專利名稱：視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞在羊膜上的培養(yǎng)和移植的制作方法
相關(guān)申請本發(fā)明要求2002年10月4日提交的美國臨時申請?zhí)?0/415,986的優(yōu)先權(quán)，所述申請的內(nèi)容包含在本文中作為參考。
背景技術(shù)：
角膜是多層神經(jīng)組織，光能在角膜轉(zhuǎn)變成神經(jīng)沖動。最靠近眼睛前部的角膜的最外層是包含神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的神經(jīng)元層。所述神經(jīng)節(jié)細(xì)胞后是整合性神經(jīng)元層，所述整合型神經(jīng)元(integrating neurons)層后方是稱為視桿(rods)和視錐(cones)的光感受器細(xì)胞層。視桿和視錐中的光感受器開始通過所述細(xì)胞中的色素吸收光，吸收的光引發(fā)受體電位。
與光感受器細(xì)胞形成緊密結(jié)構(gòu)和功能聯(lián)系的是視網(wǎng)膜色素上皮，其為位于視網(wǎng)膜后方并與視網(wǎng)膜緊鄰的單層特化立方形細(xì)胞。視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞支持光感受器細(xì)胞并執(zhí)行重要的生理功能，包含溶質(zhì)運(yùn)輸、吞噬作用、以及消化從光感受器細(xì)胞脫落的膜的廢棄外部片段、以及藥物解毒。
RPE細(xì)胞位于特化基底膜即布魯赫氏膜上，該膜為1-5微米厚，并由膠原、層粘連蛋白和其它分子組成。
RPE細(xì)胞下方是脈絡(luò)膜組織的脈絡(luò)膜血管層。脈絡(luò)膜血管層含有脈管系統(tǒng)，以提供營養(yǎng)以及除去來自視網(wǎng)膜的代謝副產(chǎn)物。脈絡(luò)膜組織下方是鞏膜。
據(jù)信RPE細(xì)胞不能正確行使其功能會改變光感受器細(xì)胞的細(xì)胞外環(huán)境，并導(dǎo)致光感受器細(xì)胞最終變性并丟失。RPE功能障礙導(dǎo)致多種危害視力的疾病的發(fā)病，所述疾病包含老年性黃斑變性(ARMD)1、嚴(yán)重視網(wǎng)膜剝離2以及遺傳疾病諸如腦回狀萎縮3和無脈絡(luò)膜4。
老年性黃斑變性ARMD在西方國家是導(dǎo)致視力障礙的主要原因，并據(jù)信其由RPE/布魯赫氏膜和脈絡(luò)膜血管層的進(jìn)行性變性造成，這導(dǎo)致隨后對光感受器細(xì)胞的損傷。在ARMD中，RPE細(xì)胞是功能不良的。在一種形式的ARMD中，RPE細(xì)胞變性后出現(xiàn)脈絡(luò)膜血管層的萎縮。另一種形式中，布魯赫氏膜被改變和降解是由于脈絡(luò)膜新生血管膜(CNV)侵入視網(wǎng)膜下隙，導(dǎo)致視網(wǎng)膜下隙出血和疤痕形成，并可能進(jìn)一步破壞RPE和光感受器。
盡管CNV侵入5上皮下和/或視網(wǎng)膜下隙可通過激光凝固治療，如果新生血管形成是視網(wǎng)膜中央凹下(subfoveal)，結(jié)果是不良6。通過手術(shù)去除CNV膜很少導(dǎo)致視力提高或停止ARMD的進(jìn)展7。這種不良的結(jié)果可能是由于在CNV去除8的過程中無意中去除了RPE、RPE再增殖失敗、黃斑下手術(shù)9后脈絡(luò)膜血管層萎縮漸進(jìn)性擴(kuò)大以及光感受器喪失造成。
RPE移植的現(xiàn)有技術(shù)方法的問題利用現(xiàn)有RPE移植的方法僅能有限地恢復(fù)視力，所述方法利用自體或同種異體RPE來源(實驗6、10和臨床11-14)。在實驗動物中，具體是在RoyalCollege of Surgeons(RCS)的視網(wǎng)膜變性大鼠模型15-19中，RPE移植用于挽救光感受器、保護(hù)脈絡(luò)膜血管層以及防止CNV。對于同種異體RPE移植，解釋所述失敗的一個明顯的原因是同種異體移植排斥13、20。然而，對于自體RPE移植，恢復(fù)視力失敗可歸因于移植的RPE在患病部位的再增殖或在體內(nèi)發(fā)揮功能的失敗。RPE生長或發(fā)揮功能的失敗可歸因于布魯赫氏膜的損傷。
