專利名稱：酶促制備香子蘭香精的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備香子蘭香精的新方法。
香子蘭香精是蘭科扁葉香果蘭(Vanilla planifolia)的豆中所含的有機(jī)物質(zhì)的平衡混合物。
更具體地，主要化合物香草醛是從其糖基化前體(葡糖香草醛)開(kāi)始在豆的成熟期間經(jīng)豆中存在的酶的天然酶促水解后而形成。
因此，提取香草醛的常規(guī)方法包括熟成期，其需要長(zhǎng)時(shí)間(1至5個(gè)月，取決于收獲位置)、許多長(zhǎng)時(shí)間的質(zhì)量控制并且受到環(huán)境條件的嚴(yán)重影響。結(jié)果，這牽涉終產(chǎn)物的顯著變異性和香草醛含量部分的損失。因此，該方法從工業(yè)觀點(diǎn)看非常昂貴。
EP0555466公開(kāi)了替代常規(guī)熟成的方法，其包括用水解酶(纖維素酶、果膠酶、β-glucosydase)處理適宜碾磨的青豆(green bean)，所述水解酶通過(guò)分解豆的植物組織起作用，從而促進(jìn)活性成分的提取，而且將釋放的葡糖香草醛水解成香草醛。
本發(fā)明涉及制備香子蘭提取物的方法，其包括對(duì)香子蘭青豆進(jìn)行提取并隨后用具有高總分解活性的酶系統(tǒng)酶促分解所得提取物的合并處理。
根據(jù)本發(fā)明，該方法在時(shí)間(數(shù)月溫育)和環(huán)境方面都不存在當(dāng)前已知的工業(yè)方法的限制，同時(shí)提供了高產(chǎn)率的富含香草醛的產(chǎn)物。因此，本發(fā)明的方法在容易性、短暫性、可重復(fù)性和產(chǎn)率方面與公知方法相比具有顯著優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的方法包括以下步驟a)使豆加速褐變；b)對(duì)褐變的豆進(jìn)行提取，然后用含有纖維素酶和半纖維素酶活性的酶系統(tǒng)處理；
c)純化產(chǎn)物以得到富含香草醛的濃縮物。
豆的加速褐變即步驟a)包括將青豆在-10℃至-30℃溫度冷凍，隨后在2至8℃、優(yōu)選4℃的溫度避光解凍達(dá)到所需溫度必需的時(shí)間，該時(shí)間通常為0.5至7天。
備選地，豆的加速褐變即步驟a)可以包括通過(guò)將它們?cè)跍囟葹?0至65℃的水中浸泡3分鐘以熱燙青豆，隨后將它們?cè)?5至45℃、更優(yōu)選30℃的溫度溫育產(chǎn)生褐色顏色必需的時(shí)間，通常為0.5至7天。
提取直接對(duì)褐色碾磨的豆進(jìn)行，使用濃度為20至80％v/v、優(yōu)選40至60％v/v的水-乙醇溶液，溫度為室溫至80℃、優(yōu)選60至70℃，提取時(shí)間為70至100分鐘。然后蒸發(fā)所得提取物到總固體約35至約25％w/w。然后將濃縮物用水稀釋到總固體為5至20％w/w，并進(jìn)行酶處理。
根據(jù)本發(fā)明使用的酶系統(tǒng)的特征在于顯著的纖維素酶活性，為2000至6000IU/g、優(yōu)選3000至5000IU/g、最優(yōu)選4000IU/g。該酶系統(tǒng)與現(xiàn)有技術(shù)中引用的酶(通常以不同類型的復(fù)合系統(tǒng)使用)的不同在于其更高的總分解活性，這使得可以對(duì)新鮮豆使用非常低的濃度，甚至0.1-0.3％，或更低。這不僅對(duì)于工業(yè)可行性和成本而且對(duì)于所得產(chǎn)物的可重復(fù)性都無(wú)疑是有優(yōu)勢(shì)的。
