專利名稱：：用于基于pcr的克隆系研究的核酸擴(kuò)增引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于早期診斷淋巴組織增生性疾病(lymphoproliferativedisorder)的基于PCR的克隆系(PCR-basedclonality)研究。在大多數(shù)可疑患有淋巴組織增生性疾病的患者中，組織形態(tài)學(xué)或細(xì)胞形態(tài)學(xué)以及免疫組織學(xué)或流式細(xì)胞免疫分型(flowcytometricimmunophenotyping)可區(qū)分惡性與反應(yīng)性(reactive)淋巴組織增生。然而，在5-10％的病例中，進(jìn)行診斷較困難。淋巴組織惡性疾病的診斷可由克隆系評估支持，所述評估基于通常所有惡性細(xì)胞都具有共同的克隆起源的事實(shí)。大多數(shù)淋巴組織惡性疾病屬于B-細(xì)胞系(90-95％)并且僅有少數(shù)屬于T-細(xì)胞系(5-7％)或NK-細(xì)胞系(＜2％)。急性淋巴細(xì)胞白血病(acutelymphoblasticleukemia)(所有)的15-20％的病例是T-細(xì)胞來源的，但成熟淋巴系統(tǒng)白血病(maturelymphoidleukemia)和非霍杰金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma)(NHL)的組中T-細(xì)胞惡性疾病相對較少，但其中具體的亞組諸如皮膚淋巴瘤(cutaneouslymphoma)除外(表1)。因此，大多數(shù)淋巴系統(tǒng)惡性疾病(＞98％)含有以相同的(克隆的)方式進(jìn)行重排的免疫球蛋白(Ig)和/或T-細(xì)胞受體(TCR)基因，并且在25-30％的病例中，還發(fā)現(xiàn)了明確的(well-defined)染色體異常，所有這些均可作為克隆系的標(biāo)志物。1，2Ig和TCR基因的基因座含有許多不同的可變(variable)(V)，多樣性(diversity)(D)，和連接(joining)(J)基因片段，其在早期淋巴細(xì)胞分化中經(jīng)歷重排過程。3，4V-D-J重排由重組酶復(fù)合物介導(dǎo)，其中RAG1和RAG2蛋白通過識(shí)別并在重組信號(hào)序列(recombinationsignalsequence)(RSS)切割DNA而起重要作用，所述RSS位于V基因片段下游，D基因片段兩側(cè)，以及J基因片段上游(圖1)。不適宜的RSS減少或完全阻止重排。所述重排過程通常從D到J重排開始，然后對于以下基因?yàn)閂到D-J重排Ig重鏈(IGH)，TCRβ(TCRB)，和TCRδ(TCRD)基因(圖1)，或?qū)τ谝韵禄驗(yàn)橹苯覸到J重排Igκ(IGK)，Igλ(IGL)，TCRα(TCRA)和TCRγ(TCRG)基因。發(fā)生重排的基因片段之間的序列通常以環(huán)狀切除產(chǎn)物(circularexcisionproduct)的形式(也稱TCR切除環(huán)(TREC)或B細(xì)胞受體切除環(huán)(BREC))(圖1)的形式缺失。淋巴系統(tǒng)早期分化過程中Ig和TCR基因重排通常遵循等級(jí)順序(hierarchicalorder)。B-細(xì)胞分化過程中IGH基因首先發(fā)生重排，然后是IGK，可能導(dǎo)致IGH/κ表達(dá)或然后是IGK缺失和IGL重排，可能然后是IGH/λ表達(dá)。5這表明實(shí)際上所有Igλ+B-細(xì)胞具有單等位基因(monoallelic)或雙等位基因(biallelic)IGK基因缺失。T-細(xì)胞分化過程中TCRD基因首先發(fā)生重排，然后是TCRG，可能導(dǎo)致TCRγδ表達(dá)或然后是進(jìn)一步TCRB重排和TCRD缺失以及隨后的TCRA重排，可能然后是TCRαβ表達(dá)。淋巴系統(tǒng)惡性疾病中的Ig和TCR基因重排模式通常適合上述等級(jí)順序，但也可見到異常重排模式，具體是在所有中。6V，D和J基因片段的不同組合代表所謂的組合庫(combinatorialrepertoire)(表2)，估計(jì)其包含～2×106Ig分子，～3×106TCRαβ分子以及～5×103TCRγδ分子。在V，D和J基因片段的接點(diǎn)，在重排過程中出現(xiàn)缺失和隨機(jī)插入，導(dǎo)致連接區(qū)的高度多樣性，其對于Ig和TCR分子的總庫有很大貢獻(xiàn)，估計(jì)為＞1012。5成熟B-淋巴細(xì)胞還在濾泡中心進(jìn)行抗原識(shí)別時(shí)通過體細(xì)胞高變(somatichypermutation)來擴(kuò)大其Ig庫，所述體細(xì)胞高變過程導(dǎo)致Ig分子的親和力成熟。體細(xì)胞高變過程集中在IGH的V-(D-)J外顯子以及Ig輕鏈基因，并涉及單個(gè)核苷酸突變且有時(shí)涉及核苷酸插入或缺失。體細(xì)胞-突變的(somatic所有ymutated)Ig基因也見于濾泡性或后-濾泡性(post-follicular)來源的的成熟B細(xì)胞惡性疾病。7功能重排的Ig和TCR基因?qū)е翴g、TCRαβ或TCRγδ分子的表面膜表達(dá)(surfacemembraneexpression)。根據(jù)淋巴細(xì)胞或淋巴細(xì)胞克隆僅表達(dá)一個(gè)類型的Ig或TCR分子這一觀點(diǎn)，成熟淋巴系統(tǒng)惡性疾病的克隆重排的基因可在蛋白水平檢出。長期以來，檢測單個(gè)Ig輕鏈表達(dá)(IGK或IgS)已經(jīng)用于區(qū)分反應(yīng)性(多克隆)B-淋巴細(xì)胞(正常Igκ/Igλ比0.7-2.8)與異常(克隆的)B-淋巴細(xì)胞(Igκ/Igλ比為＞4.0或＜0.5)。8-10在大多數(shù)(＞90％)成熟B淋巴細(xì)胞惡性疾病中，單個(gè)Ig輕鏈表達(dá)可由惡性疾病的克隆來源支持。同樣，當(dāng)與適宜的參照值比較時(shí)，許多不同抗各種TCR鏈可變區(qū)的抗體允許檢測單型(monotypic)Vβ，Vγ和VS區(qū)。11-16在利用抗不同Vβ家族(表2)的20-25種抗體解釋單型Vβ結(jié)果時(shí)，應(yīng)理解臨床良性的克隆TCRαβ+T-細(xì)胞擴(kuò)增(通常是CD8+)常規(guī)見于老年個(gè)體的外周血(PB)。13，17然而這些克隆T-細(xì)胞在PB中的擴(kuò)增的體積相對較?。?0％的PBT-淋巴細(xì)胞，且＜0.5×106/mlPB。13然而，仍不清楚所述臨床良性T細(xì)胞克隆在淋巴系統(tǒng)的組織中被所發(fā)現(xiàn)的程度。單型Vγ和Vδ區(qū)表達(dá)的結(jié)果應(yīng)謹(jǐn)慎解釋，因?yàn)樵诮】祩€(gè)體中，大部分正常多克隆TCRγδ+T-淋巴細(xì)胞被選擇用于Vγ9-Jγ1.2和Vδ2-Jδ1。18，19因此，Vy9+/Vδ2+T-淋巴細(xì)胞在PB中的高頻率應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是正常發(fā)現(xiàn)，除非絕對計(jì)數(shù)為1-2×106/mlPB。應(yīng)注意大多數(shù)TCRγδ+T-細(xì)胞惡性疾病表達(dá)Vδ1或其它非-Vδ2基因片段以及單個(gè)Vγ區(qū)(通常不是Vγ9)。15，20檢測Igκ或Igλ限制的表達(dá)或單型Vβ、Vγ或Vδ的表達(dá)在對患有成熟B細(xì)胞或T細(xì)胞白血病患者的PB和骨髓(BM)樣品進(jìn)行的流式細(xì)胞研究相對容易。然而，這在與正常(反應(yīng)性)淋巴細(xì)胞混合的可疑淋巴組織增生性疾病的組織樣品中較難。與基于抗體的技術(shù)不同，分子技術(shù)廣泛用于檢測克隆重排的Ig/TCR基因以及確定的染色體異常。這以前涉及Southern印跡分析，但現(xiàn)在具體使用PCR技術(shù)。盡管由免疫分型，在一部分(5-10％)病例中最終診斷為淋巴系統(tǒng)惡性疾病(lymphoidmalignancy)仍有困難。因此，需要其它(分子克隆系)診斷來產(chǎn)生或確認(rèn)最后診斷，諸如-任何可疑B細(xì)胞增生，其中形態(tài)學(xué)和免疫分型不是結(jié)論性的；-所有可疑T細(xì)胞增生(注意T細(xì)胞富集的B-NHL(T-cellrichB-NHL))；-免疫缺陷的患者或接受過移植的患者的淋巴組織增生；-評價(jià)一個(gè)患者中的兩種淋巴系統(tǒng)惡性疾病之間的克隆相關(guān)性或區(qū)分惡性疾病的復(fù)發(fā)和第二種惡性疾??；-惡性疾病的進(jìn)一步分類，例如通過Ig/TCR基因重排模式或具體染色體異常；-較少地(occasionally)淋巴瘤的分期(staging)。長期以來，Southern印跡分析是分子克隆系研究的金標(biāo)準(zhǔn)。Southern印跡基于非-種系(″經(jīng)過重排的″)DNA片段的檢測，所述片段是用限制酶消化后獲得的。選定的適宜(well-chosen)限制酶(產(chǎn)生2-15kb的片段)以及適宜定位的(well-positioned)DNA探針(具體是下游J片段探針)允許檢測基本上所有Ig和TCR基因重排，以及涉及J基因片段的染色體異常。21-28應(yīng)注意Southern印跡分析的焦點(diǎn)在于Ig/TCR基因片段的重排多樣性，由此可利用組合庫。用于克隆系評估的優(yōu)化Southern印跡結(jié)果具體可用IGH，IGK和TCRB基因獲得，因?yàn)檫@些基因具有廣泛的組合庫以及相對簡單的基因結(jié)構(gòu)，其可僅用一或兩種DNA探針評估。22，24，28IGL和TCRA基因更加復(fù)雜并需要多個(gè)探針組。25，26，29最后，TCRG和TCRD基因具有限制的組合庫，其對于經(jīng)由Southern印跡分析區(qū)分單克隆系(monoclonality)和多克隆系(polyclonality)為次最佳的。20，21盡管Southern印跡分析的高度可信性，它逐漸被PCR技術(shù)取代，這是由于多種內(nèi)在優(yōu)勢Southern印跡分析較為耗時(shí)，技術(shù)要求較高，需要10-20μg高質(zhì)量DNA，并且具有限制的敏感性5-10％。21通過PCR技術(shù)檢測經(jīng)過重排的Ig/TCR基因和染色體異常需要對于重排后的基因片段的精確了解，以便分別在連接區(qū)多樣性和斷點(diǎn)融合區(qū)(breakpointfusionregion)的對應(yīng)側(cè)(oppositeside)設(shè)計(jì)適宜的引物。在常規(guī)的基于PCR的克隆系研究中，引物之間的距離應(yīng)小于1kb，優(yōu)選小于500bp。這對于區(qū)分來自單克隆Ig/TCR基因重排的PCR產(chǎn)物與來自多克隆Ig/TCR基因重排的PCR產(chǎn)物尤其重要，所述區(qū)分基于連接區(qū)的多樣性(大小和組成的多樣性)。目前為止，主要是IGH和TCRG基因重排用于基于PCR的克隆系研究，這是由于檢測VH-JH和Vy-Jy重排所需的有限數(shù)量的引物。PCR技術(shù)的主要優(yōu)勢是它們的速度，需要DNA量較少，可能利用低質(zhì)量DNA，以及相對較好的敏感性1-5％，對于一些類型的重排敏感性甚至＜1％。因此，PCR技術(shù)允許利用小的生物活檢樣品(例如，細(xì)針吸出的生物活檢樣品)，或利用甲醛固定的、石蠟包埋的樣品(通常產(chǎn)生較低質(zhì)量的DNA)。因此，如果需要還可使用存檔物質(zhì)(archivalmaterial)。分子克隆系研究可以包含大量信息，但一些限制和缺陷將阻礙對傳統(tǒng)檢測方法獲得的結(jié)果進(jìn)行解釋1.有限制的敏感性，與正常多克隆背景相關(guān)檢測限為1％-10％(或甚至15％)，依賴于所應(yīng)用的技術(shù)(Southern印跡分析或PCR技術(shù))，并且依賴于正常B和T淋巴細(xì)胞的“背景”的相對大小。有限制的敏感性會(huì)妨礙具有小于5-10％的克隆淋巴細(xì)胞群的小克隆淋巴細(xì)胞群的檢測。2.克隆系不等同于惡性疾病檢測到克隆系不總表示存在惡性疾病。一些臨床良性增生具有克隆性(clonal)來源，諸如許多為免疫缺陷患者的CD8+(或有時(shí)為CD4+)T-淋巴細(xì)胞增多(lymphocytosis)，良性單克隆丙種球蛋白癥(monoclonalgammopathy)，EBV′淋巴組織增生(通常是寡克隆的)，以及良性皮膚T-細(xì)胞增生，諸如淋巴瘤樣丘疹病(lymphomatoidpapulosis)等。這表示分子克隆系研究的結(jié)果應(yīng)總是在臨床，形態(tài)學(xué)和免疫分型診斷的背景中解釋，即在血液學(xué)家，細(xì)胞形態(tài)學(xué)家，病理學(xué)家以及免疫學(xué)家的密切支持下。3.Ig和TCR基因重排不是系(lineage)的標(biāo)記與最初的推定不同，10多年以來明確了Ig和TCR基因重排不必要分別限于B-細(xì)胞和T-細(xì)胞系。交叉-系(cross-lineage)TCR基因重排在未成熟B-細(xì)胞惡性疾病種相對常見，尤其在前體-B-ALL(＞90％的病例)中，30但急性髓細(xì)胞白血病(acutemyeloidleukemia)(AML)和成熟B-細(xì)胞惡性疾病也可含有TCR基因重排。31-33雖然頻率較低，交叉-系Ig基因重排也出現(xiàn)于T-細(xì)胞惡性疾病和AML，主要涉及Ig重鏈(IGH)位點(diǎn)。33，34幾乎所有(＞98％)TCRαβ+T-細(xì)胞惡性疾病都具有TCRG基因重排(通常為雙等位基因)，且許多TCRγδ+T-細(xì)胞惡性疾病都具有TCRB基因重排，也提示檢測到TCRB或TCRG重排不分別指示αβ或γδT細(xì)胞系的T細(xì)胞。除了這些重排，還確定了多種淋巴系統(tǒng)惡性疾病具有異常Ig/TCR基因重排模式。該信息可詳細(xì)用于前體-B-ALL和T-ALL，但仍不適于大多數(shù)其它淋巴系統(tǒng)惡性疾病。64.假克隆系(pseudoclonality)和寡克隆系(oligoclonality)似乎為克隆的或似乎為寡克隆的淋巴細(xì)胞群(假克隆系)的檢測在Southern印跡分析中較少，除非使用具有限制的組合庫的基因，諸如TCRG或TCRD。這可導(dǎo)致弱的重排帶，例如分別為來自經(jīng)抗原選擇的TCRγδ+T-淋巴細(xì)胞的Vγ9-Jγ1.2或Vδ2-Jδ1重排。然而，這是Southern印跡分析的公知缺陷，并且不產(chǎn)生高密度重排帶。基于PCR的克隆系研究中的假克隆系較難識(shí)別。PCR的高敏感性可導(dǎo)致來自所研究的組織樣品中有限數(shù)目的B-細(xì)胞或T-細(xì)胞的較少Ig或TCR基因重排的擴(kuò)增。具體地，具有高腫瘤負(fù)荷的小針活檢樣品中或B-NHL樣品中的很少的反應(yīng)性(多克隆)T-細(xì)胞可導(dǎo)致(寡)克隆的PCR產(chǎn)物。通常，這種PCR產(chǎn)物的量有限。這在TCRG基因用作PCR靶時(shí)具體可見。二元(duplicate)或三元(triplicate)PCR分析之后混合獲得的PCR產(chǎn)物將有助于闡明似乎是克隆的PCR產(chǎn)物是否實(shí)際上起源于不同的淋巴細(xì)胞。最后，反應(yīng)性淋巴結(jié)可顯示降低的Ig/TCR庫多樣性，這是由數(shù)個(gè)經(jīng)抗原選擇的亞克隆(寡克隆系)的優(yōu)勢(predominance)造成的。具體地，具有活躍EBV或CMV感染的患者的淋巴結(jié)或血樣品可顯示限制的TCR庫或TCR基因寡克隆系。同樣，免疫抑制的臨床圖像也通常與限制的TCR庫相關(guān)，例如在接受移植的患者或患有毛細(xì)胞白血病(hairycellleukemia)的患者中。35從移植(transplantation)或血液學(xué)緩解(hematologicairemission)回收后，恢復(fù)(restoration)多克隆TCR庫。36375.假-陽性結(jié)果Southern印跡分析中，假-陽性結(jié)果罕見并通常可通過檢測消化不完全(underdigestion)或通過排除多態(tài)性限制位點(diǎn)來防止。21如果沒有對所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行適當(dāng)分析以區(qū)分單克隆或多克隆PCR產(chǎn)物，假-陽性PCR結(jié)果就包括嚴(yán)重的問題。所述區(qū)分可通過單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析(single-strandconformationpolymorphism(SSCP)ananlysis)，38變性梯度凝膠電泳(denaturinggradientgelelectrophoresis)(DGGE)，39異源雙鏈分析(heteroduplexanalysis)(HD)，40或GeneScanning(GS)實(shí)現(xiàn)。4243這些技術(shù)利用連接區(qū)多樣性來區(qū)分具有相同的連接區(qū)多樣性的單克隆細(xì)胞與具有高度多樣的連接區(qū)的多克隆細(xì)胞。6.假-陰性結(jié)果假-陰性結(jié)果在Southern印跡分析很少見，條件是使用適當(dāng)?shù)腏基因片段探針。然而，一些異常重排(通常為非-功能性重排)可被遺漏，諸如V-D重排或J區(qū)缺失。Ig和TCR基因的PCR分析可受到假-陰性結(jié)果的阻礙，這是由于所用PCR產(chǎn)物與經(jīng)過重排的基因片段發(fā)生不適當(dāng)?shù)耐嘶稹＿@種不適當(dāng)?shù)囊锿嘶鹂捎蓛煞N不同現(xiàn)象導(dǎo)致。首先，所有不同V，D，和J基因片段的精確檢測需要許多不同引物(表1)，這在實(shí)踐中是不可行的。結(jié)果，設(shè)計(jì)出家族引物(familyprimer)，其特異性識(shí)別大多數(shù)或所有具體V，D或J家族的成員?？蛇x，使用共有序列引物，推定其識(shí)別所研究基因座的幾乎所有V和J基因片段。家族引物以及具體地共有序列引物(consensusprimer)對于部分相關(guān)基因片段是通常最合適的，但顯示與其它基因片段的同源性較低(70-80％)。這可最終導(dǎo)致假-陰性結(jié)果，具體是在具有不同基因片段的Ig/TCR基因中。TCRG和TCRD基因中，這個(gè)問題很小，這是由于其不同基因片段數(shù)目有限。第二個(gè)現(xiàn)象是體細(xì)胞高變出現(xiàn)在濾泡性和后濾泡性B-細(xì)胞惡性疾病的經(jīng)過重排的Ig基因中，具體是具有類別轉(zhuǎn)換的(class-switched)IGH基因的B-細(xì)胞惡性疾病。足夠的知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)可防止前四個(gè)缺陷，這是由于它們主要涉及解釋問題。后兩個(gè)缺陷涉及技術(shù)問題，其可通過選擇適宜的PCR產(chǎn)物分析技術(shù)以及設(shè)計(jì)較好的引物組來解決。Ig/TCR基因的Southern印跡分析的優(yōu)化在過去的10年中的結(jié)果是選擇限制酶(2-15kb的片段，避免多態(tài)性限制位點(diǎn))以及探針(主要是J基因片段下游)的可信組合。盡管Southern印跡分析是絕對“金標(biāo)準(zhǔn)”技術(shù)，許多實(shí)驗(yàn)室都逐漸用PCR技術(shù)取代Southern印跡分析，這是由于PCR較快，需要最少量的中等質(zhì)量DNA，并總體上具有較好的敏感性。盡管優(yōu)勢明顯，用PCR技術(shù)取代Southern印跡分析進(jìn)行可信的Ig/TCR研究受兩個(gè)主要的技術(shù)問題阻礙-不適當(dāng)?shù)囊锿嘶鹪斐傻募訇幮越Y(jié)果；-區(qū)分單克隆和多克隆Ig/TCR基因重排的困難。數(shù)個(gè)單獨(dú)診斷實(shí)驗(yàn)室試圖解決基于PCR的克隆系研究的問題，但目前沒有可信的標(biāo)準(zhǔn)化PCR方案。反之使用許多不同引物組，所述引物組的敏感性和適用性(applicability)不同。本發(fā)明提供了核酸擴(kuò)增引物組和標(biāo)準(zhǔn)化PCR方案，用于檢測幾乎所有相關(guān)Ig和TCR基因座以及兩種經(jīng)常出現(xiàn)的染色體異常。本發(fā)明的引物組包含正向和反向引物組，其能夠擴(kuò)增Ig重鏈基因(IGH)，Igκ鏈基因(IGI)，Igλ鏈基因(IGL)，TCRβ基因(TCRB)，TCRγ基因(TCRG)，以及TCRδ基因(TCRD)或染色體轉(zhuǎn)位t(11；14)(BCLI-IGF1)和t(14；18)(BCL2-IGH)。本發(fā)明的引物使得完全和不完全重排都可檢測，并且可識(shí)別來自不同V，(D)，和J家族的基因片段?？捎糜诒景l(fā)明區(qū)分單克隆與多克隆Ig/TCR基因重排的方法中的兩種技術(shù)是異源雙鏈分析和GeneScanning。異源雙鏈分析利用雙鏈PCR產(chǎn)物，并利用連接區(qū)多樣性的長度和組成，而GeneScanning中單鏈PCR產(chǎn)物在高分辨凝膠或聚合物中僅根據(jù)其長度而被分離(圖2)。提供了107種不同的特異性引物用于所有相關(guān)Ig/TCR基因座以及t(11；14)(BCL1-IGH)和t(14；18)(BCL2-IGH)，或其變體(見圖3-11)。術(shù)語“變體(variant)”指這樣的引物，其與所示引物的核苷酸序列的大小和/或位置相差1-5個(gè)核苷酸，優(yōu)選1-3個(gè)核苷酸，只要所述變體引物的核苷酸序列含有與靶基因座的最多2個(gè)錯(cuò)配，最多1個(gè)錯(cuò)配，最優(yōu)選不含錯(cuò)配。此外，變體引物包含(區(qū)別)標(biāo)記的引物，即具有可通過任何手段(包括使用分析裝置)來鑒定或與其它標(biāo)記區(qū)分的標(biāo)記的引物。區(qū)別標(biāo)記的引物的實(shí)例是具有熒光標(biāo)記諸如6-FAM，HEX，TET或NED染料的引物。本發(fā)明標(biāo)記的引物具體優(yōu)選用于自動(dòng)高分辨率PCR片段分析(GeneScanning技術(shù))用于檢測PCR產(chǎn)物。如下所示，本發(fā)明區(qū)別標(biāo)記的引物允許區(qū)分長度(大小)大致相同的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，優(yōu)選使用多色(multi-color)GeneScanning。當(dāng)然，變體核酸擴(kuò)增引物(可為正向或反向(染料標(biāo)記的)引物)應(yīng)不能與用于擴(kuò)增反應(yīng)的任何其它(變體)正向和/或反向核酸擴(kuò)增引物形成二聚體。這是由于這可干擾與靶位點(diǎn)退火的引物，并由此干擾目的轉(zhuǎn)位或重排的擴(kuò)增。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了利用本發(fā)明的至少一組引物的核酸擴(kuò)增檢測法，優(yōu)選PCR檢測法。所述PCR檢測法可為單(single)(單元(monoplex))或多元(monoplex)PCR。優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的引物組可用于標(biāo)準(zhǔn)化多元PCR檢測法，所述檢測法利用例如兩或多種正向引物，或3或4種正向引物，或其變體(例如選自“家族引物”的組，例如來自VH家族引物)，以及一或多種共有序列反向引物，或其變體(例如JH共有序列引物)。本發(fā)明的家族引物被設(shè)計(jì)為可識(shí)別具體家族的大多數(shù)或所有基因片段(見表2)。在具體實(shí)施方案中，所有107種引物用于僅18個(gè)多元PCR試管5個(gè)用于IGH(3xVH-JH和2xDH-JH)，2個(gè)用于IGK，1個(gè)用于IGL，3個(gè)用于TCRB(2xVβ-Jβ和1xDβ-Jβ)，2個(gè)用于TCRG，1個(gè)用于TCRD，3個(gè)用于BCL2-IGH，1個(gè)用于BCL1-IGH(圖3-11)。這種檢測法允許評估克隆重排和/或染色體異常。此外，其允許檢測淋巴組織增生性疾病。在約90個(gè)定義為淋巴組織增生的Southern印跡上對引物進(jìn)行的多元PCR檢測顯示，在95％以上樣品中Southern印跡和PCR結(jié)果一致。