布魯赫氏膜有證據(jù)表明布魯赫氏膜完整對于RPE再增殖和隨后發(fā)揮功能很重要。例如，通過手術(shù)去除RPE而不傷害布魯赫氏膜導(dǎo)致在非人靈長類和家養(yǎng)豬中單層RPE的部分再生，同時保留了下方的脈絡(luò)膜血管層和下方的光感受器21-23。反之，磨平清創(chuàng)術(shù)導(dǎo)致對布魯赫氏膜更多的損傷，導(dǎo)致RPE的不完全再增殖，脈絡(luò)膜血管層萎縮和外節(jié)視網(wǎng)膜變性24。將培養(yǎng)的人RPE實驗性移植到貓頭鷹猴的眼睛的布魯赫氏膜的結(jié)果是正常的附著(attachment)、存活力(viability)并表達(dá)接點(diǎn)(junction)和形態(tài)學(xué)極性25。將RPE自體移植到經(jīng)過磨平清創(chuàng)術(shù)的布魯赫氏膜可降低兔的脈絡(luò)膜血管層萎縮和光感受器喪失26。
對于人ARMD患者，在移植的人自體RPE中恢復(fù)RPE功能的失敗可至少部分歸因于布魯赫氏膜的內(nèi)在改變，所述改變是由ARMD27以及外科手術(shù)23、24去除CNV膜所導(dǎo)致的。
目前RPE移植的方法，即經(jīng)視網(wǎng)膜下注射RPE細(xì)胞懸液的成功有限。該方法有很多問題，包含導(dǎo)致視網(wǎng)膜下纖維化以及形成多層RPE 6。這些問題可歸因于體內(nèi)(正常)上皮表型和功能恢復(fù)失敗。目前，在ARMD手術(shù)治療中恢復(fù)布魯赫氏膜還沒有進(jìn)展。
RPE移植的免疫學(xué)方面盡管作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)一部分的眼睛具有免疫學(xué)優(yōu)先的位點(diǎn)(immunologically privileged site)的性質(zhì)，已證明RPE移植物使得其受體對同種異體抗原和RPE-特異性自體抗原都過敏。它們都被認(rèn)為是成功移植的潛在障礙，并使得免疫抑制方案變得必不可少28。還證實所述免疫反應(yīng)很可能與被移植的細(xì)胞的量有關(guān)，并且所述反應(yīng)隨時間增加。RCS大鼠中的RPE同種異體移植物在達(dá)一年的時間內(nèi)都不被排斥。
現(xiàn)有技術(shù)基質(zhì)(Substrate)和培養(yǎng)RPE方法的問題用于這一目的的基質(zhì)包含塑料31、交聯(lián)的膠原32、凝膠1、纖維蛋白原2、聚-L-乳酸(PLLA)3、PLLA/PLGA(聚-DL-乳酸-共-羥基乙酸(Poly-DL-lactic-co-glycolic acid))薄膜5-6、水凝膠7和含基底膜的前晶狀體囊(basement membrane-containing anterior lens capsule)7。用于培養(yǎng)移植用RPE細(xì)胞的每種現(xiàn)有技術(shù)基質(zhì)都有許多缺點(diǎn)，并且許多問題仍有待解決。
不透基質(zhì)RPE移植的一個嘗試是利用Dispase(GodoShusei Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)分離自完整眼或活檢物的RPE細(xì)胞，并將所述細(xì)胞接種在不透基質(zhì)諸如塑料皿31。進(jìn)行移植前，這些細(xì)胞被制備為解離的細(xì)胞懸液6、10或來自胎兒的補(bǔ)片(patch)。這些細(xì)胞不能完全保持其上皮形態(tài)。此外，黑脂褐素(melanolipofuscin)顆粒的著色在塑料培養(yǎng)皿上很快消失33。
多孔支持物(交聯(lián)的膠原、膠原、凝膠、纖維蛋白原、PLLA/PLGA、水凝膠、CNV膜、晶狀體囊)交聯(lián)的膠原用于移植時將對視網(wǎng)膜造成損害，這是由于其較厚、通透性差且不能降解32。盡管接種在膠原膜上的人RPE細(xì)胞34產(chǎn)生單細(xì)胞層，所述單細(xì)胞層顯示了可測定的跨上皮電阻和電位35，所述細(xì)胞不能達(dá)到發(fā)育性和有功能的體內(nèi)狀態(tài)。
凝膠被用作包埋基質(zhì)，但不作為附著基質(zhì)。纖維蛋白原和PLLA微球在移植到視網(wǎng)膜下隙時也不適合作為單個層來移植RPE 2、3。PLLA/PLGA包膜確實提供了用于移植的RPE單層薄片，但在體外培養(yǎng)生長在這些支持物上的人胚胎RPE細(xì)胞不顯示色素沉著(黑素生成(melanogenesis))5、6。水凝膠也提供了用于移植的RPE單層薄片，但通過ZO-1表達(dá)測定所得的細(xì)胞密度以及細(xì)胞緊密連接相對較低7。