可以在非滅菌環(huán)境中、在裝備攪拌器(例如槳式攪拌器)的恒溫箱中連續(xù)溫和攪拌或者處于靜態(tài)條件下或者用間歇攪拌進(jìn)行酶促分解，以釋放香草醛。反應(yīng)在25℃至50℃、優(yōu)選30℃至40℃溫度下進(jìn)行20至72小時(shí)、優(yōu)選24至40小時(shí)。加入一定量的纖維素酶活性為2000-6000IU/g的酶，相當(dāng)于新鮮物質(zhì)的0.05-0.4％、優(yōu)選0.1-0.3％?；旌衔锏膒H可以為3.5至5.5、優(yōu)選4至5。轉(zhuǎn)化可以通過(guò)TLC或者HPLC監(jiān)測(cè)并進(jìn)行至觀察到所需組分的明顯增加。
最后，純化(步驟b)包括純化軟的水性提取物，通過(guò)用不同醇度(alcoholic degree)的水性乙醇溶液處理或用乙醇稀釋酶處理得到的提取物而得到的50％v/v水性乙醇溶液，所述純化在室溫至50℃溫度下操作。合并所得水性乙醇級(jí)分并在真空下于不高于+45℃的溫度下濃縮，得到稠的水性濃縮物。
使用小體積濃縮乙醇可以進(jìn)一步純化所得產(chǎn)物。
通過(guò)進(jìn)一步純化處理，如用乙酸乙酯萃取或者用醇混合物替換，可以得到更為濃縮和純化的產(chǎn)物。
通過(guò)TLC和HPLC可以進(jìn)行中間步驟和終產(chǎn)物的香草醛含量分析。
TLC分析適當(dāng)?shù)厥褂霉枘z60F254板(Merck)進(jìn)行，洗脫劑系統(tǒng)85∶15氯仿-甲醇，254nm紫外檢測(cè)；隨后與反應(yīng)性CAS(硫酸鈰銨二水合物、鉬酸銨四水合物、濃硫酸)反應(yīng)并在可見(jiàn)光下觀察條帶。
HPLC分析可以使用Zorbax Eclipse XDB-C18柱(250×4.6mm)5μm適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行，使用0.3％H3PO4/乙腈95∶5-10∶90線性梯度，流速1ml/min，λ254nm，運(yùn)行時(shí)間55min。
通過(guò)將樣品的等分試樣在+105℃烘箱中保溫15小時(shí)，可方便地進(jìn)行中間體和終產(chǎn)物的總固體測(cè)定。備選地，可以使用水分分析儀(例如Sartorius Model MA100)，設(shè)置分析溫度+105℃；當(dāng)記錄到失重低于1mg/60秒時(shí)，測(cè)定樣品的總固體百分?jǐn)?shù)。
提取物的質(zhì)量從感觀和儀器兩方面評(píng)價(jià)，所述儀器評(píng)價(jià)根據(jù)USP26/NF20<1061>測(cè)量L*、a*、b*、YIE313坐標(biāo)(CIELAB坐標(biāo))?？梢杂帽壬?jì)(例如HunterLab model ColorFlex)適當(dāng)?shù)卮_定終產(chǎn)物的CIELAB顏色坐標(biāo)。使用50％v/v乙醇作為稀釋劑，對(duì)5.0％w/w總固體的稀釋液測(cè)定終產(chǎn)物的顏色。
根據(jù)本發(fā)明的方法可以得到的終產(chǎn)物的香草醛含量為4.2-8.5g/kg起始青豆，與用現(xiàn)有技術(shù)方法得到的產(chǎn)物具有更優(yōu)的感官特征。
以下實(shí)施例更詳細(xì)闡明本發(fā)明的方法。
