專利名稱：高比活植酸酶基因及其高效表達的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高比活植酸酶及其編碼基因。本發(fā)明還涉及含有該植酸酶基因的、能高效表達植酸酶的重組酵母細胞。
背景技術(shù)：
植物中50～70％磷以植酸磷(肌醇六磷酸)的形式存在(Lolas M.Etal.Food Sci.421094-1097，1977；Nelson T.S.Poultry Sci.47862-871，1967)，不能直接被單胃動物和人所利用(Cromwell G.L.Biotechnology in the Feed Industry，Lyons T.P.ed.Alltech TechnicalPublication，Nicholasville，KY，133-145)，造成磷源浪費、飼料成本增加，同時，植酸磷不能被動物利用而直接排出體外，還會造成土壤及水域的磷污染。另外，植酸還能與動物所必須的微量元素及蛋白質(zhì)螯合，使這些營養(yǎng)元素不能有效利用，導(dǎo)致了植物性飼料(或食品)營養(yǎng)價值的降低(Sharma C.B.et al.，Phytochemistry.17201-204，1978)。廣泛存在于微生物中的植酸酶(Phytase，肌醇六磷酸酶)將植酸水解為肌醇和磷酸。植酸酶喂飼效果已有確證，可使飼料中磷的利用率提高60％，糞便磷排泄量減少40％，還可降低植酸磷的抗?fàn)I養(yǎng)作用。因此飼料中加入植酸酶，可減少無機磷酸鹽加入量，對提高畜牧業(yè)生產(chǎn)效益和降低植酸磷對環(huán)境的污染有重要意義。
雖然植酸酶具有良好的飼喂效果(Ware J.H.et al.，US PatentNo.3297548，1967；Nelson T.S.et al.，J.Nutrition 1011289-1294，1971；Nelson T.S.et al.，Poult Sci.471842-1848，1968)，但到目前為止它還沒有在飼料工業(yè)上得到廣泛應(yīng)用，其根本原因在于，在天然微生物中植酸酶的表達量太低，從而難以大量獲得廉價的植酸酶產(chǎn)品，不能滿足飼料工業(yè)發(fā)展的要求(Han Y.W.，Animal Feed Sci.Technol.，24345-350，1989).隨著生物技術(shù)、基因工程等高新技術(shù)的發(fā)展，人們意識到通過基因工程的手段，利用生物反應(yīng)器來高效表達植酸酶基因，可望達到大幅度提高植酸酶產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本的目的(Conneely O.M.，Biotechnologyin the Feed Industry，T.P.Lyons(Ed)，Alltech Technical Publications.Nicholasville，K Y.57-66，1992)。
幾種微生物來源的植酸酶基因已得到了分離，如酵母Saccaromyces cerevisiae(Bajwa W.，Nucleic Acids Res.127721-7739，1984)、Aspergillus niger(MacRae W.D.，Gene，71339-348，1988；姚斌，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，Vol.6，No.1，1-6，1998)、A.terreus和Myceliophthorathermophila(van Loon，Patent NO.EP 0684313A2，1995)、A.niger(ficuum)(van Hartimgsveldt et al.，Gene，12787-94，1993；Ehrlich K.C.，Biocem.Biophys.Res.Comm.19553-57，1993)、A.niger var.awamori(Piddington C.S.Gene，13355-62，1993)等。
通過基因工程手段使植酸酶基因在重組菌株中高效表達是植酸酶得以大規(guī)模廉價生產(chǎn)和實際應(yīng)用的有效途徑。1995年Van Gorcomd等(Van Gorcom R.F.M.et al.，1995)將酸性植酸酶基因phyA重組到黑曲霉中，使植酸酶在重組菌株中的表達量達到了2.8×105U/mL，與天然植酸酶產(chǎn)生菌株相比有了大幅度的提高，大大降低了植酸酶的生產(chǎn)成本。1997年姚斌等構(gòu)建的基因工程酵母在小試水平上其酸性植酸酶的表達量達到5×105U/mL(相當(dāng)于每毫升發(fā)酵液中表達5mg植酸酶蛋白)(姚斌等，中國發(fā)明專利97121731.9，2000)，中試水平上將表達量提高到1×106U/mL發(fā)酵液，比原始的天然菌株Aspergillus niger 963中的植酸酶表達量高3000倍，比國外正在用于商品化生產(chǎn)酸性植酸酶的基因工程曲霉(Van Gorcom R.F.M.et al.，US Patent 5436156,1995)高一倍以上。最近姚斌等采用來源于大腸桿菌的高比活植酸酶基因構(gòu)建了重組酵母，將植酸酶的表達水平提高到6×106以上(姚斌，生物工程學(xué)報，20(1)78～84，2004)。