人RPE細(xì)胞也在ARMD患者的手術(shù)切除的CNV膜上培養(yǎng)，但所述培養(yǎng)形成多個層36。
盡管晶狀體囊是含基底膜的天然物質(zhì)，它不是RPE培養(yǎng)和移植的理想基質(zhì)。前晶狀體囊被用于使RPE 7、8和IPE 8生長，并用于將RPE和IPE 8連同晶狀體囊一起移植到視網(wǎng)膜下隙。水凝膠和晶狀體囊在用作RPE培養(yǎng)的基質(zhì)時不允許RPE細(xì)胞在培養(yǎng)物中形成色素沉著(或黑素形成)7、8。
本發(fā)明主題的發(fā)明人試圖利用晶狀體囊作為RPE/IPE移植的自體基質(zhì)。然而，所述囊彎曲的傾向使得該技術(shù)不實用。由于多種原因利用較薄的后囊的想法也被放棄。首先，后囊難以在手術(shù)中以對患者較低的風(fēng)險獲得。其次，晶狀體囊物質(zhì)不吸收或吸收較慢可抑制移植的RPE細(xì)胞的存活，這是由于所述細(xì)胞與布魯赫氏膜和/或脈絡(luò)膜血管層的接觸不充分。
最近，Bilbao et al，37公開了使用PLGA，其包被在晶狀體囊的一側(cè)以防止卷曲以及促進(jìn)晶狀體囊在視網(wǎng)膜下的釋放。然而，組織學(xué)研究顯示，不僅PLGA在4周后完全溶解，而且其上的視網(wǎng)膜層也被破壞，所述破壞伴有大量細(xì)胞的浸潤。
由Farrokh-Siar et al于1999(38)對來自血液供體的冷凝物(Cryoprecipitate)作為可能的人胚胎視網(wǎng)膜色素上皮自體基質(zhì)進(jìn)行檢測。Duttet al，39利用數(shù)種基質(zhì)來培養(yǎng)HPE細(xì)胞系0041、來自胎盤和羊膜的提取物、可購得的基底膜基質(zhì)MATRIGEL(Collaborative Biomedical Products.Inc.，Bedford，MA)、由內(nèi)皮細(xì)胞(ECM)分泌的細(xì)胞外基質(zhì)覆蓋的皿、由膠原IV和/或?qū)诱虫湹鞍赘采w的皿、由膠原I和/或纖連蛋白覆蓋的皿。盡管高度變色，在MATRIGEL上生長的細(xì)胞看似纖維細(xì)胞。
如上所述，有待解決的問題包含，例如，保持培養(yǎng)的和移植的RPE細(xì)胞中的RPE表型的形態(tài)、在生物相容的基質(zhì)上產(chǎn)生相同的自體RPE單層、改善移植技術(shù)以更好地覆蓋所述缺陷、克服RPE移植物由于同種異體抗原和RPE-特異性自體抗原的免疫排斥以及防止RPE移植后的視網(wǎng)膜下纖維化。
羊膜是一種生物膜，其覆蓋羊膜腔的內(nèi)表面，并且包含單一的立方體狀上皮、較厚的基底膜和無血管的含透明質(zhì)酸的間充質(zhì)層。羊膜移植已經(jīng)用于治療角膜組織的急性化學(xué)傷害和熱灼傷中的眼睛表面重構(gòu)53。
總之，對于培養(yǎng)適宜移植到視網(wǎng)膜下隙的RPE細(xì)胞方法、可保持上皮表型并對下方的基質(zhì)顯示抗炎、抗疤痕形成以及抗血管生成效果的適宜的RPE移植復(fù)合物(composite)、以及將RPE細(xì)胞移植到視網(wǎng)膜下隙中的醫(yī)學(xué)需要沒有得到滿足。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面涉及適當(dāng)獲取并處理的低溫保藏的羊膜可用于培養(yǎng)RPE細(xì)胞或RPE等同細(xì)胞(RPE equivalent cell)，并用于取代布魯赫氏膜作為基底的外科移植物，以及用于將RPE細(xì)胞或RPE等同細(xì)胞移植到視網(wǎng)膜下隙，且所述移植物不激發(fā)免疫反應(yīng)。本發(fā)明一方面涉及可移植到有其需要的患者眼睛的視網(wǎng)膜下隙中的組合物(composition)，所述組合物包含羊膜和RPE細(xì)胞或RPE等同細(xì)胞。本發(fā)明一種實施方案中，所述復(fù)合物中的羊膜是人羊膜。所述羊膜可為完整的，經(jīng)過上皮剝除處理或其它處理。本發(fā)明一種實施方案中，所述膜的一側(cè)經(jīng)過處理，例如薄化或去除一側(cè)。另一實施方案中，所述羊膜通過激光消融(laser ablation)以去除間質(zhì)(stromal)側(cè)或薄化基底膜側(cè)。另一實施方案中，所述間充質(zhì)細(xì)胞被加到間質(zhì)側(cè)。本發(fā)明以單獨(dú)或組合的方式包含以下內(nèi)容。