另一實(shí)施方案中，提供利用本發(fā)明的至少一組引物檢測重排，優(yōu)選兩或多種重排的方法，所述重排選自VH-J高重排，DH-JHIGH重排，Vκ-JκIGK重排，Vκ/內(nèi)含子-KdeIGK重排，Vλ-JλIGL重排，Vβ-JβTCRB重排，Dβ-JβTCRB重排，Vγ-JγTCRG重排，Vδ-JδTCRD重排，Dδ-JδTCRD重排，Dδ-DδTCRD重排，和Vδ-DδTCRD重排。還提供了利用本發(fā)明的至少一組引物檢測t(11；14)(BCL1-IGH)轉(zhuǎn)位或t(14；18)(BCL2-IGH)轉(zhuǎn)位的方法。此外，提供利用本發(fā)明提供的至少兩組引物檢測上述至少一種重排與至少一種轉(zhuǎn)位的方法。另一方面，提供了能擴(kuò)增以下人基因的核酸擴(kuò)增引物組人AF4基因(外顯子3)，人AF4基因(外顯子11)，人PLZF1基因，人RAG1基因和人TBXAS1基因(見圖12)。利用這5組引物中的一或多種(包含正向引物(或其變體)和反向引物(或其變體))，在本發(fā)明核酸擴(kuò)增試驗(yàn)中，可能檢測一或多種“對照基因(ControlGene)”，所述對照基因選自人AF4基因(外顯子3)，人AF4基因(外顯子11)，人PLZF1基因，人RAG1基因和人TBXAS1基因。這種檢測方法優(yōu)選用于評估核酸(DNA)樣品的質(zhì)量(例如完整性和可擴(kuò)增性)，所述核酸提取或分離自生物樣品的核酸，例如提取自石蠟包埋的樣品的DNA(見實(shí)施例10)。本發(fā)明不同引物組擴(kuò)增克隆重排和/或染色體異常(轉(zhuǎn)位)的能力已經(jīng)在不同類型的惡性淋巴瘤中檢測過，所述惡性淋巴瘤包括濾泡性淋巴瘤(follicularlymphoma)，彌散大B-細(xì)胞淋巴瘤(diffuselargeB-celllymphoma)，和多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma)。發(fā)現(xiàn)一組引物非常適合用于檢測克隆重排和/或染色體轉(zhuǎn)位。利用本發(fā)明的多元引物試管的克隆重排檢出率空前地高，即至少95％。平行檢測可得的上述石蠟包埋的組織樣品顯示大致相同結(jié)果，如果這些組織的DNA質(zhì)量足夠高，表明可在特異性設(shè)計(jì)的對照基因PCR中擴(kuò)增出至少300bp的片段。在每種類型的淋巴系統(tǒng)惡性疾病的50-100個(gè)病例系列中評估本發(fā)明開發(fā)的多元PCR檢測法的可用性。在有困難的情況下根據(jù)nationalpathologypanelreview，以及centralpathologypanelreview，所有這些病例都根據(jù)WorldHealthOrganization(WHO)分類來確定。研究的診斷分類包括惡性疾病諸如濾泡性淋巴瘤(follicularlymphoma)，套細(xì)胞淋巴瘤(mantlecelllymphoma)，邊緣帶淋巴瘤(marginalzonelymphoma)，彌散大B-細(xì)胞淋巴瘤，成血管免疫細(xì)胞性(angioimmunoblastic)T-細(xì)胞淋巴瘤，外周(peripheral)T-細(xì)胞淋巴瘤，和分化不良的大細(xì)胞淋巴瘤(anaplasticlargecelllymphoma)，以及反應(yīng)性損傷(reactivelesion)。結(jié)果顯示非常高水平的克隆系檢測，即使在已知具有體細(xì)胞高變(somatichypermutation)的實(shí)體(entity)諸如濾泡性淋巴瘤和彌散大B-細(xì)胞淋巴瘤等中也如此。具體地，三個(gè)IGHVH-JH試管，以及兩個(gè)IGHDH-JH試管和兩個(gè)IGK試管的使用似乎可高效檢測克隆Ig基因重排。所述高效通過Ig試管的互補(bǔ)性以及DH-JH和IGK-Kde重排不是(或很少為)體細(xì)胞突變(somaticallymutated)的這一事實(shí)來獲得。對于T-細(xì)胞惡性疾病，所述互補(bǔ)性也見于TCRB和TCRG引物。此外，觀察到有趣的且不可預(yù)測的重排模式，諸如異常交叉-系重排。明顯地，在約10％的反應(yīng)性損傷中檢測到克隆重排。這些反應(yīng)性淋巴組織增生包括EBV-相關(guān)的淋巴組織增生和不典型增生例如Castlemanbin病(Castleman′sdisease)，以及可疑為B-或T-細(xì)胞克隆的疾病。在具體實(shí)施方案中，提供了檢測微小殘留病變(MRD)的方法。術(shù)語微小殘留病變(MRD)描述了一種狀態(tài)，其中在急性白血病(AL)化療后，形態(tài)正常的骨髓仍可保持相應(yīng)量的殘留惡性細(xì)胞。檢測微小殘留病變(MRD)是精確檢測治療過程中的癥狀緩解誘導(dǎo)的新實(shí)用工具，這是由于白血病母細(xì)胞的檢測限為10-4-10-6。已知基于PCR的MRD分析利用克隆抗原受體重排，其可在所研究患者樣品的～90-95％中檢測到。然而，擴(kuò)增多克隆產(chǎn)物通常導(dǎo)致假-陽性PCR擴(kuò)增子，其不適合MRD分析。本發(fā)明提供檢測以相同(克隆)方式重排的Ig和TCR基因或檢測已定性且頻繁的染色體異常，諸如t(11；14)，和t(14；18)。因此利用本發(fā)明引物組檢測的重排和轉(zhuǎn)位不僅可作為克隆系診斷的標(biāo)記，也作為檢測隨診過程中的MRD的PCR靶。另一方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的至少一組引物的(診斷)試劑盒，其用于檢測選自VH-JHIGH重排，DH-JHIGH重排，Vκ-JκIGK重排，Vκ/內(nèi)含子-KdeIGK重排，Vλ-JλIGL重排，Vβ-JβTCRB重排，Dβ-JβTCRB重排，Vγ-JγTCRG重排，Vδ-JδTCRD重排，Dδ-DδTCRD重排，Dδ-JδTCRD重排或Vδ-DδTCRD重排的至少一種重排和/或選自t(11；14)(BCL-IGH)和t(14；18)(BCL2-IGH)的至少一種轉(zhuǎn)位。本發(fā)明的試劑盒高度適合基于PCR的克隆系檢測?？蛇x所述試劑盒可包含至少一組引物，其能夠擴(kuò)增人“對照基因”，如上述。在對照試管中包含一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)，更優(yōu)選至少三個(gè)這些對照基因引物組有助于評估待診斷DNA樣品例如從石蠟包埋的組織提取的DNA的質(zhì)量。另一方面，本發(fā)明提供在相同多元PCR試管中快速區(qū)分不同類型的Ig/TCR基因重排的方法。GeneScanning允許在單個(gè)試管中應(yīng)用多種不同熒光染料偶聯(lián)的引物。這種對引物的區(qū)別標(biāo)記可用于額外區(qū)分不同類型的Ig或TCR基因重排。V引物的區(qū)別標(biāo)記通常具有限制的增加值，但區(qū)別標(biāo)記下游引物支持Ig/TCR基因重排類型的快速且容易地鑒定，其用于基于PCR的微小殘留病變的檢測。4445標(biāo)記J引物不認(rèn)為是提示(informativefor)IGH(VH-JH或DH-JH)，IGK(Vκ-Jκ)，或IGL(VX-JB)。為快速鑒定IGKKde重排，通過區(qū)別標(biāo)記Kde和內(nèi)含子RSS引物可區(qū)分Vκ-Kde和內(nèi)含子RSS-Kde重排(見圖5B)?？稍O(shè)計(jì)提供的信息最豐富的(mostinformative)多色(multicolor)GeneScanning用于TCR基因重排，促進(jìn)快速識(shí)別不同類型的TCRB，TCRG和TCRD基因重排。例如，在TCRB試管A中區(qū)別標(biāo)記Jβ1和Jβ2引物(見圖7B)允許容易地鑒定多克隆和單克隆Vβ-Jβ1與Vβ-Jβ2重排(圖13A)。區(qū)別標(biāo)記Jγ1.3/2.3和Jγ1.1/2.1引物(圖8B)導(dǎo)致可容易地鑒定不同類型的TCRG基因重排(圖13B)。在TCRD試管中區(qū)別標(biāo)記Jδ引物，Dδ2引物，和Dδ3引物(圖9B)導(dǎo)致容易鑒定大多數(shù)相關(guān)TCRD基因重排，諸如Dδ2-Jδ，Vδ-Jδ，Dδ2-Dδ3以及Vδ2-Dδ3重排(圖13C)。這些多色多元PCR試管對于基于PCR的克隆系診斷的日常實(shí)踐而言容易且方便。圖1TCRB基因的順次重排步驟，轉(zhuǎn)錄和翻譯的圖示。在該實(shí)例中，首先Dβ2與Jβ2.3重排，然后是Vβ4與Dβ2-Jβ2.3重排，形成Vβ4-Dβ2-Jβ2.3編碼連接(joint)。經(jīng)過重排的TCRB基因轉(zhuǎn)錄成前體mRNA，經(jīng)剪切成為RNA，并最終翻譯成TCRβ蛋白質(zhì)鏈。還顯示出在該重組過程中形成的兩種染色體外TCR切割環(huán)(TREC)；它們分別含有D-J信號(hào)接點(diǎn)和V-D信號(hào)接點(diǎn)。圖2.獲自經(jīng)過重排的Ig和TCR基因的PCR產(chǎn)物的異源雙鏈分析和GeneScanning的圖示。A.經(jīng)過重排的Ig和TCR基因(實(shí)施例中的IGH)顯示異源連接區(qū)的大小和核苷酸組成。V，D和J基因片段的種系核苷酸以大的大寫字母給出，并隨機(jī)插入的核苷酸為小的大寫字母。連接區(qū)異源性用于異源雙鏈分析(大小和組成)以及GeneScanning(僅大小)以區(qū)分來自單克隆淋巴細(xì)胞群的產(chǎn)物與來自多克隆淋巴細(xì)胞(lymphoidcell)群的產(chǎn)物。B.異源雙鏈分析中，PCR產(chǎn)物經(jīng)加熱變性(5min，94℃)并隨后迅速冷卻(1小時(shí)，4℃)以誘導(dǎo)雙鏈體(同源或異源雙鏈)形成。在由克隆性淋巴細(xì)胞組成的細(xì)胞樣品中，經(jīng)重排的IGH基因的PCR產(chǎn)物在變性和復(fù)性后產(chǎn)生雙鏈體，而在含有多克隆淋巴組織細(xì)胞群的樣品中，單鏈PCR片段主要形成異源雙鏈，導(dǎo)致電泳時(shí)緩慢遷移的背景成片條帶(backgroundsmear)。C.在GeneScanning中，使經(jīng)重排的IGH基因的熒光染料-標(biāo)記的PCR產(chǎn)物變性然后對產(chǎn)生的單鏈片段進(jìn)行高分辨率片段分析。單克隆細(xì)胞樣品產(chǎn)生相同大小的PCR產(chǎn)物(單峰)，而多克隆樣品中形成許多不同IGHPCR產(chǎn)物，其顯示特征性Gaussian大小分布。圖3.IGH(VH-JH)重排的PCR分析。A.染色體帶14q32.3上的IGH基因復(fù)合物的圖示(得自ImMuno基因Tics數(shù)據(jù)庫)。46，47僅可重排的非多態(tài)性VH基因片段包含在藍(lán)色部分(功能性VH)，或灰色部分(可重排的假基因(pseudogene))中。最近發(fā)現(xiàn)的(通常為截短的)VH假基因未顯示。B.圖示了IGHVH-JH重排以及三組VH引物和一種JH共有序列引物，引物在三個(gè)多元試管中混合。VH和JH引物的相對位置由其位于所涉及RSS的上游(-)或下游(+)的最5′核苷酸給出。用作代表性VH家族成員以進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的VH基因片段顯示在括號(hào)中。C，D，和E.相同的多克隆和單克隆細(xì)胞群的異源雙鏈分析和GeneScanning，顯示常見的異源雙鏈成片條帶和同源雙鏈帶(左圖)以及常見的多克隆Gaussian曲線和單克隆峰(右圖)。多克隆Gaussian曲線的大致分布在nt中顯示。圖4.IGH(DH-JH)重排的PCR分析。A.IGH(DH-JH)重排以及七種DH家族引物和一種JH共有序列引物的圖示，所述引物被分入兩個(gè)試管(IGH試管D和E)。將DH7(7-27)引物與其它6種DH引物分離，因?yàn)镈H7和JH共有序列引物將產(chǎn)生211nt的種系PCR產(chǎn)物。DH和JH引物的相對位置根據(jù)其位于所涉及RSS的上游(-)或下游(+)的最5′核苷酸給出。用作代表性DH家族成員以進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的DH基因片段顯示在括號(hào)中。B和C.相同的多克隆和單克隆細(xì)胞群的異源雙鏈分析(左圖)和GeneScanning(右圖)。顯示多克隆峰和單克隆峰的大致分布。試管D中可能的背景帶/峰用星號(hào)表示，并位于DH-JH重排的預(yù)期范圍以外。試管E的種系DH7-JH帶也用星號(hào)指示。圖5.IGK基因重排的PCR分析。A.染色體帶2p11.2的IGK基因復(fù)合物的圖示(得自ImMuno基因Tics數(shù)據(jù)庫)。4647僅可重排的非多態(tài)性Vκ基因片段用藍(lán)(功能性Vκ)，或灰(非功能性Vκ)表示。反轉(zhuǎn)的Vκ基因片段簇(cluster)(由字母D編碼)位于非-反轉(zhuǎn)的Vκ基因片段上游～800kb。這些上游Vκ基因片段為其相應(yīng)的非反轉(zhuǎn)對應(yīng)物的鏡像(mirroredimage)。B.Vκ-Jκ重排和兩種類型的Kde重排(Vκ-Kde和內(nèi)含子RSS-Kde)的圖示。Vκ，Jκ，Kde和內(nèi)含子RSS(INTR)引物的相對位置根據(jù)其位于所涉及RSS的上游(-)或下游(+)的最5′核苷酸給出。用作Vκ1，Vκ2，和Vκ3家族的代表性成員的Vκ基因片段顯示在括號(hào)中。Vκ4，Vκ5，和Vκ7是單成員的Vκ家族。所述引物分入兩個(gè)試管試管A具有Vκ和Jκ引物，試管B具有Vκ，內(nèi)含子RSS和Kde引物。C和D.相同的多克隆及單克隆細(xì)胞群的異源雙鏈分析和GeneScanning，顯示常見的異源雙鏈成片條帶和同源雙鏈帶(左圖)以及常見的Gaussian曲線和單克隆峰(右圖)。多克隆Gaussian曲線的大致分布在nt中顯示。圖6.IGL基因重排的PCR分析。A.染色體帶22q11.2上的IGL基因復(fù)合物的圖示(得自ImMunoGenetics數(shù)據(jù)庫)。4647僅可重排的非多態(tài)性Vλ基因片段包括在藍(lán)色部分(功能性Vλ)或灰色部分(非功能性Vλ)中。B.Vλ-Jλ重排以及兩種Vλ家族引物和一種Jλ共有序列引物的圖示。僅兩種Vλ引物設(shè)計(jì)用于Vλ1及Vλ2并用于Vλ3，因?yàn)檫@些三個(gè)Vλ家族覆蓋了大約70％可重排的Vλ基因片段，且因?yàn)樗蠭GL基因重排中大約90％涉及Vλ1，Vλ2或Vλ3基因片段。46盡管7個(gè)Jλ基因片段中有5個(gè)可重排，僅一個(gè)Jλ共有序列引物被設(shè)計(jì)為用于Jλ1，Jλ2，和Jλ3，因?yàn)樗蠭GL基因重排的98％涉及這三個(gè)基因片段之一。49Vλ和Jλ引物的相對位置根據(jù)其位于所涉及RSS的上游(-)或下游(+)的最5′核苷酸來表示。C.相同的多克隆和單克隆細(xì)胞群的異源雙鏈分析以及GeneScanning，顯示常見的異源雙鏈成片條帶和同源雙鏈帶(左圖)以及常見的多克隆Gaussian曲線和單克隆峰(右圖)。多克隆Gaussian曲線的大致分布在nt中顯示。圖7.TCRB基因重排的PCR分析。A.人TCRB基因座的圖示。所述基因片段根據(jù)Arden等所述命名。50根據(jù)Rowen等51和Lefranc等48，47的命名顯示在括號(hào)中。該圖得自internationalImMunoGeneTics數(shù)據(jù)庫。46，47僅可重排的非-多態(tài)性Vβ基因片段描繪在藍(lán)色部分(功能性Vβ)，半藍(lán)/半灰部分(可能有功能，但沒有發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)表達(dá))和灰色部分(非-功能性Vβ)中。B.Vβ-Jβ和Dβ-Jβ重排的圖示。23種Vβ引物，13種Jβ引物和兩種Dβ引物在三個(gè)試管中混合試管A含有23種Vβ引物和9種Jβ引物，試管B含有23種Vβ引物和四種Jβ引物，且試管C含有兩種Dβ引物和13種Jβ引物。將23種Vp引物與13種Jp引物進(jìn)行序列比對以便獲得PCR產(chǎn)物的相對大小(見圖C和D)。Vβ引物包括大約90％的所有Vβ基因片段。Vβ，Dβ，和Jp引物的相對位置根據(jù)其位于所涉及RSS的上游(-)或下游(+)的最5′核苷酸來表示。C，D，和E.相同多克隆和單克隆細(xì)胞群的異源雙鏈分析和GeneScanning，顯示常見的異源雙鏈成片條帶和同源雙鏈帶(左圖)以及常見的多克隆Gaussian曲線和單克隆峰(右圖)。多克隆Gaussian曲線的大致分布在nt中顯示。圖8.TCRG基因重排的PCR分析。A.染色體帶7p14上的人TCRG基因座的圖示。僅可重排的Vγ基因片段在藍(lán)色部分(功能性Vγ)或灰色部分(非功能性Vγ)中顯示。對于Jγ基因片段，使用了兩種命名法。46，47，52B.TCRGVγ-Jγ重排以及四種Vγ引物和兩種Jγ引物的的圖示，所述引物被分入兩個(gè)試管。Vγ和Jγ引物的相對位置根據(jù)其位于所涉及RSS的上游(-)或下游(+)的最5′核苷酸來表示。C和D.相同的多克隆和單克隆細(xì)胞群的異源雙鏈分析以及GeneScanning，顯示常見的異源雙鏈成片條帶和同源雙鏈帶(左圖)以及常見的多克隆Gaussian曲線和單克隆峰(右圖)。多克隆Gaussian曲線的大致分布在nt中顯示。圖9.TCRD基因重排的PCR分析。A.圖示了染色體帶14q11.2上的人TCRD基因座。六種“經(jīng)典的”Vd基因片段用藍(lán)色表示，分散在黑色的Vα基因片段之間。由于Vδ4，Vδ5和Vδ6也被識(shí)別為Vα基因片段，它們的Vα基因密碼在括號(hào)中給出。B.圖示Vδ-Jδ，Dδ2-Jδ，Dδ2-Dδ3和Vδ-Dδ3重排，顯示6種Vδ，4種Jδ和兩種Dδ引物的定位，所有都在單個(gè)試管中混合。Vδ，Dδ和Jδ引物的相對位置根據(jù)它們位于涉及的RSS上游(-)或下游(+)的最5′核苷酸來表示。C.相同的多克隆和單克隆細(xì)胞群的異源雙鏈分析(左圖)以及GeneScanning(右圖)。多克隆細(xì)胞系在異源雙鏈分析中顯示模糊的成片條帶，并在GeneScanning中顯示復(fù)雜的廣泛峰模式。顯示GeneScanning中不同類型的重排的PCR產(chǎn)物的大致位置。圖10.BCL1-IGH重排的檢測。A.圖示了染色體帶11q13上的CCND1基因和BCL1斷點(diǎn)區(qū)MTC以及染色體帶14q32上的JH基因片段。為BCL1-MTC區(qū)中進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，組成人工BCLI-MTC/JH4接頭序列(如對JVM2的部分報(bào)道53)Williams54報(bào)道的前50個(gè)核苷酸連接于MTC-序列的核苷酸1-439(得自NCBI(登錄號(hào)S7704955))；JVM253的N-區(qū)“GCCC”被加入代表JH4-JH6基因組區(qū)(登錄號(hào)J00256)的核苷酸1921-3182后。B.來自不同MCL患者和陽性對照細(xì)胞系JVM2的一系列BCLI-IGHPCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物大小不同，表明BCL1-MTC斷點(diǎn)位置不同。低密度的較大帶代表延伸到下一個(gè)下游種系JH基因片段的PCR產(chǎn)物。圖11.BCL2-IGH重排的PCR檢測。A.染色體帶18q21上的BCL2基因的圖示。BCL2斷點(diǎn)的主要部分聚集在三個(gè)區(qū)MBR，3′MBR，和mcr。因此，設(shè)計(jì)包含所述三個(gè)區(qū)中的斷點(diǎn)的多元引物兩種MBR引物，四種3′MBR引物，和三種mcr引物。BCL2引物的相對位置根據(jù)其位于涉及的BCL2外顯子3(NCBI登錄號(hào)AF325194S1)的3′末端上游(-)或下游(+)的最5′核苷酸來表示，但除外兩種BCL2-mcr引物；其位置在AF275873序列的第一個(gè)核苷酸下游標(biāo)出。B，C，和D.來自不同F(xiàn)CL患者和數(shù)種陽性對照細(xì)胞系(DoHH2，K231，OZ，和SC1)的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳。圖B和D含有相同樣品并顯示陽性中的互補(bǔ)性(complementarityinpositivity)，表明試管C(mcr管)具有附加的值。PCR產(chǎn)物大小不同，與BCL2斷點(diǎn)的不同位置相關(guān)。同一泳道中低密度的較大帶代表PCR產(chǎn)物，所述產(chǎn)物延伸到下一下游種系JH基因片段或到下一上游BCL2引物。圖12.用于評估DNA樣品的可擴(kuò)增性和完整性的對照基因PCR。A.圖示了五種對照基因外顯子和五組引物，其用于獲得600bp，400bp，300bp，200bp和100bp的PCR產(chǎn)物。對照基因引物的相對位置根據(jù)涉及的對照基因外顯子的5’剪切位點(diǎn)下游的最5′核苷酸給出。B.六種DNA樣品的對照基因PCR產(chǎn)物，在6％聚丙烯酰胺凝膠中分離。兩種對照樣品含有高分子量DNA(外側(cè)泳道)，四種DNA樣品獲自石蠟包埋的組織樣品，顯示降低的可擴(kuò)增性(例如GBS-450ng相對于GBS-4500ng)或降低的DNA完整性(PT-4)。圖13.用于支持快速且容易的TCR基因重排鑒定的多色GeneScanning。A.用區(qū)別標(biāo)記的Jβ1引物(TET-標(biāo)記的；綠)和Jβ2引物(FAM標(biāo)記的；藍(lán))進(jìn)行的TCRB試管A的雙色分析。上部的圖顯示兩種多克隆Jβ1和Jβ2重排模式(c.f.圖7C)，其中另外兩個(gè)圖顯示克隆性Jβ2重排。B.利用區(qū)別標(biāo)記的Jy1.3/2.3引物(FAM-標(biāo)記的；藍(lán)色)和Jy1.1/2.1(TET-標(biāo)記；綠色)進(jìn)行的TCRG試管A的雙色分析。上部的圖顯示多克隆重排模式(c.f.圖8C)，而另外兩張圖分別顯示克隆性Jγ1.3/2.3和克隆Jγ1.1/2.1重排。C.用區(qū)別標(biāo)記的Jδ引物(FAM標(biāo)記；藍(lán)色)，Dδ2引物(HEX-標(biāo)記；綠色)和Dδ3引物(NED-標(biāo)記；黑色)進(jìn)行的TCRD基因重排的三色分析(three-coloranalysis)。在TCRD試管中的復(fù)雜重排模式中(圖9C)，三色分析允許直接檢測Vδ-Jδ重排(藍(lán)峰)，Dδ2-Jδ重排(藍(lán)色和綠色的峰，不完全共遷移(comigrate)是由于兩種熒光染色體的遷移速度不同)，Vδ2-Dδ3重排(黑色的峰)，和Dδ2-Dδ3重排(共遷移的綠和黑色峰)。材料和方法PCR靶選擇目的在于互補(bǔ)性決定目標(biāo)是在每種淋巴系統(tǒng)惡性疾病中提供至少一種PCR-可檢測的克隆系靶。在成熟B-細(xì)胞惡性疾病中，該目的可能由于Ig基因中的體細(xì)胞高變的出現(xiàn)而受到阻礙，具體見于濾泡性和后濾泡性(post-follicular)B-細(xì)胞惡性疾病。因此決定包括具有一定程度的互補(bǔ)性的PCR靶。數(shù)種原理用于靶選擇-IGH基因不僅完整VH-JH重排還有不完全DH-JH重排都被包含在內(nèi)作為靶，因?yàn)镈H-JH重排可能不受體細(xì)胞高變影響；-IGK和IGL基因Ig輕鏈基因均可被包含作為PCR靶，由于這可增加發(fā)現(xiàn)每種成熟B-細(xì)胞惡性疾病中的PCR-可檢測型Ig基因重排的幾率；-IGK基因不僅包括Vκ-Jκ重排還包括κ缺失元件(Kde)的重排，因?yàn)樗鼈兂霈F(xiàn)在(幾乎)所有IGK+B-細(xì)胞惡性疾病和以及三分之一的IGK+B-細(xì)胞惡性疾病中的一個(gè)或所有兩個(gè)等位基因中，且因?yàn)镵de重排很可能不受體細(xì)胞高變影響；-TCRB基因完全Vβ-Jβ和不完全Dβ-Jβ重排，因?yàn)橥耆筒煌耆玊RCB基因重排出現(xiàn)在所有成熟TCRαβ+T-細(xì)胞惡性疾病以及許多TCRγδ+T-細(xì)胞惡性疾病中；-TCRG基因該經(jīng)典的PCR克隆系靶可用于TCRγδ和TCRαβ系的所有T-細(xì)胞惡性疾病中。-TCRD基因其為未成熟T-細(xì)胞惡性疾病以及TCRγδ+T-細(xì)胞惡性疾病中可能有用的靶；-TCRA基因該基因不作為PCR靶，因?yàn)樗c～50V和61J基因片段具有高度復(fù)合性(complexity)。