專利名稱：Glp-1類似物的反相hplc純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)類似物的純化，特別涉及用于純化具有SEQ ID N0.1 的氨基酸序列的 GLP-1 類似物的方法:His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser_Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-1Ie-Ala-Trp-Leu-Val-LyS-Aib-Arg-NH2,其中，這些氨基酸中的26個(gè)氨基酸是天然L構(gòu)型，而4個(gè)氨基酸是非手性構(gòu)型。Aib表示通過反相高效液相層析(RP-HPLC)純化的人胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)的α-氨基異丁酸類似物。該肽也稱為(Aib8，35)GLP-1(7-36)NH2，并在PCT公布TO 2000/34331 中描述了其藥物用途及其通過固相肽合成(SPPS)的制備。
背景技術(shù)：
可遵循這樣的混合方法合成GLP-1類似物，所述混合方法包括固相肽合成(SPPS)和溶液中的片段偶聯(lián)。例如，PCT公布WO 2007/147816描述了通過制備三條片段并在溶液中偶聯(lián)這些片段來制備(Aib8’35)GLP-1 (7-36)NH2。各合成步驟一般是高選擇性的，然而，在多步化學(xué)合成結(jié)束時(shí)，產(chǎn)物通常不純，不足以用作藥物。因此，粗產(chǎn)品可以經(jīng)過反向高效液相層析(RP-HPLC)來進(jìn)一步純化肽并獲得96至99%(面積)范圍內(nèi)的純度。經(jīng)RP-HPLC階段后，通常獲得一般具有I到15%(w/w)肽濃度的溶液形式的產(chǎn)物。`為了獲得適合于藥物制劑的干燥終產(chǎn)物，溶液可以進(jìn)行沉淀、凍干或噴霧干燥技術(shù)。已在本領(lǐng)域廣泛描述了用于人胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)的RP-HPLC純化。例如根據(jù)PCT公布WO 2007/147816, GLP-1類似物進(jìn)行了兩步RP-HPLC方法；在pH 2下進(jìn)行第一步層析，其利用由乙腈(15%)、水(85%)和少量TFA組成的混合物A和由四氫呋喃(15%)、乙腈(70%)、水(15%)和少量TFA組成的混合物B作為流動相，并且在pH 8.8下進(jìn)行第二步層析，其利用由乙腈(15%)、水(85%)和乙酸銨緩沖液組成的混合物A，和由含四氫呋喃(15%)、乙腈(60%)、水(25%)和乙酸銨緩沖液組成的混合物B作為流動相。由于四氫呋喃傾向于形成過氧化物，因此在大規(guī)模上洗脫液對于RP-HPLC是至關(guān)重要的。EP-Bl 1664 109公開了利用pH緩沖的醇，特別是乙醇作為洗脫劑來純化胰高血糖素樣肽的RP-HPLC方法，由此pH值范圍可以設(shè)定在pH 4和pH 10之間，但不能與pH設(shè)定點(diǎn)差別超過+/_1.0pH單位。為了獲得所需純度，因此本方法需要嚴(yán)格的pH控制。然而，發(fā)現(xiàn)以乙醇作為洗脫劑時(shí)，無法獲得想要的純度，特別是無法有效去除雜質(zhì)des-Ser17, Ser18-[Aib8’35]hGLP-1 (7-36)NH2。
因此，本發(fā)明的目標(biāo)在于開發(fā)RP-HPLC方法，其在技術(shù)規(guī)模上易于應(yīng)用，并且在溶劑方面安全并能夠提供具有極好純度的GLP-1溶液。發(fā)明詳述發(fā)現(xiàn)利用如下文概述的本發(fā)明的方法能夠?qū)崿F(xiàn)該目標(biāo)。應(yīng)用反向高效液相層析(RP-HPLC)純化GLP-1肽類似物的方法包括以水性緩沖液和有機(jī)溶劑的混合物用于洗脫的第一個(gè)和第二個(gè)層析步驟，其特征在于用于第二個(gè)層析步驟的有機(jī)溶劑為乙腈并且用PH值在8.0至11.0之間的堿性緩沖液進(jìn)行第二步層析。水性緩沖液為含防止pH變化的緩沖劑的水溶液。根據(jù)所用的緩沖劑，該緩沖液可以是酸性的或堿性的。術(shù)語“GLP-1肽類似物”包含天然人胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)類似物GLP-1 (7-37)和 GLP-1 (7-36) NH2 和 GLP-1 肽的合成類似物(GLP-1 類似物)。優(yōu)選的GLP-1類似物為具有根據(jù)SEQ ID N0.1的氨基酸序列的人GLP-1類似物:His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-1Ie-Ala-Trp-Leu-Val-LyS-Aib-Arg-NH2,即(Aib8，35)GLP-1(7-36)NH2，和如 PCT 公布 WO 2000/34331 中描述的其它類似物。特別感興趣的是(Aib8’35)GLP-1 (7-36)NH2。短的形式指通過缺失I至6位氨基酸殘基、在C末端酰胺化并由α-氨基異丁酸(Aib)取代第8位(Ala)和第35位(Gly)中天然存在的氨基酸殘基而在形式上來源于天然人GLP-1 (1-37)的類似物。