專利名稱：微生物法制備光學(xué)純(r)－2－辛醇的方法及其專用微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
微生物法制備光學(xué)純(R)-2-辛醇的方法及其專用微生物，屬于生物法拆分外消旋化合物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2-辛醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)為 外消旋2-辛醇由(R)-2-辛醇和(S)-2-辛醇兩個(gè)對映體構(gòu)成。
光學(xué)純2-辛醇，包括(R)-2-辛醇和(S)-2-辛醇，其不僅是合成類固醇、維生素E和昆蟲性外激素(生物殺蟲劑)等許多光學(xué)活性藥物和農(nóng)藥的重要手性中間體，而且是制備高性能液晶及其器件的不可缺少的重要手性原料，它的旋光性和高介電常數(shù)與液晶的許多性能密切相關(guān)；作為重要的中間體，也用于精細(xì)化工有機(jī)合成，生產(chǎn)手性化學(xué)材料。因此，開展2-辛醇拆分方法的研究極有意義。
手性化合物在人們生活中具有重要作用，由于兩個(gè)對映體在藥理、毒理及功能作用等各方面均有所不同，因此，制備光學(xué)純的手性模塊化合物在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、材料以及環(huán)保等領(lǐng)域都具有廣泛的價(jià)值。
利用傳統(tǒng)的化學(xué)法制備光學(xué)純2-辛醇需在反應(yīng)中添加昂貴并具有毒性的手性催化劑，拆分難度較大，會對環(huán)境造成危害，因此利用生物法轉(zhuǎn)化光學(xué)純2-辛醇就成為研究的熱點(diǎn)。
目前，國際上拆分外消旋化合物常見方法主要包括化學(xué)拆分法，色譜拆分法，液體膜拆分法和手性固體膜拆分的膜拆分法，和生物法。
利用生物法轉(zhuǎn)化制備光學(xué)純的手性化合物具有反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物單一，立體選擇性、區(qū)域選擇性和化學(xué)選擇性較高，并能完成一些化學(xué)合成難以進(jìn)行的反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。合成光學(xué)活性物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)大致可分為兩類一類是把外消旋體拆分為兩個(gè)具有光學(xué)活性的對映體；另一類是從內(nèi)消旋或前手性的前體出發(fā)，通過催化反應(yīng)得到不對稱的光學(xué)活性產(chǎn)物。
90年代起國際上對微生物及酶拆分手性化合物進(jìn)行大量的研究。酶由L-氨基酸構(gòu)成，其活性中心構(gòu)成了一個(gè)不對稱環(huán)境，有利于對消旋體的識別，是一種高度手性的催化劑。其催化效率高，有較強(qiáng)的專一性。酶促拆分消旋體是比較理想的選擇。利用完整細(xì)胞對外消旋化合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，可以獲得光學(xué)純對映體，在非水相及有機(jī)—水雙相反應(yīng)體系中，也可酶促轉(zhuǎn)化制備光學(xué)純化合物。
據(jù)報(bào)道，目前生物法制備光學(xué)純2-辛醇的方法主要為利用脂肪酶進(jìn)行動力學(xué)拆分。在轉(zhuǎn)化過程中，通過脂肪酶選擇性的催化外消旋底物的一種對映體發(fā)生酯化或水解反應(yīng)，而另一種對映體不發(fā)生反應(yīng)，從而達(dá)到拆分的目的。
該方法雖能得到光學(xué)純的產(chǎn)物，但在反應(yīng)中只保留了外消旋底物中的某一對映體，而沒有實(shí)現(xiàn)一種對映體向另一種對映體的轉(zhuǎn)化，因此其理論產(chǎn)率最高只能達(dá)到50％；反應(yīng)過程較復(fù)雜，需在酯化后將生成的酯與未反應(yīng)的對映體分離后經(jīng)水解才能得到另一種對映體；反應(yīng)后體系成分較為復(fù)雜，為產(chǎn)物分離帶來一定的困難。由于以上方法的缺陷，應(yīng)用脂肪酶催化轉(zhuǎn)化手性2-辛醇尚未實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