此外，所有具有TCRA基因重排的T-細(xì)胞惡性疾病包含TCRB基因重排并通常也具有TCRG基因重排；-功能性基因片段大多數(shù)可疑淋巴組織增生涉及成熟淋巴細(xì)胞，其因此具有功能性Ig或TCR基因重排。因此PCR引物設(shè)計(jì)意在包括(幾乎)所有功能性Ig/TCR基因片段。-確定的(well-defined)染色體異常具有BCL1-IGH的t(11；14)和具有BCL2-IGH的t(14；18)被包含作為另外的靶，因?yàn)檫@兩種異常在淋巴瘤中通過PCR檢出的頻率相對高，即分別見于30％的套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)和60-70％的濾泡性細(xì)胞淋巴瘤(FCL)。用于多元PCR的引物設(shè)計(jì)在經(jīng)過重排的Ig和TCR基因中精確檢測所有V，D和J基因片段需要許多不同引物(表2)。對于一些基因復(fù)合物這是可能的(例如TCRG和TCRD)，但對于其它實(shí)踐中的基因座而言這是不可能的，因?yàn)椴煌蚱蔚臄?shù)目較高。為解決該問題，可設(shè)計(jì)家族引物，其識(shí)別具體家族的大多數(shù)或所有基因片段(表2)。可選，可制備共有序列引物，其識(shí)別出現(xiàn)在許多或所有涉及的基因片段中的保守序列。家族引物以及共有序列引物的設(shè)計(jì)在有限數(shù)目的引物和與所有相關(guān)基因片段的最大同源性之間平衡。在該研究中，我們的目的在于與所有相關(guān)基因片段(尤其是功能性基因片段)的最大同源性以防止次最佳引物退火，其可導(dǎo)致假-陰性結(jié)果。此外，我們的目的在于設(shè)計(jì)具體家族引物，其不與其它家族發(fā)生交叉退火。為限制每個(gè)基因座的PCR試管數(shù)，PCR引物多元化(多重xing)對于實(shí)際原因很重要。因此，研發(fā)具體的方案以保證設(shè)計(jì)用于多元PCR試管的引物的最大可能。為該目的，W.Rychlick博士(MolecularBiologyInsIGHts，Cascade，CO，USA)提供了其特殊改進(jìn)的OLIGO6.2軟件程序，并支持了用于最佳引物設(shè)計(jì)的方案的開發(fā)。引物設(shè)計(jì)的常用方案如下-選擇引物的位置使得PCR產(chǎn)物的大小優(yōu)選＜300bp(優(yōu)選100-300bp)，以便能利用石蠟包埋的物質(zhì)；-應(yīng)考慮與接點(diǎn)區(qū)的最小距離優(yōu)選＞10-15bp(為了避免假陰性，這由因種系序列的核苷酸缺失致使引物的3’末端不可能與經(jīng)重排的靶退火導(dǎo)致)；-引物優(yōu)選不太長(例如＜25核苷酸)。以下參數(shù)用于利用OLIGO6.2程序設(shè)計(jì)引物-搜索引物應(yīng)當(dāng)采用中等嚴(yán)謹(jǐn)度；-引物效率(efficiency)(PE)值應(yīng)當(dāng)優(yōu)選-400(且＞630，如果所述引物也用作其它基因片段的共有序列引物；-上/上、下/下或上/下引物的最穩(wěn)定的3′二聚體不應(yīng)超過～4Kcal(適度搜索策略(moderatesearchstrategy))；最穩(wěn)定的二聚體總體上較不重要；-對于多元PCR，考慮以下方案需在大多數(shù)共有序列區(qū)(即在共有序列搜索中高PE)中設(shè)計(jì)共同引物，而單個(gè)引物(家族或成員)必須被設(shè)計(jì)在最小共有序列區(qū)中(即該引物對于不應(yīng)包括在內(nèi)的基因片段的PE值較低)，以避免與其它基因片段的交叉退火并從而避免形成多重(不需要的)PCR產(chǎn)物。PCR方案標(biāo)準(zhǔn)PCR方案基于來自早期歐洲聯(lián)合研究的現(xiàn)存經(jīng)驗(yàn)開發(fā)。經(jīng)初始測定和許可后，所述方案被接受并總結(jié)于表3。用于分析獲自Ig/TCR基因重排的PCR產(chǎn)物的技術(shù)需分析獲自Ig和TCR基因重排的PCR產(chǎn)物以區(qū)分具有相同連接區(qū)的單克隆淋巴細(xì)胞以及具有高度多樣的連接區(qū)的多克隆淋巴組織細(xì)胞?；趨⑴c的實(shí)驗(yàn)室的綜合經(jīng)驗(yàn)，選擇兩種技術(shù)異源雙鏈(HD)分析和GeneScanning(GS)分析。HD分析利用雙鏈PCR產(chǎn)物并利用連接區(qū)的長度和組成；而在GS中，單鏈PCR產(chǎn)物在高分辨率凝膠或聚合物中僅根據(jù)它們的長度分離(圖2)。PCR產(chǎn)物的異源雙鏈分析用未標(biāo)記的引物獲得的PCR產(chǎn)物在高溫變性(～95C、5min)，然后在低溫快速隨機(jī)復(fù)性(優(yōu)選4℃、1小時(shí))。該強(qiáng)迫的(enforced)雙鏈體形成在多克隆淋巴組織增生時(shí)產(chǎn)生遷移速度不同的多種不同異源雙鏈，但對于單克隆淋巴組織增生，產(chǎn)生遷移速度同樣快速的的同源雙鏈。在6％聚丙烯酰胺凝膠中同源雙鏈的電泳結(jié)果是單個(gè)預(yù)定大小的帶，而異源雙鏈形成較高位置的成片條帶(圖2)。所述異源雙鏈技術(shù)迅速，簡單并廉價(jià)(見表4中的技術(shù)細(xì)節(jié))并檢測限～5％。所述檢測限受多克隆淋巴細(xì)胞的頻率影響，因?yàn)樵S多異源雙鏈的形成也消耗部分單克隆PCR產(chǎn)物。41PCR產(chǎn)物的的GeneScanning分析用于GeneScannning分析的引物需要用熒光染料標(biāo)記以便用自動(dòng)測序儀(automatedsequencingequipement)檢測PCR產(chǎn)物(圖2)。熒光染料標(biāo)記的單鏈(變性的)PCR產(chǎn)物是在變性的聚丙烯酰胺測序凝膠或毛細(xì)管測序聚合物(capillarysequencingpolymer)中根據(jù)大小分離的，并通過激光進(jìn)行自動(dòng)掃描來檢測(見表5的技術(shù)細(xì)節(jié))。這導(dǎo)致多峰型Gausian分布，對于多克隆淋巴組織增生表示許多不同PCR產(chǎn)物，而對于完全單克隆淋巴組織增生則為由一種類型PCR產(chǎn)物組成的單峰。GeneScanning快速，相對簡單，但需要昂貴的儀器。GeneScanning通常比異源雙鏈分析更敏感，且敏感性可達(dá)0.5-1.0％克隆淋巴細(xì)胞。對照基因和石蠟包埋的組織在數(shù)個(gè)歐洲國家中，新鮮組織物質(zhì)不易于進(jìn)行分子診斷諸如基于PCR的克隆系研究。因此本研究的一個(gè)目的是開發(fā)用于在石蠟包埋的組織中進(jìn)行基于PCR的克隆系研究的策略。為控制來自石蠟包埋的物質(zhì)的DNA的質(zhì)量和可擴(kuò)增性，開發(fā)了具體的多元對照基因PCR，其產(chǎn)生5片段的梯(ladder)(100bp，200bp，300bp，400bp，和600bp)。將來自上述90個(gè)病例中45例的石蠟包埋的組織的用于DNA提取。這些DNA樣品與新鮮獲得的DNA樣品平行檢測，利用對照基因多元管(ControlGenemultiplextube)以及Ig/TCR/BCLI1/BCL2多元管用于克隆系診斷(見實(shí)施例10)。實(shí)施例實(shí)施例1.完全I(xiàn)GH基因重排VH-JH背景IGH基因的功能性重排，首先是DH與JH重排，然后V與DH-JH重排，然后進(jìn)行抗體表達(dá)(成熟B-細(xì)胞的標(biāo)志)。IGH基因位于染色體14q32.3上大約包含1250個(gè)堿基的區(qū)域中。鑒定了46-52個(gè)功能性VH片段(根據(jù)個(gè)體單體型)，其根據(jù)它們在6或7個(gè)VH亞組中的同源性分組。此外，描述了大約30非-功能性VH片段。此外，一致發(fā)現(xiàn)了27種DH片段以及6種功能性JH片段(表2和圖3A)。56VH片段包含三個(gè)框架(FR)和兩個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)(圖3B)。FR的特征在于其在各種VH片段中的相似性而CDR即使在相同的VH家族中也相差很大。此外，CDR代表生發(fā)中心反應(yīng)(germinalcenterreaction)過程中體細(xì)胞高變的優(yōu)選靶序列，所述反應(yīng)增加了這些區(qū)中的變異性。盡管FR通常受到體細(xì)胞突變的影響較小，核苷酸取代也可出現(xiàn)在這些區(qū)內(nèi)，尤其是在重(heavy)突變過程下的B細(xì)胞中。高變的V-D-JH區(qū)可通過PCR擴(kuò)增以檢測克隆性B-細(xì)胞群，所述細(xì)胞群指示惡性B細(xì)胞疾病的存在?？寺⌒訠-細(xì)胞可與多克隆B-細(xì)胞(即正?；蚍磻?yīng)性淋巴系統(tǒng)組織)區(qū)別，所述區(qū)別基于與大小(大約60bp)的許多不同多克隆PCR產(chǎn)物相比，克隆性PCR產(chǎn)物的大小和組成一致并以Gaussian分布排列。用于檢測組織切片和細(xì)胞懸液中的克隆性B-細(xì)胞群的基于PCR的策略已經(jīng)在90年代早期建立。然而，最早的PCR方案利用單個(gè)VH共有序列引物，其能結(jié)合三個(gè)框架區(qū)之一，主要是FR3。這種共有序列引物不適合以相同的效率擴(kuò)增所有VH片段，這導(dǎo)致大量克隆重排不可檢測出。此外，生發(fā)中心反應(yīng)的過程中的體細(xì)胞高變不限于CDR，也出現(xiàn)于FR，從而防止引物退火并導(dǎo)致在存在腫瘤性B細(xì)胞群存在的情況下克隆性PCR產(chǎn)物仍缺失。這對于濾泡性淋巴瘤，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤以及多發(fā)性骨髓瘤尤其正確，所述腫瘤通常含有很高數(shù)目的體細(xì)胞高變。為進(jìn)一步增加IGHPCR的檢出率，進(jìn)行多種嘗試以設(shè)計(jì)家族特異性引物來克服共有序列引物的限制。然而，這些家族特異性引物主要基于以前的共有序列引物的序列。盡管這些PCR策略有助于改善檢出率，仍需要其對于體細(xì)胞高變較不敏感的引物系統(tǒng)，從而允許擴(kuò)增(幾乎)所有可能的V-D-JH重排.。引物設(shè)計(jì)根據(jù)本發(fā)明的方案，利用OLIGO-6.2程序設(shè)計(jì)三組VH引物，所述引物組對應(yīng)于三個(gè)VH框架區(qū)(FR1，F(xiàn)R2和FR3)(圖3B)。每組引物由6或7個(gè)寡核苷酸組成，并且大多數(shù)VH片段能夠無錯(cuò)配地與其相應(yīng)VH片段退火(VH1與VH7)，而對于一些少見的VH片段所述退火可具有一或至多兩個(gè)錯(cuò)配。所述設(shè)計(jì)使得錯(cuò)配就位于所述引物的5’末端。這些VH引物組與單個(gè)JH共有序列引物一起使用，其設(shè)計(jì)為與6種JH片段的同源最高的3’末端(大約在JHRSS下游35bp)退火。這保證所有JH片段可以相同結(jié)合效率檢出，并且引物結(jié)合經(jīng)不容易受到重排過程中的大量(extensive)核苷酸缺失的影響。此外，通過OLIGO-6.2程序評估發(fā)現(xiàn)，VH引物和JH引物之間沒有交叉退火。也將JH引物設(shè)計(jì)為用于擴(kuò)增其它PCR靶，諸如不完全DH-JH重排以及t(11；14)(BCL1-IGH)和t(14；18)(BCL2-IGH)。這允許通過GS分析采用相同的經(jīng)標(biāo)記的JH引物來檢測不同PCR產(chǎn)物。初始檢測階段的結(jié)果新設(shè)計(jì)的VH-JHPCR的初始檢測通過在單獨(dú)的PCR中分開應(yīng)用每種VH引物以及JH引物實(shí)施。為此，使用提取自B-細(xì)胞系以及確定的克隆性患者樣品的DNA。此外，通過在提取自反應(yīng)性扁桃體的DNA中進(jìn)行連續(xù)稀釋來檢測克隆重排的敏感性?？寺⌒詫φ諛悠凡豢捎糜诿糠N可能的IGH重排，但所有主要VH片段和數(shù)種幾乎沒有經(jīng)過重排的VH片段包括在初始檢測階段內(nèi)。所有引物對均為高效且敏感的。預(yù)期的克隆VH重排是可檢測的且敏感性為至少1％(10-2)。在預(yù)期大小范圍內(nèi)沒有背景且扁桃體DNA的擴(kuò)增給出預(yù)期的Gaussian分布曲線。(圖3C，D和E)根據(jù)這些結(jié)果，我們通過以下方式開始初始引物檢驗(yàn)的下一階段將VH引物結(jié)合成三個(gè)組，每個(gè)組特異于三個(gè)框架區(qū)之一，所述引物組與共同JH引物一起使用(圖3B)。結(jié)果與用單個(gè)引物對所得結(jié)果一致，但具有較低的敏感性。此外，除了出現(xiàn)于FR1多元PCR中的340bpPCR產(chǎn)物，沒有擴(kuò)增出大小在預(yù)期范圍內(nèi)的非特異性產(chǎn)物。該P(yáng)CR產(chǎn)物的產(chǎn)生與用于PCR的DNA來源(淋巴系統(tǒng)的和非淋巴系統(tǒng)的)無關(guān)，而當(dāng)沒有應(yīng)用DN模板時(shí)沒有獲得PCR產(chǎn)物。此外，該擴(kuò)增子僅可在異源雙鏈分析中檢測到，而不見于GeneScanning。這表明熒光標(biāo)記的JH引物與該P(yáng)CR產(chǎn)物的產(chǎn)生無關(guān)。該P(yáng)CR產(chǎn)物的序列分析公開了通過FR1VH4引物以及FR1VH2引物擴(kuò)增的VH4片段，F(xiàn)R1VH2引物通過與內(nèi)含子VH4序列結(jié)合而明顯地作為下游引物。該問題可通過設(shè)計(jì)新的FR1VH2引物解決，所述引物位于前述引物結(jié)合位點(diǎn)上游25bp。一般(general)檢測階段的結(jié)果將認(rèn)可的IGHPCR用于90個(gè)Southern印跡定義的DNA樣品，其來自確定的病例。參與一般檢測階段的11個(gè)實(shí)驗(yàn)室中的6個(gè)進(jìn)行了PCR產(chǎn)物的GS分析且5個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了HD分析。此外，包括數(shù)個(gè)多克隆以及單克隆樣品(細(xì)胞系DNA)作為對照。GS分析顯示這些病例中的45例顯示優(yōu)勢(dominant)PCR產(chǎn)物，而HD檢測顯示這些病例中的49例顯示優(yōu)勢PCR產(chǎn)物，表示存在單克隆B細(xì)胞群?？寺≈嘏趴捎盟腥NFR引物組由45個(gè)克隆病例(GS)的33個(gè)中檢出，并且在余下的12個(gè)病例中由一或兩個(gè)三個(gè)FR引物組檢出。結(jié)論是，大多數(shù)陰性結(jié)果由引物結(jié)合位點(diǎn)中的體細(xì)胞高變造成，其阻止引物退火且從而阻止擴(kuò)增。VH-JHPCR結(jié)果與Southern印跡的結(jié)果比較顯示了高度一致性。分別有85％(55個(gè)中有46個(gè))和76％(55個(gè)中有42個(gè))通過Southern印跡分析發(fā)現(xiàn)具有經(jīng)過重排的VH基因的樣品顯示GS分析和HD分析的優(yōu)勢擴(kuò)增產(chǎn)物。反之，除了兩個(gè)樣品以外的所有通過Southern印跡顯示具有種系VH基因的樣品經(jīng)GS和HD分析而顯示多克隆模式。結(jié)論結(jié)論是，用于檢測克隆VH-JH重排的三種多元PCR提供了鑒定克隆B-細(xì)胞增生的新的且可信的檢測法。在三種不同F(xiàn)R中聯(lián)合利用標(biāo)準(zhǔn)化引物有助于降低假-陰性結(jié)果率，所述假陰性結(jié)果由涉及的VH基因片段的引物結(jié)合位點(diǎn)中的體細(xì)胞高變造成。實(shí)施例2.不完全I(xiàn)GH基因重排DH-JH背景完全V-D-J重排在染色體14q32.3上IGH基因座中的形成是連續(xù)的兩步過程在早期前體-B細(xì)胞中通常首先是DH和JH基因片段之間的初始重排，然后是VH偶聯(lián)(綜述57)。除了許多不同許多不同的VH基因片段和6個(gè)功能性JH基因片段(見實(shí)施例1)，人IGH基因座還包含27個(gè)DH基因片段。58基于序列同源性，27個(gè)DH片段可分成7個(gè)家族DH1(以前稱作DM)，DH2(DLR)，DH3(DXP)，DH4(DA)，DH5(DK)，DH6(DN)，和DH7(DQ52)；所有家族包含至少四個(gè)成員，但第七個(gè)由JH區(qū)上游的單個(gè)DH7-27片段組成(圖3A)。58，59DH和JH片段之間的重組將導(dǎo)致形成不完全DH-JH連接，其可輕易在骨髓來源的CD10+/CD19-前體B-細(xì)胞中檢出60，61，且從而也見于前體B-細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病的亞組(20-25％)，其顯示未成熟基因型。62測序顯示DH2(DH2-2)，DH3(DH3-9)和DH7-27片段在前體B-ALL中占主要部分，分別包含所有鑒定的片段的36％，33％，和19％。62然而，據(jù)報(bào)道不完全DH-JH重排也見于成熟B-細(xì)胞惡性疾病。61，63此外，即使在IGH-陰性的多發(fā)性骨髓瘤(其可被認(rèn)為是B-系惡性疾病的最成熟類型)中，也觀察到DH-JH連接。64這些DH-JH重排來自非編碼型第二等位基因，并涉及DH1到DH4家族的片段。64基于對前體-B-ALL以及多發(fā)性骨髓瘤中的DH-JH連接的描述，推定不完全DH-JH重排也存在于其它類型的B-細(xì)胞白血病和淋巴瘤中。在未成熟T-細(xì)胞惡性疾病中，將DH-JH偶聯(lián)鑒定為交叉系重排；34有趣的是，這些幾乎僅出現(xiàn)在更不成熟的非-TCRαβ+T-ALL亞組并且主要涉及更下游的DH6-19和DH7-27片段。后一片段通常(達(dá)40％)用于胎B細(xì)胞但很少用于成人B細(xì)胞。65，66可見人成人前體和成熟B細(xì)胞主要利用DH2和DH3家族片段，這可由完全VH-DH-JH重排的序列證實(shí)。66盡管不同類型的成熟B-細(xì)胞惡性疾病中的不完全DH-JH偶聯(lián)的確切頻率未知，很明顯它們至少低于VH-JH連接的頻率。然而，DH-JH重排可仍代表用于基于PCR的克隆系評估的重要互補(bǔ)靶。該推定的DH-JH重排分布(作為PCR靶)基于IGH基因座中的不完全重排不包含體細(xì)胞高變的推定，因?yàn)閺腣基因片段中的啟動(dòng)子開始的轉(zhuǎn)錄沒有出現(xiàn)，而所述轉(zhuǎn)錄被認(rèn)為是體細(xì)胞高變出現(xiàn)的必要前提。87，88具體在其中體細(xì)胞高變頻繁的那些類型的B-系增生中，可能的DH-JH重組產(chǎn)物的PCR分析可因此相關(guān)，且有時(shí)甚至為檢測B-細(xì)胞克隆的唯一可能性。引物設(shè)計(jì)基于每個(gè)DH家族的高度同源性，設(shè)計(jì)7種家族-特異性DH引物(圖4)以及共有序列JH引物，所述JH引物也用于檢測VH-JH重排(見實(shí)施例1)和t(11；14)(BCLT-IGH)和t(14；18)(BCL2-IGH)(實(shí)施例8和9)。設(shè)計(jì)引物使得與其它DH家族片段的交叉-退火可最小化或優(yōu)選缺失，導(dǎo)致不同家族引物相對于RB元件的不同位置(圖4)。DH-JH接點(diǎn)的預(yù)期PCR產(chǎn)物的大小為110-130bp(對于DH7-JH連接)到395-415bp(對于DH3-JH重排)。注意，由于DH7-27片段的位置接近JH區(qū)中的片段，211bp的PCR產(chǎn)物(以及對于與下游JH基因片段退火的引物而言也可為419，1031，1404，1804，和2420bp)將從未-經(jīng)過重排的等位基因開始擴(kuò)增并作為種系帶的梯在幾乎每個(gè)樣品中檢測出。初始檢測階段的結(jié)果對于單個(gè)DH引物的首次檢測，使用具有確定的克隆DH-JH重排的高腫瘤負(fù)荷前體B-ALL或T-ALL樣品。在標(biāo)準(zhǔn)PCR條件下，利用1.5mMMgCl2和AmpliTaqGold緩沖液，所有7種引物組合可檢測克隆DH-JH靶，其產(chǎn)物長度在預(yù)期大小范圍內(nèi)。DH引物與來自其它DH家族的、重排過的基因片段的交叉退火僅僅非常弱或根本沒有觀察到。此外，健康對照中也觀察到大小在正確范圍內(nèi)的扁桃體或MNCDNAPCR產(chǎn)物。利用非-模板特異性對照DNA，對于幾乎所有引物組都沒有觀察到引物的非特異性退火；僅在DH2/JH引物組的情況現(xiàn)，在HeLaDNA中觀察到(有時(shí)微弱)340-350bp產(chǎn)物。進(jìn)一步測序顯示該非特異性產(chǎn)物是由于DH2引物對JH4片段上游的DNA序列假引發(fā)(falsepriming)造成的。然而，由于該非特異性產(chǎn)物大小與任何真正DH-JHPCR產(chǎn)物的大小差異很大，決定不設(shè)計(jì)新的DH2引物。事實(shí)上，非特異性350bp帶可用作成功DNA擴(kuò)增的內(nèi)部標(biāo)記，由此反映模板DNA的質(zhì)量，所述帶在提供足夠的克隆或多克隆DH-JH模板時(shí)(例如在扁桃體DNA或來自具體白血病樣品的DNA中)，幾乎不能觀察到或僅為很微弱的帶，但在包含少量具有DH-JH重排的淋巴細(xì)胞的樣品中尤其強(qiáng)。利用HD分析發(fā)現(xiàn)，將來自克隆參照樣品的DNA的逐級(jí)稀釋入扁桃體DNA通常導(dǎo)致敏感性為5％或更低(DH6-JH重排時(shí)為0.5-1％)；GS分析中的敏感性通常1-2個(gè)稀釋步驟更好(1-2dilutionstepsbetter)，即1％或更低?？寺H7-JH靶僅可在敏感性為～10％時(shí)檢測到，其最可能由在包括非-經(jīng)過重排的種系DH7和JH基因片段的PCR擴(kuò)增子中的引物消耗造成。盡管最初的多元策略(如來自O(shè)LIGO6.2-支持的引物設(shè)計(jì)提示)，是將各種DH引物分入兩個(gè)試管，決定在檢測各種多元方法后將除了DH7引物外的所有引物結(jié)合到一個(gè)試管中(IGH克隆系檢測的試管D)，DH7引物包含在分離的試管中(IGH克隆系檢測的試管E)。包括DH7引物的理由是復(fù)雜的種系模式，這是由于容易用非-重排的DH7片段擴(kuò)增等位基因。利用這種兩-試管的多元方法(two-tubemultiplexapproach)，所有克隆參照樣品仍可檢測。在多元條件下這些各種克隆靶的檢測限與單檢測(singleassay)相比合乎邏輯地為次佳的，所述檢測限的范圍是～5％(DH3，DH4，和DH6)到～10％(DH2和DH5)。對于可得的DH1克隆參照樣品，觀察到敏感性～20％；在后一階段，發(fā)現(xiàn)在多元檢測法中細(xì)胞系KCA的DH1-JH重排在低至敏感性10％時(shí)是為可檢測的。由于試管E僅含有DH7引物，對于該試管10％敏感性與前所述的相同。用500ng而不是100ngDNA的連續(xù)稀釋進(jìn)行相同的多元分析，所得敏感性稍好。在MNCDNA而非扁桃體DNA中利用連續(xù)稀釋不明顯影響DH-JH重組檢測法的檢測限。一般檢測階段的結(jié)果在參與引物設(shè)計(jì)的三個(gè)檢測法室中進(jìn)行初始檢測后，進(jìn)一步利用90個(gè)Southern印跡-確定的樣品評估開發(fā)的IGHDH-JH多元PCR檢測法。在4個(gè)實(shí)驗(yàn)室通過HD并在5個(gè)實(shí)驗(yàn)室通過GS分析平行分析每個(gè)樣品，在另外兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室所有樣品均通過所述兩種技術(shù)分析。對于每個(gè)樣品每管總共獲得6個(gè)HD和7個(gè)GS分析結(jié)果。盡管大多數(shù)樣品中的結(jié)果一致(＞80％的實(shí)驗(yàn)室具有相同結(jié)果)，9個(gè)顯示試管D的結(jié)果在實(shí)驗(yàn)室間不一致。進(jìn)一步分析顯示這些可通過存在具有弱克隆產(chǎn)物的小克隆，或大體積的產(chǎn)物(-390和更大的)得以解釋。在一些情況中所述產(chǎn)物非常大，使得僅在測序后才清楚它們涉及真實(shí)但延長的DH-JH重排，其可自上游的DH(例如DH6-25-DH1-26-JHNL-12中)或自下游的JH基因片段(例如PT-14中的DH6-25-JH4-JH5)。