實(shí)施例11)提取將青豆在-20℃冷凍，取出并在4℃的溫度保持7天(褐變豆139kg，含1.19％w/w香草醛葡糖苷和0.10％w/w香草醛)，然后通過(guò)4.5mm格網(wǎng)(grid)碾磨并載入滲濾器。將植物材料用50％v/v乙醇充分提取。用基于豆水分含量(約80％w/w)計(jì)算的一定量的95％v/v乙醇進(jìn)行第一次提取(即124升)，以得到50％v/v醇度的溶液。隨后的提取(共8次)用與碾磨的植物材料(以Kg表達(dá))的重量相當(dāng)?shù)囊欢w積的50％v/v乙醇(以升表達(dá))(即139升)進(jìn)行。每次提取在+70℃的溫度進(jìn)行，接觸時(shí)間為90分鐘。合并所得水性乙醇滲濾液并在+30℃真空濃縮，得到稠的軟濃縮物(36kg，27％w/w總固體)，其通過(guò)加入乙醇穩(wěn)定，得到20％v/v醇度(基于水含量計(jì)算的％)并在+4℃保存，直到用于生物轉(zhuǎn)化。
2)酶促轉(zhuǎn)化生物轉(zhuǎn)化前，通過(guò)用水替換兩次從中間濃縮物除去存在的乙醇。所得濃縮物用水稀釋，得到10％總固體溶液。向該溶液加入酶Cellulosin AC40(HBI Enzymes Inc.)，其量基于碾磨的植物材料為約0.2％w/w。生物轉(zhuǎn)化(250升反應(yīng)器中95升反應(yīng)混合物)在溫和攪拌下在40℃進(jìn)行48小時(shí)。轉(zhuǎn)化完成后，在+30℃真空濃縮懸液并通過(guò)加入乙醇(20％v/v基于存在的水)穩(wěn)定，以得到29Kg軟殘?jiān)?，其含?.4Kg干殘?jiān)?br> 3)提純將20％v/v水-乙醇濃縮物用95％v/v乙醇稀釋，得到50％v/v乙醇的水-醇溶液(％基于存在的水)。將稀釋的混合物在+45℃、攪拌下保持約1小時(shí)，然后在室溫靜置，最后過(guò)濾。將過(guò)濾殘?jiān)盟詹⒃?45℃勻漿，用乙醇稀釋到60％v/v醇度并在室溫過(guò)夜靜置。隨后過(guò)濾該水-醇溶液。合并水-醇溶液并在+45℃溫度的真空下濃縮，直至得到稠的水性濃縮物。保持+45℃并在攪拌下，加入95％v/v乙醇，直到均勻并且無(wú)論如何直至達(dá)到最終醇度不低于20％v/v。
該方法對(duì)每Kg處理的植物材料產(chǎn)生6.29g香草醛，相當(dāng)于植物材料的總計(jì)算香草醛的93.7％(6.72g/Kg植物材料，為游離香草醛和葡糖苷結(jié)合的香草醛的總和)。
實(shí)施例2
1)提取將青豆(198.6g，含1.12％w/w葡糖苷香草醛和0.05％w/w香草醛)在預(yù)熱至+60℃的水中浸泡3分鐘。熱燙后，將豆在+30℃溫育5天，期間植物材料變成暗褐色。完成溫育后，觀察到的失重為16％。將褐變的豆(166.7g)碾磨，調(diào)節(jié)至50％v/v醇度(加入147ml 95％v/v乙醇得到)并置于加熱夾套式滲濾器中。將植物材料用50％v/v乙醇充分提取。每次提取(共9次)用550ml 50％v/v乙醇。每次提取在+70℃溫度下進(jìn)行，接觸時(shí)間為100分鐘。合并所得水性醇滲濾液并在+45℃真空下濃縮，得到稠的軟濃縮物(33.1g，36.4％w/w總固體)。
2)酶轉(zhuǎn)化將所得濃縮物用水稀釋，直至得到20％w/w總固體溶液。向該溶液加入酶Cellulosin AC40(HBI Enzymes Inc.)，其量基于碾磨的植物材料為約0.2％w/w。生物轉(zhuǎn)化在溫和攪拌、40℃下進(jìn)行72小時(shí)。
3)提純轉(zhuǎn)化完成后，通過(guò)加入一定量的調(diào)節(jié)醇度到50％v/v的95％v/v乙醇淬滅反應(yīng)。將提取液在+45℃真空濃縮約1小時(shí)，得到稠的軟殘?jiān)?。得?6.9g提取物，其含有33.9％w/w總固體。
該方法對(duì)每Kg處理的植物材料產(chǎn)生5.06g香草醛，相當(dāng)于植物材料的總計(jì)算香草醛的85.5％(5.92g/Kg植物材料，為游離香草醛和葡糖苷結(jié)合的香草醛的總和)。