本發(fā)明的一種實施方案包含含羊膜的復(fù)合物以及存在于羊膜上的大量視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞。
另一實施方案包含含羊膜的試劑盒、存在于所述羊膜上的大量視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞、緩沖介質(zhì)或培養(yǎng)基，并且可選地同時、分別或相繼使用所述試劑盒的至少一種組分以治療視網(wǎng)膜疾病。一種實施方案中，包含在所述試劑盒中的羊膜是人羊膜。
本發(fā)明另一實施方案是形成復(fù)合物的方法，所述方法包含將至少一種視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞應(yīng)用于羊膜上的步驟，以及在適宜生長一段時間的條件下在所述膜上培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞，其中所述時間足以產(chǎn)生大量的培養(yǎng)細(xì)胞。用于一種實施方案中的羊膜是人羊膜。一種實施方案中，包含培養(yǎng)的RPE細(xì)胞或培養(yǎng)的RPE等同細(xì)胞以及羊膜的復(fù)合物可用于移植到有其需要的宿主眼睛的視網(wǎng)膜下隙。所述宿主可以是任何哺乳動物，例如人。
另一方面，本發(fā)明的實施方案包含誘導(dǎo)切除的或培養(yǎng)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞以表達(dá)或保持視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞表型的方法，所述方法包含以下步驟將羊膜與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞接觸；在適宜生長一段時間的條件下在所述膜上培養(yǎng)所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞，所述時間足以產(chǎn)生大量培養(yǎng)的細(xì)胞；以及或者將所述培養(yǎng)的細(xì)胞與有效量的試劑接觸，其中所述試劑可將細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加到足以誘導(dǎo)或保持所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的表型的水平，或者將包含培養(yǎng)的細(xì)胞的所述膜暴露于氣-液界面一段時間，其中所述時間足以誘導(dǎo)或保持視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的表型。用于實施方案中的羊膜可以是人。
一種實施方案中，將培養(yǎng)的細(xì)胞與增加所述細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的試劑進(jìn)行的接觸步驟以及將包含培養(yǎng)的細(xì)胞的膜暴露于氣-液界面以誘導(dǎo)或保持視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的表型的步驟，是依次或基本同時進(jìn)行的。然而，在另一實施方案中，所述培養(yǎng)基可包含正?；蜉^高的Ca2+濃度，并添加了生長因子。
本發(fā)明另一方面還涉及羊膜在促進(jìn)至少一種視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞生長并分化成表達(dá)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的表型的大量細(xì)胞中的用途。一個具體實施方案中，所述羊膜是人羊膜。