在其中的克隆產(chǎn)物利用試管E發(fā)現(xiàn)的所有三個(gè)病例中(NL-17，蕈樣肉芽腫(mycosisfungoides)；FR-1，B-CLL；FR-5，F(xiàn)CL)，實(shí)驗(yàn)室間的結(jié)果完全一致。當(dāng)評估HD和GS分析的結(jié)果時(shí)，這些似乎是可比的，但通常在所得結(jié)果相同的實(shí)驗(yàn)室中，利用HD分析的實(shí)驗(yàn)室的數(shù)目高于利用GS分析的實(shí)驗(yàn)室的數(shù)目(圖4B和C)。直接比較DH-JH多元PCR結(jié)果與SB數(shù)據(jù)實(shí)際上不可能，這是因?yàn)樵?IGHJ6)JH區(qū)中用單個(gè)探針進(jìn)行雜交不能區(qū)分VH-JH和DH-JH重排。三個(gè)樣品中，很明顯結(jié)合的VH-JH和DH-JH檢測的克隆產(chǎn)物的檢測不符合(fitwith)SB分析中IGH基因座的構(gòu)型。明顯地，在前濾泡性(pre-follicular)B-細(xì)胞惡性疾病中沒有觀察到克隆DH-JHPCR產(chǎn)物。反之，11/16B-CLL樣品和12/25(后(post)-)濾泡性B-細(xì)胞惡性疾病樣品包含克隆重排的DH-JHPCR產(chǎn)物。在18個(gè)T-細(xì)胞惡性疾病病例的3個(gè)中可見克隆性DH-JH重排；這些涉及具有SB-檢測到的IGH重排的T-LBL(ES-9)和蕈樣肉芽腫(NL-17)病例，和一例不具有SB-檢測到的IGH重排的T-NHL/EATL(PT-4)，可能由＜15％的低腫瘤負(fù)荷造成。所有15個(gè)反應(yīng)性病例僅顯示多克隆性DH-JHPCR產(chǎn)物，這與SB結(jié)果相符。在診斷困難的類型D中，三個(gè)樣品(PT-12，GBS-10，和GBN-8)顯示克隆性IGHDH-JHPCR產(chǎn)物，這與三個(gè)病例的兩個(gè)中的SB數(shù)據(jù)以及IGICPCR數(shù)據(jù)相符；其它兩個(gè)樣品(PT-6和GBS-9)中(均為富含T-細(xì)胞的B-NHL病例)，發(fā)現(xiàn)克隆性DH-JH產(chǎn)物以及克隆性IGK和/或IGL產(chǎn)物，但沒有來自SB分析的克隆系的證據(jù)，其最好可由這些樣品中B-細(xì)胞克隆較小來解釋。為確定DH-JHPCR分析的其它價(jià)值，將所述結(jié)果與VH-JHPCR分析的結(jié)果進(jìn)行比較。在5種(NL-4，PT-14，GBN-2，F(xiàn)R-7，NL-12)B-細(xì)胞惡性疾病中，發(fā)現(xiàn)克隆性DH-JHPCR產(chǎn)物，而僅觀察到多克隆VH-JHPCR產(chǎn)物。結(jié)論結(jié)論是，基于最初和一般檢測階段，DH-JHPCR分析顯示對克隆系評估有附加價(jià)值。盡管HD的分析結(jié)果可能稍微更容易解釋，沒有對HD或GS分析的明顯偏向，這是由于它們都適合分析擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。DH-JHPCR分析的可能困難是預(yù)期的PCR產(chǎn)物的大小范圍相對較大，這是由于分散的引物位置以及自上游DH或下游JH基因片段的延伸的擴(kuò)增，表示對于GS分析推薦較長距離(longrun)。最后，DH7-27基因片段在IGH基因座中的不尋常位置導(dǎo)致在管E中的種系擴(kuò)增產(chǎn)物的梯(ladderofgermlineamplificationproduct)，其中的克隆產(chǎn)物作為小得多的帶/峰而容易被識(shí)別。實(shí)施例3.IGK基因重排Vκ-Jκ，Vκ-Kde/內(nèi)含子RSS-Kde背景人IGK輕鏈基因座(染色體2p11.2上)包含許多不同Vκ基因片段(分成七個(gè)Vκ基因家族)以及Cκ區(qū)上游的5個(gè)Jκ基因片段。最初，Vκ基因片段根據(jù)Zachau等所述的命名法來命名。可選的命名法將Vκ基因片段分成7個(gè)家族，并用于ImMunoGeneTics數(shù)據(jù)庫種。46。這里，我們根據(jù)后一命名法。Vκ1，Vκ2，和Vκ3家是包括功能性和假基因片段的多-成員家族，而另一家族僅含有單個(gè)(Vκ4，Vκ5，Vκ7)或一些片段(Vκ6)。70明顯地，所有Vκ基因片段分散在兩個(gè)大的復(fù)制性簇(duplicatedcluster)中，一個(gè)在Jκ片段上游與所述片段緊鄰且與該片段方向相同，另一個(gè)位于更遠(yuǎn)端(distal)并為反轉(zhuǎn)方向(invertedorientation)(圖5A)。71后者提示所謂的反轉(zhuǎn)重排是形成涉及遠(yuǎn)端簇的Vκ基因的Vκ-Jκ連接所需的。此外對Vκ和Jκ片段，位于IGK基因座中的其它元件可參與重組。κ缺失型元件(kappadeletingelement)(Kde)(Jκ-Cκ區(qū)下游大約24kb)，可與Vκ基因片段(Vκ-Kde)重排，但也可與Jκ-CK內(nèi)含子(內(nèi)含子RSS-Kde)中分離的RSS重排。24，27兩種類型的重排都導(dǎo)致IGK等位基因的功能性失活，所述失活可通過缺失CK外顯子(內(nèi)含子RSS-Kde重排)或整個(gè)Jκ-Cκ區(qū)(Vκ-Kde重排)。由于人IGK重組開始于骨髓中的前體B細(xì)胞，IGK重排也可在前體B細(xì)胞急性白血病(30-45％的等位基因，與年齡有關(guān))中檢出。盡管存在Vκ-Jκ連接，這些IGK重排主要涉及包括Kde的重組(25-35％的等位基因)。在兒童期前體B-ALL中，Vκ-Kde重組比內(nèi)含子-Kde更有優(yōu)勢，而成人ALL所述缺失只涉及Vκ-Kde偶聯(lián)。24，73，74在慢性B-細(xì)胞白血病中，IGK重排甚至更經(jīng)常，可在所有等位基因的75％(Igκ+病例)或甚至95％(Igλ+病例)中檢出。通過定義，功能性Vκ-Jκ重排見于Igκ+B-細(xì)胞白血病中的至少一個(gè)等位基因；非-編碼型第二個(gè)等位基因存在于種系構(gòu)型(germlineconfiguration)中或通過Vκ-Kde(8％的等位基因)或內(nèi)含子RSS-Kde(8％的等位基因)重組失活。Kde重排在Igλ+B-細(xì)胞白血病(～85％的等位基因)中常見，內(nèi)含子RSS-Kde重組比Vκ-Kde重排稍占優(yōu)勢。這表明幾乎所有Igλ+白血病都含有Kde重排，而可能的功能性Vκ-Jκ偶聯(lián)相對非常少。24，75數(shù)個(gè)研究表明Vκ基因片段的利用在各種正常和惡性B細(xì)胞群中幾乎相同并在很大程度上反映了每個(gè)家族中可得基因片段的數(shù)目。Vκ-Jκ以及Vκ-Kde重排中，來自前四個(gè)家族(Vκ1-Vκ4)的Vκ基因片段占優(yōu)勢。Vκ2基因利用在前體B-ALL中高于更成熟的B-細(xì)胞淋巴組織增生或正常B細(xì)胞中的所述利用。值得注意地，遠(yuǎn)端的反轉(zhuǎn)的Vκ簇很少用于Vκ-Jκ重排，而Vκ假基因片段從不參與，也不參與到Igλ+病例中。76對于Jκ基因片段利用知之甚少，但少量的數(shù)據(jù)顯示Jκ1，Jκ2和Jκ4最常用的Jκ基因片段。75Vκ-Jκ重排可以是B-細(xì)胞增生的重要互補(bǔ)PCR靶，所述B細(xì)胞增生中的體細(xì)胞高變可妨礙VH-JH靶的擴(kuò)增，但涉及Kde的重組很可能更有價(jià)值。Jκ-Cκ內(nèi)含子中的干擾序列的缺失導(dǎo)致去除了IGK增強(qiáng)子，所述增強(qiáng)子被認(rèn)為對于體細(xì)胞高變過程的出現(xiàn)很重要。涉及Kde的重排因此被認(rèn)為無體細(xì)胞高變，并由此應(yīng)該可相當(dāng)容易地?cái)U(kuò)增。引物設(shè)計(jì)利用OLIGO6.2軟件，設(shè)計(jì)6種家族-特異性Vκ引物，其可識(shí)別七個(gè)Vκ家族的各種Vκ基因片段；Vκ6家族基因片段被Vκ1家族引物(圖5B)覆蓋(cover)。對于相對較大的Vκ1，Vκ2和Vκ3家族僅考慮功能性Vκ基因片段，這是由于同源性較低的假基因片段使得最佳引物設(shè)計(jì)變得非常復(fù)雜。設(shè)計(jì)家族-特異性Vκ引物，所述引物與兩種Jκ引物的組(包括前四個(gè)Jκ片段的Jκ1-4及包括第5個(gè)Jκ片段的Jκ5)或Kde引物(圖5B)聯(lián)合使用。為分析Kde重排，制備了識(shí)別內(nèi)含子RSS上游序列的另一正向引物。為顯示與其它Vκ家族片段的最小交叉退火并仍可用于多元反應(yīng)，可設(shè)計(jì)位于相似的RSS元件相對位置的各種引物(圖5B)。Vκ-Jκ連接的預(yù)期PCR產(chǎn)物大小為～115-135bp(對于Vκ7-Jκ連接)到～280-300bp(Vκ2-Jκ重排)。對于Kde重排，產(chǎn)物大小為～195-215bp(Vκ7-Kde)到～360-380bp(Vκ2-Kde)，而內(nèi)含子RSS-Kde產(chǎn)物為～275-295bp。初始檢測階段的結(jié)果對于單個(gè)引物的初始檢測，使用數(shù)個(gè)細(xì)胞系以及具有精確確定的克隆Vκ-Jκ，或Vκ-Kde/內(nèi)含子RSS-Kde重排的患者樣品。具有Vκ-Jκ連接的患者樣品大多與慢性B-細(xì)胞白血病有關(guān)，其另外基于高腫瘤負(fù)荷進(jìn)行選擇以便快速并敏感地檢測所涉及的重排。不幸的是，克隆性參照樣品不可用于所有Vκ-Jκ靶；尤其是涉及Vκ5，Vκ7和/或Jκ5的更少見的重排不在參照樣品系列中顯示。對于這些靶以及可利用克隆參照樣品的靶，利用健康對照扁桃體或MNCDNA樣品，其中確實(shí)觀察到正確預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物。唯一的例外是Vκ7/Jκ5引物組合；最可能是Vκ7-Jκ5連接在正常B細(xì)胞非常少見，使得這些PCR產(chǎn)物幾乎不能或不能在扁桃體中檢測到。大小在預(yù)期范圍內(nèi)的經(jīng)重排的產(chǎn)物可在所有克隆參照樣品中檢出，所述檢測在標(biāo)準(zhǔn)PCR條件利用1.5mMMgCl2和ABIGold緩沖液或ABI緩沖液II進(jìn)行。然而，在一些病例中具體Vκ-Jκ重排的弱擴(kuò)增可用其它Vκ家族/Jκ引物組觀察到，這是由于Vκ3引物與一些Vκ1基因片段的輕微交叉退火。此外，在一些克隆性參照樣品中，用其它Vκ/Jκ或甚至Vκ/Kde以及內(nèi)含子RSS/Kde引物組可見明顯的其它克隆性PCR產(chǎn)物；在大多數(shù)樣品中，這可通過兩種IGK等位基因的完整構(gòu)型來解釋。多種克隆性PCR產(chǎn)物的出現(xiàn)說明IGK重排模式在給定細(xì)胞樣品中的復(fù)雜性，這主要由兩種克隆重排出現(xiàn)在一種等位基因(Vκ-Jκ和內(nèi)含子RSS-Kde)上的可能性導(dǎo)致。這種復(fù)雜生并不阻礙反而支持了多克隆系(polyclonality)和單克隆系(monoclonality)的區(qū)分。利用HeLaDNA作為非-模板特異性對照時(shí)，對于Vκ-Jκ和Vκ-Kde/內(nèi)含子RSS-Kde引物組沒有觀察到引物的非特異性退火。在扁桃體DNA中連續(xù)稀釋克隆性參照樣品的DNA通常導(dǎo)致利用HD分析時(shí)Vκ-Jκ重排的敏感性為5-10％而Vκ-Kde重排的敏感性為1-10％。通常，GS分析的敏感性在大約一步稀釋時(shí)更好(onedilutionstepbetter)。唯一稍有問題的靶是內(nèi)含子RSS-Kde靶，其僅可在所用患者樣品中的10％連續(xù)稀釋中檢測到。這可能由內(nèi)含子RSS-Kde重排大量在來自用于稀釋實(shí)驗(yàn)的Igκ+和Igλ+扁桃體B細(xì)胞的DNA中較充足這一事實(shí)造成。檢測兩個(gè)不同多元PCR反應(yīng)試管組成的數(shù)種方法后選出多元策略。在Vκ-Jκ試管(試管A)中，所有Vκ引物都與兩種Jκ引物組合，而試管B含有所有Vκ引物以及內(nèi)含子RSS引物與Kde反向引物的組合(圖5B)。所有前述克隆性參照樣品可利用該兩-試管多元方法檢測。需要注意的是這樣一個(gè)觀察，即非-克隆性扁桃體樣品中，占優(yōu)勢的、似乎是克隆性的～150bp帶可利用Vκ-Jκ多元試管A分析檢出。該產(chǎn)物的存在(可見于HD分析但尤其可見于GS分析)，可通過Vκ-Jκ連接區(qū)的有限制的異源性解釋，所述異源性導(dǎo)致高頻率的平均大小為～150bp的產(chǎn)物。此外，一些樣品中，有時(shí)在試管B中觀察到弱404bp非特異性帶。盡管平均來看敏感性稍好于其它多元方法(其中的Vκ引物被進(jìn)一步分入多個(gè)試管)中的敏感性，僅用兩個(gè)試管分析所有相關(guān)IGH重排的可能性最終是選擇如圖5B所示的兩-試管多元方法的最重要依據(jù)。兩-試管多元方法中的各種克隆性靶的檢測限對于大多數(shù)克隆性Vκ-Jκ重排(Vκ1-Jκ4，Vκ2-Jκ4，Vκ3-Jκ4)而言為～10％，所述重排來自具有高腫瘤負(fù)荷的可提供信息的樣品；數(shù)種Vκ-Kde靶可以以仍合理的敏感性～10％進(jìn)行檢測，但一些含有Vκ2-Kde，Vκ5-Kde以及內(nèi)含子RSS-Kde靶的其它樣品顯示檢測限高于10％。即使利用500ng而非100ng連續(xù)稀釋的DNA幾乎不能產(chǎn)生更好的敏感性，而MNCDNA中的連續(xù)稀釋不影響所述檢測限。然而，參照DNA在水中的連續(xù)稀釋的檢測限均為0.5-1％的級(jí)別，其顯示所選多元IGKPCR檢測等較好。重要的是要注意所用淋巴結(jié)或外周血中潛在的克隆性細(xì)胞群必須在多克隆細(xì)胞的背景中檢出，其可阻礙敏感的克隆系檢測，尤其是在具有相對高的多克隆B細(xì)胞本底(background)的樣品中。一般檢測階段的結(jié)果初始檢測以后在參與引物設(shè)計(jì)的四個(gè)實(shí)驗(yàn)室中，進(jìn)一步用90個(gè)Southern印跡確定的樣品來評估開發(fā)的IGK多元PCR檢測。每種樣品通過HD(五個(gè)實(shí)驗(yàn)室)和GS(兩種實(shí)驗(yàn)室)分析進(jìn)行平行分析，在另外四個(gè)實(shí)驗(yàn)室通過所述兩種技術(shù)分析所有樣品?？偟膩砜矗糠N樣品每試管可得8個(gè)HD和5個(gè)GS分析結(jié)果。在大多數(shù)樣品中，＞80％的實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生相同的結(jié)果，即在一個(gè)或兩個(gè)試管中的克隆帶/峰或多克隆成片條帶/曲線。然而，發(fā)現(xiàn)9個(gè)(～10％)樣品存在實(shí)驗(yàn)室間的不一致，其在重復(fù)分析這些樣品后保持。更詳細(xì)的分析顯示在至少6個(gè)病例中，不能容易地區(qū)分管A中大約150和200bp大小的克隆產(chǎn)物與大小幾乎相同的多克隆產(chǎn)物。這是具體Vκ-Jκ分析中的固有困難，其由這些重排的相對限制的連接異源性導(dǎo)致。然而在兩種樣品中，試管B的結(jié)果在所有利用兩種技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室中非常明確，表明實(shí)際上沒有差異。在一個(gè)樣品中(ES-8)約500bp的大產(chǎn)物為造成不一致的實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果的原因；進(jìn)一步測序顯示從下游Jκ片段開始的擴(kuò)增導(dǎo)致延長的Vκ1-Jκ3-Jκ4PCR產(chǎn)物的產(chǎn)生。當(dāng)評估來自HD和GS分析的結(jié)果時(shí)，這些似乎是可比的，但通常在顯示相同結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室中，利用HD分析的實(shí)驗(yàn)室的數(shù)目高于利用GS分析的實(shí)驗(yàn)室的數(shù)目(圖5C和D)。值得注意地，在一個(gè)樣品中(GBS-4)HD分析在兩個(gè)試管中都顯示明確的產(chǎn)物，而GS分析僅顯示多克隆系。HD產(chǎn)物的克隆顯示具體的Vκ3-Vκ5PCR產(chǎn)物，其不能在其它任何樣品中觀察到；該產(chǎn)物的Vκ-Vκ構(gòu)型解釋了為什么它不能由標(biāo)記的Jκ引物在GS分析中檢測到。PCR結(jié)果與SB數(shù)據(jù)的比較顯示在前濾泡性B-細(xì)胞惡性疾病和B-CLL樣品中沒有SB-PCR差異；與SB分析中經(jīng)重排的IGK帶的存在一致，所有樣品含有克隆性IGKPCR產(chǎn)物。反之，在25個(gè)(后-)濾泡性B-細(xì)胞惡性疾病樣品中，利用兩種技術(shù)時(shí)克隆性IGKPCR產(chǎn)物在四個(gè)DLCL病例(ES-5，PT-13，PT-14，F(xiàn)R-7)以及一個(gè)PC白血病(NL-19)病例中缺失，而僅在利用GS分析時(shí)在另一DLCL病例(GBS-4，見上文)中缺失。在所有病例中，這最可能由體細(xì)胞高變引起。有趣的是，在一個(gè)FCL病例(NL-4)中，發(fā)現(xiàn)克隆性PCR產(chǎn)物，而SB分析顯示IGK基因的種系帶(germlineband)而在對IGH分析時(shí)顯示弱的克隆帶。在所有18個(gè)T-細(xì)胞惡性疾病病例和所有15個(gè)反應(yīng)性病例(類別C)中，發(fā)現(xiàn)除了一個(gè)外周T-NHL病例(FR-10)外多克隆IGKPCR產(chǎn)物與SB結(jié)果一致?？寺CR和IGK產(chǎn)物之后，該樣品還顯示克隆IGH和IGLPCR產(chǎn)物，但SB分析中沒有克隆Ig重排，很可能反映了小的其它B-細(xì)胞克隆存在于該樣品中。最后，在診斷較為困難的類別(D)中，兩種樣品(GBS-10和GBN-8)顯示克隆性IGKPCR產(chǎn)物，這與SB數(shù)據(jù)一致；然而，在另外兩種樣品(PT-6和GBS-9)(均為富含T-細(xì)胞的B-NHL病例)中，發(fā)現(xiàn)了克隆性IGKPCR產(chǎn)物以及克隆性IGH和/或IGL產(chǎn)物，但沒有來自SB分析的克隆系的證據(jù)。所述差異還很可能通過在這兩個(gè)患者樣品中的B細(xì)胞克隆體積較小來解釋。為確定分析IGK基因座的附加價(jià)值，我們比較了IGKPCR分析與IGHPCR分析的結(jié)果。在九個(gè)樣品的五個(gè)(ES-2，NL-4，PT-8，GBN-2，ES-8)中(其中沒有發(fā)現(xiàn)克隆性VH-JHPCR產(chǎn)物)，克隆產(chǎn)物可輕易在IGK分析中觀察到。當(dāng)同時(shí)考慮VH-JH和DH-JH分析時(shí)，在這些用于檢測克隆性IgPCR產(chǎn)物的三個(gè)病例中，IGKPCR分析仍與IGHPCR分析互補(bǔ)。結(jié)論結(jié)論是，基于初始和一般檢測階段以及利用這些多元分析在病例確定的淋巴組織增生系列中所得的初步證據(jù)，IGK基因座的PCR分析對于克隆系檢測具有明確(附加)的價(jià)值。然而，應(yīng)注意具體對在試管A中的似乎是克隆性的帶的說明，這是由于固有的有限IGK連接異源性。由于該問題在GS分析中尤其明顯，HD分析稍稍由于GS分析，但應(yīng)該指出一些情況下，GS分析可促進(jìn)結(jié)果的適當(dāng)解釋。另一可能的陷阱是預(yù)期經(jīng)重排的IGK產(chǎn)物的相對較大的大小范圍，這是由于分散的(scattered)引物位置，以及從下游Jκ基因片段開始的延長的擴(kuò)增。這表明對于GS分析推薦較長距離(longrun)。最后，IGK基因座中的多重重排(在同一等位基因上的Vκ-Jκ和Kde重排)的固有復(fù)雜性，以及Vκ引物的低水平交叉退火，有時(shí)可導(dǎo)致具有多重帶或峰的模式，這與寡克隆系(oligoclonality)相似。然而，考慮到這些，兩-試管IGK多元PCR系統(tǒng)在基于PCR的克隆系診斷中是有價(jià)值的。實(shí)施例4.IGL基因重排背景IGL基因重排存在于5-10％的Igκ+B-細(xì)胞惡性疾病和所有Igλ+B-細(xì)胞惡性疾病中。75因此Vλ-Jλ重排可代表用于克隆系研究的另一有吸引力的PCR靶，以補(bǔ)償主要由體細(xì)胞突變導(dǎo)致的假陰性IGHVH-JHPCR結(jié)果。IGL基因座在染色體22q11.2占據(jù)1Mb。77-79在900kb的長度上有73-74個(gè)Vλ基因，其中有30-33個(gè)是功能性的(圖6A)。根據(jù)序列同源性，Vλ基因可分為11個(gè)家族和三個(gè)異種集團(tuán)(clans)。同一家族的成員傾向于在染色體上形成簇。Jλ和Cλ基因串聯(lián)排列，Jλ片段位于Cλ基因前。通常有7個(gè)J-Cλ基因片段，其中J-Cλ1，J-Cλ2，J-Cλ3和J-Cλ7是功能性的，并編碼四個(gè)Ihλ同種型(圖6A)。80，81然而在許多J-Cλ基因片段中存在多態(tài)性變異，這是由于一些個(gè)體可攜帶多至11個(gè)所述基因片段，這是由于Cλ2-Cλ3區(qū)的擴(kuò)增導(dǎo)致的。8283一些研究顯示正常和惡性B細(xì)胞的IGL基因庫都是被偏向的(bias)。48，49，84，85因此正常B細(xì)胞利用的Vλ基因的90％以上屬于Vλ1，Vλ2和Vλ3家族，其中包括60％的功能性基因。此外，三種基因(2-14，1-40，2-8)占表達(dá)的庫的一半。而正常B細(xì)胞利用基本相同比例的J-Cλ1，J-Cλ2和J-Cλ3基因片段，腫瘤B細(xì)胞傾向于主要利用J-Cλ2和J-Cλ3基因片段。49在正常和惡性B細(xì)胞中，J-Cλ7都很少使用(1％)。然而后一發(fā)現(xiàn)受到正常細(xì)胞的單個(gè)-細(xì)胞研究(single-cellstudy)的挑戰(zhàn)，所述單個(gè)-細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)一半以上的重排利用J-Cλ7基因片段。86反之對于小鼠，由于外切核酸酶活性和人IGL基因重排中的N核苷酸添加，存在一些連接多樣性(junctionaldiversity)。82，85-87然而，它的廣泛性比IGH基因座的廣泛性小很多，且許多重排由種系Vλ和Jλ基因片段的直接偶聯(lián)導(dǎo)致。然而，IGL基因座可能代表用于B細(xì)胞克隆系研究的、與IGH互補(bǔ)的可選基因座。引物設(shè)計(jì)考慮到被偏向的Vλ庫，我們選擇僅擴(kuò)增利用Vλ1，Vλ2和Vλ3基因片段的重排。在相同家族成員之間高同源性的區(qū)中設(shè)計(jì)識(shí)別Vλ1和λ2基因片段的單個(gè)共有序列引物以及Vλ3引物(圖6B)。初始檢測顯示它們在多元檢測法中分別起到良好作用。實(shí)際上，當(dāng)分別使用Vλ引物時(shí)，可觀察到與Vλ1或Vλ2基因(或反之)雜交的Vλ3引物的交叉退火；但在多元PCR中不能見到。為Jλ1，Jλ2和Jλ3基因片段設(shè)計(jì)單個(gè)共有序列引物，并且所述引物與每個(gè)種系序列相比在其中心部分具有一個(gè)錯(cuò)配。在初步的檢測中，發(fā)現(xiàn)所述引物所得結(jié)果比完美匹配的Jλ1和Jλ2-Jλ3引物組合所得結(jié)果更好。由于單檢測報(bào)道了在正常B細(xì)胞中頻繁利用Jλ7基因，86我們還設(shè)計(jì)了Jλ7特異性引物。當(dāng)在各種多克隆B細(xì)胞樣品上檢測時(shí)，我們幾乎不能在HD分析中檢測到信號(hào)，這與利用Jλ1，Jλ2-Jλ3或Jλ共有序列引物在相同樣品上進(jìn)行的擴(kuò)增相反。類似地，當(dāng)分析單克隆B細(xì)胞腫瘤的集合時(shí)，我們不能利用該引物檢測到任何重排?；谶@些結(jié)果以及文獻(xiàn)中的報(bào)道49，我們推論未經(jīng)證實(shí)的高頻率Jλ7重排(在單個(gè)研究中)86由技術(shù)缺陷導(dǎo)致，并因此我們決定不包括Jλ7引物。PCR檢測法用于檢測IGL基因重排克隆系研究因此由含有三種引物的單個(gè)試管組成(圖6B)。預(yù)期該單個(gè)試管可檢測絕大多數(shù)重排。初始檢測階段的結(jié)果對于一組單克隆和多克隆樣品的初始檢測顯示它們可通過在10％聚丙烯酰胺凝膠電泳上對PCR產(chǎn)物進(jìn)行HD分析來很好地區(qū)分(圖6C)?？