中國專利CN1366550A已報(bào)道得到了一種(R)-2-辛醇脫氫酶，能夠優(yōu)先氧化2-辛醇的兩種光學(xué)異構(gòu)體中的(R)-2-辛醇，但其不能以外消旋2-辛醇為底物轉(zhuǎn)化得到(R)-2-辛醇，且在手性醇制備的應(yīng)用方面僅以酮為底物還原得到相應(yīng)的手性醇，而不是以外消旋體為底物通過手性拆分的過程得到光學(xué)純的產(chǎn)物。

發(fā)明內(nèi)容
(1)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種微生物法制備光學(xué)純(R)-2-辛醇的方法及其專用微生物。本發(fā)明目的不僅僅在于制備高光學(xué)純度的(R)-2-辛醇，而且通過篩選尋找不同于以往研究的新菌種，從而考察在手性拆分方面微生物菌種的多樣性，進(jìn)而比較不同菌種在轉(zhuǎn)化途徑及反應(yīng)機(jī)理上的差別。
(2)技術(shù)方案一、選擇菌株經(jīng)過對實(shí)驗(yàn)室保藏的包括細(xì)菌、酵母和霉菌等大量微生物進(jìn)行篩選，從所得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的光學(xué)純度和產(chǎn)率兩個(gè)方面考慮，選定柱狀假絲酵母(Candidacylindracea SYB-3)CCTCC M204041為催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)用出發(fā)菌株。
產(chǎn)物(R)-2-辛醇，光學(xué)純度為90～100％e.e.，產(chǎn)率為55～90％。
二、菌株的培養(yǎng)培養(yǎng)基成分優(yōu)化通過Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)考察了C.cylindracea CCTCC M204041菌株培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件中的溫度、pH值、搖瓶轉(zhuǎn)速、碳源、氮源及無機(jī)鹽成分對轉(zhuǎn)化效果的影響，得到顯著影響因子為搖瓶轉(zhuǎn)速、碳源、氮源及(NH4)2HPO4。對以上顯著影響因子進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)最終確定柱狀假絲酵母C.cylindracea CCTCC M204041培養(yǎng)基組成為(g/100ml)葡萄糖2～6，酵母膏0.25～1，(NH4)2HPO40.5～2.0，KH2PO40.1～0.5，MgSO4·7H2O0.02～0.06，NaCl 0.0025～0.01，ZnSO4·7H2O 0.001～0.005，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001～0.005，CuSO4·5H2O 0.0001～0.0005，MnSO4·4H2O 0.00025～0.001。
柱狀假絲酵母C.cylindracea CCTCC M204041培養(yǎng)條件為起始pH6.0～8.0，裝液量5～30％，培養(yǎng)溫度25～35℃，搖瓶轉(zhuǎn)速100～300rpm，培養(yǎng)時(shí)間24～72小時(shí)。
優(yōu)化后，C.cylindracea CCTCC M204041轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(R)-2-辛醇的光學(xué)純度為93～100％e.e.。
三、全細(xì)胞的制備和催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)全細(xì)胞的制備C.cylindracea CCTCC M204041從斜面上取一環(huán)接種在裝液量為5～30％培養(yǎng)液的250ml搖瓶中于25～35℃、100～300rpm振蕩培養(yǎng)24～72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，將該菌株的菌體離心并用生理鹽水洗滌兩次，收集得到菌株全細(xì)胞用于拆分反應(yīng)。