本發(fā)明另一實施方案是將大量視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞遞送到有其需要的個體的視網(wǎng)膜下隙中的靶位點(diǎn)的方法，其包含以下步驟在所述個體的視網(wǎng)膜形成至少一個孔，或至少部分剝離視網(wǎng)膜以到達(dá)視網(wǎng)膜下隙；將包含羊膜和存在與該膜上的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的復(fù)合物插入所述孔；以及將所述復(fù)合物置于所述靶位點(diǎn)。
本發(fā)明還涉及治療視網(wǎng)膜疾病的方法，該方法包含將包含羊膜例如人羊膜以及大量位于該膜上的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的復(fù)合物插入有其需要的患者的視網(wǎng)膜下隙。RPE細(xì)胞可根據(jù)本發(fā)明的方法培養(yǎng)在所述膜上。根據(jù)本發(fā)明實施方案進(jìn)行治療的視網(wǎng)膜疾病的非限制性實施例是老年性黃斑變性、視網(wǎng)膜變性、腦回狀萎縮和無脈絡(luò)膜。
本發(fā)明另一方面是羊膜和至少一種視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞在制備用于治療患者的視網(wǎng)膜疾病的組合物中的用途，所述患者患有所述疾病或具有發(fā)展成所述疾病風(fēng)險，其中所述羊膜在一種實施方案中是人來源的。
本發(fā)明還涉及人羊膜在促進(jìn)至少一種視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞生長并分化為大量表達(dá)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞表型的細(xì)胞中的用途。
本發(fā)明另一方面是羊膜在將視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或虹膜色素上皮細(xì)胞移植到視網(wǎng)膜下隙以防止或降低受體對同種異體抗原以及視網(wǎng)膜色素上皮-特異性自體抗原的過敏中的用途。在具體實施方案中，用于將RPE細(xì)胞或IPE細(xì)胞移植到視網(wǎng)膜下隙以防止或降低受體對同種異體抗原以及視網(wǎng)膜色素上皮-特異性自體抗原的過敏的羊膜是人來源的。
本發(fā)明還涉及羊膜，包含人羊膜在抑制RPE細(xì)胞或虹膜色素上皮(IPE)細(xì)胞移植到視網(wǎng)膜下隙后的纖維化中的用途。本發(fā)明另一實施方案是人羊膜和至少一種RPE細(xì)胞在制備用于治療患者的視網(wǎng)膜疾病的組合物中的用途，所述患者患有所述疾病或具有發(fā)展成所述疾病風(fēng)險。
許多優(yōu)勢是通過利用羊膜作為培養(yǎng)在其上的RPE或RPE等同細(xì)胞的基質(zhì)而獲得的，其中所述羊膜根據(jù)本發(fā)明的實施方案加工并低溫保藏。例如，包含羊膜和RPE或RPE等同細(xì)胞的復(fù)合物可作為外科移植物用于基質(zhì)取代以及將RPE細(xì)胞移植到視網(wǎng)膜下隙中。所述復(fù)合物顯示抗炎、抗血管生成、抗纖維化和抗疤痕形成效應(yīng)，且不激發(fā)對同種異體抗原或RPE-特異性自體抗原的免疫反應(yīng)。此外，根據(jù)本發(fā)明的實施方案使用的羊膜促進(jìn)在培養(yǎng)中RPE細(xì)胞的生長和分化，并保持在培養(yǎng)中以及移植到視網(wǎng)膜下隙后的RPE細(xì)胞的形態(tài)外觀。將RPE細(xì)胞遞送到視網(wǎng)膜下隙中的復(fù)合物和方法可在具有基底膜的生物相容性基質(zhì)上產(chǎn)生一致的單層RPE細(xì)胞。本發(fā)明一種實施方案的復(fù)合物可用作外科移植物，其適宜作為取代物取代布魯赫氏膜以及適宜將RPE細(xì)胞移植到視網(wǎng)膜下隙中。本發(fā)明的實施方案提供改進(jìn)的移植復(fù)合物和技術(shù)以克服所述缺陷，克服RPE移植物對同種異體抗原和RPE-特異性自體抗原的免疫排斥，防止RPE移植后的視網(wǎng)膜下纖維化。


本發(fā)明前述和其它目的、特征和優(yōu)勢將通過本發(fā)明示例性實施方案的更具體描述而更明確，所述示例性實施方案如附圖所示。
圖1是RPE采集插管10的側(cè)面圖。
圖2是插管10的遠(yuǎn)端12的局部放大圖20。
圖3是圖2的3-3角度圖。
圖4是圖2插管10的尖端12的4-4角度圖。
圖5是另一實施方案的具有輔助輸注管52的RPE采集插管50的側(cè)視圖。
