專利名稱：液－固兩相發(fā)酵生產(chǎn)紡織、造紙用高活性纖維素酶制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種內(nèi)切纖維素酶活性高而外切纖維素酶和葡萄糖苷酶活性相對(duì)較低的高活性纖維素酶的制備方法，可做為造紙、紡織專用酶制劑，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
農(nóng)作物秸稈數(shù)量巨大，每年各類秸稈有10億噸，至今未能很好的利用，大量秸稈被焚燒，既造成環(huán)境污染，又極大的浪費(fèi)了資源，因此，尋求秸稈高值生態(tài)化利用，是目前急待解決的問(wèn)題。
作為可再生的生物質(zhì)資源降解轉(zhuǎn)化作用的主要酶種，纖維素酶長(zhǎng)期受到科技界的高度重視，已開(kāi)展了深入廣泛的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究。但研究多以降解纖維產(chǎn)糖、發(fā)酵生產(chǎn)能源和化工產(chǎn)品為主要目標(biāo)。由于廉價(jià)石油和糧食的競(jìng)爭(zhēng)，遲遲未能轉(zhuǎn)入工業(yè)化生產(chǎn)。然而，近幾年來(lái)，纖維素酶作為工業(yè)酶制劑已開(kāi)始在紡織印染、制漿造紙、飼料加工、洗滌劑等行業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用。例如作為酶整理劑，明顯提高了棉麻織物質(zhì)量，使產(chǎn)品高檔化；用做廢紙脫墨劑，改善了再生漿質(zhì)量，減少了對(duì)環(huán)境的污染；用作飼料添加劑，增進(jìn)了飼料的可消化性，提高了畜牧業(yè)效益等。從而使纖維素酶成為酶制劑工業(yè)中發(fā)展最快的新酶種之一，同時(shí)也有力地推動(dòng)了上述產(chǎn)業(yè)的技術(shù)進(jìn)步和產(chǎn)品的更新?lián)Q代，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
絲狀真菌分泌的纖維素酶是包括內(nèi)切纖維素酶、外切纖維素酶、葡萄糖苷酶等多酶復(fù)合物，多酶的協(xié)同，有利于完成纖維素的完全降解。但在造紙、紡織等實(shí)際應(yīng)用中，內(nèi)切纖維素酶發(fā)揮重要作用，而外切纖維素酶則具有副作用。因此，對(duì)于纖維素酶的生產(chǎn)，除了開(kāi)發(fā)高效的生產(chǎn)技術(shù)外，生產(chǎn)用菌株的內(nèi)切纖維素酶、外切纖維素酶、葡萄糖苷酶等表達(dá)譜已經(jīng)越來(lái)越受到關(guān)注。對(duì)于造紙、紡織等領(lǐng)域，需要篩選或應(yīng)用生物技術(shù)手段構(gòu)建高產(chǎn)內(nèi)切纖維素酶、而外切纖維素酶和葡萄糖糖苷酶活性相對(duì)較低的工程菌株，開(kāi)發(fā)專用的纖維素酶制劑，以滿足生產(chǎn)的需要，最大限度的發(fā)揮作用。
由于纖維素酶需經(jīng)纖維材料誘導(dǎo)而產(chǎn)生，又受葡萄糖等易代謝糖類的阻遏。國(guó)外纖維素酶生產(chǎn)主要采用纖維素粉或乳糖等作為碳源，補(bǔ)加蛋白胨、吐溫80等高價(jià)輔料，并且采用液體深層發(fā)酵的方式生產(chǎn)。液體深層發(fā)酵，能耗高，發(fā)酵周期長(zhǎng)，體積生產(chǎn)效率低，后處理工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本很高，并且發(fā)酵液易污染環(huán)境。相比之下，固體發(fā)酵技術(shù)，體積生產(chǎn)效率高，能耗低，后處理工藝簡(jiǎn)單，不污染環(huán)境，其難點(diǎn)在于發(fā)酵條件難于控制，易污染。