寺⌒訧GL重排見于同源雙鏈區(qū)，在異源雙鏈區(qū)有一種或有時(shí)兩種較弱的帶，而多克隆重排顯示為異源雙鏈區(qū)中的成片條帶(圖6C)。沒有觀察到非特異性帶。應(yīng)注意由于連接區(qū)大小有限，很難通過單純的聚丙烯酰胺凝膠電泳而不進(jìn)行異源雙鏈形成來區(qū)分多克隆與單克隆重排。由此，證實(shí)通過GS分析PCR產(chǎn)物較不直接(圖6C)。可明確鑒定單克隆重排，而多克隆重排模式由于有限的連接多樣性具有寡克隆的方式(oligoclonalaspect)。其解釋更為困難，尤其是對于區(qū)別多克隆病例與具有多克隆B-細(xì)胞背景中的次要(minor)克隆性B-細(xì)胞群的那些病例而言。我們因此推薦HD分析作為分析IGL基因重排的方法。當(dāng)腫瘤DNA在PB-MNC稀釋時(shí)，在數(shù)個(gè)病例上進(jìn)行的所述檢測的敏感性證明約5％(2.5％-10％)，當(dāng)在淋巴結(jié)DNA中稀釋時(shí)所述敏感性為約10％(5％-20％)。一般檢測階段的結(jié)果單-試管IGLPCR檢測法在一系列90Southern印跡確定的淋巴系統(tǒng)增生進(jìn)行評估。該檢測法由9個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。四個(gè)僅利用HD分析，一個(gè)僅利用GS分析，四個(gè)利用所述兩種技術(shù)?？寺⌒訧GL基因重排在19個(gè)病例中檢出。其中的15個(gè)病例在9個(gè)實(shí)驗(yàn)室中獲得高于70％的一致性。在4個(gè)病例中獲得低于70％的一致性，這可通過其中三個(gè)(ES-12，GB-10和FR-10)中的次要克隆性IGL基因重排解釋。在第四個(gè)病例中的不一致性病例(PT-11)沒有得到解釋，具體因?yàn)闆]有通過Southern印跡檢測到IGL基因重排。如從初始檢測推定的，GS分析的解釋比HD分析的解釋更難，尤其在次要克隆群的病例中。在這19個(gè)克隆性IGL基因病例中，17個(gè)為B-細(xì)胞增生(16個(gè)為成熟B細(xì)胞，1個(gè)為前體B細(xì)胞)。一個(gè)病例(ES12)符合霍杰金氏病(Hodgkin’sdisease)，而另一個(gè)(FR-10)符合T-NHL。兩種都僅具有次要克隆IGL基因重排，且FR-10還顯示克隆性IGK基因重排。比較Southern印跡數(shù)據(jù)顯示一些不一致性。6個(gè)通過PCR顯示為具有克隆性IGL基因重排的病例通過Southern印跡分析顯示為多克隆的。其中三個(gè)(PT-6，ES-12，F(xiàn)R-10)涉及次要克隆群，其可低于Southern印跡技術(shù)的敏感性水平。在三個(gè)其它病例(NL-19，ES-1，PT-11)中，在Southern印跡上由于IGL基因座的相當(dāng)復(fù)雜的重排模式而沒有見到克隆重排的帶。26，49反之PCR檢測法不能檢測克隆重排，所述克隆重排可通過Southern印跡分析在兩個(gè)病例(GBS-6，F(xiàn)R-5)中顯示。然而存在這樣的濾泡性淋巴瘤，其中高程度體細(xì)胞高變可阻止IGL基因引物的退火。結(jié)論結(jié)論是，僅含有三種引物(圖6B)的、用于檢測IGL基因重排的單-試管PCR檢測法允許檢測絕大多數(shù)IGL基因重排(Vλ1，Vλ2，和V3基因重排)。異源雙鏈分析是優(yōu)選的分析方法，盡管可利用GeneScanning分析，但最重要的是注意避免由于有限的連接多樣性而不合理地解釋(overinterpretation)克隆系。實(shí)施例5TCRB基因重排Vβ-Jβ，Dβ-Jβ背景TCRB基因的分子分析是評估可疑T-細(xì)胞增生中的克隆系的重要方法。TCRB基因重排不僅出現(xiàn)在幾乎所有成熟T-細(xì)胞惡性疾病中也見于約80％的CD3陰性T-細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病(T-ALL)以及95％的CD3陽性T-ALL中。28TCRB重排不限于T-系惡性疾病，這是由于約三分之一的前體B-ALL含有經(jīng)重排的TCRB基因。30它們的頻率在成熟B細(xì)胞增生中要低得多(0到7％)。21人TCRB基因座位于染色體7的長臂、帶7q34并占據(jù)685kb的區(qū)。與TCRG和TCRD基因座相反，TCRB基因座的V區(qū)基因簇要復(fù)雜得多(圖7A)。1它包含約65個(gè)Vβ基因元件，所述元件采用兩種不同命名法一種由Arden等總結(jié)50，其根據(jù)Wei等的基因命名88并將Vβ基因分成34個(gè)家族。另一命名法由Rowen等提議，51進(jìn)一步將30種Vβ基因分成亞組并后來被IMGT采納，IMGT為InternationalImMunoGeneTics數(shù)據(jù)庫http://imgt.cines.fr(發(fā)起人和協(xié)作者M(jìn)arie-PauleLefranc，Montpellier，F(xiàn)rance).[Lefranc，2003#212；Lefranc，2003#219]最大的家族Vβ5，Vβ6，Vβ8和Vβ13(Arden命名法)分別達(dá)到7，9，5和8個(gè)成員。有12個(gè)Vβ家族僅含單個(gè)成員。通常，所述家族相互之間有明顯的界限。50在本報(bào)告中我們遵循Arden命名法。5039-47個(gè)Vβ基因元件為功能性的并屬于23個(gè)家族。7-9個(gè)非功能性Vβ元件具有開放讀框但在拼接位點(diǎn)、重組信號(hào)和/或調(diào)節(jié)元件包含變異。10-16種被分類為假基因。此外，據(jù)報(bào)道6個(gè)非-功能性孤兒Vβ基因的簇位于染色體9的短臂(9p21)。89，90它們不在轉(zhuǎn)錄物中檢測到。50，51除了一個(gè)Vβ基因以外的所有Vβ基因都位于兩個(gè)Dβ-Jβ-Cβ簇的上游。圖7A顯示了兩種Cβ基因片段(Cβ1和Cβ2)的前接Dβ基因(Dβ1和Dβ2)以及包含6個(gè)(Jβ1.1-Jβ1.6)和7個(gè)(Jβ2.1-Jβ2.7)功能性Jβ片段的Jβ簇。Jβ區(qū)基因座根據(jù)它們的基因組定位而不是序列相似性而分成兩個(gè)家族。51，88，91由于大的種系編碼的庫，TCRB基因重排的組合多樣性與TCRG和TCRD重排的相比更為廣泛。TCRβ分子的初級(jí)(primary)庫通過添加平均3.6(V-D連接)和4.6(D-J連接)個(gè)核苷酸并缺失平均3.6(V)，3.8(D的5′)，3.7(D的3′)和4.1(J)個(gè)核苷酸進(jìn)一步擴(kuò)大。51完整高變區(qū)是V，D和J片段的連接的結(jié)果，所述片段特征性地包括9個(gè)或10個(gè)密碼子。大小變化是有限的，這是由于7-12個(gè)殘基占所有功能性重排的80％以上，與IGHCDR3區(qū)的廣泛(broad)長度庫相反。92在早期T-細(xì)胞發(fā)育過程中，TCRB基因的重排由兩個(gè)連續(xù)步驟組成Dβ與Jβ重排以及Vβ與D-Jβ重排，這兩個(gè)步驟間隔一到兩天。93Dβ1基因片段可連接Jβ1或Jβ2基因片段，但Dβ2基因片段通常僅與Jβ2基因片段連接，這是由于Dβ2基因片段的位置在TCRB基因的基因座中。28，51由于存在兩個(gè)連續(xù)的TCRBD-J簇，還可能在一個(gè)等位基因中檢測到兩種重排不完全TCRBDβ2-Jβ2重排以及TCRBDβ1-Jβ1區(qū)中的完全或不完全重排。1在TCRB基因重排中，可見非隨機(jī)分布基因片段的利用。健康個(gè)體中，一些Vβ家族(例如Vβ1-Vβ5)在外周血T-細(xì)胞庫中占優(yōu)勢，而另一些僅僅很少使用(例如Vβ11，Vβ16，Vβ18，Vβ23)。Vβ庫的平均值在老化(aging)過程中似乎穩(wěn)定，但老年人中的標(biāo)準(zhǔn)偏差增加。13，94人胸腺中一些Vβ基因片段也占優(yōu)勢最有優(yōu)勢的七個(gè)Vβ基因(Vβ3-1，Vβ4-1，Vβ5-1，Vβ6-7，Vβ7-2，Vβ8-2，Vβ13-2)占完整功能性TCRB庫的將近一半。95J片段通常也遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過相等(farfromeven)。Jβ2家族是比Jβ1家族更常用(對于TCRB重排為72％相對于28％)。96具體地，Jβ2.1的比例高于預(yù)期(24％)，然后是Jβ2.2(11％)和Jβ2.3和Jβ2.5(10％每種)。95TCRB基因重排模式在各種類型的T細(xì)胞惡性疾病之間有差異。TCRBDβ-Jβ2簇中的完全TCRBVβ-Jβ1重排和不完全重排的等位基因在TCRαβ+T-ALL中比CD3-T-ALL和TCRγδ+T-ALL中更為常見。28所有T-ALL的組中，TCRBDβ-Jβ1區(qū)相對頻繁地參與重排，這與前體-B-ALL中的交叉系TCRB基因重排相反，后者僅僅涉及TCRBDβ-Jβ2區(qū)。30，73抗大多數(shù)Vβ區(qū)單克隆抗體的開發(fā)有助于鑒定Vβ家族擴(kuò)大。13然而，TCR基因重排分析對于T細(xì)胞淋巴組織增生性疾病中的克隆系評估必不可少。由于限制的種系編碼的TCRG和TCRD基因座庫促進(jìn)基于DNA的PCR方法，建立各種PCR方法以檢測TCRG和TCRD基因重排。97-99然而，TCRG重排的有限的連接多樣性導(dǎo)致正常T細(xì)胞中類似重排的高背景擴(kuò)增(backgroundamplification)(實(shí)施例6)。另一方面TCRD基因在大多數(shù)成熟T細(xì)胞惡性疾病中缺失。21因此基于DNA的TCRBPCR技術(shù)是克隆系評估所需的。此外，TCRB重排對于淋巴組織增生性疾病的隨診研究很有用，因?yàn)門CRB重排的廣泛組合庫以及大的高變區(qū)使得可高度特異性地檢測臨床隱蔽的(occult)殘留腫瘤細(xì)胞。然而，廣泛的種系編碼的庫使得PCR檢測法更加困難。一些公開的PCR方法采用耗時(shí)的多試管法，所述方法利用一組家族-或亞家族-特異性引物。96，100利用高度簡并的共有序列引物限制了在理論上可由引物檢測出的可檢測的重排數(shù)，這是由于沒有具有足夠同一性的單個(gè)共同序列以允許對所有可能的重排的可信的擴(kuò)增。42，101，102一些公開的實(shí)驗(yàn)利用需要附加PCR反應(yīng)的嵌套(nested)PCR。42，102其它實(shí)驗(yàn)的焦點(diǎn)在于分析TCRBVβ-Dβ-Jβ-Cβ轉(zhuǎn)錄物以限制所需引物數(shù)。16，100，103然而，這些基于mRNA的方法的主要缺陷在于需要新鮮或冷凍物質(zhì)以及PCR擴(kuò)增以前的反轉(zhuǎn)錄步驟。我們試圖克服這些限制通過創(chuàng)造完全新的且方便的基于DNA的TCRBPCR。我們設(shè)計(jì)了多重Vβ和Jβ引物，其包括所有功能性Vβ和Jβ基因片段并適合在多元PCR反應(yīng)中組合。此外，所述實(shí)驗(yàn)可用于HD和GS分析，并也可利用相同Jβ引物組檢測不完全TCRBDβ-Jβ重排。為了避免由于交叉引發(fā)(crosspriming)造成的問題，我們決定設(shè)計(jì)位于每個(gè)基因片段的相同保守區(qū)的所有Vβ和Jβ引物。引物設(shè)計(jì)開始設(shè)計(jì)了總共23種Vβ，2種Dβ(Dβ1和Dβ2)和13種Jβ(Jβ1.1-1.6和Jβ2.1-2.7)引物，所述所有Vβ和Jβ引物位于每個(gè)Vβ和Jβ基因片段的相同保守區(qū)，使得多元反應(yīng)中交叉退火的影響可忽略。此外，罕見的多克隆TCRBV-J重排即使不產(chǎn)生完全多克隆Gaussian峰模式也不會(huì)被誤認(rèn)為是克隆重排，因?yàn)樗锌赡艿慕?jīng)重排的PCR產(chǎn)物在相同大小范圍內(nèi)。對于引物設(shè)計(jì)，只要可能就將可重排的假基因或開放讀框基因考慮在內(nèi)，其在剪接位點(diǎn)，重組信號(hào)和/或調(diào)節(jié)性元件中具有變異或保守氨基酸的改變。然而，主要的目的是覆蓋(cover)所有功能性Vβ基因。利用寡6.2軟件檢測每種Vβ引物對于每種Vβ基因的引發(fā)效率。這導(dǎo)致不嚴(yán)格Vβ家族特異性的引物，其中一些覆蓋一個(gè)以上家族的Vβ基因片段(圖7B)。由于13Jβ引物與每種Jβ基因引物的相同片段退火，二聚化使得需要將J引物分入兩個(gè)試管。開始，計(jì)劃在四組多元反應(yīng)中如下利用所述引物所有23種Vβ引物和6種Jβ1家族引物(240-285bp)的組合，所有23種Vβ引物和7種Jβ2家族引物(240-285bp)，Dβ1(280-320bp)和6種Jβ1引物，和Dβ1(280-320bp)加Dβ2(170-210bp)及7種Jβ2家族引物。初始實(shí)驗(yàn)階段的結(jié)果每種可能引物組合的初始單元(monoplex)實(shí)驗(yàn)利用已知具有單克隆TCRB重排和多克隆對照的樣品進(jìn)行。產(chǎn)生的預(yù)期大小范圍的PCR產(chǎn)物，其中多克隆樣品的產(chǎn)物強(qiáng)度和信號(hào)圖譜有差異，所述差異有賴于利用不同Vβ和Jβ基因片段的頻率。然而，當(dāng)引物在多元反應(yīng)中組合時(shí)，一些Jβ2重排具體地被遺漏(miss)，并觀察到試管B和D中的非特異性產(chǎn)物。此外Jβ1和Jβ2引物之間的交叉引發(fā)導(dǎo)致解釋問題。結(jié)果，須重新設(shè)計(jì)Jβ2引物，且不同試管中的引物組合須重排Jβ引物Jβ2.2，2.6和2.7稍經(jīng)修飾并加入試管A。引物Jβ2.1，2.3，2.4和2.5的定位向下游移動(dòng)4bp以避免引物二聚化以及剩余Jβ引物的交叉引發(fā)。利用特異性模板DNA，僅大小在預(yù)期范圍以外的、具有不同的強(qiáng)度的非特異性帶保持在試管B(帶＜150bp，221bp)和試管C(128bp，337bp)中。然而，因?yàn)樗蟹翘禺愋詳U(kuò)增產(chǎn)物的大小在TCRB特異性產(chǎn)物的范圍以外，它們不影響解釋并且認(rèn)為它們不是問題。然而，利用非特異性模板對照，一個(gè)另外的弱273bp帶非特異性(aspecific)峰在試管A中可通過GS顯示。該產(chǎn)物當(dāng)所述DNA含有足夠的克隆或多克隆TCRB重排時(shí)被完全抑制，但可出現(xiàn)在包含少量淋巴細(xì)胞的樣品中。在初始試驗(yàn)階段，產(chǎn)生相對弱的V-D-JPCR產(chǎn)物。因此我們通過增加MgCl2濃度和Taq聚合酶的量優(yōu)化了用于完全V-D-J重排的PCR條件。利用高度純化的引物以及應(yīng)用ABI緩沖液II取代ABIGold緩沖液也非常重要。對于不完全Dβ-Jβ重排的檢測，最終可將所有Jβ引物混合到一只試管中而不會(huì)喪失敏感性或信息。因此，多元反應(yīng)的總數(shù)可減少到三個(gè)試管。最終確定的引物組是(圖7B)試管A23種Vβ引物和9種Jβ引物Jβ1.1-1.6，2.2，2.6和2.7試管B23種Vβ引物和4種Jβ引物Jβ2.1，2.3，2.4和2.5試管CDβ1，Dβ2和所有13種Jβ引物。由于試管A和C含有Jβ1和Jβ2引物，用不同染料差異標(biāo)記Jβ1和Jβ2引物(TET用于Jβ1.1-1.6和FAM用于Jβ2.1-2.7引物)允許在試管A和C反應(yīng)中通過GS區(qū)分Jβ1或Jβ2利用(見圖13A)。敏感性檢測通過稀釋實(shí)驗(yàn)利用各種細(xì)胞系和患者樣品以及MNC中克隆重排的TCRB基因進(jìn)行。單PCR稀釋試驗(yàn)(singlePCRdilutionexperiment)的敏感性水平通常為至少0.1％-1％。如所預(yù)期的，敏感性在多元檢測法中降低，這可能是由于背景擴(kuò)增的增加。尤其在GS分析中，由于TCRBPCR產(chǎn)物相對小的長度變化該背景會(huì)阻礙解釋。然而，利用異源雙鏈分析或GeneScanning檢出的46個(gè)陽性對照中有40個(gè)的敏感性為至少1％-10％(表6)。一般實(shí)驗(yàn)階段的結(jié)果參與DNA的分析的11個(gè)組利用TCRB多元方案，所述DNA來自90例Southern印跡確定的惡性和反應(yīng)性淋巴組織增生性疾病。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室中通過HD分析每個(gè)樣品，6個(gè)實(shí)驗(yàn)室中利用GS分析每個(gè)樣品。其它三種實(shí)驗(yàn)室利用兩種技術(shù)進(jìn)行PCR分析(圖7C，D和E)。該實(shí)驗(yàn)階段以及使用這些TCRBPCR檢測法所得的經(jīng)驗(yàn)激發(fā)了關(guān)于該方案的一些一般問題，所述問題的一部分已經(jīng)在初始試驗(yàn)階段描述過1.TCRBPCR產(chǎn)物的有限的長度變化可阻礙在多克隆背景中通過GS檢測克隆信號(hào)。2.僅預(yù)期大小范圍內(nèi)的帶/峰代表克隆性TCRB基因重排。尤其對于試管A，非特異性對照DNA必須被包含以定義出現(xiàn)在沒有競爭的情況下的非特異性273bp峰。3.非常重要的是利用高度純化的引物和ABI緩沖液II(和不是ABIGold緩沖液)以獲得良好的PCR結(jié)果，并利用推薦的PCR產(chǎn)物制備方案進(jìn)行HD分析。所給的90個(gè)Southern印跡-確定的病例中，29例對于單克隆TCRB重排是SB陽性的。這些克隆重排中有25種(86％)也可通過TCRBPCR檢測法。23種重排通過GS和HD分析顯示，兩種另外的病例僅通過HD顯示。一個(gè)GS陰性HD陽性病例(FR-9)通過參與一般實(shí)驗(yàn)階段的9個(gè)實(shí)驗(yàn)室中的4個(gè)進(jìn)行的GS分析而被解釋為是單克隆的(圖7C)。然而，由于明顯多克隆背景，GS模式的解釋在該具體病例中較困難。其它GS陰性HD陽性病例顯示試管C中大小約400bp的不典型PCR產(chǎn)物(圖7E)。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠和HD分析中明顯可見但在GS中不明顯。對該片段進(jìn)行DNA測序后，鑒定了TCRBDβ1-Dβ2擴(kuò)增產(chǎn)物，其可解釋未標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。四個(gè)SB陽性病例(NL-15，NL-16，GBN-2和FR-6)既不能通過GS也不能通過HD分析檢測，它們都具有潛在的(underlying)B淋巴系統(tǒng)惡性疾病。可能解釋該失敗的是不典型重排(例如不完全Vβ-Dβ重排)，28，104重排的Vβ基因片段的序列變異51或?qū)τ诰唧w重排缺乏敏感性。通過SB，認(rèn)為62個(gè)樣品是多克隆的。這些病例中的61(98％)的PCR結(jié)果在利用至少一種方法的分析時(shí)一致，57(92％)個(gè)病例結(jié)果在利用兩種方法時(shí)是一致的。通過HD和GS分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)單克隆的SB陰性樣品(ES-14)顯示不完全Dβ2-重排。對于四個(gè)樣品獲得不一致的結(jié)果通過GS發(fā)現(xiàn)一種樣品(GBS-4)是克隆的，但所述結(jié)果僅由50％通過HD分析PCR產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)室獲得。僅可通過HD分析發(fā)現(xiàn)三個(gè)樣品(ES-6，GBS-9和DE-2)產(chǎn)生弱克隆信號(hào)。TCRB重排的亞克隆對于通過SB分析的檢測而言太小，其僅可通過更敏感PCR方法學(xué)顯示。在B細(xì)胞惡性疾病中，檢測到的重排也可代表殘留T細(xì)胞的克隆性或寡克隆性擴(kuò)增。105在該病例中，這些弱克隆PCR產(chǎn)物應(yīng)不被認(rèn)為是克隆性T細(xì)胞疾病的證據(jù)。這強(qiáng)調(diào)了根據(jù)其它診斷實(shí)驗(yàn)以及患者臨床情況解釋PCR結(jié)果的重要性。TCRB重排的最佳PCR評估是通過聯(lián)合利用HD和GS分析獲得的。敏感性在兩種檢測方法中可存在差異，其可分別作為克隆PCR產(chǎn)物大小和多克隆大小分布的函數(shù)一方面HD分析分散來自克隆產(chǎn)物的多克隆背景，另一方面大小在主要范圍之外的PCR產(chǎn)物允許更敏感的GS檢測。假-陽性結(jié)果的可能性在聯(lián)合利用HD和GS分析時(shí)也降低。此外，HD分析允許檢測一些其它不典型TCRBDβ1-Dβ2重排，所述不典型的重排不能通過PCR產(chǎn)物的GS分析檢測，這是由于標(biāo)記的引物不參與擴(kuò)增。然而，GS分析是通常能為具有高腫瘤負(fù)荷的樣品提供更多信息的方法，這是因?yàn)轱@示了單克隆PCR產(chǎn)物的確切大小(其可用于監(jiān)測目的)，并且區(qū)別標(biāo)記的Jβ引物提供關(guān)于了Jβ基因利用的其它信息。結(jié)論結(jié)論是，三-試管TCRB多元PCR系統(tǒng)提供了具有空前高的克隆系檢出率的、新的且方便的實(shí)驗(yàn)，所述實(shí)驗(yàn)可用于評估可疑T細(xì)胞增生中的克隆系。實(shí)施例6TCRG基因重排背景TCRG基因重排長期用于淋巴系統(tǒng)克隆系的DNAPCR檢測法并代表有限制的庫靶的“原型”。其為克隆系分析的優(yōu)選靶，這是由于它在早期T淋巴細(xì)胞發(fā)育中于TCRαβ和TCRγδ1系前體中進(jìn)行重排，很可能就在TCRD之后。106其在超過90％T-ALL，T-LGL和T-PLL，50-75％外周T-NHL和蕈樣肉芽腫中進(jìn)行重排，但不在真正的NK細(xì)胞增生中進(jìn)行重排。它也在B系A(chǔ)LL的主要部分中重排，但在B-NHL中要少得多。1，30，73和數(shù)種其它IIg/T-CR基因座不同，完整的基因組結(jié)構(gòu)已經(jīng)已知多年。其包含有限數(shù)目的Vγ和Jγ片段。利用有限數(shù)目的4Vγ和3Jγ引物可擴(kuò)增所有主要Vγ-Jγ組合。染色體7p14上的人TCRG基因座包含14個(gè)Vγ片段，僅其中的10個(gè)顯示經(jīng)歷重排(圖8A)。表達(dá)的Vγ庫包括僅6個(gè)Vγ基因(Vγ2，Vγ3，Vγ4，Vγ5，Vγ8和Vγ9)，但重排也見于ψVγ7，ψVγ10，γψVγ11片段。107，108ψVγB(也已知為Vγ12)的重排107是非常少見的，其很少用于診斷性PCR策略中。重排的Vγ片段可在分成屬于VγI家族的那些(VγfIVγ2，Vγ3，Vγ4，Vγ5，ψVγ7和Vγ8；總體同源性＞90％，且最高同源性存在于Vγ2和Vγ4之間以及Vγ3和Vγ5之間)，單成員Vγ9，ψVγ10，ψVγ11家族的那些。TCRG基因座含有五個(gè)Jγ片段Jγ1.1(JγP1)，Jγ1.2(JγP)，Jγ1.3(Jγ1)，Jγ2.1(JγP2)，Jγ2.3(Jγ2)，其中Jγ1.3和Jγ2.3高度同源，Jγ1.1和Jγ2.1也高度同源。109雖然限制性TCRG種系庫促進(jìn)PCR擴(kuò)增，TCRG重排的有限的連接多樣性使得克隆的和多克隆的PCR產(chǎn)物之間的區(qū)分復(fù)雜化。TCRG基因座不含有D片段并顯示相對有限的核苷酸添加。TCRGV-J連接長度因此可改變20-30bp，而對IGH和TCRD而言可改變大約60bp。區(qū)別克隆的與多克隆的TCRG重排有賴于多克隆庫的復(fù)雜性。通常，利用頻繁的Vγ-Jγ重排諸如VγfI-Jγ1.3/2.3的次要克隆群可能在多克隆庫中丟失(lost)，而少見的組合將以更高的敏感性檢出。然而，有時(shí)顯示很少的Vγ-Jγ重排的多克隆T淋巴細(xì)胞可與克隆性重排混淆，這是由于對于該類型的重排缺乏多克隆背景。假陽性結(jié)果的另一可能來源由于顯示“規(guī)范的(canonical)”TCRG重排的TCRγδ表達(dá)型T淋巴細(xì)胞的存在造成，其不顯示N核苷酸添加。最常被識(shí)別的人規(guī)范TCRG重排包括Vγ9-Jγ1.2片段并出現(xiàn)于大約1％的血T-淋巴細(xì)胞。110，111因此注意利用高分辨率電泳技術(shù)分析TCRGPCR產(chǎn)物或根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)而不是僅僅根據(jù)大小來分離PCR產(chǎn)物以降低假陽性結(jié)果的可能性是非常重要的。