全細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)C.cylindracea CCTCC M204041全細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件為菌體細(xì)胞溶于0.1mol/L的磷酸鉀緩沖溶液中，細(xì)胞濃度5～20％(W/V)，底物外消旋2-辛醇溶于烷烴溶劑中，底物濃度0.5～2％(W/V)，反應(yīng)體系中水相pH值6.0～8.0，反應(yīng)溫度25～33℃，有機(jī)相采用烷烴包括環(huán)己烷、正戊烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、正壬烷或正癸烷，有機(jī)-水兩相比例1∶3～9∶1，反應(yīng)時(shí)間8～48小時(shí)。
反應(yīng)后混合物離心，取2ml上清液用4ml相同烷烴萃取，得到的有機(jī)相用于分析。
(R)-2-辛醇和(S)-2-辛醇分析方法的確定(R)-2-辛醇、(S)-2-辛醇、(R，S)-2-辛醇標(biāo)樣在Chrompack CP-Chirasil Dex CB柱上通過氣相色譜(GC)進(jìn)行分析，(R)-2-辛醇的保留時(shí)間為18.2min，(S)-2-辛醇的保留時(shí)間為18.5min。所用氣相色譜儀為CP3900購于美國Varian公司，手性柱CP-Chirasil-Dex CB(25m×0.25mm×0.25μm)購于美國Chrompack公司。
確定具體色譜條件為手性柱CP-Chirasil-Dex CB(25m×0.25mm×0.25μm)；載氣H2；柱溫70℃；進(jìn)樣口溫度250℃；檢測器溫度270℃；載氣流量2.5ml/min；分流比50。
產(chǎn)物的光學(xué)純度通過對映過量值(％e.e.)來評價(jià)。
(S)-2-辛醇％e.e.＝[(CS-CR)/(CS+CR)]×100％(R)-2-辛醇％e.e.＝[(CR-CS)/(CS+CR)]×100％殘余2-辛醇Residual(％)＝[(CS+CR)/C0]×100％產(chǎn)率yield(％)＝Residual×[1-(100-％e.e.)/200]CS反應(yīng)后(S)-對映體的含量；CR反應(yīng)后(R)-對映體的含量；C0反應(yīng)前(S)-和(R)-對映體的含量之和。
反應(yīng)中間體的分析利用氣相色譜質(zhì)譜儀分析反應(yīng)中間體。取反應(yīng)8小時(shí)的樣品，進(jìn)行GC-MS分析，確定反應(yīng)中間體的化學(xué)結(jié)構(gòu)。所用氣相色譜質(zhì)譜儀Trace MS美國Finigon質(zhì)譜公司出品。
GC-MS色譜條件為色譜柱ov17(30m×0.25mm×0.25μm)；起始溫度50℃；終止溫度210℃；程序升溫速度10deg/min；停留時(shí)間1.0min；載氣He；起始流速0.80ml/min。
通過對微生物細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化8小時(shí)的反應(yīng)混合物進(jìn)行GC-MS分析，2-辛醇(保留時(shí)間6.03min)外，還有另外一種物質(zhì)(保留時(shí)間5.89min)存在并積累。通過對上述物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)其分子離子為m/z128.1，根據(jù)其碎片的結(jié)構(gòu)可以確定該物質(zhì)為2-辛酮。因此，確定轉(zhuǎn)化外消旋2-辛醇的反應(yīng)中間體為2-辛酮。
考察轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程，發(fā)現(xiàn)C.cylindracea CCTCC M204041先將(S)-2-辛醇轉(zhuǎn)化為中間體2-辛酮，然后再將2-辛酮不對稱還原為(R)-2-辛醇。因此，反應(yīng)后(R)-2-辛醇的含量高于反應(yīng)前外消旋混合物中(R)-2-辛醇對映體的含量，產(chǎn)物的產(chǎn)率高于50％。
除了能夠高效轉(zhuǎn)化外消旋2-辛醇，C.cylindracea CCTCC M204041全細(xì)胞還可以用于催化其他次級手性醇，如2-庚醇，2-戊醇，2-己醇等的不對稱轉(zhuǎn)化。