國(guó)內(nèi)已建成的十余家以固體發(fā)酵方式生產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵廠家都因技術(shù)工藝落后，均處于產(chǎn)酶不穩(wěn)定、污染嚴(yán)重、生產(chǎn)不正常狀態(tài)，不能形成工業(yè)化。因此，利用固體發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的技術(shù)急需突破。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種液-固兩相發(fā)酵生產(chǎn)紡織、造紙專用高活性纖維素酶的方法。
本發(fā)明利用玉米秸桿、麥秸農(nóng)作物廢棄物秸稈等廉價(jià)原料，利用高產(chǎn)內(nèi)切纖維素酶和高抗代謝物阻遏的木霉工程菌株，應(yīng)用發(fā)酵工程、酶工程和生化工程技術(shù)，發(fā)酵生產(chǎn)并進(jìn)一步提取制備高活性、高純度的纖維素酶，應(yīng)用于紡織、造紙等行業(yè)，具有優(yōu)良效果。
本發(fā)明的纖維素酶的制備方法步驟如下(1)采用高抗代謝物(葡萄糖)阻遏的內(nèi)切纖維素酶產(chǎn)率高的工程菌株——擬康寧木霉(Trichoderma pseukoningii UV III)為菌株，接種三角瓶液體菌種，以麩皮汁為培養(yǎng)基，液體發(fā)酵灌發(fā)酵制備液體菌種；(2)以玉米秸粉、小麥秸粉、麩皮為主要原料，配以硫酸銨和水，滅菌，接種擬康寧木霉(Trichoderma pseukoningii UV III)的液體菌種，轉(zhuǎn)入無(wú)菌的固體發(fā)酵曲池，通無(wú)菌風(fēng)，厚層通風(fēng)發(fā)酵制備纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)物；(3)將發(fā)酵培養(yǎng)的纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)物加水浸泡，過(guò)濾，上清液為纖維素酶的提取液；(4)將纖維素酶提取液經(jīng)濃縮，制得高活性的液體纖維素酶。將濃縮的纖維素酶經(jīng)噴霧干燥，即得到高活性的粉狀纖維素酶。
下面對(duì)本發(fā)明的纖維素酶的制備方法的各步驟具體說(shuō)明如下(1)生產(chǎn)用液體菌種的制備。
培養(yǎng)基麩皮8～12份、土豆4～6份，水100份，均為重量份，下同。煮沸，過(guò)濾，加蛋白胨0.45～0.65份、Na2HPO40.3～0.5份和KH2PO40.04～0.05份，滅菌，冷卻，接種擬康寧木霉(Trichoderma pseukoningii UV III)的二級(jí)液體菌種，6～8份，通風(fēng)攪拌，培養(yǎng)24～36小時(shí)，作為生產(chǎn)用液體種子待用。
(2)厚層通風(fēng)發(fā)酵制備纖維素酶制劑培養(yǎng)物。
玉米秸粉和或小麥秸粉65～75份，麩皮25～35份，硫酸銨1～2份，均為重量份，潤(rùn)水，原料∶水＝1∶2.7～3.1(重量比)，滅菌，冷卻，接種接種步驟(1)的擬康寧木霉(Trichodermapseukoningii UV III)生產(chǎn)用液體菌種6～8份，轉(zhuǎn)入無(wú)菌固體發(fā)酵曲池中，通以無(wú)菌風(fēng)，在26～29℃，空氣相對(duì)濕度81～84％下發(fā)酵，25～31小時(shí)翻曲一次，發(fā)酵4～5天，即得到纖維素酶的發(fā)酵物。所得發(fā)酵物纖維素酶活性(CMC酶活性)可達(dá)到600～750IU/g干曲。
(3)纖維素酶的提取上述纖維素酶的發(fā)酵培養(yǎng)物按1∶(8～10)的重量比加水浸泡11～12小時(shí)，過(guò)濾，過(guò)濾液即為纖維素酶的提取液。
(4)將上述濾液濃縮至原來(lái)體積的3/10～4/10，濃縮液經(jīng)噴霧干燥制成高活性纖維素酶粉。酶活性可達(dá)到8500～10500IU/g干品(CMC酶活性)。
