專利名稱：一種從微生物發(fā)酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從微生物發(fā)酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法，可用于降血脂藥物中的研究和生產(chǎn)，屬于心血管藥物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
心血管疾病已是人類死亡的主要原因之一，其發(fā)病率與死亡率均高居所有疾病前列。在上世紀(jì)中葉工業(yè)化國家出現(xiàn)了心血管疾病大流行，心血管疾病死亡人數(shù)占了總死亡人數(shù)的一半。從絕對數(shù)看，我國是心血管疾病的大國。而且隨著人民生活水平的不斷提高，生活方式與飲食習(xí)慣的改變，使各種心血管疾病的發(fā)生率正趨于上升。經(jīng)研究證實心血管疾病的主要病理基礎(chǔ)為動脈粥樣硬化，高血脂癥是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的首要因素，因此降脂藥在減少心血管疾病發(fā)病率方面的重要性已引起人們的關(guān)注。
在眾多類型的降血脂藥物中，上世紀(jì)八十年代初發(fā)展起來的一類羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，即他汀類藥物，由于它們降低膽固醇的高效性，抑制膽固醇合成的高度選擇性以及低毒性，已成為心血管藥物研制中最活躍，發(fā)展最迅速的領(lǐng)域。其中普伐他汀鈉(pravastatin sodium)是近年發(fā)展起來的一種新型他汀類降血脂藥物，由于其高效低毒性，療效顯著，耐受性好等優(yōu)點(diǎn)，被公認(rèn)為該類藥物中最有發(fā)展前途的一種。
普伐他汀是由其前體美伐他汀(compactin)經(jīng)轉(zhuǎn)化菌羥基化得到，美伐他汀由微生物發(fā)酵產(chǎn)生，其結(jié)構(gòu)式為 C23H36O6美伐他汀的質(zhì)量直接影響轉(zhuǎn)化菌的轉(zhuǎn)化效率和普伐他汀的純度，同時它也是普伐他汀的主要生產(chǎn)成本來源。因此制備低成本、高質(zhì)量的美伐他汀對提高普伐他汀的得率和純度，降低生產(chǎn)成本具有重要意義。目前美伐他汀的制備方法大多采用有機(jī)溶劑萃取發(fā)酵液，高溫下回流濃縮使美伐他汀閉環(huán)，然后低溫下結(jié)晶純化。這種方法制備的美伐他汀閉環(huán)對許多普伐他汀轉(zhuǎn)化菌有毒性，無法直接添加，而且生產(chǎn)能耗大，成本高，不利于普伐他汀的大規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)能耗小、成本低、得率高、最終生產(chǎn)可直接用普伐他汀的從微生物發(fā)酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法。
為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種從微生物發(fā)酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法，其特點(diǎn)在于含有美伐他汀的發(fā)酵液經(jīng)過濾后，用水解酶處理，然后真空濃縮，再在酸性條件下將美伐他汀萃取到疏水性有機(jī)溶劑中，有機(jī)溶劑用弱酸性緩沖液洗滌后，真空濃縮至美伐他汀濃度大于300g/L，加入親水性有機(jī)溶劑混合均勻，最后加入銨鹽或氨水，使美伐他汀轉(zhuǎn)換為銨鹽形式結(jié)晶析出。
它包括以下步驟(1).含有美伐他汀的發(fā)酵液經(jīng)過濾后，用酸調(diào)節(jié)pH值為4-10；(2).在發(fā)酵液中加入水解酶，水解酶終濃度為0.1％～10％，調(diào)節(jié)pH值為6～10，在40～60℃下保溫10～20小時；(3).酶降解液在0.08Mpa、50～90℃下減壓濃縮，冷卻到低于30℃；(4).濃縮液調(diào)節(jié)pH值為3～5，加入疏水性有機(jī)溶劑，充分?jǐn)嚢杌旌?0～20分鐘，有機(jī)溶劑與濃縮液的體積比為1∶2；(5).高速離心分離有機(jī)相和水相，水相可以加入有機(jī)溶劑再萃取1～4次，棄水相，合并有機(jī)相；(6).有機(jī)相加入含有10～20％NaCl的微酸性緩沖液洗滌，有機(jī)相和緩沖液的體積比為2∶1，緩沖液pH值為5～7，高速離心分離水相和有機(jī)相，棄水相，重復(fù)洗滌有機(jī)相1～2次；(7).有機(jī)相加入無水Na2SO4，攪拌10～20分鐘，然后過濾，在0.08MPa，30～90℃下真空濃縮至美伐他汀含量為250～350g/L；(8).濃縮液冷卻到低于30℃，加入親水性有機(jī)溶劑，有機(jī)溶劑終濃度50～95％，邊攪拌邊加入銨鹽或氨水，使美伐他汀以銨鹽形式結(jié)晶析出；(9).過濾收集美伐他汀銨鹽晶體，用親水性有機(jī)溶劑洗滌晶體，在40-60℃下真空干燥，HPLC檢測美伐他汀純度大于94％，得率大于80％；(10).美伐他汀銨鹽可進(jìn)一步通過重結(jié)晶提高純度，最終得到的美伐他汀銨鹽純度大于98％。