目前分離到的比活性最高的植酸酶為來源于大腸桿菌的植酸酶APPA(Golovan S.Can J Microbiol，4659～71,2000)。其比活性可達3,000,000IU/mg左右。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過構(gòu)建豬腸道微生物總DNA基因組文庫的方法，直接篩選到高比活植酸酶基因，進一步，利用生物反應(yīng)器畢赤酵母(Pichia pastoris)高效表達此基因，使植酸酶得以廉價生產(chǎn)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種編碼本發(fā)明的植酸酶的DNA分子。所述的DNA分子具有圖2(SEQ ID NO.1)的核苷酸序列。
本發(fā)明的再一目的是提供本發(fā)明的植酸酶基因在表達系統(tǒng)中高效表達的方法。
本發(fā)明人從豬腸道微生物總DNA中篩選到高比活植酸酶基因。篩選到的植酸酶基因(定名為PHYQ)編碼的植酸酶，其比活性高達4.1×106IU/mg蛋白，與目前報道的比活性最高的植酸酶APPA(來源于大腸桿菌)相比，比活性高37％。該基因phyQ長該基因全長1299bp，編碼432個氨基酸，與報道的植酸酶相比，同源性最高的是來源于大腸桿菌的植酸酶APPA，但核苷酸序列同源性僅為67.7％，氨基酸序列同源性僅為50.3％，是一種新的植酸酶基因，具有如圖2(SEQ ID NO.2)所述的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了具有如圖3(SEQ ID NO.2)所示的氨基酸序列的植酸酶具有。
本發(fā)明提供了phyQ基因在表達系統(tǒng)中高效表達的方法。包括整套重組表達載體的構(gòu)建、受體菌的遺傳轉(zhuǎn)化、重組子的篩選與分子鑒定方法以及重組子中植酸酶表達，其中本發(fā)明采用畢赤酵母(P.pastoris)作為phyQ基因的表達受體，它為利用重組酵母工業(yè)化大規(guī)模、低成本發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶奠定了基礎(chǔ)。
上述phyQ基因在表達系統(tǒng)高效表達的方法中，其它可以使用的真核表達系統(tǒng)為昆蟲表達系統(tǒng)如家蠶-桿狀病毒表達系統(tǒng)、霉菌表達系統(tǒng)如黑曲霉表達和植物表達系統(tǒng)如玉米、大豆等。
上述phyQ基因在表達系統(tǒng)高效表達的方法中，可以使用大腸桿菌作為克隆和表達該植酸酶基因的載體。
本發(fā)明還提供了含有所述phyQ基因的表達載體。
本發(fā)明提供了phyQ的表達載體pPIC9-phyQ。
本發(fā)明提供的具體技術(shù)方案如下1.豬腸道中微生物總DNA的提取和純化 參照從土壤中提取、純化總DNA的方法(張福瑞等，微生物學(xué)報，2003，2276-282；Ogram A等，J Microb.Methods，1987，757-66)。
2.基因克隆按常規(guī)方法克隆(Maniatis T.，et al.Molecular cloning.New YorkCold Spring harbor laboratory，1982)。將提取的總DNA酶切后克隆到大腸桿菌載體pET-22b(+)上，同樣的方法也可克隆到大腸桿菌克隆載體或表達載體上，如pPUC18、pPGEM等，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得重組子。
3.植酸酶的篩選 對重組大腸桿菌表達的植酸酶進行性質(zhì)測定，篩選出比活性高的植酸酶的編碼基因，并進行序列測定。
4.重組高效表達體系的構(gòu)建選擇高效表達系統(tǒng)-P.pastoris作為表達植酸酶基因的生物反應(yīng)器。通過體內(nèi)重組使植酸酶基因整合到酵母的基因組上，篩選出陽性重組子。別的真核表達系統(tǒng)如桿狀病毒的昆蟲表達系統(tǒng)、霉菌表達系統(tǒng)、植物表達系統(tǒng)等也適應(yīng)于此基因的高效表達。
本發(fā)明提供了具有高比活性的植酸酶及其編碼基因。通過基因工程手段使植酸酶基因在重組菌株中高效的表達，使得植酸酶可以大規(guī)模的廉價生產(chǎn)，并在實際中得到廣泛的應(yīng)用。帶來巨大的經(jīng)濟效益。