實(shí)施例31)提取將冷凍的青豆(2117g，含1.19％w/w香草醛葡糖苷和0.10％w/w香草醛)在+4℃的溫度保持0.5天。溫育期間植物材料解凍并變成暗褐色，溫育完成后，觀察到的失重為7.6％。將褐變的豆(2006g)通過(guò)4.5mm格網(wǎng)碾磨，加入1800ml 95％v/v乙醇并室溫下置于滲濾器中。提取植物材料80分鐘，然后收集首次提取物。將植物材料用50％v/v乙醇充分提取。隨后的提取(共5次)用與碾磨的植物材料的重量(以Kg表示)相當(dāng)?shù)囊欢w積的50％v/v乙醇(以升表示)(即2升)進(jìn)行。每次提取在室溫進(jìn)行，接觸時(shí)間為80分鐘。合并所得水性醇滲濾液并在+45℃真空濃縮，得到稠的軟濃縮物(265g，53.8％w/w總固體)。
2)酶轉(zhuǎn)化將所得濃縮物用水稀釋得到20％總固體溶液。向該溶液加入酶Cellulosin AC40(HBI Enzymes Inc.)，其量基于碾磨的植物材料為約0.2％w/w。生物轉(zhuǎn)化在溫和攪拌、50℃進(jìn)行47小時(shí)。轉(zhuǎn)化完成后，通過(guò)加入一定量的調(diào)節(jié)醇度至50％v/v的95％v/v乙醇淬滅反應(yīng)(所加的體積以ml表示，相當(dāng)于以g表示的反應(yīng)混合物重量的0.89倍)。
3)提純將稀釋的混合物在+45℃、攪拌下保持約1小時(shí)，然后在室溫靜置，最后過(guò)濾。將過(guò)濾殘?jiān)盟詹⒃?45℃勻漿，用乙醇稀釋到60％v/v醇度并在室溫過(guò)夜靜置。最后，通過(guò)濾紙過(guò)濾該水性醇溶液。合并水性醇溶液并在真空、+45℃溫度濃縮，直至得到稠的水性濃縮物。保持溫度為+45℃并在攪拌下，加入95％v/v乙醇，直至均勻并且無(wú)論如何直至達(dá)到最終醇度不低于20％v/v。
該方法對(duì)每Kg處理的植物材料產(chǎn)生6.45g香草醛，相當(dāng)于植物材料的總計(jì)算香草醛的72.0％(8.96g/Kg植物材料，為游離香草醛和葡糖苷結(jié)合的香草醛的總和)。
實(shí)施例41)提取將青豆在-20℃冷凍(350kg，含1.32％w/w香草醛葡糖苷和0.10％w/w香草醛)，通過(guò)4.5mm格網(wǎng)碾磨并置于滲濾器中。將碾磨的植物材料用50％v/v乙醇充分提取。用基于豆的水含量(約80％w/w)計(jì)算的一定量的95％v/v乙醇進(jìn)行首次提取(即311升)，以得到50％v/v醇度的溶液。隨后的提取(共8次)用與碾磨的植物材料的重量(以Kg表示)相當(dāng)?shù)囊欢w積的50％v/v乙醇(以升表示)(即350升)進(jìn)行。每次提取在+70℃的溫度進(jìn)行，接觸時(shí)間為90分鐘。合并所得水-醇滲濾液并在+30℃真空濃縮，得到稠的軟殘?jiān)?92.5kg，26.3％w/w總固體)，通過(guò)加入乙醇將其穩(wěn)定，得到20％v/v醇度(％基于存在的水計(jì)算)并在+4℃保存，直到用于生物轉(zhuǎn)化。
2)酶轉(zhuǎn)化生物轉(zhuǎn)化前，通過(guò)用水替換兩次從中間濃縮物除去存在的乙醇。所得濃縮物用水稀釋，得到10％總固體溶液。向該溶液加入酶Cellulosin AC40(HBI Enzymes Inc.)，其量基于碾磨的植物材料為約0.2％w/w。生物轉(zhuǎn)化(1000升反應(yīng)器中240升反應(yīng)混合物)在+40℃溫和攪拌下進(jìn)行44小時(shí)。