注意規(guī)范重排的圖譜以及它們通常出現(xiàn)的情況也是重要的。規(guī)范的Vγ9-Jγ1.2重排，例如主要見于外周血并其頻率隨年齡增加，這是由于它們導(dǎo)致TCRγδ+T-淋巴細(xì)胞的累積。19與TCRD不同，TCRG在TCRαβ系細(xì)胞不被缺失。由于TCRG重排出現(xiàn)在TCRαβ和TCRγδ系前體中，它們的鑒定不能用于確定T細(xì)胞系類型。類似地，TCRG重排出現(xiàn)在60％的B系A(chǔ)LL中，30表明它們不能用于評估不成熟增生中的B對(vs.)T細(xì)胞系。然而，它們出現(xiàn)在成熟B淋巴組織增生包括大部分B-NHL1中的頻率低得多，并可由此與臨床以及免疫基因分型數(shù)據(jù)聯(lián)合使用以確定參與成熟淋巴組織增生的系。有限的種系庫允許確定Vγ和Jγ片段的利用，可通過Southern印跡或PCR分析來進(jìn)行。鑒定Vγ和Jγ利用不是為純研究目的，這是由于特異性擴(kuò)增是MRD分析所需的。112我們著手開發(fā)最少數(shù)目的多元TCRG策略，其可保持最佳敏感性和信息性(informativity)，最小化出現(xiàn)假陽性結(jié)果的可能性，并允許簡單的Vγ和Jγ鑒定，包括通過HD分析或單熒光(monofluorescent)GS策略。我們選擇包括Vγ引物，其可檢測除ψVγB(ψVγ12)以外的所有重排片段，這是由于ψVγB(ψVγ12)的罕見性所致的。為了降低錯(cuò)誤鑒定規(guī)范的重排作為克隆產(chǎn)物的可能性，我們排除了Jγ1.2引物，由于它很少與淋巴系統(tǒng)腫瘤相關(guān)并通常但不總是與其它等位基因上的TCRG重排相關(guān)。113引物設(shè)計(jì)我們最初開發(fā)了3Vγ和2Jγ引物，所述引物用于兩種多元反應(yīng)，如下一個(gè)試管具有Jγ1.3/2.3以及Vγ9特異性(160-190bp)，VγfI共有序列(200-230bp)和Vγ10/11共有序列(220-250bp)，第二個(gè)試管具有Jγ1.1/2.1以及Vγ9特異性(190-220bp)，VγfI共有序列(230-260bp)和Vγ10/11共有序列(250-280bp)。Vγ利用是為由HD分析通過PCR產(chǎn)物大小進(jìn)行鑒定。意圖使得Jγ1.3和Jγ2.3或Jγ1.1和Jγ2.1之間沒有區(qū)別。初始實(shí)驗(yàn)階段的結(jié)果雖然所有Vγ-Jγ組合都可在單次PCR擴(kuò)增上產(chǎn)生預(yù)期圖譜，多元擴(kuò)增導(dǎo)致較大PCR產(chǎn)物的競爭，同時(shí)優(yōu)先擴(kuò)增較小的片段，并不能檢測一些VγfI和Vγ10/11重排。這通過Vγ10/11共有序列和VγfI引物之間有意義的引物二聚物形成而被進(jìn)一步復(fù)雜化。大小不同的片段之間的競爭以及引物二聚物形成都導(dǎo)致不滿意的敏感性及信息性，并且該策略由此被放棄。我們推定競爭可通過分離大多數(shù)常用Vγ引物(VγfI和Vγ9)并將它們分別與Vγ10和Vγ11特異性引物結(jié)合而被最小化。后一重排很少使用，并因此可最小化優(yōu)勢(predominant)庫的競爭。Vγ10/11共有序列引物因此被兩種特異性Vγ引物置換，后者產(chǎn)生較小的PCR產(chǎn)物(圖8B)。通過混合Jγ1.3/2.3和Jγ1.1/2.1，可能保持兩-試管多元，其允許基于Vγ利用的產(chǎn)物大小通過HD分析以及基于Jγ和Vγ利用的產(chǎn)物大小通過GS分的大致鑒定。認(rèn)可的、具有四種Vγ和兩種Jγ引物的多元TCRGPCR試管組包括(圖8B)試管AVγfI+Vγ10+Jγ1.1/2.1+Jγ1.3/2.3試管BVγ9+Vγ11+Jγ1.1/2.1+Jγ1.3/2.3引物的位置和序列顯示于圖8B。這些引物在單和多元PCR模式中產(chǎn)生令人滿意的擴(kuò)增并允許檢測幾乎所有已知Vγ-Jγ組合。較大PCR片段的競爭不再出現(xiàn)，盡管不能排除可出現(xiàn)Vγ9或VγfI重排的一些競爭，條件是它們存在于次要群體中。敏感性檢測可在1％-10％之間變化，其可作為多克隆庫和克隆重排相對于多克隆Gaussian峰的位置的函數(shù)。114解釋ψVγ11重排可較困難，這是由于正常庫非常有限并由于這些最初的重排通常存在于亞克隆中。由于Vγ4片段比其它VγfI成員長大約40bp，且Vγ4重排在生理性和病理性淋巴細(xì)胞中相對常見，多克隆庫傾向(skewedtowards)體積較大的片段，而且克隆性Vγ4-Jγ1.3/2.3重排可在理論上被誤認(rèn)為是VγfI-Jγ1.1/2.1重排。不同庫的接近性使得Vγ和Jγ鑒定更可信，條件是使用差異標(biāo)記的Jγ引物。例如，在單個(gè)中心中檢測TET-la為ledJγ1.1/2.1和FAM標(biāo)記的Jγ1.3/2.3的利用并顯示其可產(chǎn)生令人滿意的結(jié)果(圖13B)。然而可根據(jù)GS分析僅基于大小來估計(jì)Vγ和Jγ的利用(圖8C和D)。一般實(shí)驗(yàn)階段的結(jié)果由于有限的種系TCRG庫和有限的連接多樣性，經(jīng)過TCRG重排的反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞將作為通過GS分析的明顯的克隆群而進(jìn)行遷移，所述重排利用具有長度相同的可變CDR3序列的單個(gè)Vγ和Jγ片段。HD形成將更容易地分散這些重排，并從而將防止它們被錯(cuò)誤地解釋作為淋巴克隆系的證據(jù)。反之，與HD分析相比，GS分析提供改進(jìn)的分辨率和敏感性。如果這不可能，可優(yōu)選單獨(dú)的HD分析，這是由于其可與假陰性結(jié)果的可能性相關(guān)，而單獨(dú)的GS分析將增加假陽性結(jié)果的幾率。通過Southern印跡在90個(gè)病例種檢出的18種TCRG重排種，16種也可通過PCR檢出。通過Southern在NL-1寡克隆病例中檢出的次要Vγf1-Jγ1.3/2.3重排，僅通過PCR在部分進(jìn)行GS分析的實(shí)驗(yàn)室中檢出。HD和GS所有實(shí)驗(yàn)室都發(fā)現(xiàn)在GBS-6中檢出的主要Vγ9-Jγ1.3/2.3重排是多克隆的，因此可能代表假陰性結(jié)果。比較等位基因鑒定顯示，對于通過Southern印跡鑒定的所有等位基因，基于大小的PCRVγ和Jγ鑒定給出一致的結(jié)果。7種重排可通過Southern印跡檢出，但精確的等位基因鑒定是不可能的。其中的6種是由于Jγ1.1/2.1的利用，提示PCR允許優(yōu)先檢測該該類型的重排。通過Southern發(fā)現(xiàn)72種樣品為多克隆的。通過TCRGPCR顯示其中的16個(gè)(22％)具有總共24種重排。其中，13種(81％)是B淋巴系統(tǒng)增生。24種克隆重排中的16種是次要的，其中的15種僅可通過GS在大部分實(shí)驗(yàn)室中檢出。值得注意，在這些次要重排中，9種(39％)涉及ψVγ10片段且8種(33％)Vγ9.ψVγ11重排沒有被檢出。沒有ψVγ10重排是通過Southern印跡分析檢出的。因此PCR允許更敏感地檢測次要克隆ψVγ10重排，具體是通過GS分析。很可能這些重排代表殘留的、占優(yōu)勢的TCRαβ系，T淋巴細(xì)胞具有限制的庫，其可能于潛在的B淋巴系統(tǒng)惡性疾病相關(guān)或不相關(guān)。這些次要峰應(yīng)當(dāng)明顯不能解釋為克隆性T細(xì)胞疾病的證據(jù)。它們強(qiáng)調(diào)了在利用TCRG基因座作為淋巴克隆系診斷裝置(lymphoidclonalitydiagnosticsetting)之前理解TCRG重排性質(zhì)的重要性。因此，在它們的臨床背景中解釋TCRG基因結(jié)果也是非常重要的。結(jié)論結(jié)論是，兩個(gè)TCRG多元試管允許檢測絕大多數(shù)克隆性TCRG重排。由于不合理地解釋次要克隆峰導(dǎo)致的假陽性結(jié)果的潛在可能性可通過聯(lián)用異源雙鏈分析和GeneScanning以及通過在它們的臨床背景中解釋結(jié)果而最小化，具體是當(dāng)明顯克隆系涉及ψVγ10和ψVγ11片段時(shí)。與TCRB分析相比，TCRG對檢測克隆性T淋巴組織增生疾病相對優(yōu)點(diǎn)應(yīng)當(dāng)預(yù)期性地(prospectively)研究。它們很可能代表互補(bǔ)的策略。實(shí)施例7.TCRD基因重排Vδ-Dδ-Jδ，Dδ-Dδ，Vδ-Dδ和Dδ-Jδ背景人TCRD基因基因座位于染色體14q11.2的Vα和Jα基因片段之間。TCRD基因座的主要部分(Dδ-Jδ-Cδ)由TCRD-缺失元件，ψJα和δREC側(cè)接，使得缺失元件彼此之間的重排或Vα與Jα基因片段的重排造成中間TCRD基因基因座的缺失(圖9A)。編碼TCRD基因座的種系由8Vδ，4Jδ，和3Dδ基因片段組成，其中8個(gè)Vδ基因片段中的至少5個(gè)也可與Jα基因片段重排。115在罕見的情況下，其它Vα基因片段也可用于TCRD基因重排中。TCR基因片段的WHO-IUIS命名法116對于那些主要或唯一地用于TCRδ鏈的V基因利用不同編號(hào)系統(tǒng)，所述V基因來自可用于TCRα或TCRδ鏈的那些。因此TCRDV101S1(Vδ1)，TCRDV102S1(Vδ2)和TCRDV103S1(Vδ3)幾乎唯一地用于TCRD重排，而TCRADV6S1(Vδ4)，TCRADV21S1(Vδ5)和TCRADV17S1(Vδ6)可用于TCRδ或α鏈。TCRADV28S1(Vδ7)和TCRADV14S1(Vδ8)極其少見地用于TCRD重排。TCRγδ+T細(xì)胞的種系-編碼的庫與TCRαβ+T細(xì)胞的相比較小，且由于在外周血和胸腺細(xì)胞TCRγδ+T細(xì)胞中的優(yōu)選重組所述組合庫甚至更受限制。出生時(shí)，臍帶血(cord)TCRγδ+T細(xì)胞的庫較廣泛，沒有明顯限制或具體Vγ/Vδ組合的優(yōu)選表達(dá)。然而在兒童期，外周血TCRγδ+T細(xì)胞庫的明顯形狀(strikinglyshaped)使得Vγ9/Vδ2細(xì)胞在成人中占明顯優(yōu)勢。117研究顯示Vδ1和Vδ2庫隨年齡而逐漸受到限制，導(dǎo)致血液和小腸中出現(xiàn)寡克隆Vδ1+和Vδ2+細(xì)胞。118TCRγδ+T細(xì)胞在人淋巴系統(tǒng)組織中均勻分布，但沒有具體Vδ片段在具體解剖位點(diǎn)的優(yōu)選表達(dá)。值得注意的是，出現(xiàn)在小腸和結(jié)腸中的大多數(shù)上皮內(nèi)TCRγδT細(xì)胞表達(dá)Vδ1。類似地，Vδ1由正常脾TCRγδ+T細(xì)胞表達(dá)，但皮膚中的TCRγδ+T細(xì)胞表達(dá)Vδ2基因。盡管少量可用于重組的V，D和J基因片段限制了可能的組合多樣性，由于重組酶導(dǎo)致的N區(qū)、P區(qū)的添加以及核苷酸的隨機(jī)缺失，CDR3或連接多樣性是廣泛的。該多樣性也通過多至3個(gè)Dδ片段且因此多至四個(gè)N-區(qū)的重組在重排的TCRD基因座內(nèi)的重組而得以擴(kuò)展。在TCRD基因座編碼的該有限的種系多樣性以及廣泛的連接多樣性產(chǎn)生了有用的PCR分析的靶，且TCRD重組事件已非常廣泛地在T和B細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病(所有)中用作克隆性標(biāo)記。119，120TCRD基因座是所有TCR基因座中第一個(gè)在T細(xì)胞個(gè)體發(fā)生(ontogeny)過程中發(fā)生重排的基因座。第一個(gè)事件是Dδ2-Dδ3重排，然后通過Vδ2-(Dδ1-Dδ2)-Dδ3重排，且最后是Vδ-Dδ-Jδ重排。不成熟的重排(Vδ2-Dδ3或Dδ2-Dδ3)出現(xiàn)在70％前體B-ALL中(并由此為非系限制性)30，而在T-ALL中沒有發(fā)現(xiàn)包含不完全Dδ2-Jδ1和完全Vδ1，Vδ2，Vδ3-Jδ1的成熟重排占優(yōu)勢。23，121因此特異性引物組也可用于鑒定對應(yīng)于不同類型ALL的不同類型的完全和不完全重排。122TCRγδ+T-ALL形成相對較小的ALL亞組，代表10-15％的T-ALL，但仍僅構(gòu)成所有ALL的2％。Vδ1-Jδ1重排在TCRγδ+T-ALL中占優(yōu)勢；有趣的是，從沒有發(fā)現(xiàn)Vδ1與除Jδ1以外的Jδ片段的組合。15，20其它重組出現(xiàn)在少于25％的等位基因中。此外，Vδ1-Jδ1-Cδ鏈幾乎總是通過二硫鍵與和Jγ2.3-Cγ2重組的VγI或VγII基因家族相連。這種基因利用與這些白細(xì)胞的不成熟胸腺來源一致。大多數(shù)T細(xì)胞淋巴瘤表達(dá)TCRαβ，而少數(shù)表達(dá)TCRγδ并包含數(shù)種不同的實(shí)體。表達(dá)TCRγδ的外周T細(xì)胞淋巴瘤(PTCL)包含所有PTCL的8-13％，并且已經(jīng)公開了Vδ1-Jδ1以及其它Vδ與Jδ1的重組。123，124肝脾(heptosplenic)γδT-細(xì)胞淋巴瘤來自脾TCRγδT細(xì)胞，其通常表達(dá)Vδ1。這是一種不尋常的實(shí)體，其顯示獨(dú)特的臨床病理特征，基因利用分析顯示克隆性Vδ1-Jδ1重排與這些淋巴瘤相關(guān)。125此外，少見類型的皮膚TCRγδ+T細(xì)胞淋巴瘤表達(dá)Vδ2并因此顯示代表通常存在皮膚中的TCRγδ+T細(xì)胞的克隆性擴(kuò)增。126其它克隆性TCRγδ增生包括CD3+TCRγδ+大顆粒淋巴細(xì)胞(LGL)增生，其包含所有CD3+LGL的約5％并通常顯示Vδ1-Jδ1重排。127單克隆抗體向TCRγδ框架區(qū)以及最近向特異性Vδ基因片段的發(fā)展有助于通過流式細(xì)胞分析鑒定TCRγδ+T細(xì)胞群，15但PCR克隆系研究仍需要鑒定這些群代表克隆的或是多克隆的擴(kuò)增。128引物設(shè)計(jì)由8個(gè)Vδ，4個(gè)Jδ3和3個(gè)Dδ基因片段組成的TCRD基因片段相互之間的同源性很小或沒有同源性，并且設(shè)計(jì)了不與其它基因片段交叉退火的片段-特異性引物。利用Vδ7和Vδ8基因片段被認(rèn)為太少見而不能說明包括用于這些片段的引物是正確的，因此根據(jù)本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)的常用方案，設(shè)計(jì)了總共16bp的引物6Vδ，4Jδ以及3Dδ基因片段的5′和3′(圖9B)。所有引物被設(shè)計(jì)為在任何組合中用于以多元方式使用(multiplex)，但最初計(jì)劃是利用具有所有V和所有J引物的一個(gè)試管(A)，其可擴(kuò)增所有完全V(D)J重排，以及另一個(gè)具有Vδ2，Dδ2-5’，Dδ3-3’和Jδ1引物的第二試管(B)，以擴(kuò)增主要的部分重排(Vδ2-Dδ3，Dδ2-Dδ3和Dδ2-Jδ1)。這些試管共同可擴(kuò)增95％的已知重排。其它引物(Dδ1-5’，Dδ3-5’，Dδ1-3’和Dδ2-3’)可用于擴(kuò)增其它Dδ-Jδ，Vδ-Dδ或Dδ-Dδ重排，但總被認(rèn)為是可選的。初始實(shí)驗(yàn)階段的結(jié)果利用多克隆DNA(扁桃體和MNC)檢測所有引物對的組合。大多數(shù)產(chǎn)生預(yù)期大小的產(chǎn)物，但一些在(Dδ1-5’，Dδ1-3’和Dδ2-3’)與其它任何引物組合時(shí)不產(chǎn)生可見的產(chǎn)物。涉及這些引物區(qū)的重組很可能非常少見，并因此這些以及Dδ3-5’被排除在隨后的實(shí)驗(yàn)之外。6種主要重排(Vδ1-Jδ1，Vδ2-Jδ1，Vδ3-Jδ1，Dδ2-Dδ3，Vδ2-Dδ3和Dδ2-Jδ1)的克隆性病例最初在多元PCR中檢測并隨后在多元試管A和B(見上文)中檢測。克隆性DNA在多克隆DNA(扁桃體或MNC)中的連續(xù)稀釋顯示在所有病例中的敏感性均為至少5％。然而，在具有雙等位基因重排(biallelicrearrangement)(其可在單PCR反應(yīng)中明顯檢出)的克隆性疾病中，通常更大的第二個(gè)等位基因通常不能在多元反應(yīng)時(shí)擴(kuò)增。此外，利用不同克隆性病例組發(fā)現(xiàn)數(shù)種Vδ2-Jδ1重排不能擴(kuò)增。隨后在最初的Vδ2引物的位置鑒定了多態(tài)性位點(diǎn)；129該多態(tài)性在常見群中的頻率未知，且因此該引物重新設(shè)計(jì)成具有Vδ2基因片段的新的區(qū)，重新放置(rerest)并發(fā)現(xiàn)其可擴(kuò)增所有病例。不能擴(kuò)增第二個(gè)等位基因的問題通過將MgCl2濃度從1.5mM增加到2.0mM而得以解決。我們還檢驗(yàn)了將兩個(gè)試管結(jié)合到一個(gè)多元反應(yīng)中的可能性。檢測了12個(gè)克隆，所述克隆之間總共具有21種基因重排。含有12種引物(6Vδ，4Jδ，Dδ2-5’和Dδ3-3’)的單個(gè)多元試管與ABIGold緩沖液和2.0mMMgCl2一起使用以擴(kuò)增所有病例。當(dāng)在多克隆MNCDNA(表7)中稀釋時(shí)，所有基因重排的HD分析實(shí)際上具有0.5-10％的敏感性。將所有TCRD引物混合在一個(gè)試管中的唯一問題為在所有擴(kuò)增中出現(xiàn)約90bp的非特異性帶，當(dāng)使用兩個(gè)分離的多元試管時(shí)所述帶不存在。由于該帶的大小在TCRD產(chǎn)物的范圍以外且不干擾解釋，不認(rèn)為它是問題。一般實(shí)驗(yàn)階段的結(jié)果十個(gè)實(shí)驗(yàn)室中對90個(gè)Southern印跡-確定的樣品的檢驗(yàn)產(chǎn)生出關(guān)于TCRD方案的一些問題一些GS結(jié)果的解釋較為困難。因?yàn)門CRD基因座的產(chǎn)物的大小范圍較大，對于多克隆樣品沒有經(jīng)典Gaussian分布(見圖9C)，并且上述原因結(jié)合許多樣品中的TCRD低利用表示在一些病例中，很難確定樣品是多克隆或是克隆的。HD分析中沒有相同的問題，并且因此推薦GS僅在非常小心的情況下用于TCRD，并注意可能的問題。90bp非特異性帶在一些實(shí)驗(yàn)室中非常強(qiáng)(intense)，但在其它實(shí)驗(yàn)室中不是這樣。所述帶在利用緩沖液II而不是Gold緩沖液(通過隨后實(shí)驗(yàn)確定)時(shí)較弱并且對MgCl2濃度也敏感，并隨MgCl2濃度增加而變強(qiáng)。該產(chǎn)物現(xiàn)在正進(jìn)行測序并利用Dδ2和Jδ3引物發(fā)現(xiàn)不相關(guān)的基因。90個(gè)Southern印跡確定的樣品的一般實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示所有參與該實(shí)驗(yàn)的PCR組的總體一致性非常高(95％)。90個(gè)病例中，6個(gè)的TCRD克隆性重排為Southern印跡陽性的，五個(gè)通過PCR發(fā)現(xiàn)為克隆性的。余下的病例(DE-10，具有高腫瘤負(fù)荷的T-ALL)在所有實(shí)驗(yàn)室中均被發(fā)現(xiàn)為多克隆的。84個(gè)Southern印跡陰性病例中75個(gè)通過PCR發(fā)現(xiàn)為多克隆的，4個(gè)被發(fā)現(xiàn)為克隆性的，余下5個(gè)病例顯示GS和HD結(jié)果不一致?？寺⌒圆±?，兩個(gè)(DE-2和GBS-9)是具有推定的低腫瘤負(fù)荷的富含T的B-NHL，因此結(jié)果可反映增加的PCR敏感性高于Southern印跡的敏感性。其它兩個(gè)克隆性病例(GBS-15和ES-7)具有高腫瘤負(fù)荷。在顯示GS和HD結(jié)果有差異的五個(gè)病例中，一種(NL-1)是困難的寡克隆病例，其導(dǎo)致了數(shù)個(gè)其它基因座的問題。其余的四個(gè)通過HD被發(fā)現(xiàn)為多克隆的而通過GS被發(fā)現(xiàn)為克隆的。在三個(gè)病例(NL-13，NL-15和NL-18)中，這可反應(yīng)GS的敏感性高于HD分析的敏感性，但其余的病例(PT-1，反應(yīng)性淋巴結(jié))對“假克隆性”GS分析有貢獻(xiàn)，這是因?yàn)橐恍悠分杏邢薜腡CRD庫的利用。結(jié)論結(jié)論是，推薦的檢測TCRD基因重排的方案是利用緩沖液II和2.0mMMgCl2的單試管實(shí)驗(yàn)以保證最大特異性和檢測，所述試管含有12種用于檢測所有主要Vδ(D)Jδ，Vδ-Dδ，Dδ-DδDδ-Jδ重排的引物。優(yōu)選的分析方法是HD，但GS可小心使用，條件是考慮到一些樣品中TCRD的有限利用導(dǎo)致的假克隆系問題。然而，利用多色GeneScanning(見圖13C)有助于快速識(shí)別不同類型ALL中不同類型的完全和不完全TCRD基因重排?？紤]到這些限制，TCRD仍可作為有價(jià)值的靶用于更加不成熟的T-細(xì)胞白血病以及TCRγδ+T-細(xì)胞增生。實(shí)施例8.具有BCL1-IGH重排的t(11；14)背景t(11；14)(q13；q32)是套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)的特征，因?yàn)樵摷?xì)胞遺傳交互轉(zhuǎn)位(cytogeneticreciprocaltranslocation)見于60-70％的MCL病例并且在其它B-細(xì)胞NHL中僅為偶發(fā)的。130斷點(diǎn)區(qū)最早由Tsujimoto等(1983)克隆，并稱為BCL1-區(qū)。131然而僅在少數(shù)具有細(xì)胞遺傳(cytogenetic)t(11；14)的病例中鑒定了BCL1-區(qū)中的基因組斷點(diǎn)。利用纖維(fiber)和分裂間期(interphase)FISH以及覆蓋大約750kb11q13-BCL1區(qū)的探針，在幾乎所有MCL(34個(gè)中的33個(gè))觀察到斷點(diǎn)且所有斷點(diǎn)都限于細(xì)胞周期蛋白D1基因5′的360kb區(qū)。132，133將近一半的MCL病例(41％)中，所述斷點(diǎn)簇集在85bp區(qū)中，所述區(qū)稱為主要轉(zhuǎn)位簇集區(qū)(majortranslocationclusterregion)即BCL1-MTC。130，134，135大多數(shù)(如果不是全部)MCL病例中，位于14q32的IGH基因座處的斷裂包括使得IGH-Eμ增強(qiáng)子與染色體11q13并置的JH基因，并因此導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白D1基因的轉(zhuǎn)錄活化。136細(xì)胞周期蛋白D1與CDK4一起使得pRB磷酸化(和失活)，并允許其經(jīng)過細(xì)胞周期的G1期。因?yàn)榧?xì)胞周期蛋白D1在B-淋巴細(xì)胞和B-細(xì)胞NHL而并非MCL中是沉默的，并且該轉(zhuǎn)位的存在與細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)之間的相關(guān)性良好，該基因被認(rèn)為是MCL中的生物相關(guān)靶。136細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)和/或t(11；14)(q13；q32)的存在被用作NHL區(qū)別診斷中的另外工具。2在新鮮或冷凍物質(zhì)中133以及保存的(archival)樣品中，可鑒定幾乎所有斷點(diǎn)的t(11；14)存在的金標(biāo)準(zhǔn)檢測策略是利用斷點(diǎn)-側(cè)接型探針的分裂間期FISH。137然而，用于t(11；14)的基于PCR的檢測策略可用于例如殘留病變的監(jiān)測。許多組已經(jīng)開發(fā)了基于PCR的實(shí)驗(yàn)以檢測BCL1/JH-斷點(diǎn)，通常聯(lián)用共有序列JH-引物以及BCL1-MTC區(qū)中的引物(都位于392bp的區(qū)中)。54，55BCL1-MTC區(qū)中的斷裂可出現(xiàn)在MTC區(qū)下游2kb處，但大多數(shù)斷點(diǎn)緊湊地簇集在85bp片段中，緊接著位于報(bào)道的最3′-引物(54，134中的″引物B″)下游。因?yàn)樵揃CL1-MTC-區(qū)中的斷裂僅造成MCL病例中11q13-BCL1區(qū)中的部分?jǐn)帱c(diǎn)(41％)，用于t(11；14)的基于PCR的策略與FISH相比由于高假陰性結(jié)果率而嚴(yán)重阻礙診斷能力。