圖1大腸桿菌重組載體pWY的物理圖譜圖2phyQ基因DNA序列圖3推導(dǎo)出的phyQ編碼的氨基酸序列圖4重組酵母表達載體pPIC9-phyQ的物理圖譜圖5在5L發(fā)酵罐中表達植酸酶的發(fā)酵曲線；
具體實施例方式
具體實施方式
實驗條件1.菌株與載體 大腸桿菌菌株E.coli DH5a、質(zhì)粒pET-22b(+)等購自Promega公司，酵母菌株P(guān)ichia pastoris GS115(His-Mut+)、質(zhì)粒pPIC9由加拿大Alberta大學(xué)D.Luo博士惠贈(Invitrogen公司產(chǎn)品)。
2.酶與試劑盒 限制性內(nèi)切酶、連接酶為Boehringer公司產(chǎn)品。
3.生化試劑 IPTG、X-Gal、SDS及植酸鈉為Sigma公司產(chǎn)品。TEMED、過硫酸銨、丙烯酰胺及甲叉雙丙烯酰胺為Promega公司產(chǎn)品。
4.培養(yǎng)基 大腸桿菌培養(yǎng)基為LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。酵母完全培養(yǎng)基為YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)；酵母轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為RDB[18.6％山梨醇、2％葡萄糖、1.34％Yeast Nitrogen Base W/O amino acids(YNB)、0.00004％Biotin、0.005％谷氨酸、0.005％甲硫氨酸、0.005％賴氨酸、0.005％亮氨酸、0.005％異亮氨酸、2％瓊脂糖]；酵母選擇培養(yǎng)基為MM(1.34％YNB、0.00004％Biotin、0.5％甲醇、1.5％瓊脂糖)和MD(1.34％YNB、0.00004％Biotin、2％葡萄糖、1.5％瓊脂糖)；酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMGY[1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V)]和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相與BMGY相同)。重組酵母發(fā)酵培養(yǎng)基為10×Basal Salts(2.67％磷酸、0.093％硫酸鈣、1.82％硫酸鉀、1.49％硫酸鎂、0.413％氫氧化鉀、4％甘油或葡萄糖)；發(fā)酵中所用的微量鹽溶液PTM1(0.6％硫酸銅、0.008％碘化鈉、0.3％硫酸錳、0.02％鉬酸鈉、0.002％硼酸、0.05％氯化鈷、2％氯化鋅、6.5％硫酸亞鐵、0.025％生物素、0.5％硫酸)。
實驗一本實驗說明豬腸道微生物總DNA的提取和純化程序。
取豬腸液0.5mL，加入1mL DNA提取液(100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA，100mmol/L磷酸鈉，1.5mol/L NaCl，1％CTAB，pH9.0)，混勻，加入100mL蛋白酶K(10mg/mL)，37℃搖動1hr，加入1.5mL 20％的SDS，65℃水浴2hr，6000rpm離心10min，收集上清液。沉淀部分再加入450mL提取液和50mL的20％SDS，65℃水浴2hr，6000rpm離心10min，收集上清液并與上次上清液合并。上清液中加入等體積的氯仿抽提，上清液用0.6倍體積沉淀。沉淀溶于50mL水中備用。
DNA純化采用電泳純化的方法。將提取的總DNA在0.5％的瓊脂糖凝膠電泳，切取DNA條帶，用QXII DNA純化試劑盒回收，回收方法見試劑盒使用說明。
實驗二本實驗說明DNA分子的克隆程序。
實驗一中獲得的DNA分子，用Sau3A部分酶切，使酶切片斷集中在2.0～8.0kb，電泳回收，與經(jīng)BamHI酶切的載體pET-22b(+)于15℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5a，LB培養(yǎng)基上涂板后挑選陽性重組子，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，得到重組子。每個重組子中含有一段DNA分子。
實驗三本實驗說明進行突變植酸酶的篩選程序。