轉(zhuǎn)化完成后，在+30℃真空濃縮懸液并通過(guò)加入乙醇(20％v/v基于存在的水)穩(wěn)定，以得到63Kg軟濃縮物，其含有24Kg干殘?jiān)?br> 3)提純將20％v/v水性醇濃縮物用95％v/v乙醇稀釋，得到50％v/v水性醇溶液(％基于水含量)。將稀釋的混合物在+45℃、攪拌下保持約1小時(shí)，然后在室溫靜置，最后過(guò)濾。將過(guò)濾殘?jiān)盟詹⒃?45℃勻漿，用乙醇稀釋到60％v/v醇度并在室溫過(guò)夜靜置。隨后過(guò)濾水-醇溶液。合并水性醇溶液并在+45℃溫度的真空濃縮，得到稠的水性濃縮物。保持溫度+45℃并在攪拌下，加入95％v/v乙醇，直至均勻并且無(wú)論如何直至達(dá)到最終醇度不低于20％v/v。
該方法對(duì)每Kg處理的植物材料產(chǎn)生6.96g香草醛，相當(dāng)于植物材料的總計(jì)算香草醛的94％(7.40g/Kg植物材料，為游離香草醛和葡糖苷結(jié)合的香草醛的總和)。
實(shí)施例5(比較實(shí)施例，EP0555466的方法)將青豆(220kg，含1.24％w/w香草醛葡糖苷和0.10％w/w香草醛)通過(guò)4.5mm網(wǎng)格碾磨。
將1000升滲濾器加載相當(dāng)于碾磨的植物材料重量(以Kg表示)兩倍的水體積(以升表示)(即440升)，所述水含有基于植物材料為0.2％w/w的一定量的酶Cellulosin AC40(HBI Enzymes Inc.)。將碾磨的植物材料置于裝備再循環(huán)系統(tǒng)的滲濾器中。生物轉(zhuǎn)化在+40℃進(jìn)行24小時(shí)。
將反應(yīng)混合物滲濾并將滲濾液(506kg)加入500升95％v/v乙醇，得到50％v/v乙醇溶液。將植物材料在+70℃用50％v/v乙醇連續(xù)、充分提取，得到5份每份200升的水性乙醇級(jí)分(共1000升)。
將兩份(水性和水性醇)滲濾液保持分離并在約30℃真空中濃縮。之后，向每份濃縮物中加入乙醇，基于所存在的水達(dá)到20％v/v醇度。
得到以下濃縮物1.來(lái)自水性提取物的水-乙醇濃縮物(37.4kg，含10kg干殘?jiān)?2.來(lái)自水-乙醇提取物的水-乙醇濃縮物(30.6kg，含3.5kg干殘?jiān)?。
混合所得產(chǎn)物并通過(guò)蒸發(fā)溶劑濃縮。
該方法對(duì)每kg處理的植物材料產(chǎn)生4.29g香草醛，相當(dāng)于植物材料的總計(jì)算香草醛的61.3％(7.00g/Kg植物材料，為游離香草醛和葡糖苷結(jié)合的香草醛的總和)。
實(shí)施例61)測(cè)定終產(chǎn)物總固體對(duì)于來(lái)自實(shí)施例1至5的每種軟提取物遵循以下步驟將每種提取物的約1g等分試樣均勻分布在板(裝備玻璃纖維濾器)上并在水分分析儀上準(zhǔn)確稱重；加熱程序設(shè)置在+105℃并將樣品的失重記錄為時(shí)間的函數(shù)；當(dāng)失重速率低于1mg/60秒時(shí)，認(rèn)為樣品重量恒定；總固體百分?jǐn)?shù)(TS％)計(jì)算為最終重量與最初重量的比。
實(shí)施例1至5的產(chǎn)物的記錄值在下表1中報(bào)告
2)測(cè)定CIELAB顏色坐標(biāo)將來(lái)自實(shí)施例1至5的每種提取物的等分試樣用50％v/v乙醇稀釋，得到含5.0％w/w總固體的溶液。根據(jù)USP26/NF20<1061>，用比色計(jì)(HunterLab，model ColorFlex)分析溶液，以確定L*、a*、b*、YIE313坐標(biāo)。