據(jù)報(bào)道t(11；14)(q13；q32)見于其它B-細(xì)胞增生性疾病諸如多發(fā)性骨髓瘤(20％)，SLVL(30％)，B-PLL(33％)和B-CLL(8％)中。130，138，139一些研究中B-CLL中存在t(11；14)的一個(gè)理由可由不正確的B-CLL分類導(dǎo)致。130骨髓瘤中的斷點(diǎn)與MCL中的斷點(diǎn)有很大差異，這是由于(i)頻率低得多；(ii)大多數(shù)斷裂涉及類型轉(zhuǎn)換(swith-class)重組位點(diǎn)；和(iii)盡管所有檢測的病例位于相同360kbBCL1-區(qū)中，似乎沒有在BCL1-MTC區(qū)中的優(yōu)選簇集。另一方面，所有具有斷裂的病例中，細(xì)胞周期蛋白D1基因被活化。需要注意，具有IGH-轉(zhuǎn)換-斷裂myeov的多發(fā)性骨髓瘤亞組中，涉及11q13-BCL1區(qū)中的其它區(qū)。138引物設(shè)計(jì)基于所報(bào)道的最遠(yuǎn)端5′-斷點(diǎn)的位置和來自BCL1-MTC區(qū)的可得核苷酸序列(GenBank登錄號(hào)S77049)，我們利用引物設(shè)計(jì)程序OL1GO6.2在該斷點(diǎn)5′的472-bp區(qū)中相對于共有序列JH引物設(shè)計(jì)了單個(gè)BCL1引物(5’-GGATAAAGGCGAGGAGCATAA-3’)。初始實(shí)驗(yàn)階段的結(jié)果利用共有序列JH-引物以及單個(gè)BCL1-MTC-引物的組合，我們首先在較小系列的MCL(n＝5)上平行比較了兩種實(shí)驗(yàn)，所述MCL以前利用類似的共有序列JH18-引物(18nt)和5′-GCACTGTCTGGATGCACCGC-3′作為BCL1-MTC-引物由內(nèi)部BCL1/JH-PCR鑒定為陽性的。與通過GS和/或HD分析對Ig/TCR基因重排進(jìn)行的分析相反，BCL1-JHPCR產(chǎn)物(BCL2-JH產(chǎn)物)通過瓊脂糖凝膠電泳僅利用溴化乙錠(ethidiumbromide)染色而被鑒定。五個(gè)陽性和兩種陰性樣品的結(jié)果相同但所述PCR產(chǎn)物明顯更弱。為評估我們可否增加PCR的敏感性，我們在Stratagene-RobocyclerPCR-儀器(所有其它PCR在ABI-480或ABI-9700上進(jìn)行)中確定了不同濃度的MgCl2及引物以及不同溫度的影響。最令人感興趣的是由于MgCl2濃度改變較小導(dǎo)致的變異。2.0mM時(shí)550bp的弱非特異性產(chǎn)物逐漸明顯，而在2.5mM或更高濃度時(shí)該非特異性產(chǎn)物在包括非-模板DNA對照在內(nèi)的所有DNA中都非常明顯。在較低濃度(低于1.5mM)沒有觀察到非特異性片段，但預(yù)期的特異性產(chǎn)物非常弱。與BCL1-MTC-內(nèi)部寡-探針(5’-ACCGAATATGCAGTGCAGC-3’)的雜交沒有顯示與該550bp產(chǎn)物的雜交。利用每種引物進(jìn)行的PCR分別顯示550bp產(chǎn)物可僅利用JH-共有序列引物產(chǎn)生。一些MCL病例中，除150-350bp的PCR-產(chǎn)物以外(圖10B)，較大的特異性PCR-產(chǎn)物可由于共有序列JH-引物與下游JH5和JH6片段的退火(如對BCL2/JH所述)而明顯。140從初始實(shí)驗(yàn)階段來看，用于BCL1-MTC/JH-PCR的最佳PCR-條件是退火溫度60℃，2.0mMMgCl2且每種引物10pmol(在ABI9700中進(jìn)行35個(gè)PCR-循環(huán))。為評估PCR在較大的病例系列上的特異性，在三種實(shí)驗(yàn)室中對來自總共25例MCL以及18個(gè)陰性對照的DNA進(jìn)行BCL1-MTC/JH-PCR，所述病例以前通過內(nèi)部BCL1/JH-PCR而被鑒定為陽性的。沒有陰性病例顯示PCR-產(chǎn)物，而25個(gè)陽性病例中有22個(gè)顯示預(yù)期大小的產(chǎn)物。三個(gè)沒有在瓊脂糖-凝膠上顯示產(chǎn)物的病例中，利用GS檢測到的產(chǎn)物提示敏感性低于內(nèi)部PCR。PCR敏感性通過擴(kuò)增正常扁桃體DNA中MCL的DNA稀釋物進(jìn)行評估。在瓊脂糖凝膠上利用開發(fā)的PCR-引物觀察到10-3和10-4之間的敏感性。對相同樣品平行進(jìn)行的內(nèi)部PCR至少更敏感10倍。與內(nèi)部BCL1-MTC-寡-探針的雜交顯示兩種PCR的敏感性高10-100倍。用具有BCL1-MTC/JH4-斷點(diǎn)53的確定細(xì)胞系JVM2(得自DSMZ；http://www.dsmz.de)的DNA的稀釋用作我們的標(biāo)準(zhǔn)陽性對照。作為陰性，可使用對照正常扁桃體組織或外周血細(xì)胞，但幾乎任何非-MCLB-細(xì)胞NHL應(yīng)為適合的，這是因?yàn)樵摦惓５念l率非常低。130一般實(shí)驗(yàn)階段的結(jié)果為評估檢測BCL1-MTC區(qū)斷點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)室間變異，十個(gè)組參與了利用BCL1-MTC/JH-PCR方案進(jìn)行的DNA分析，所述DNA來自一系列90個(gè)組織學(xué)確定的惡性和反應(yīng)性淋巴組織增生。利用Southern雜交技術(shù)確定所有病例在Ig和TCR基因座的狀態(tài)(status)。在90病例中，7個(gè)的組織學(xué)特征為MCL。通過Southern雜交發(fā)現(xiàn)所有7個(gè)MCL病例都具有克隆性IGH重排。通過Southern雜交或FISH評估染色體11q13的BCL1-MTC-區(qū)中的重排不是對所有病例都進(jìn)行的。7個(gè)MCL病例中的6個(gè)病例中，在所有10個(gè)實(shí)驗(yàn)室中鑒定了PCR-產(chǎn)物。在MCL病例NL-15中，在6個(gè)實(shí)驗(yàn)室中鑒定了預(yù)期的1.8kbPCR產(chǎn)物。該具體病例攜帶具有異常大的PCR產(chǎn)物(通常為150-350bp)的異常斷點(diǎn)，并且據(jù)我們所知代表3′-最(most)-遠(yuǎn)(far)的可檢測的BCL1-MTC-斷點(diǎn)。6個(gè)實(shí)驗(yàn)室中的2個(gè)觀察到所述PCR產(chǎn)物，但最初由于其異常的大小而認(rèn)為其為非特異性的。在所有十個(gè)實(shí)驗(yàn)室中都不能通過組織學(xué)而定性成MCL的ES-4中，可檢測到PCR產(chǎn)物提示該病例攜帶位于BCL1-MTC以外的斷點(diǎn)。應(yīng)強(qiáng)調(diào)用于一般實(shí)驗(yàn)階段的該系列的MCL病例被選出，并因此預(yù)期其攜帶位于BCL1-MTC區(qū)的斷點(diǎn)的可能性高于正常。重要的是，除了一個(gè)病例(FR-1)以外，在包括16個(gè)在組織學(xué)上定性為B-CLL的病例的所有83個(gè)其它的非-MCL病例中，沒有在任何實(shí)驗(yàn)室檢測到BCL1-MTC/JH-PCR產(chǎn)物。如果FR-1在組織學(xué)上鑒定為B-CLL，在10個(gè)實(shí)驗(yàn)室中的3個(gè)中鑒定了產(chǎn)物，其表明該斷裂中的細(xì)胞數(shù)目較低。通過Southern印跡分析確定的IGH狀態(tài)顯示該樣品由90％的克隆B-細(xì)胞組成，這于組織學(xué)檢查很好地符合。對于IGH和IGK的基于PCR的B-細(xì)胞克隆性分析(敏感性為大約1％)顯示單克隆，且對IGK的Southern印跡分析顯示單個(gè)主要IGK重排。此外，對細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)的Northern印跡分析沒有顯示過表達(dá)。所有這些數(shù)據(jù)提示非常少(低于1％)的t(11；14)-陽性細(xì)胞代表(i)來自B-CLL的亞克隆，(ii)獨(dú)立的第二B-惡性疾病或(iii)正常B-細(xì)胞，如對正常個(gè)體中的t(14；18)-陽性B-細(xì)胞所述的那樣。140然而，根據(jù)該患者目前可得的數(shù)據(jù)，我們不能區(qū)分這三種可選情況(alternatives)?？傊?，10個(gè)實(shí)驗(yàn)室的分析顯示BCL1-MTC/JH-PCR策略的高特異性。為評估由PCR的相對低的敏感性造成的可能的假陰性病例的存在，在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室中，對全部90個(gè)病例的DNA進(jìn)行前述內(nèi)部PCR(具有約高10倍的敏感性)，并且兩種實(shí)驗(yàn)的PCR產(chǎn)物也都與內(nèi)部-BCL1-MTC寡-探針進(jìn)行雜交，所述探針可將敏感性再提高10-100倍。該分析顯示其它病例中沒有PCR產(chǎn)物。結(jié)論我們的結(jié)論是BCL1-MTC/JHPCR的敏感性(10-3和10-4之間)對于檢測診斷物質(zhì)中的BCL1-MTC/JH-斷點(diǎn)而言足夠高。該方法的結(jié)果非常鼓舞人心并且提示常用方法和反應(yīng)條件的確定(definition)可最小化錯(cuò)誤結(jié)果。然而，應(yīng)記住最多可檢測MCL中的t(11；14)斷點(diǎn)的約50％，并且對于診斷而言推薦其它檢測工具。實(shí)施例9.具有BCL2-IGH重排的t(14；18)背景t(14；18)是外周B細(xì)胞淋巴組織增生性疾病中最為確定的(characterized)復(fù)發(fā)性細(xì)胞遺傳異常之一。141根據(jù)所用診斷實(shí)驗(yàn)，它可在達(dá)90％的濾泡性淋巴瘤和20％的大細(xì)胞B-細(xì)胞淋巴瘤中檢出。142轉(zhuǎn)位導(dǎo)致來自18q32的BCL2基因位于IGH基因座的強(qiáng)增強(qiáng)子的控制下，導(dǎo)致其正常表達(dá)模式的去調(diào)節(jié)(deregulation)。143，144BCL2位于外側(cè)線粒體膜且其功能是拮抗凋亡，并且在去調(diào)節(jié)時(shí)，其與腫瘤的發(fā)病密切相關(guān)。145-148其在發(fā)病中的所述作用使得t(14；18)提供了殘留病變的診斷和分子監(jiān)測(molecularmonitoring)的理想靶。IGH基因座位于14q32.3，其VH區(qū)的位置靠近端粒側(cè)(telomeric)，DH，JH和恒定區(qū)的位置靠近中心粒側(cè)(centromeric)。轉(zhuǎn)錄方向是從端粒到中心粒，增強(qiáng)子位于V區(qū)的5’以及每個(gè)恒定區(qū)之間。最常見的轉(zhuǎn)位形式涉及VDJ重組過程，且6個(gè)種系JH區(qū)之一與BCL2緊密相對。大多數(shù)基于PCR的檢測策略利用共有序列JH引物，所述引物將檢測大部分轉(zhuǎn)位。149，150與IGH基因座相反，BCL2中的斷裂模式更為復(fù)雜。BCL2位于染色體18q21并且其方向是5’到3’由中心粒到端粒。大多數(shù)斷點(diǎn)在位于外顯子3的3’未翻譯區(qū)中的150bpMBR中。151作為轉(zhuǎn)位的結(jié)果，位于JH區(qū)3’的Sμ增強(qiáng)子被置于與導(dǎo)致其去調(diào)節(jié)的BCL2基因緊鄰處。隨著更多轉(zhuǎn)位得到研究，很明顯由許多必須考慮在有效PCR檢測法策略之內(nèi)的其它斷點(diǎn)區(qū)。位于MBR下游4kb的是另一個(gè)斷點(diǎn)區(qū)3’MBR亞簇，其包含3.8kb的區(qū)。152mcr位于MBR3’20kb并覆蓋500bp的區(qū)。153然而，盡管與MBR同源，mcr比最初設(shè)想的更大，并且mcr上游的10kb區(qū)即5’mcr亞簇已有描述。154，155除了這些經(jīng)典斷點(diǎn)以外，描述了許多變體轉(zhuǎn)位，其中斷裂出現(xiàn)在BCL2的5’。156然而，這些是非常少見的，并且因此在利用基于PCR的檢測策略時(shí)不考慮在內(nèi)。對于t(14；18)沒有單獨(dú)的金標(biāo)準(zhǔn)檢測策略，且細(xì)胞遺傳學(xué)和Southern印跡的組合已經(jīng)是常用的。157，158分裂間期FISH檢測策略提供了可用的選擇，其具有檢出更多轉(zhuǎn)位的潛力159。與基于DNA的纖維相反，F(xiàn)ISH已經(jīng)可提供確定變體轉(zhuǎn)位的信息，但不適合常規(guī)應(yīng)用。160對于分子診斷實(shí)驗(yàn)室，基于PCR的檢測策略提供了快速的結(jié)果，其通常可使用并可用于殘留病變的監(jiān)測。然而，通常使用的引物已經(jīng)源自具體的(adhoc)的基礎(chǔ)，并且沒有被設(shè)計(jì)成考慮近期關(guān)于斷點(diǎn)分子解剖的信息。結(jié)果，當(dāng)與金標(biāo)準(zhǔn)方法比較時(shí)，基于PCR的技術(shù)只能檢出最多60％的轉(zhuǎn)，這嚴(yán)重妨礙了PCR的診斷能力。與假陰性的高百分比結(jié)合導(dǎo)致了由其它樣品和以前擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的污染引起的假陽性結(jié)果的問題。引物設(shè)計(jì)我們開始評估了兩試管多元系統(tǒng)，一個(gè)試管設(shè)計(jì)為檢測MBR中的斷點(diǎn)，而另一個(gè)用于鑒定該區(qū)以外的斷點(diǎn)。MBR策略含有三種引物MBR1，MBR2和共有序列JH引物。另一多重反應(yīng)含有五種引物，MCR1，MCR2，5’mcr，3’MBR1和共有序列JH(圖11A)，并設(shè)計(jì)為檢測mcr，5’mcr和3’MBR區(qū)中的斷點(diǎn)。初始實(shí)驗(yàn)階段的結(jié)果這些引物的評價(jià)在三種實(shí)驗(yàn)室中對來自總共124個(gè)已知攜帶t(14；18)的濾泡性淋巴瘤病例的DNA進(jìn)行。109個(gè)病例(88％)被鑒定為具有BCL2-IGH融合，利用MBR多元檢測法(MBRmultiplex)發(fā)現(xiàn)83/124(67％)是陽性的，而利用非-MBR多元檢測法發(fā)現(xiàn)26/124(21％)是陽性的。15/14(12％)病例中，沒有可擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。對用非-MBR多元檢測法鑒定的病例的進(jìn)一步檢測顯示11個(gè)病例(9％)具有mcr中的斷點(diǎn)，五個(gè)病例(4％)具有5’mcr中的斷點(diǎn)而10/124(8％)具有3’MBR中的斷點(diǎn)。為進(jìn)一步研究該組引物對于檢測5’mcr和3’MBR亞-簇區(qū)中的斷點(diǎn)的價(jià)值，在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室中通過Southern雜交在MBR和mcr分析已知為種系的一系列32個(gè)t(14；18)陽性濾泡性淋巴瘤病例。所述病例中的五個(gè)在5’mcr(260-490bp)中具有斷點(diǎn)并且利用分離的5’mcr引物并由多元反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增。在32個(gè)病例的系列中，9個(gè)已知具有3’MBR區(qū)中的斷點(diǎn)并且所述多元方法可檢測這些病例5/9。為改善該區(qū)的實(shí)驗(yàn)中的敏感性，我們設(shè)計(jì)了另外3種引物，其占據(jù)3’MBR亞-簇區(qū)3’MBR2，3’MBR3和3’MBR4，并在另外的多元反應(yīng)中將它們與3’MBR1和共有序列JH結(jié)合；3’MBR多元(圖11)。這種新方法確定了32個(gè)病例中的8個(gè)是陽性的但遺漏了9個(gè)病例。所述引物隨后單獨(dú)使用，并且在該實(shí)驗(yàn)中32個(gè)病例中有11個(gè)是陽性的。所述斷點(diǎn)分布如下2/11病例具有位于引物3’MBR1和3’MBR2之間的斷點(diǎn)，3/11病例具有位于引物3’MBR2和3’MBR3之間的斷點(diǎn)，2/11病例具有位于引物3’MBR3和3’MBR4之間的斷點(diǎn)，其余四個(gè)病例利用引物3’MBR4擴(kuò)增并分布在該引物3’200-1000bp。利用3’MBR多元策略，這個(gè)系列的病例中有三個(gè)假陽性結(jié)果。所述病例之一是真假陰性(truefalsenegative)的，其中的斷裂出現(xiàn)在3’MBR中間，與Alu重復(fù)序列接近。轉(zhuǎn)位利用單獨(dú)的3’MBR3引物檢測，并產(chǎn)生450bp的產(chǎn)物，提示多元策略的敏感性降低。利用3’MBR4引物，余下的兩個(gè)假陰性病例產(chǎn)生的產(chǎn)物大于1000bp，使得它們位于該方法不能完全覆蓋的遠(yuǎn)(far)3’MBR。3’MBR實(shí)驗(yàn)敏感性的進(jìn)一步改進(jìn)已經(jīng)由該研究的一般實(shí)驗(yàn)階段獲得。用新的下游引物5’-GGTGACAGAGCAAAACATGAACA-3’(見圖11A)取代引物3’MBR3可明顯改善3’MBR實(shí)驗(yàn)的敏感性和特異性。基于此，3’MBR多元策略并入我們的診斷策略中。對Southern印跡確定的病例的分析因此利用圖11A中的所述三試管多元系統(tǒng)進(jìn)行。一般實(shí)驗(yàn)階段的結(jié)果實(shí)驗(yàn)室間變異是診斷性PCR策略的明顯特征。為評估它，11個(gè)組參與了大量外部質(zhì)量控制實(shí)踐。DNA提取自一系列90個(gè)組織學(xué)確定的惡性和反應(yīng)性淋巴組織增生，并利用t(14；18)多元方案(圖11B，C和D)分析。利用Southern雜交技術(shù)確定所有病例在Ig和TCR基因座的情況。t(14；18)的核型確認(rèn)(Karyotypicconfirmation)不能用于該系列。我們因此采用需要網(wǎng)絡(luò)(network)成員之間具有高于70％的一致性以接受t(14；18)的方法。在90個(gè)病例中，11個(gè)在組織學(xué)上定性為濾泡性淋巴瘤。通過Southern雜交發(fā)現(xiàn)所有11個(gè)病例具有克隆性IGH重排。評估BCL2基因中的重排也通過Southern雜交利用MBR，mcr和3’MBR的特異性探針在10/11病例中進(jìn)行。4/10個(gè)病例顯示與PCR結(jié)果一致的MBR中的重排。利用mcr探針，顯示為mcr多元陽性的單個(gè)病例GBS-7給出不確定的SB結(jié)果。從免疫分型角度來看，該病例顯示兩種完全不同的克隆群，代表最初診斷物質(zhì)的大約5％和15％。在該病例中兩種技術(shù)之間的差異很可能代表與PCR相比SB的敏感性降低。通過SB分析，在任何的其余病例中都沒有發(fā)現(xiàn)3’MBR重排的證據(jù)。利用MBR多元策略發(fā)現(xiàn)，在6個(gè)SB陰性FCL病例中，單個(gè)病例ES-7顯示t(14；18)。通過SB或PCR顯示，5/11FCL病例顯示沒有t(14；18)的證據(jù)。t(14；18)通過PCR是在另外兩個(gè)病例中檢出；DLBCL病例FR-6顯示MBR斷點(diǎn)并被所有11實(shí)驗(yàn)室鑒定，該發(fā)現(xiàn)與以前的研究一致，后者已經(jīng)在20-40％的DLBCL病例檢測出t(14；18)。161，162利用3’MBR多元策略，10/11實(shí)驗(yàn)室對于樣品ES-12報(bào)道了陽性結(jié)果，ES-12為霍杰金淋巴瘤病例，其含有非常少的B細(xì)胞。難以通過Southern印跡在不存在IGH重排的情況下解釋該結(jié)果。對樣品來源的污染或錯(cuò)誤標(biāo)記很可能是解釋。總而言之，在網(wǎng)絡(luò)中有很好的一致性，盡管出現(xiàn)了少量假陽性和假陰性結(jié)果。總共鑒定了12個(gè)假陽性結(jié)果，代表低于總分析數(shù)的0.4％(12/3036)。這由五個(gè)實(shí)驗(yàn)室報(bào)道并且涉及6個(gè)樣品。大多數(shù)假陽性(9/12)見于三個(gè)病例。五個(gè)假陰性結(jié)果，代表6％(5/88)的失敗率，由三種實(shí)驗(yàn)室報(bào)道，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室沒有檢測到ES-7，網(wǎng)絡(luò)中的三個(gè)其它組認(rèn)為利用MBR多元策略時(shí)該病例顯示弱擴(kuò)增信號(hào)。其余的三個(gè)假陰性病例由各個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別報(bào)道。利用該方法的診斷結(jié)果非常鼓舞人心，并提示常用方法和反應(yīng)條件的限定可最小化錯(cuò)誤結(jié)果。結(jié)論結(jié)論是，我們設(shè)計(jì)并評估了穩(wěn)定(robust)的三-試管多元PCR，以便最大化t(14；18)的檢出。該策略能夠在大多數(shù)具有細(xì)胞遺傳學(xué)確定的轉(zhuǎn)位的FCL病例中跨(across)斷點(diǎn)區(qū)擴(kuò)增。盡管該策略敏感性低于常用的單循環(huán)或嵌套d的PCR方法，其對于診斷方法仍為非?？山邮艿?。廣泛采用標(biāo)準(zhǔn)化試劑和方法學(xué)有助于最小化該大的多中心網(wǎng)絡(luò)(network)中不準(zhǔn)確的結(jié)果。然而，從該研究的一般實(shí)驗(yàn)階段可注意到，可能在所有病例中檢測t(14；18)。這肯定受其它能夠使BCL2基因去調(diào)節(jié)的分子機(jī)制的影響。163，164實(shí)施例10提取自石蠟包埋組織活檢樣品的DNA的用途以及對照基因引物組的研發(fā)背景新鮮/冷凍組織被認(rèn)為是提取用于基于PCR的克隆系分析的DNA的理想樣品類型。然而，新鮮/冷凍物質(zhì)不總用于診斷實(shí)驗(yàn)室，且在歐洲的許多實(shí)驗(yàn)室中，石蠟包埋的組織樣品組成用于分析的診斷活檢的主要部分。提取自石蠟包埋的物質(zhì)的DNA通常質(zhì)量較差，并且因此在PCR方法廣泛用于診斷實(shí)驗(yàn)室以前，需要利用這些樣品評估PCR方案。提取自石蠟包埋的樣品的DNA的完整性以及其由PCR的擴(kuò)增受多種因素的影響，諸如組織厚度，固定類型，固定時(shí)間，分析前儲(chǔ)存的時(shí)間，，DNA提取方法和PCR抑制物的共-提取。165-17210％中性緩沖的福爾馬林液(10％NBF)是最常用的固定劑，盡管實(shí)驗(yàn)室也利用許多其它固定劑，包括未經(jīng)緩沖的福爾馬林以及Bouins。利用10％NBF允許擴(kuò)增大小范圍較廣的DNA片段，而Bouins似乎至少可用于PCR分析。167，168，171，173提取自石蠟包埋的樣品的DNA片段的完整性也有賴于石蠟塊保存的時(shí)間，最好的結(jié)果通常來自保存時(shí)間低于2年的石蠟塊，而超過15年的石蠟塊傾向于產(chǎn)生降解程度較高的片段。174引物設(shè)計(jì)最初，設(shè)計(jì)五對對照基因PCR引物以擴(kuò)增大小確切為100，200，400，600和1,000bp的產(chǎn)物以評估用于分析的DNA的質(zhì)量。靶基因基于具有帶開放讀框的大外顯子選擇，以降低選出多樣性區(qū)的可能性，且所述引物被設(shè)計(jì)為用于多元檢測法的標(biāo)準(zhǔn)化方案中。選擇以下靶基因人血栓烷(thromboxane)合酶基因(TBXAS1，外顯子9；GenBank登錄號(hào)D34621)，人重組活化基因(RAG1，外顯子2；GenBank登錄號(hào)M29474)，人早幼粒(promyelocytic)白血病鋅指基因(PLZF，外顯子1；GenBank登錄號(hào)AF060568)，和人AF4基因(外顯子3；GenBank登錄號(hào)Z83679，和外顯子11；GenBank登錄號(hào)Z83687)。初始實(shí)驗(yàn)階段的結(jié)果引物對在分別的反應(yīng)中檢測并隨后在多元反應(yīng)中利用高分子量DNA檢測。