本發(fā)明所述的微生物可以是Penicillium sp.，Penicilliumbrevicompactin，Penicilmyces.sp.，Trichoderma longibraiatum，Hyphomyceschrisopomus，penicillium citrium其中之一或它們的混合物；所述的水解酶可以是枯草桿菌蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶其中之一或它們的混合物；所述的疏水性有機(jī)溶劑可以是乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸異丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸丙酯、富馬酸乙酯、丁甲酮、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、甲苯其中之一或它們的混合物；所述的微酸性緩沖液可以是KH2PO4、NaH2PO4其中之一或它們的混合物；所述的親水性有機(jī)溶劑可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、異戊醇、辛醇、丙酮其中之一或它們的混合物；所述的銨鹽或氨水，銨鹽可以是NH4CL、(NH4)2SO4、NH4Ac，NH4NO3其中之一或它們的混合物。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是美伐他汀以銨鹽形式在常溫下結(jié)晶純化，生產(chǎn)能耗小，成本低，得率高，純化得到的高純度的美伐他汀銨鹽，純度不低于98％，對普伐他汀轉(zhuǎn)化菌無毒性，可直接用于普伐他汀生產(chǎn)。
具體實施例方式下面對本發(fā)明提出的一種從微生物發(fā)酵液中純化普伐他汀前體美伐的方法的實施例作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
實施例1(1).5L發(fā)酵濾液，含有美伐他汀10g，用6N HCl調(diào)節(jié)pH值為8.0；(2).加入20ml枯草桿菌蛋白酶溶液，55℃保溫，攪拌12小時；(3).將酶降解液在80℃、0.08MPa下真空濃縮至50ml，冷卻到低于30℃；(4).濃縮液用6N HCl調(diào)節(jié)pH值為4.0，加入25ml乙酸乙酯，充分?jǐn)嚢杌旌?5分鐘；(5).高速離心分離水相和有機(jī)相，水相用25ml乙酸乙酯再萃取兩次，棄水相，合并有機(jī)相；(6).有機(jī)相用40ml含15％NaCl的1％KH2PO4緩沖液，pH值為6.5，洗滌兩遍，高速離心分離水相和有機(jī)相，棄水相；(7).有機(jī)相加入0.2g無水Na2SO4，攪拌15分鐘，過濾，濾液在0.08Mpa、50℃下真空濃縮至3ml；(8).濃縮液冷卻到低于30℃，加入12ml無水丙酮，終濃度為80％，邊攪拌邊加人0.5ml 5N NH4Cl溶液，使美伐他汀銨鹽結(jié)晶析出；(9).過濾收集美伐他汀銨鹽晶體，用無水丙酮洗滌晶體，在50℃下真空干燥，共得到美伐他汀銨鹽晶體8.8g，HPLC檢測純度為93.5％；(10).美伐他汀銨鹽晶體進(jìn)一步重結(jié)晶，得到美伐他汀銨鹽晶體8.3g，HPLC檢測純度為98.5％。
實施例2(1).60L發(fā)酵濾液，含有美伐他汀175g，用6N HCl調(diào)節(jié)pH值為8.0；(2).加入200ml胰蛋白酶溶液，55℃保溫，攪拌15小時；(3).酶降解液在0.08MPa、80℃真空濃縮至5L，冷卻到低于30℃；(4).濃縮液用6N HCL調(diào)節(jié)pH值為4.0，加入25L乙酸丁酯，充分?jǐn)嚢杌旌?5分鐘；(5).高速離心分離水相和有機(jī)相，水相用25L乙酸丁酯重復(fù)萃取兩次，棄水相，合并有機(jī)相；(6).有機(jī)相用40L含有15％NaCl的1％KH2PO4緩沖液，pH值為6.5，洗滌兩遍，離心分離水相和有機(jī)相，棄水相；
(7).有機(jī)相加入1g無水Na2SO4，攪拌15分鐘，過濾，濾液在0.08Mpa、50℃下真空濃縮至550ml；(8).有機(jī)相冷卻到低于30℃，加入2200ml無水乙醇，終濃度為80％，邊攪拌邊加入20ml 2N NH4Ac溶液，使美伐他汀銨鹽結(jié)晶析出；(9).過濾收集美伐他汀銨鹽晶體，用無水乙醇洗滌晶體，在50℃下真空干燥，共得到美伐他汀銨鹽晶體150g，HPLC檢測純度為94.2％；(10).美伐他汀銨鹽晶體進(jìn)一步重結(jié)晶，得到美伐他汀銨鹽晶體143g，HPLC檢測純度為98.5％。
權(quán)利要求
1.一種從微生物發(fā)酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法，其特征在于，含有美伐他汀的發(fā)酵液經(jīng)過濾后，用水解酶處理，然后真空濃縮，再在酸性條件下將美伐他汀萃取到疏水性有機(jī)溶劑中，有機(jī)溶劑用弱酸性緩沖液洗滌后，真空濃縮至美伐他汀濃度大于300g/L，加入親水性有機(jī)溶劑混合均勻，最后加入銨鹽或氨水，使美伐他汀轉(zhuǎn)換為銨鹽形式結(jié)晶析出。它包括以下步驟(1).含有美伐他汀的發(fā)酵液經(jīng)過濾后，用酸調(diào)節(jié)pH值為4-10；(2).在發(fā)酵液中加入水解酶，水解酶終濃度為0.1％～10％，調(diào)節(jié)pH值為6～10，在40～60℃下保溫10～20小時；(3).酶降解液在0.08Mpa、50～90℃下減壓濃縮，冷卻到低于30℃；(4).濃縮液調(diào)節(jié)pH值為3～5，加入疏水性有機(jī)溶劑，充分?jǐn)嚢杌旌?0～20分鐘，有機(jī)溶劑與濃縮液的體積比為1∶2；(5).