實驗二中得到的5000個重組子，分別接種到5mL LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)至OD值0.6，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)2小時，誘導(dǎo)表達植酸酶。離心收集菌體，菌體重懸于5mL 0.25mol/L醋酸緩沖液(pH5.0)中，超聲波破碎菌體，15000rpm離心15分鐘去細胞碎片，上清液用于進行植酸酶酶活性測定。測定方法為0.2mL的酶稀釋液加入0.8mL 1.25mmol/L的植酸鈉，37℃保溫30min，加入1mL 10％TCA終止酶活反應(yīng)，然后加入2mL硫酸亞鐵-鉬酸銨顯色液，700nm測定無機磷含量。對照為先在0.2mL的酶稀釋液中加入1mL 10％TCA使酶滅活，再加入同體積的底物保溫。一個酶活性單位(U)定義為在一定條件下，每分鐘釋放出1nmol無機磷所需酶量為一個酶活性單位。篩選到8個重組子可產(chǎn)生植酸酶活性，進一步通過實驗確定植酸酶的比活性。8個重組子培養(yǎng)后，收集菌體細胞，進行超聲波破碎，含植酸酶的細胞破碎液用85％硫酸胺沉淀濃縮，純化用KTA FPLC快速液相色譜儀(Pharmacia公司)純化。含酶的濃縮液首先用HiPrep_26/10_Desalting柱脫鹽，緩沖液為20mmol/L HAc-NaAc(pH5.0)，流速為5mL/min，收集洗脫峰，接著用離子交換柱Hitrip_SP_Sepharose_XL(5mL)分離，A泵為15mmol/L HAc-NaAc(pH5.0)，B泵為1mol/L NaCl、15mmol/LHAc-NaAc(pH5.0)高鹽緩沖液，流速為1.5mL/min，高鹽緩沖液從0～100％梯度洗脫10個柱床，分部收集洗脫峰，通過酶活性測定后的洗脫峰進一步用凝膠柱Superdex 75HR 10/30純化，緩沖液同樣為15mmol/L HAc-NaAc(pH5.0)，流速為0.8mL/min，收集洗脫峰得到純蛋白。對純化的植酸酶進行酶活性的測定，計算酶活性和酶蛋白的比值，得到酶的比活性。8個重組子中，產(chǎn)生的植酸酶比活性最高的達到4.1×106IU/mg蛋白，高于目前報道的所用植酸酶，比目前發(fā)現(xiàn)的比活性最高的植酸酶APPA還高37％。該重組質(zhì)粒定名為pWY，該植酸酶定名為PHYQ。
實驗四本實驗說明植酸酶PHYQ的序列。
對重組質(zhì)粒pWY上的植酸酶基因進行序列測定，圖3為其核苷酸序列，圖4為其氨基酸序列。結(jié)果表明，該基因phyQ長該基因全長1299bp，編碼432個氨基酸，與報道的植酸酶相比，同源性最高的是來源于大腸桿菌的植酸酶APPA，但核苷酸序列同源性僅為67.7％，氨基酸序列同源性僅為50.3％，是一種新的植酸酶基因。
實驗五本實驗說明phyQ在酵母表達載體上的構(gòu)建程序。
用于構(gòu)建酵母表達載體的質(zhì)粒是pPIC9(帶有α-因子分泌信號)。首先將植酸酶基因插入到上述表達載體的信號肽序列的下游，與信號肽形成正確的閱讀框架，然后通過載體與酵母P.pastoris染色體基因組之間的同源重組事件使目的基因穩(wěn)定整合到酵母染色體上。具體的過程是根據(jù)植酸酶基因phyQ的5’端和3’端設(shè)計一對引物，在引物上加上EcoRI位點(p15’TTGAATTCATGATACCCACCGGAAACCC；p25’GCGAATTCTTACAGATCCCACGCCAAAAT)，以重組質(zhì)粒pWY為模板，PCR擴增出1.3Kb的植酸酶基因，用EcoRI酶切后，電泳回收約，再將它們插入到載體pPIC9上的EcoRI位點，通過序列測定判斷phyQ的插入方向，得到了插入方向正確的用于酵母轉(zhuǎn)化的重組表達載體-pPIC9-phyQ(圖4)。這樣就將帶有α-因子分泌信號的植酸酶基因克隆到了AOX1啟動子下游。
實驗六本實驗是說明酵母轉(zhuǎn)化及篩選重組酵母株系的程序。
質(zhì)粒pPIC9-phyQ的DNA經(jīng)BglII酶切后電擊轉(zhuǎn)化酵母細胞后，通過體內(nèi)重組，目的基因?qū)⒄系绞荏w酵母基因組中。在外源誘導(dǎo)物甲醇存在的條件下，AOX1啟動子可以啟動其下游基因的表達，并且信號肽可以指導(dǎo)表達產(chǎn)物進入酵母的分泌途徑，經(jīng)過切割，外源蛋白產(chǎn)物最終分泌至胞外，所產(chǎn)生的植酸酶氨基酸序列按設(shè)計應(yīng)與天然存在的成熟植酸酶完全相同。外源蛋白經(jīng)過這樣的代謝途徑，可以進行翻譯后修飾，例如糖基化等，從而得到具有生物活性的蛋白產(chǎn)物。
首先用2～3倍過量的內(nèi)切酶BglII消化質(zhì)粒pPIC9-phyQ的DNA，使之線性化，電泳檢測酶切是否完全。用酚抽提，乙醇沉淀，70％乙醇洗兩次，冷凍干燥，無菌水溶解，取5μgDNA轉(zhuǎn)化畢赤酵母細胞，在RDB固體培養(yǎng)基上涂板，每板涂0.1mL，30℃下將培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。