柱狀假絲酵母(Candida cylindracea SYB-3)CCTCC M204041菌落形態(tài)為乳白色，表面光滑，有光澤，菌落不透明。菌體形態(tài)為卵圓形，細(xì)胞無性繁殖，芽殖，有時(shí)有假菌絲和有隔菌絲。生理生化特性為發(fā)酵葡萄糖，能利用D-半乳糖，D-木糖，L-阿拉伯糖，蔗糖，麥芽糖，海藻糖，甲基-a-D-吡喃葡糖苷，松三糖，甘油，D-山梨醇，D-甘露醇，D-葡糖酸-1，5-內(nèi)酯，2-酮-D-葡糖酸，琥珀酸，檸檬酸，乙醇作為唯一碳源，能利用乙胺，L-賴氨酸作為唯一氮源。最適生長溫度28℃，最適起始作用pH7.0。該菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化2-辛醇的最適溫度30℃，最適作用pH6.8。
(3)有益效果本發(fā)明通過篩選得到轉(zhuǎn)化生成(R)-2-辛醇效果較好的菌株Candida cylindraceaCCTCC M204041。
利用C.cylindracea CCTCC M204041不對稱轉(zhuǎn)化外消旋2-辛醇得到產(chǎn)物(R)-2-辛醇，產(chǎn)物的光學(xué)純度可達(dá)到90％e.e.以上。該菌株還可以用于催化其他次級手性醇，如2-庚醇，2-戊醇，2-己醇等的不對稱轉(zhuǎn)化。
經(jīng)培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件優(yōu)化后，C.cylindracea CCTCC M204041不對稱轉(zhuǎn)化外消旋2-辛醇得到產(chǎn)物(R)-2-辛醇的光學(xué)純度得到提高，確定了優(yōu)化的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件。
確定了該菌株全細(xì)胞不對稱轉(zhuǎn)化外消旋2-辛醇的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。
對該菌株全細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化的反應(yīng)途徑進(jìn)行了研究，并探討了轉(zhuǎn)化反應(yīng)機(jī)理。這些工作有助于了解外消旋化合物拆分的生物多樣性，對于今后拆分專用酶源的開發(fā)和拆分方法的研究具有較為重要的意義。
生物材料樣品保藏柱狀假絲酵母保藏日期2004年6月16日，保藏單位名稱及簡稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC，保藏編號為NOM204041。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1菌株的培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為每100ml培養(yǎng)液所含組分以g計(jì)葡萄糖2～6，酵母膏0.25～1，(NH4)2HPO40.5～2.0，KH2PO40.1～0.5，MgSO4·7H2O 0.02～0.06，NaCl 0.0025～0.01，ZnSO4·7H2O 0.001～0.005，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001～0.005，CuSO4·5H2O 0.0001～0.0005，MnSO4·4H2O 0.00025～0.001。
培養(yǎng)條件為起始pH6.0～8.0，裝液量30％，培養(yǎng)溫度25℃，搖瓶轉(zhuǎn)速100～300rpm，培養(yǎng)時(shí)間72小時(shí)。
實(shí)施例2菌株的培養(yǎng)培養(yǎng)基組成同實(shí)施例1。培養(yǎng)條件為起始pH6.0～8.0，裝液量5％，培養(yǎng)溫度35℃，搖瓶轉(zhuǎn)速100～300rpm，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)。
實(shí)施例3全細(xì)胞的制備C.cylindracea CCTCC M204041從斜面上取一環(huán)接種在裝液量為30％培養(yǎng)液的250ml搖瓶中于25℃、100～300rpm振蕩培養(yǎng)72小時(shí)；培養(yǎng)結(jié)束后將菌株的菌體離心并用生理鹽水洗滌兩次，收集得到菌株全細(xì)胞用于轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
實(shí)施例4
全細(xì)胞的制備C.cylindracea CCTCC M204041從斜面上取一環(huán)接種在裝液量為5％培養(yǎng)液的250ml搖瓶中于35℃、100～300rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)；培養(yǎng)結(jié)束后將菌株的菌體離心并用生理鹽水洗滌兩次，收集得到菌株的全細(xì)胞用于轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