由于產(chǎn)物大小范圍較大(100-1,000bp)，需要改變引物濃度以在多元反應(yīng)中獲得等強(qiáng)度的帶。然而，證明可重復(fù)地?cái)U(kuò)增所有帶是非常困難的，并決定1,000bp產(chǎn)物可能是非必要的，這是由于本發(fā)明所有PCR方案都產(chǎn)生小于600bp的產(chǎn)物。因此決定排除1,000bp產(chǎn)物以便挨近該實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。通過增加MgCl2濃度到2mM并以1∶1∶1∶2的比例加入引物，可能從高分子量DNA樣品可重復(fù)地?cái)U(kuò)增等強(qiáng)度的四個(gè)帶(100，200，400和600bp)。然而，對于提取自石蠟塊的DNA，認(rèn)為300bp的特大標(biāo)記可提供非常多的信息，并且600bp的引物可為非必要的。利用用于1,000bp標(biāo)記(PLZF)的基因序列，將所述引物重新設(shè)計(jì)為產(chǎn)生300bp產(chǎn)物。這些引物與100，200，300，400和600bp引物的結(jié)合在單元反應(yīng)以及多元反應(yīng)中都獲得了成功(見圖12A)。因此兩個(gè)引物組可用于評估用于擴(kuò)增的DNA的質(zhì)量以每種2.5pmol利用的100，200，300和400bp引物可用于評估來自石蠟包埋組織的DNA。添加5pmol600bp引物允許該組用于檢測任何利用本發(fā)明的引物和方案的DNA樣品的質(zhì)量。兩個(gè)引物組豆科在標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增條件下與ABI緩沖液II和2.0mMMgCl2一起使用。產(chǎn)物可在6％PAGE或2％瓊脂糖上分析(見圖12B)。一般實(shí)驗(yàn)階段的結(jié)果收集對應(yīng)于30種B細(xì)胞惡性疾病的55個(gè)石蠟包膜的活檢樣品，以8種T細(xì)胞惡性疾病和7種反應(yīng)性淋巴組織增生作為新鮮/冷凍組織樣品。石蠟塊的保存時(shí)間(theageofparaffinblock)以及固定方法和組織的包埋在NationalNetworks之間不同。將ES樣品作為預(yù)切割切片(pre-cutsection)，NL-14，15和16作為DNA樣品，余下的活檢樣品為石蠟塊的形式。從石蠟塊上切下五個(gè)切片(每個(gè)10μm)并利用QIAampDNAMini試劑盒(QIAGEN)根據(jù)生產(chǎn)商的從石蠟包埋的組織分離基因組DNA的方案來提取DNA。選擇這種DNA提取方法是由于所述試劑盒可從血液，新鮮/冷凍組織和石蠟包埋的組織快速提取較好質(zhì)量的DNA，并且由此使得可在質(zhì)量控制得以保證的條件下平行加工各種樣品類型。各種用于從用于PCR分析的石蠟包埋的組織提取DNA的方案已經(jīng)公開。171，172，175-177其中許多的目的在于減少DNA降解以及PCR抑制物的共提取(co-extraction)，但這些方法中許多需要延長的提取步驟并不適合用于常規(guī)診斷實(shí)驗(yàn)室。166，178，179DNA樣品濃度和完整性通過分光光度法并在瓊脂糖凝膠電泳上比較樣品DNA與已知的標(biāo)準(zhǔn)品而進(jìn)行評估。隨后利用對照基因PCR引物(100-400bp)分析DNA樣品(100ng)的完整性和可擴(kuò)增性，并利用PCR方案評估所有靶基因座的克隆系。24/45病例的對照基因PCR反應(yīng)中，經(jīng)擴(kuò)增的產(chǎn)物至少300bp，而余下的21個(gè)樣品中經(jīng)擴(kuò)增的產(chǎn)物是200bp或更小。DNA重量和塊的保存時(shí)間(blockage)或固定方法之間沒有顯示明顯的相關(guān)性。因此很可能多種因素的組合導(dǎo)致了這些樣品中的DNA質(zhì)量。利用18多元PCR反應(yīng)對DNA樣品進(jìn)行克隆系評估，并利用HD和GS進(jìn)行分析。將在9個(gè)靶基因座顯示克隆系和轉(zhuǎn)位的石蠟樣品的數(shù)目與相應(yīng)的新鮮/冷凍樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。在具有達(dá)200bp的對照基因PCR產(chǎn)物的樣品中，在9個(gè)靶基因座克隆系的總體檢出率為9/55(16％)。在46個(gè)遺漏的(missed)重排中，45個(gè)可通過預(yù)期的克隆PCR產(chǎn)物的分子量高于對照基因PCR中自所述樣品擴(kuò)增的最大尺寸(size)這一事實(shí)來解釋。在對照基因PCR中余下的樣品(PT-9)擴(kuò)增到100bp，但沒有檢測到預(yù)期的81bpTCRG克隆產(chǎn)物。在具有至少300bp的對照基因PCR產(chǎn)物的樣品中，在9個(gè)靶基因座的克隆系總體檢出率為42/55(76％)。在13個(gè)遺漏的重排中，5個(gè)可仍通過預(yù)期克隆的PCR產(chǎn)物的分子量高于對照基因PCR中自所述樣品擴(kuò)增的最大尺寸這一事實(shí)來解釋。余下的8個(gè)遺漏的重排不能直接通過DNA質(zhì)量得以解釋。在反應(yīng)性淋巴結(jié)中檢出一個(gè)假陽性克隆結(jié)果(GBN-9；IGL)，其可代表假克隆系。已知PCR抑制物存在于提取自石蠟樣品的DNA。DNA樣品的稀釋可降低這些抑制物的濃度到允許出現(xiàn)成功擴(kuò)增的水平。為研究稀釋DNA樣品對于擴(kuò)增效率的影響，在對照基因PCR反應(yīng)中檢測了4種不同濃度的DNA5，50，100和500ng。我們觀察到DNA樣品的稀釋對于對照基因PCR中的PCR產(chǎn)物有明顯的影響?？偟膩砜矗?dāng)從100ng稀釋到50ng時(shí)24/45病例(53％)顯示擴(kuò)增效率增加。最佳DNA濃度似乎為50ng到100ng之間，而利用500ng似乎可抑制較大產(chǎn)物的擴(kuò)增(300bp或以上)。盡管利用5ngDNA的對照基因PCR產(chǎn)生可接受的結(jié)果，其可導(dǎo)致由于總淋巴細(xì)胞DNA的低表現(xiàn)(representation)導(dǎo)致的基于PCR的克隆系實(shí)驗(yàn)中的假陽性。180，181更重要的是，5ngDNA與稀釋成50ngDNA相比沒有優(yōu)勢。為評估利用50ngDNA是否也增加克隆系的檢出，所有樣品在IGHV-J基因座利用所述DNA濃度進(jìn)行再檢測。在三個(gè)IGHV-J試管中利用100ngDNA檢出的克隆重排數(shù)目為12，而利用相應(yīng)的新鮮/冷凍樣品時(shí)檢出的克隆重排數(shù)目為23。克隆系在該基因座的總體檢出率增加到23種中檢出17種，其可檢出另外的9種FR1，6種FR2和4種FR3克隆產(chǎn)物。由此DNA的稀釋可增加克隆性產(chǎn)物的檢出，推定是由于PCR抑制物的稀釋。符合邏輯地，DNA的稀釋僅可能改進(jìn)對照基因DNA結(jié)果以及克隆系的檢出，條件是PCR抑制物存在，而不是DNA樣品是否是高度降解的。因此，推薦利用對照基因PCR檢測至少兩個(gè)DNA的稀釋度，并且將給出較好結(jié)果的稀釋度用于隨后的克隆系分析。9個(gè)克隆重排在初始分析后仍未被檢測到，這不能通過DNA質(zhì)量得到解釋(PT-9和NL-11中的TCRG；GBS-4中的TCRB；NL-15中的TCRD；GBN-4，NL-4和NL-5中的IGK；GBS-6和GBS-8中的IGHV-JH)。這些樣品利用50ngDNA進(jìn)行再次檢驗(yàn)，但僅一個(gè)樣品(GBS8；IGH)顯示改進(jìn)的檢測，提示其它未知因素可組織具體靶在少量病例中的擴(kuò)增。然而，應(yīng)注意對于這些樣品中的7個(gè)樣品(NL-11，GBS-4，NL-15，GBN-4，NL-5，GBS-6&GBS-8)，可在至少一個(gè)另外的基因座中檢測到克隆性產(chǎn)物。這證實(shí)了在多重靶基因座對克隆系的檢測增加了檢出克隆性淋巴細(xì)胞群的可能性。結(jié)論結(jié)論是，本文推薦的方案適合于提取自石蠟包埋的物質(zhì)的DNA，條件是所述DNA可在對照基因PCR中擴(kuò)增300bp或更大的產(chǎn)物。優(yōu)選在對照基因PCR中檢測兩種濃度的DNA，且更“可擴(kuò)增”(more“amplfiable)的濃度應(yīng)當(dāng)用于進(jìn)一步的檢測中，盡管條件是低于20ng的DNA濃度有助于檢出由于靶淋巴DNA的低表現(xiàn)(lowrepresentation)導(dǎo)致的假克隆系。180，181總的來看所述數(shù)據(jù)顯示利用對照基因PCR進(jìn)行的DNA質(zhì)量評估較好地指示了所述DNA對于利用所提供方案的克隆系分析的適宜性。注意到對照基因PCR不能指示存在于樣品中的淋巴細(xì)胞DNA的量，并因此良好質(zhì)量的DNA對于克隆系分析仍可產(chǎn)生陰性結(jié)果也是重要的。為保證單克隆結(jié)果可重復(fù)(并避免可能的假克隆系)，所有克隆系檢測，具體是利用石蠟提取的DNA，優(yōu)選以一式兩份進(jìn)行并且只要可能就通過HD和GS進(jìn)行分析。對比文件1.VanDongenJJMandWolvers-TetteroILM.AnalysisofimmunoglobulinandTcellreceptorgenes.PartIIPossibilitiesandlimitationsinthediagnosisandmanagementoflymphoproliferativediseasesandrelateddisorders.ClinChimActa1991；19893-174.2.JaffeES，HarrisNL，SteinH，VardimanJW，eds.WorldHealthOrganizationclassificationoftumours.Pathologyandgeneticsoftumoursofhaematopoieticandlymphoidtissues.2001，IARCPressLyon.3.TonegawaS.Somaticgenerationofantibodydiversity.Nature1983；302575-581.4.DavisMMandBjrkmanPJ.T-cellantigenreceptorgenesandT-cellrecognition.Nature1988；334395-402.5.VanDongenJJM，SzczepanskiT，AdriaansenHJ，Immunobiologyofleukemia，inLeukemia，E.S.Henderson，T.A.Lister，andM.F.Greaves，Editors.2002，WBSaundersCompanyPhiladelphia.p.85-129.6.SzczepanskiT，Pongers-WillemseMJ，LangerakAW，vanDongenJJM.UnusualimmunoglobulinandT-cellreceptorgenerearrangementpatternsinacutelymphoblasticleukemias.CurrTopMicrobiolImmunol1999；246205-215.7.KüppersR，KleinU，HansmannML，RajewskyK.CellularoriginofhumanB-celllymphomas.NEnglJMed1999；3411520-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能夠擴(kuò)增Vκ/內(nèi)含子-KdeIGK重排的核酸擴(kuò)增引物組，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物選自圖5B所示Vκ引物或INTR引物或其變體，且其中所述反向引物是圖5B所示Kde引物或其變體。5.能夠擴(kuò)增Vλ-JλIGL重排的核酸擴(kuò)增引物組，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物選自圖6B所示Vλ引物或其變體，且其中所述反向引物是圖6B所示Jλ引物或其變體。6.能夠擴(kuò)增Vβ-JβTCRB重排的核酸擴(kuò)增引物組，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物選自圖7B所示Vβ家族引物或其變體，且其中所述反向引物選自圖7B所示引物JβA或JβB或所述引物的變體。7.能夠擴(kuò)增Dβ-JβTCRB重排的核酸擴(kuò)增引物組，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物選自圖7B所示Dβ引物或其變體，且其中所述反向引物選自圖7B所示引物JβA或JβB或所述引物的變體。8.能夠擴(kuò)增Vγ-JγTCRG重排的核酸擴(kuò)增引物組，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物選自圖8B所示Vγ家族引物或其變體，且其中所述反向引物選自圖8B所示Jγ引物或其變體。9.能夠擴(kuò)增Vδ-JδTCRD重排的核酸擴(kuò)增引物組，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物選自圖9B所示Vδ引物或其變體，且其中所述反向引物選自圖9B所示Jδ引物或其變體。10.能夠擴(kuò)增Dδ-DδTCRD重排的核酸擴(kuò)增引物組，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物是圖9B所示Dδ2引物或其變體，且其中所述反向引物是圖9B所示Dδ3引物或其變體。11.能夠擴(kuò)增Dδ-JδTCRD重排的核酸擴(kuò)增引物組，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物是圖9B所示Dδ2引物或其變體，且其中所述反向引物選自圖9B所示Jδ引物或其變體。12.能夠擴(kuò)增Vδ-DδTCRD重排的核酸擴(kuò)增引物組，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物選自圖9B所示Vδ引物或其變體，且其中所述反向引物是圖9B所示Dδ3引物或其變體。13.能夠擴(kuò)增染色體轉(zhuǎn)位(11；14)(BCL1-IGH)的核酸擴(kuò)增引物組，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物是圖10A所示BCL1/MTC引物或其變體，且其中所述反向引物是圖10A所示JH共有序列引物或其變體。14.能夠擴(kuò)增染色體轉(zhuǎn)位t(14；18)(BCL2-IGH)的核酸擴(kuò)增引物組，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物選自圖11A所示的MBR引物、3′MBR引物或mcr引物或所述引物的變體，且其中所述反向引物是圖11A所示JH共有序列引物或其變體。15.能夠擴(kuò)增人TBXAS1基因的核酸擴(kuò)增引物組，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物是圖12A所示TBXAS1/X9U引物或其變體，且其中所述反向引物是圖12A所示TBXAS1/X9L引物或其變體。16.能夠擴(kuò)增人重組活化蛋白(RAG1)基因的核酸擴(kuò)增引物組，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物是圖12A所示RAG1/X2U引物或其變體，且其中所述反向引物是圖12A所示RAG1/X2L引物或其變體。17.能夠擴(kuò)增人早幼粒細(xì)胞白血病鋅指蛋白(PLZF)的核酸擴(kuò)增引物組，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物是圖12A所示PLZF/X1U引物引物或其變體，且其中所述反向引物是圖12A所示PLZF/X1L引物或其變體。18.能夠擴(kuò)增人AF4基因(外顯子3)的核酸擴(kuò)增引物組，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物是圖12A所示AF4/X3U引物或其變體，且其中所述反向引物是圖12A所示AF4/X3L引物或其變體。19.能夠擴(kuò)增人AF4基因(外顯子11)的核酸擴(kuò)增引物組，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物是圖12A所示AF4/X11U引物或其變體，且其中所述反向引物是圖12A所示AF4/X11L引物或其變體。20.一種核酸擴(kuò)增檢測方法，優(yōu)選PCR檢測法，更優(yōu)選多元PCR檢測法，所述檢測方法利用至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1-19之一的引物組。21.檢測VH-JHIGH重排的方法，包括在權(quán)利要求20的核酸擴(kuò)增檢測方法中利用一或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1的引物組。22.檢測DH-JHIGH重排的方法，包括在權(quán)利要求20的核酸擴(kuò)增檢測方法中利用一或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求2的引物組。23.檢測Vκ-JκIGK重排的方法，包括在權(quán)利要求20的核酸擴(kuò)增檢測方法中利用一或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求3的引物組。24.檢測Vκ/內(nèi)含子-KdeIGK重排的方法，包括在權(quán)利要求20的核酸擴(kuò)增檢測方法中利用一或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求4的引物組。25.檢測Vλ-JλIGL重排的方法，包括在權(quán)利要求20的核酸擴(kuò)增檢測方法中利用一或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求5的引物組。26.檢測Vβ-JβTCRB重排的方法，包括在權(quán)利要求20的核酸擴(kuò)增檢測方法中利用一或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求6的引物組。27.檢測Dβ-JβTCRB重排的方法，包括在權(quán)利要求20的核酸擴(kuò)增檢測方法中利用一或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求7的引物組。28.檢測Vγ-JγTCRG重排的方法，包括在權(quán)利要求20的核酸擴(kuò)增檢測方法中利用一或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求8的引物組。29.檢測Vδ-JδTCRD重排的方法，包括在權(quán)利要求20的核酸擴(kuò)增檢測方法中利用一或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求9的引物組。30.檢測Dδ-DδTCRD重排的方法，包括在權(quán)利要求20的核酸擴(kuò)增檢測方法中利用一或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求10的引物組。31.檢測Dδ-JδTCRD重排的方法，包括在權(quán)利要求20的核酸擴(kuò)增檢測方法中利用一或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求11的引物組。32.檢測Vδ-DδTCRD重排的方法，包括在權(quán)利要求20的核酸擴(kuò)增檢測方法中利用一或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求12的引物組。33.檢測染色體轉(zhuǎn)位(11；14)(BCL1-IGH)的方法，包括在權(quán)利要求20的核酸擴(kuò)增檢測方法中利用一或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求13的引物組。34.檢測染色體轉(zhuǎn)位t(14；18)(BCL2-IGH)的方法，包括在權(quán)利要求20的核酸擴(kuò)增檢測方法中利用一或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求14的引物組。35.檢測選自人AF4基因(外顯子3)，人AF4基因(外顯子11)，人PLZF1基因，人RAG1基因或人TBXASI基因的基因的方法，包括在權(quán)利要求20的核酸擴(kuò)增檢測方法中利用一或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求15-19之一的引物組。36.權(quán)利要求35的方法在評估DNA樣品的質(zhì)量中的用途，所述DNA樣品提取自生物樣品、優(yōu)選石蠟包埋的生物樣品。37.檢測選自下組的兩種或兩種以上重排、兩種或兩種以上轉(zhuǎn)位或至少一種重排與至少一種轉(zhuǎn)位的方法VH-JHIGH重排，DH-JHIGH重排，Vκ-JκIGK重排，Vκ/內(nèi)含子-KdeIGK重排，Vλ-JλIGL重排，Vβ-JβTCRB重排，Dβ-JβTCRB重排，Vγ-JγTCRG重排，Vδ-JδTCRD重排，Dδ-DδTCRD重排，Dδ-JδTCRD重排，Vδ-DδTCRD重排，t(11；14)(BCL1-IGH)轉(zhuǎn)位或t(14；18)(BCL2-IGH)轉(zhuǎn)位，所述檢測利用至少兩個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1或14之一的引物組。38.評估克隆重排和/或染色體異常的方法，所述方法利用至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1-14之一的引物組，以及可選至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求15-19之一的引物組。39.權(quán)利要求38的方法，其用來檢測微小殘留病變或者鑒定經(jīng)由實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行MRD檢測所用的PCR靶。40.權(quán)利要求38或39的方法，其中經(jīng)擴(kuò)增的核酸利用自動(dòng)高分辨率PCR片段分析來檢測。41.試劑盒，其用于檢測選自下組的至少一種重排VH-JHIGH重排，DH-JHIGH重排，Vκ-JκIGK重排，Vκ/內(nèi)含子-KdeIGK重排，Vλ-JλIGL重排，Vβ-JβTCRB重排，Dβ-JβTCRB重排，Vγ-JγTCRG重排，Vδ-JδTCRD重排，Dδ-DδTCRD重排，Dδ-JδTCRD重排，Vδ-DδTCRD重排，和/或其用于檢測選自下組的至少一種轉(zhuǎn)位t(11；14)(BCL1-IGH)或t(14；18)(BCL2-IGH)，所述試劑盒包括至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1-14之一的引物組。42.權(quán)利要求41的試劑盒，還包含至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求15-19之一的引物組。全文摘要本發(fā)明涉及基于PCR的克隆系研究，所述研究可用于早期診斷淋巴組織增生性疾病等。提供了一組核酸擴(kuò)增引物，包括正向引物或其變體，以及反向引物或其變體，所述引物能夠擴(kuò)增選自下組的重排V文檔編號(hào)C12Q1/68GK1965089SQ200380105998公開日2007年5月16日申請日期2003年10月13日優(yōu)先權(quán)日2002年10月11日發(fā)明者雅各布斯·J·M·范唐根,安東尼·W·蘭格拉克,埃杜阿達(dá)斯·M·D·舒林,杰瑟斯·F·桑米奎爾,拉蒙·加齊亞桑茲,安東尼奧·帕里拉,約翰·L·史密斯,弗朗西絲·L·拉文德,加雷思·J·摩根,保羅·A·S·埃文斯,邁克爾·克內(nèi)巴,邁克爾·赫梅爾,伊麗莎白·A·馬辛泰爾,克里斯琴·巴斯塔德申請人:鹿特丹伊拉茲馬斯大學(xué),弗雷德里克·B·L·戴維