轉(zhuǎn)化子可在基本培養(yǎng)基RDB(不含His)上生長，而非轉(zhuǎn)化子不能生長，這是因為受體菌GS115為組氨酸缺陷型，而載體上雖然帶有his4基因，但沒有酵母復(fù)制子，所以載體上的his4基因必須整合進酵母基因組中才能表達。另外，由于重組的酵母細胞中AOX1基因受到破壞，所以它就不能再利用甲醇作為碳源。這樣，在以甲醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化子就不會生長(或者生長極緩慢)，表現(xiàn)為甲醇利用缺陷型(mut-)。
用無菌牙簽從轉(zhuǎn)化平板RDB上挑取his+重組子，首先接種到MM固體培養(yǎng)基上，再接種到MD固體培養(yǎng)基上，如此挑取his+重組子，30℃培養(yǎng)2天。篩選在MD平板上生長正常但在MM平板上有一點生長或完全不生長的克隆子(his+mut-)即為陽性克隆子。
為了篩選得到高表達的重組酵母菌株，直接檢測誘導(dǎo)培養(yǎng)基中植酸酶的表達情況。將his+mut-轉(zhuǎn)化子首先在BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待其生長至飽和狀態(tài)，離心棄BMGY，換入誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY，在誘導(dǎo)培養(yǎng)36h后取上清液進行植酸酶酶活性分析。通過表達植酸酶的酶活性測定，從350株重組酵母中初步篩選到42株表達植酸酶的重組子，其中表達量最高的1株重組子，定名為P.pastoris phyQ-66。
實驗九本實施例是說明重組酵母在5升發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶的程序。
發(fā)酵過程分為三個階段。具體如下1)菌株培養(yǎng)階段。發(fā)酵培養(yǎng)基10×Basal Salts接種前先加入28％氨水使培養(yǎng)基的pH達到5.0，再按每升培養(yǎng)基加入4.37mL PTM1，5-10％接種種子液，通氣攪拌培養(yǎng)18～24h，在培養(yǎng)過程中隨著菌株的生長，培養(yǎng)基中的溶氧量由100％逐漸降低，當(dāng)碳源消耗完后溶氧量將再度升高至80％以上，此時菌體濕重達到90～110g/L。2)碳源飼喂階段。流加25％葡萄糖(每升中含12mL PTM1)，流加量為28mL/h/L，培養(yǎng)4h。調(diào)整通氣量使溶氧量始終大于20％。此步結(jié)束時菌體濕重達到180～220g/L。3)誘導(dǎo)表達階段。加入誘導(dǎo)劑甲醇(每升中含12mL PTM1)，使甲醇終濃度維持在0.3％，溶氧量始終大于20％。在誘導(dǎo)過程中每12h取樣一次測定表達的植酸酶的積累量。
結(jié)果表明，表達的植酸酶隨誘導(dǎo)時間的增加而積累，在誘導(dǎo)120小時時達到高峰，酶活性達到5.5×106U/mL發(fā)酵液(圖5)。結(jié)果證明植酸酶基因不僅得到了表達、有效分泌，且表達的植酸酶具有正常的生物學(xué)活性。
Application Project<110>Applicant劉大慶<120>Title高比活植酸酶基因及其高效表達<210>1<211>Length1299SequenceNamephyQ<212>TypeDNA<213>未知Sequence<400>PreSequenceStringSEQ ID No.1atgataccca ccggaaaccc acagctatct catgtgactc catttaccgc gcaatctgca 60tttgcacagc gagaacctat gctcatgctc gtaaatatgg tgaatctcag tggacatggg 120gcgcgtatcc caactaagga tacgcaacgc atgcaggacc tcacccgaga cgcatgtcaa 180acccgcccgg taaacgtggg aacgctggcg ccgtgcggtg gtttcctaat ccgctactcc 240ggtgattacg gccgcgaacg tctccaagcc atgggaaaag tggcgaacca gggctatccg 300cagccgggtc aggtcttgat ttctgcaaat gttcccgagc gttcccgtag cacaggaaaa 360gcctgcgccg ttgggctccg accttactgt gcagggaccg tccctaccca cgaagaagag 420tccagtcggg atccggcgtt taatgaacta acaactgatg tttcgcaact taataacaag 480aacgtgcccg acgcgggggt cagcagatca gtagggtcaa gggctgactc caccgaacat 540aagcaaacgg tatttcggca actttcccgg tcgcttaatt ggccgctttc attcttgtat 600cttacccgtg