實(shí)施例5在1ml、0.1mol/L的磷酸鉀緩沖溶液中(pH6.8)，加入0.2g(10％)柱狀假絲酵母C.cylindracea CCTCC M204041菌體細(xì)胞得到菌懸液，20mg(1.0％)外消旋2-辛醇溶于1ml正辛烷中，將水相和有機(jī)相混合，于30℃恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)10小時(shí)。反應(yīng)后混合物離心，取上清液萃取，產(chǎn)物(R)-2-辛醇光學(xué)純度97.84％e.e.，產(chǎn)率80.65％。
實(shí)施例6在1ml、0.1mol/L的磷酸鉀緩沖溶液中(pH6.8)，加入0.1g(5％)柱狀假絲酵母C.cylindracea CCTCC M204041菌體細(xì)胞得到菌懸液，20mg(1.0％)外消旋2-辛醇溶于1ml正辛烷中，將水相和有機(jī)相混合，于30℃恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)48小時(shí)。反應(yīng)后混合物離心，取上清液萃取，產(chǎn)物(R)-2-辛醇光學(xué)純度91.52％e.e.，產(chǎn)率67.43％。
實(shí)施例7在1ml、0.1mol/L的磷酸鉀緩沖溶液中(pH6.8)，加入0.4g(20％)柱狀假絲酵母C.cylindracea CCTCC M204041菌體細(xì)胞得到菌懸液，20mg(1.0％)外消旋2-辛醇溶于1ml正辛烷中，將水相和有機(jī)相混合，于30℃恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)8小時(shí)。反應(yīng)后混合物離心，取上清液萃取，產(chǎn)物(R)-2-辛醇光學(xué)純度91.99％e.e.，產(chǎn)率76.72％。
實(shí)施例8在1ml、0.1mol/L的磷酸鉀緩沖溶液中(pH6.8)，加入0.2g(10％)柱狀假絲酵母C.cylindracea CCTCC M204041菌體細(xì)胞得到菌懸液，10mg(0.5％)外消旋2-辛醇溶于1ml正壬烷中，將水相和有機(jī)相混合，于30℃恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)10小時(shí)。反應(yīng)后混合物離心，取上清液萃取，產(chǎn)物(R)-2-辛醇光學(xué)純度96.95％e.e.，產(chǎn)率79.17％。
實(shí)施例9在1ml、0.1mol/L的磷酸鉀緩沖溶液中(pH6.8)，加入0.2g(10％)柱狀假絲酵母C.cylindracea CCTCC M204041菌體細(xì)胞得到菌懸液，40mg(2.0％)外消旋2-辛醇溶于1ml正己烷中，將水相和有機(jī)相混合，于30℃恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)10小時(shí)。反應(yīng)后混合物離心，取上清液萃取，產(chǎn)物(R)-2-辛醇光學(xué)純度90.79％e.e.，產(chǎn)率88.90％。
實(shí)施例10在1.5ml、0.1mol/L的磷酸鉀緩沖溶液中(pH6.0)，加入0.2g(10％)柱狀假絲酵母C.cylindracea CCTCC M204041菌體細(xì)胞得到菌懸液，20mg(1.0％)外消旋2-辛醇溶于0.5ml正辛烷中，將水相和有機(jī)相混合，于25℃恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)10小時(shí)。反應(yīng)后混合物離心，取上清液萃取，產(chǎn)物(R)-2-辛醇光學(xué)純度90.58％e.e.，產(chǎn)率58.44％。
實(shí)施例11在0.2ml、0.1mol/L的磷酸鉀緩沖溶液中(pH8.0)，加入0.2g(10％)柱狀假絲酵母C.cylindracea CCTCC M204041菌體細(xì)胞得到菌懸液，20mg(1.0％)外消旋2-辛醇溶于1.8ml正辛烷中，將水相和有機(jī)相混合，于33℃恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)10小時(shí)。反應(yīng)后混合物離心，取上清液萃取，產(chǎn)物(R)-2-辛醇光學(xué)純度90.93％e.e.，產(chǎn)率77.39％。
