTGG AGGTGAAACT GGGCAAGAGG181 CCCCAGCCCG TGAAAAGTGA GCTAGATGAG GAAGAGGAGC GAAGGAAAAG GCGCCGGGAG241 AAGAACAAAG TCGCAGCAGC CCGATGCCGG AACAAGAAGA AGGAGCGCAC GGAGTTTCTG301 CAGCGGGAAT CCGAGCGGCT GGAACTCATG AACGCAGAGC TGAAGACCCA GATTGAGGAG361 CTGAAGCAGG AGCGGCAGCA GCTCATCCTG ATGCTGAACC GACACCGCCC CACCTGCATC421 GTCCGGACCG ACAGTGTCAA GACCCCCGAG TCAGAAGGCA ACCCACTGCT CGAGCAGCTC481 GAGAAGAAGT GA
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一個命名為pGEX-4T-3-JDP2的原核高效表達(dá)質(zhì)粒。其主要包括GST表達(dá)標(biāo)簽；全長為500bp的JDP2的cDNA，相應(yīng)編碼蛋白質(zhì)有163個氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于可在大腸桿菌BL21(DE3)中高效表達(dá)相對表觀分子量為46kDa的GST-JDP2融合蛋白，該蛋白以可溶形式存在于上清中，可通過親和層析的方法進(jìn)行分離和純化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述之表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于用經(jīng)過親和層析所獲得的純化的JDP2蛋白免疫新西蘭大白兔得到的抗JDP2多克隆抗體具有較高的抗體滴度及特異性。
全文摘要
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)錄因子AP－1的一個抑制蛋白，稱為JDP2蛋白。內(nèi)容包括一個命名為pGEX－4T－3－JDP2的原核高效表達(dá)質(zhì)粒的克隆，該質(zhì)粒具有GST表達(dá)標(biāo)簽并含有JDP2的全長編碼序列以及轉(zhuǎn)錄終止密碼子。該質(zhì)?？稍诖竽c桿菌BL21(DE3)中高效表達(dá)可溶性的GST－JDP2融合蛋白，可通過親和層析的方法進(jìn)行分離和純化，用純化蛋白免疫新西蘭大白兔得到的抗JDP2多克隆抗體具有較高的抗體滴度及特異性。本發(fā)明對深入闡明JDP2的生物學(xué)功能及其在細(xì)胞增殖與分化調(diào)控中的作用具有重要意義。
文檔編號C12N15/62GK1769459SQ200410088760
公開日2006年5月10日 申請日期2004年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月3日
發(fā)明者沈金花, 吳寧華, 沈珝琲 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所