GLP-1 肽的合適的類似物還可以選自 GLP-1 (7-37)、GLP-1 (7-36) NH2, (Gly8)GLP-1 (7-37)、(Gly8) GLP-1 (7-36)、(Ser34) GLP-1 (7-37), (Val8) GLP-1 (7-37), (Val8, Glu22)GLP-1 (7-37)、(N- ε - ( Y -Glu (N- α -十六酰基)))-Lys26Arg34-GLP-1 (7-37) (Liraglutide)和D-Ala8Lys37-(2-(2-(2-馬來酰亞胺基丙酰氨基(乙氧基)乙氧基)乙酰胺))GLP-1(7-37)(CJC-1131)。GLP-1肽的又一類似物可以是選自以下的exendin類似物:exendin_3、具有根據(jù)SEQ ID N0.2:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2的氨基酸序列的exendin_4(依澤那太)exendin-4 酸、exendin-4 (1-30)、exendin-4 (1-30)酉先胺、exendin-4 (1-28)、exendin-4 (1-28)酉先胺、14Leu, 25Phe exendin-4 酉先胺和 14Leu, 25Pheexendin_4 (1-28)酉先胺以及AVE-0010，其為具有根據(jù)SEQ ID N0.3的氨基酸序列的exendin類似物:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AIa-Val-Arg-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys_Lys_Lys_Lys_Lys_LyS-NH2 ο附1a: (Aib8，35)GLP-1 (7-36)NH2 的第二步層析的 RP-HPLC 層析圖；20mM 乙酸銨，ρΗ=9.2 ；Kromasil C18 100-16 ;乙醇(100%)。

圖1b: (Aib8，35)GLP-1 (7-36)NH2 的第二步層析的 RP-HPLC 層析圖；20mM 乙酸銨，ρΗ=9.5 ；Kromasil C18 100-16 ;乙腈(100%)。
與圖la)相比，用乙腈作為洗脫劑有效地去除了雜質(zhì)des-Ser17，Ser18-[Aib8'35]hGLP-1(7-36)NH2。圖2a: (Aib8'35)GLP-1 (7-36)NH2 的第二步層析的 RP-HPLC 層析圖；20mM 乙酸銨，pH=9.5 ；Kromasi I C18 100-16 ;乙腈(100%)。圖2b: (Aib8'35)GLP-1 (7-36)NH2 的第二步層析的 RP-HPLC 層析圖；20mM 乙酸銨，pH=9.5 ； Kromasi I C18 100-16 ;乙腈/甲基叔丁基醚(95:5 v:v)。使用甲基叔丁基醚作為有機(jī)改性劑可增加純度和產(chǎn)率。本發(fā)明的具體實(shí)施方案如下概述。如上概述，用乙腈作為有機(jī)溶劑并使用pH在8.0至11.0之間，更特別pH在9.0至10.0之間并且甚至更特別pH為9.5+/-0.2的堿性緩沖液進(jìn)行第二個(gè)層析步驟。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，將乙腈與甲基叔丁基醚混合作為有機(jī)改性劑。合適地應(yīng)用99/1 (v/v)至 80/20 (v/v)，特別為 97.5/2.5 (v/v)至 90/10 (v/v)，甚至更特別為95/5 (v/v)的乙腈/甲基叔丁基醚混合物。堿性緩沖液可選自本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的商品化緩沖液。發(fā)現(xiàn)乙酸銨或碳酸氫銨尤其合適。緩沖液濃度可在10至25mM范圍內(nèi)變化，由此優(yōu)選20mM的緩沖液濃度。用乙腈作為有機(jī)溶劑和pH在1.0至4.0之間，更特別pH在2.0至3.0之間并且甚至更特別pH在2.3至2.5之間，最特別pH為2.5的酸性緩沖液進(jìn)行第一個(gè)層析步驟。酸性緩沖液可選自本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的商品化緩沖液。發(fā)現(xiàn)磷酸銨尤其合適。緩沖液濃度可在100至400mM范圍內(nèi)變化，由此優(yōu)選300mM的緩沖液濃度。使用硅膠吸著劑作為固定相方便地進(jìn)行RP-HPLC。合適的娃膠類型可選自但不限于以下娃膠吸著劑:Kromasil C18100 - 16、Kromasi1 C18 100 - 10、Kromasil C8 100 - 16、Kromasil C4 100 - 16、KromasiI Phenyl 100 - 10、KromasiI C18Eternity 100 - 5、KromasiI C4 Eternity 100 - 5、Chromatorex C18SMB 100-15 HE,Chromatorex C8 SMB 100-15 HE,Chromatorex C4 SMB100-15 HE、Daisopak SP 120-15 ODS-AP, Daisopak SP120-10-C4_Bio、Daisopak SP200-10-C4-Bio、Zeosphere C18100-15、Zeosphere C8 100-15,Zeosphere C4 100-15、SepTech ST150-10 C18、Luna C18 100-10、Gemini C18 110-10、YMC Triart C18120-5 和YMC Triart C8 200-10。