ccaaactaga cgcgagctgt ttattacggc acccattgtt agcggaactc 660ccggtgattt ccgaccccgt ctcaggaact agtgccctat acctgacatc ggtgcgtacg 720acgatacggc tcgggcaaca ttcacagata atcccggagc aaaagtgggt ggggatctgg 780gatttacata cgtggagggc ctccctaaga gcgcatggag cgcaaagaga ttttttactt 840cgccggccac cggtcccccg cgtccgcata gccccggggt tagacccgat caccacagct 900ttgacttccc tttcaggcca aactcaggag gaagctgtgg gcctacccgc ctcagttttg 960tttataatcg gacttgatat ttatctgccc aatcttaccg gcggggtgga attcaacgcg 1020acgcgcgccg gagagcctta taatttgccg cccggtgcgc aactgaaatt tgggggctgc 1080ggtcttctaa atgatatttg ccagaaaatt caggcgccgc tccgcttcat aacttttatg 1140caggcccgtg gccaaacgaa gctagcattt aaggggcccg gcggagaatt gaatctgacc 1200aaagcaggcc ctgaagcgcg aaattttcag ggttagtgtt ccccggccgg ttatgcgccg 1260ctcgcgcatg ttgcgaacat tttggcgtgg gatctgtaa 1299<210>2<211>Length1211SequenceNamePHYQ<212>TypePRT<213>未知<400>PreSequenceString SEQ ID No.2MIPTGNPQLS HVTPFTAQSA FAQREPMLML VNMVNLSGHG ARIPTKDTQR MQDLTRDACQ 60TRPVNVGTLA PCGGFLIRYS GDYGRERLQA MGKVANQGYP QPGQVLISAN VPERSRSTGK 120ACAVGLRPYC AGTVPTHEEE SSRDPAFNEL TTDVSQLNNK NVPDAGVSRS VGSRADSTEH 180KQTVFRQLSR SLNWPLSFLY LTRAKLDASC LLRHPLLAEL PVISDPVSGT SALYLTSVRT 240TIRLGQHSQI IPEQKWVGIW DLHTWRASLR AHGAQRDFLL RRPPVPRVRI APGLDPITTA 300LTSLSGQTQE EAVGLPASVL FIIGLDIYLP NLTGGVEFNA TRAGEPYNLP PGAQLKFGGC 360GLLNDICQKI QAPLRFITFM QARGQTKLAF KGPGGELNLT KAGPEARNFQ GCSPAGYAPL 420AHVANILAWD L 43權(quán)利要求
1.一種新的植酸酶，其特征在于該酶蛋白具有SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。
2.編碼如權(quán)利要求1所述的植酸酶的基因，其特征在于該植酸酶的編碼基因具有SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。
3.高效表達如權(quán)利要求2所述的植酸酶基因的方法，包括整套重組表達載體的構(gòu)建、受體菌的遺傳轉(zhuǎn)化、重組子的篩選與鑒定及重組子中植酸酶基因的表達，其特征在于在表達植酸酶基因的步驟中利用高效表達系統(tǒng)畢赤酵母作為表達植酸酶基因的生物反應(yīng)器。
4.如權(quán)利要求3所述的表達植酸酶的基因的高效表達方法，其特征在于所述生物反應(yīng)器也可以為桿狀病毒的昆蟲表達系統(tǒng)、霉菌表達系統(tǒng)、植物表達系統(tǒng)。
5.包括權(quán)利要求2的植酸酶基因的表達載體。
6.包括權(quán)利要求2的植酸酶基因的表達載體pPIC9-phyQ。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高比活植酸酶及其編碼基因，篩選到的植酸酶基因(定名為PHYQ)編碼的植酸酶，其比活性高達4.1×10
文檔編號C12N15/81GK1775948SQ200410088659
公開日2006年5月24日 申請日期2004年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月15日
發(fā)明者劉大慶, 王福江 申請人:劉大慶