3)終產(chǎn)物的感官分析將來(lái)自實(shí)施例1至5的每種提取物的等分試樣用50％v/v乙醇稀釋，得到香草醛含量為1.0％w/w(HPLC測(cè)定)的溶液；評(píng)估每種水性乙醇溶液的嗅覺(jué)感官特性。將每種稀釋液的1.0g和更少(直到感知閾值)的等分試樣用加糖的全脂乳(5％w/w蔗糖)進(jìn)一步稀釋到50g。評(píng)估乳稀釋液的味道感官特征。
以下表2概括了分析結(jié)果表2
所報(bào)導(dǎo)的數(shù)據(jù)證明YIE313值小于200對(duì)應(yīng)于在感官上較YIE313值大于200的那些提取物更好的提取物。具體地，實(shí)施例1-3和實(shí)施例4-5的比較表明褐變步驟提供了感官質(zhì)量的改善，同時(shí)降低了YIE313值。
權(quán)利要求
1.制備香子蘭提取物的方法，其包括以下步驟a)使豆褐變；b)提取豆，然后用具有纖維素酶和半纖維素酶活性的酶系統(tǒng)處理；c)純化產(chǎn)物以得到富含香蘭素的濃縮物。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中通過(guò)在-10至-30℃的溫度冷凍并在2至8℃的溫度解凍的循環(huán)進(jìn)行豆的褐變。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中通過(guò)在60至65℃的溫度的水中熱燙并隨后在15至45℃的溫度溫育的循環(huán)進(jìn)行豆的褐變。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中用20至80％v/v醇度的水性乙醇溶液在室溫至80℃的溫度下進(jìn)行提取。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中用40至60％v/v醇度的水性乙醇溶液在60至70℃的溫度下進(jìn)行提取。
6.權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)使提取物與纖維素酶活性為2000至6000IU/g的酶接觸而進(jìn)行酶處理。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中使用活性為3000至5000IU/g的酶。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中使用纖維素酶活性為4000IU/g的酶。
9.權(quán)利要求6至8任一項(xiàng)所述的方法，其中使用基于新鮮的豆?jié)舛葹?.05至0.4％的酶。
10.權(quán)利要求6至8任一項(xiàng)所述的方法，其中反應(yīng)在25℃至50℃的溫度下進(jìn)行20至72小時(shí)。
11.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中純化(步驟b)包括用不同醇度的水-乙醇溶液的一系列處理，以提純水性軟提取物或者用乙醇稀釋酶處理的提取物而得到的50％v/v水性醇溶液，該處理在室溫至50℃的溫度操作。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備香子蘭提取物的方法，該方法包括使香子蘭青豆進(jìn)行加速褐變，然后進(jìn)行提取/酶處理。
文檔編號(hào)C12N9/42GK1764389SQ200380110250
公開(kāi)日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2003年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月15日
發(fā)明者C·蓬佐內(nèi), V·達(dá)達(dá)戈, M·貝爾塔尼 申請(qǐng)人:因德納有限公司