高速離心分離有機(jī)相和水相，水相可以加入有機(jī)溶劑再萃取1～4次，棄水相，合并有機(jī)相；(6).有機(jī)相加入含有10～20％NaCl的微酸性緩沖液洗滌，有機(jī)相和緩沖液的體積比為2∶1，緩沖液pH值為5～7，高速離心分離水相和有機(jī)相，棄水相，重復(fù)洗滌有機(jī)相1～2次；(7).有機(jī)相加入無水Na2SO4，攪拌10～20分鐘，然后過濾，在0.08MPa，30～90℃下真空濃縮至美伐他汀含量為250～350g/L；(8).濃縮液冷卻到低于30℃，加入親水性有機(jī)溶劑，有機(jī)溶劑終濃度50～95％，邊攪拌邊加入銨鹽或氨水，使美伐他汀以銨鹽形式結(jié)晶析出；(9).過濾收集美伐他汀銨鹽晶體，用親水性有機(jī)溶劑洗滌晶體，在40-60℃下真空干燥，HPLC檢測美伐他汀純度大于94％，得率大于80％；(10).美伐他汀銨鹽可進(jìn)一步通過重結(jié)晶提高純度，最終得到的美伐他汀銨鹽純度大于98％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從微生物發(fā)酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法，其特征在于，所述的微生物可以是Penicillium sp.，Penicilliumbrevicompactin，Penicilmyces sp.，Trichoderma longibraiatum，Hyphomyces chrisopomus，penicillium citrium其中之一或它們的混合物；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從微生物發(fā)酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法，其特征在于，所述的水解酶可以是枯草桿菌蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶其中之一或它們的混合物；
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從微生物發(fā)酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法，其特征在于，所述的疏水性有機(jī)溶劑可以是乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸異丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸丙酯、富馬酸乙酯、丁甲酮、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、甲苯其中之一或它們的混合物；
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從微生物發(fā)酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法，其特征在于，所述的微酸性緩沖液可以是KH2PO4、NaH2PO4其中之一或它們的混合物；
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從微生物發(fā)酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法，其特征在于，所述的親水性有機(jī)溶劑可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、異戊醇、辛醇、丙酮其中之一或它們的混合物；
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從微生物發(fā)酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法，其特征在于，所述的銨鹽或氨水，銨鹽可以是NH4CL、(NH4)2SO4、NH4Ac，NH4NO3其中之一或它們的混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從微生物發(fā)酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法，可用于降血脂藥物中的研究和生產(chǎn)，其特點(diǎn)在于，含有美伐他汀的發(fā)酵液經(jīng)過濾后，用水解酶處理，然后真空濃縮，再在酸性條件下將美伐他汀萃取到疏水性有機(jī)溶劑中，有機(jī)溶劑用弱酸性緩沖液洗滌后，真空濃縮至美伐他汀濃度大于300g/L，加入親水性有機(jī)溶劑混合均勻，最后加入銨鹽或氨水使美伐他汀轉(zhuǎn)換為銨鹽形式結(jié)晶析出。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是美伐他汀以銨鹽形式在常溫下結(jié)晶純化，生產(chǎn)能耗小，成本低，得率高，純化得到的高純度的美伐他汀銨鹽，純度不低于98％，對普伐他汀轉(zhuǎn)化菌無毒性，可直接用于普伐他汀生產(chǎn)。
文檔編號C07C67/00GK1504454SQ02151068
公開日2004年6月16日 申請日期2002年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月5日
發(fā)明者梅民權(quán), 季曉銘, 李嚴(yán), 姚勇, 卓中浩 申請人:上海天偉生物制藥有限公司