發(fā)現(xiàn)上文列出的Kromasil 硅膠類型尤其合適。或者，可使用基于聚合物的固定相進(jìn)行RP-HPLC。合適的聚合物相可選自但不限于PLRP-S 100-10 或 Amberchrom Profile XT20。用流動相梯度進(jìn)行第一個(gè)和第二個(gè)層析步驟的RP-HPLC，所述流動相梯度通常開始于較低濃度的有機(jī)溶劑并經(jīng)洗脫時(shí)間后結(jié)束于較高濃度的有機(jī)溶劑。洗脫參數(shù)如事件時(shí)間、流動相梯度和上樣方面可由本領(lǐng)域技術(shù)人員更改，以優(yōu)化純化過程。如PCT 公布 WO 2007/147816 所描述，任選地將含純化的(Aib8，35)GLP_1 (7-36)NH2的級分濃縮并隨后凍干。或者，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的沉淀或噴霧干燥技術(shù)從RP-HPLC 級分中分離純化的(Aib 8，35)GLP-1 (7-36)NH20以下實(shí)施例將更詳細(xì)地說明本發(fā)明的方法而不限制其范圍。實(shí)施例實(shí)施例A:肽的制備可以根據(jù)WO 2007/147816和WO 2009/074483中描述的方法，通過產(chǎn)生三條片段并在溶液中偶聯(lián)這些片段來制備粗肽(Aib8，35)GLP-1 (7-36)NH2。純化包括在pH 2.5的第一步層析純化，及隨后在pH 9.5的第二步層析純化。實(shí)施例BI:RP-HPLC 技術(shù)參數(shù):
權(quán)利要求
1.應(yīng)用反向高效液相層析(RP-HPLC)純化GLP-1肽類似物的方法，所述方法包括用水性緩沖液和有機(jī)溶劑的混合物進(jìn)行洗脫的第一個(gè)和第二個(gè)層析步驟，其特征在于用于第二個(gè)層析步驟的有機(jī)溶劑為乙腈并且使用pH在8.0至11.0之間的堿性緩沖液進(jìn)行第二步層析。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于乙腈還與甲基叔丁基醚混合作為有機(jī)改性劑。
3.權(quán)利要求2的方法，其特征在于使用99/1(v/v)至80/20(v/v)的乙腈/甲基叔丁基醚的混合物。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述堿性緩沖液選自乙酸銨或碳酸氫銨。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法,其特征在于以IOmMol至25mMol的濃度使用所述堿性緩沖液。
6.權(quán)利要求1的方法，其特征在于第一個(gè)層析步驟的水性有機(jī)溶劑為乙腈并且使用pH在1.0至4.0之間的酸性緩沖液進(jìn)行第一步層析。
7.權(quán)利要求6的方法，其特征在于所述酸性緩沖液為磷酸銨。
8.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的方法，其特征在于使用硅膠吸著劑作為固定相進(jìn)行所述RP-HPLC。
9.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的方法，其中所述GLP-1肽類似物選自由GLP-1 (7-37)、GLP-1 (7-36) NH2、(Gly8)GLP-1 (7-37) , (Gly8)GLP-1 (7-36) , (Ser34)GLP-1 (7-37)、(Val8)GLP-1 (7-37)、(Val8, Glu22) GLP-1 (7-37), (Aib8’35) hGLP—1 (7_36) NH2.、(N- ε - ( y -Glu (N- α -十六?；?))-Lys26Arg34-GLP-1 (7-37)、D-Ala Lys- (2_ (2_ (2-馬來酸亞胺基丙酸氨基(乙氧基)乙氧基)乙酸胺))GLP-1 (7-37)、exendin-3、exendin-4、exendin-4 酸、exendin-4 (1-30)、exendin-4 (1-30)酉先胺、exendin-4 (1-28)、exendin-4 (1-28)酸胺、14Leu, 25Phe exendin-4 酸胺和 14Leu, 25Phe exendin-4 (1-28)酸胺和 AVE-OO10。
10.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的方法，其中所述GLP-1肽類似物為(Aib8，35)hGLP-l(7-36)NH2。
11.用權(quán)利要求1至10的方法可以獲得的GLP-1肽類似物。
全文摘要
本發(fā)明包括應(yīng)用反相高效液相層析(RP-HPLC)來純化GLP-1肽類似物的方法。
文檔編號C07K14/605GK103080128SQ201180029074
公開日2013年5月1日 申請日期2011年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月21日
發(fā)明者C·卡爾, M·羅特, C·薩拉丁, D·斯特魯布, F·維克斯 申請人:益普生制藥股份有限公司