最后，經(jīng)粉碎、質(zhì)檢、包裝成品。
上述擬康寧木霉(Trichoderma pseukoningii UV III)的二級(jí)液體菌種制作可按已有技術(shù)。本發(fā)明提供如下具體操作步驟A.斜面菌種(固體)將土豆去皮洗凈，切成小片，放在水中，土豆∶水＝1∶(4～6)重量比，80±1℃浸泡1小時(shí)，或煮沸半小時(shí)，用濾布煮沸過(guò)濾，濾液加水稀釋至原來(lái)的體積。再加糖1～2份，瓊脂1.5～2份，自然pH值，8磅滅菌。劃線接種康寧木霉，28～30℃培養(yǎng)。
B.二級(jí)菌種(液體)培養(yǎng)基配方同斜面，只不加瓊脂，自然pH值，裝瓶，8磅滅菌，接斜面菌種的菌懸液3～5％重量百分比，28～30℃下，搖床培養(yǎng)。
本發(fā)明選用的擬康寧木霉(Trichoderma pseukoningii UV III)在含6～8％葡糖糖纖維素平板上，仍然具有分泌纖維素酶的能力，內(nèi)切纖維素酶活性高，而外切纖維素酶、葡萄糖糖苷酶活性相對(duì)較低，從而滿足紡織、造紙等應(yīng)用領(lǐng)域的要求。
本發(fā)明的優(yōu)良效果在于選用高抗代謝物(葡萄糖)阻遏的高產(chǎn)纖維素酶的工程菌株，利用液-固兩相發(fā)酵工程技術(shù)，發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，發(fā)酵物酶活性可達(dá)到600～750IU/g干曲(CMC酶活)。纖維素酶發(fā)酵物經(jīng)系列生化工程技術(shù)，制備高純度的纖維素酶粉，活性可達(dá)到8500～10500IU/g干粉(CMC酶活)。并且制得的纖維素酶粉，內(nèi)切纖維素酶活性高，而外切纖維素酶、葡萄糖糖苷酶活性相對(duì)較低，從而滿足紡織、造紙等應(yīng)用領(lǐng)域的要求。農(nóng)作物秸桿是儲(chǔ)量巨大的農(nóng)業(yè)廢棄物資源之一，到目前為止，因?yàn)闆](méi)有有效的資源化利用技術(shù)，使得這一資源的利用率很大，每年的大量秸桿被焚燒，不僅浪費(fèi)了資源，而且對(duì)空氣造成了嚴(yán)重的污染，成為我國(guó)目前亟待解決的問(wèn)題。本發(fā)明在開(kāi)發(fā)利用秸桿資源的的同時(shí)，無(wú)三廢排出，避免秸桿焚燒對(duì)環(huán)境造成的的嚴(yán)重污染，是一條農(nóng)業(yè)廢棄物資源化、高值化、生態(tài)化利用的有效途徑。
本發(fā)明采用抗降解物阻遏的高產(chǎn)突變株，可在含廢棄物的可溶性糖的培養(yǎng)基上快速生長(zhǎng)，而又不受易代謝糖類對(duì)通常菌株所產(chǎn)酶的阻遏作用影響。使用工農(nóng)業(yè)廢液廢渣制備培養(yǎng)基既降低了原料成本，又縮短了發(fā)酵周期。采用液固兩相發(fā)酵技術(shù)，在溫濕氣可控的無(wú)菌條件下發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，提高了體積發(fā)酵效率，減少了污染，大大降低了運(yùn)轉(zhuǎn)成本。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1擬康寧木霉的二級(jí)液體菌種的制備，具體操作步驟如下A.斜面菌種(固體)將土豆去皮洗凈，切成小片，放在水中，土豆∶水＝1∶4重量比，80℃浸泡1小時(shí)，用濾布煮沸過(guò)濾，濾液加水稀釋至原來(lái)的體積。再加糖2份，瓊脂1.5份，自然pH值，8磅滅菌。劃線接種擬康寧木霉(Trichoderma pseukoningii UV III)菌株，28～30℃培養(yǎng)。
B.二級(jí)菌種(液體)培養(yǎng)基配方同斜面，只不加瓊脂，自然pH值，裝瓶，8磅滅菌，接上述斜面菌種的菌懸液4％重量百分比，28～30℃搖床培養(yǎng)。