權(quán)利要求
1.一種微生物法制備光學(xué)純(R)-2-辛醇的方法，其特征是出發(fā)菌株采用柱狀假絲酵母C.cylindracea CCTCC M204041經(jīng)過菌株的培養(yǎng)，全細(xì)胞的制備，以外消旋2-辛醇為底物，進(jìn)行微生物細(xì)胞的催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)菌體細(xì)胞溶于0.1mol/L的磷酸鉀緩沖溶液中，細(xì)胞的重量/體積濃度為5～20％，底物外消旋2-辛醇溶于烷烴溶劑中，底物的重量/體積濃度為0.5～2％，反應(yīng)體系中水相pH值6.0～8.0，反應(yīng)溫度25～33℃，有機(jī)-水兩相比例1∶3～9∶1，反應(yīng)時(shí)間8～48小時(shí)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是菌株的培養(yǎng)基組成為每100ml培養(yǎng)液所含組分以g計(jì)葡萄糖2～6，酵母膏0.25～1，(NH4)2HPO40.5～2.0，KH2PO40.1～0.5，MgSO4·7H2O 0.02～0.06，NaCl 0.0025～0.01，ZnSO4·7H2O 0.001～0.005，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001～0.005，CuSO4·5H2O 0.000 1～0.0005，MnSO4·4H2O0.00025～0.001；培養(yǎng)條件為起始pH6.0～8.0，裝液量5～30％，培養(yǎng)溫度25～35℃，搖瓶轉(zhuǎn)速100～300rpm，培養(yǎng)時(shí)間24～72小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是全細(xì)胞的制備C.cylindraceaCCTCC M204041從斜面上取一環(huán)接種在裝液量為5～30％培養(yǎng)液的250ml搖瓶中于25～35℃、100～300rpm振蕩培養(yǎng)24～72小時(shí)；培養(yǎng)結(jié)束后將菌株的菌體離心并用生理鹽水洗滌兩次，收集得到菌株的全細(xì)胞用于轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所用烷烴溶劑為環(huán)己烷、正戊烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、正壬烷或正癸烷。
5.一種如權(quán)利要求1微生物法制備光學(xué)純(R)-2-辛醇所用的菌株，分類命名為柱狀假絲酵母(Candida cylindracea)SYB-3，其保藏編號為CCTCC NOM204041。
全文摘要
微生物法制備光學(xué)純(R)－2－辛醇的方法及其專用微生物，屬于生物法拆分外消旋化合物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明篩選得到菌株柱狀假絲酵母(Candida cylindraceaSYB－3)CCTCC M204041。利用該菌株經(jīng)過培養(yǎng)，全細(xì)胞制備，以外消旋2－辛醇為底物進(jìn)行微生物細(xì)胞的催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)，不對稱轉(zhuǎn)化外消旋2－辛醇得到產(chǎn)物(R)－2－辛醇，產(chǎn)物的光學(xué)純度達(dá)到90％e.e.以上。本發(fā)明確定了該菌株全細(xì)胞不對稱轉(zhuǎn)化外消旋2－辛醇的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，其產(chǎn)物的光學(xué)純度得到提高；本發(fā)明還有助于了解外消旋化合物拆分的生物多樣性，對于今后拆分專用酶源的開發(fā)和拆分方法的研究具有較為重要的意義。
文檔編號C12P7/02GK1597970SQ200410041438
公開日2005年3月23日 申請日期2004年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月19日
發(fā)明者徐巖, 聶堯, 穆曉清 申請人:江南大學(xué)