實(shí)施例2纖維素酶的制備(1)生產(chǎn)用液體菌種的制備培養(yǎng)基麩皮10份、土豆5份，水100份，均為重量份，下同。煮沸，過(guò)濾，加蛋白胨0.5份、Na2HPO40.45份、KH2PO40.035份、滅菌，冷卻，接種擬康寧木霉的二級(jí)液體菌種6份，通風(fēng)攪拌，培養(yǎng)30小時(shí)，做為生產(chǎn)用液體菌種待用。
擬康寧木霉的二級(jí)液體菌種的制備如實(shí)施例1所述。
(2)厚層通風(fēng)發(fā)酵制備纖維素酶制劑培養(yǎng)物原料玉米秸粉30份和小麥秸粉40份，麩皮30份，硫酸銨1份，均為重量份，潤(rùn)水，原料∶水＝1∶2.8(重量比)，滅菌，冷卻，接種步驟(1)的生產(chǎn)用液體菌種6份(重量)，轉(zhuǎn)入無(wú)菌固體發(fā)酵曲池中，通以無(wú)菌風(fēng)，在25～28℃，空氣相對(duì)濕度80～85％下發(fā)酵，24小時(shí)翻曲一次，發(fā)酵4天，即得到纖維素酶制劑培養(yǎng)物。
所得發(fā)酵物纖維素酶活性(CMC酶活性)700IU/g干曲。
(3)纖維素酶的提取上述纖維素酶的發(fā)酵培養(yǎng)物按1∶10的重量比加水浸泡12小時(shí)，過(guò)濾，過(guò)濾液即為纖維素酶的提取液。
(4)將上述濾液濃縮至原來(lái)體積的3/10，濃縮液經(jīng)噴霧干燥制成高活性纖維素酶粉。酶活性9500IU/g干品(CMC酶活性)。最后經(jīng)粉碎、質(zhì)檢、包裝成品。
實(shí)施例3纖維素酶的制備如實(shí)施例2所述，所不同的是(1)生產(chǎn)用液體菌種的制備培養(yǎng)基麩皮11份、土豆6份，水100份，均為重量份，下同。煮沸，過(guò)濾，加蛋白胨0.6份、Na2HPO40.5份、KH2PO40.04份、滅菌，冷卻，接種擬康寧木霉的二級(jí)液體菌種10份，通風(fēng)攪拌，培養(yǎng)34小時(shí)，做為生產(chǎn)用液體菌種待用。
(2)厚層通風(fēng)發(fā)酵制備纖維素酶制劑培養(yǎng)物原料小麥秸粉65份，麩皮35份，硫酸銨2份，均為重量份，潤(rùn)水，原料∶水＝1∶3.0(重量比)，滅菌，冷卻，接種步驟(1)的生產(chǎn)用液體菌種7份(重量)，轉(zhuǎn)入無(wú)菌固體發(fā)酵曲池中，通以無(wú)菌風(fēng)，在25～28℃，空氣相對(duì)濕度80～85％下發(fā)酵，25小時(shí)翻曲一次，發(fā)酵4.5天，即得到纖維素酶制劑培養(yǎng)物。所得發(fā)酵物纖維素酶活性(CMC酶活性)650IU/g干曲。
其他同實(shí)施例2。
實(shí)施例4纖維素酶的制備如實(shí)施例2所述，所不同的是步驟(2)厚層通風(fēng)發(fā)酵制備纖維素酶制劑培養(yǎng)物原料玉米秸粉35份和小麥秸粉35份，麩皮30份，硫酸銨2份，均為重量份，潤(rùn)水，原料∶水＝1∶2.9(重量比)，滅菌，冷卻，接種步驟(1)的生產(chǎn)用液體菌種5.5份(重量)，轉(zhuǎn)入無(wú)菌固體發(fā)酵曲池中，通以無(wú)菌風(fēng)，在25～28℃，空氣相對(duì)濕度80～85％下發(fā)酵，28小時(shí)翻曲一次，發(fā)酵5天，即得到纖維素酶制劑培養(yǎng)物。所得發(fā)酵物纖維素酶活性(CMC酶活性)600IU/g干曲。
實(shí)施例5纖維素酶的制備如實(shí)施例2所述，所不同的是步驟(3)纖維素酶的提取是將步驟(2)的纖維素酶制劑培養(yǎng)物按1∶11的重量比加水浸泡11小時(shí)，過(guò)濾，過(guò)濾液即為纖維素酶的提取液。
步驟(4)將上述濾液濃縮至原來(lái)體積的4/10，濃縮液經(jīng)噴霧干燥制成高活性纖維素酶粉。酶活性8500IU/g干品(CMC酶活性)。
權(quán)利要求
1.纖維素酶的制備方法，步驟如下(1)采用高抗代謝物阻遏的內(nèi)切纖維素酶產(chǎn)率高的工程菌株擬康寧木霉為菌株，接種三角瓶液體菌種，以麩皮汁為培養(yǎng)基，液體發(fā)酵灌發(fā)酵制備生產(chǎn)用液體菌種；(2)以玉米秸粉、小麥秸粉、麩皮為主要原料，配以硫酸銨和水，滅菌，接種擬康寧木霉的液體菌種，轉(zhuǎn)入無(wú)菌的固體發(fā)酵曲池，通無(wú)菌風(fēng)，厚層通風(fēng)發(fā)酵制備纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)物；(3)將發(fā)酵培養(yǎng)的纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)物加水浸泡，過(guò)濾，上清液為纖維素酶的提取液；(4)將纖維素酶提取液經(jīng)濃縮，制得高活性的液體纖維素酶；將濃縮的纖維素酶經(jīng)噴霧干燥，即得到高活性的粉狀纖維素酶。
2.如權(quán)利要求1所述的纖維素酶的制備方法，其特征在于，步驟(1)生產(chǎn)用液體菌種的制備如下培養(yǎng)基麩皮8～12份，土豆4～6份，水100份，均為重量份，煮沸，過(guò)濾，加蛋白胨0.45～0.65份、Na2HPO40.3～0.5份和KH2PO40.04～0.05份，均為重量份，滅菌，冷卻，接種擬康寧木霉的二級(jí)液體菌種，6～8份，重量份，通風(fēng)攪拌，培養(yǎng)24～36小時(shí)。
3.如權(quán)利要求1所述的纖維素酶的制備方法，其特征在于，步驟(2)厚層通風(fēng)發(fā)酵制備纖維素酶制劑培養(yǎng)物，具體操作如下玉米秸粉和或小麥秸粉65～75份，麩皮25～35份，硫酸銨1～2份，均為重量份，潤(rùn)水，原料∶水＝1∶2.7～3.1，重量比，滅菌，冷卻，接種接種步驟(1)的擬康寧木霉生產(chǎn)用液體菌種6～8份，轉(zhuǎn)入無(wú)菌固體發(fā)酵曲池中，通以無(wú)菌風(fēng)，在26～29℃，空氣相對(duì)濕度81～84％下發(fā)酵，25～31小時(shí)翻曲一次，發(fā)酵4～5天，即得到纖維素酶的發(fā)酵物。
4.如權(quán)利要求1所述的纖維素酶的制備方法，其特征在于，步驟(3)中纖維素酶的發(fā)酵培養(yǎng)物加水浸泡，是按1∶8～10的重量比加水浸泡11～12小時(shí)。
5.如權(quán)利要求1所述的纖維素酶的制備方法，其特征在于，步驟(4)將上述濾液濃縮至原來(lái)體積的3/10～4/10。
全文摘要
液一固兩相發(fā)酵生產(chǎn)紡織、造紙用高活性纖維素酶制劑的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。采用高抗代謝物阻遏的內(nèi)切纖維素酶產(chǎn)率高的工程菌株擬康寧木霉為菌株，接種三角瓶液體菌種，以麩皮汁為培養(yǎng)基，液體發(fā)酵灌發(fā)酵制備生產(chǎn)用液體菌種；以玉米秸粉、小麥秸粉、麩皮為主要原料，配以硫酸銨和水，高溫高壓滅菌，接種擬康寧木霉的液體菌種，厚層通風(fēng)發(fā)酵制備纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)物；將發(fā)酵培養(yǎng)的纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)物加水浸泡，過(guò)濾，所得纖維素酶的提取液經(jīng)濃縮，噴霧干燥，得到高活性的粉狀纖維素酶。用于紡織、造紙等領(lǐng)域，開(kāi)發(fā)利用秸稈資源的的同時(shí)，無(wú)三廢排出，避免秸稈焚燒對(duì)環(huán)境造成的的嚴(yán)重污染。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1648245SQ200410036449
公開(kāi)日2005年8月3日 申請(qǐng)日期2004年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月7日
發(fā)明者張玉忠, 孫彩云, 陳秀蘭, 陳蕾蕾, 宋桂經(jīng) 申請(qǐng)人:山東大學(xué)