圖6是插管50遠(yuǎn)端58的局部放大圖60。
圖7是插管50遠(yuǎn)端58的仰視圖70，其取自圖6的角度7-7。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的示例性實施方案的描述如下。將理解本發(fā)明的具體實施方案是舉例而不限制本發(fā)明。起初，本發(fā)明在其最廣泛的總體方面進(jìn)行描述，并隨后具有更加詳細(xì)的描述。本發(fā)明的組合物和方法的特征和其它細(xì)節(jié)將進(jìn)一步在權(quán)利要求中指出。
本發(fā)明主題的發(fā)明人試圖首先利用羊膜的間質(zhì)側(cè)作為基底，在其上使得人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞生長，但所述細(xì)胞不在羊膜上生長。事實上，所述內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。本發(fā)明人還利用羊膜的間質(zhì)側(cè)作為基底，以試圖使人多形核白細(xì)胞在其上生長，但白細(xì)胞不在羊膜上生長。
本發(fā)明涉及這樣的發(fā)現(xiàn)，即在適宜的條件下，RPE細(xì)胞、RPE等同細(xì)胞和IPE細(xì)胞將在適宜獲取并加工、低溫保藏的羊膜，例如人羊膜上生長。羊膜在組織學(xué)上包含厚基底膜和無血管基質(zhì)。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)了人羊膜是理想的細(xì)胞外基質(zhì)，所述基質(zhì)可促進(jìn)RPE等同細(xì)胞和RPE細(xì)胞在培養(yǎng)中的生長和分化。
RPE細(xì)胞、RPE等同細(xì)胞和IPE細(xì)胞在適宜條件下在羊膜生長、分化、傾向于保持其形態(tài)特征，且不傾向于去分化。此外，其上具有細(xì)胞的羊膜可用作外科移植物以將RPE細(xì)胞移植到視網(wǎng)膜下隙，以及可用作基質(zhì)取代。所述移植物不激發(fā)免疫反應(yīng)，并可用于治療視網(wǎng)膜疾病。
因此，本發(fā)明涉及得到的復(fù)合物和方法，所述復(fù)合物包含羊膜和大量RPE、RPE-等同細(xì)胞或IPE細(xì)胞，所述方法是應(yīng)用所述復(fù)合物作為外科移植物以將RPE移植到哺乳動物眼的視網(wǎng)膜下隙中來治療視網(wǎng)膜疾病如老年性黃斑變性、視網(wǎng)膜變性、腦回狀萎縮和無脈絡(luò)膜的方法。
RPE或RPE-等同細(xì)胞本文術(shù)語“RPE等同細(xì)胞”是指來自視網(wǎng)膜、虹膜、睫狀體、成人干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞，其保持其正常表型或功能；或具有亞最佳功能；或在體外或體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)而分化成RPE細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的一種實施方案，RPE細(xì)胞的來源可來自人或其它哺乳動物。根據(jù)本發(fā)明另一實施方案，RPE細(xì)胞的來源可為自體(來自與受體相同的個體)或同種異體(來自不同于受體的個體)。對于后一種情況，這些細(xì)胞可獲自成人或胚胎、個體尸體或活個體，其中后者可為HLA-匹配或不匹配的。
此外，人RPE等同細(xì)胞來源可源于視網(wǎng)膜或虹膜或睫狀體。一種實施方案中，RPE細(xì)胞包含來自神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞如視桿細(xì)胞或視錐細(xì)胞的細(xì)胞。如果來自虹膜，所述細(xì)胞稱為虹膜色素上皮細(xì)胞(IPE)，且其功能可為亞最佳的。人RPE等同細(xì)胞的來源也可源于通過病毒或非病毒劑永生化但仍保持正常表型或功能的RPE細(xì)胞。
人RPE等同細(xì)胞的來源也可來自成人干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，其中可在體外誘導(dǎo)所述干細(xì)胞分化成RPE。對于前者，這種成人干細(xì)胞可獲自自體或同種異體的身體各部位，例如來自外周血或骨髓。
RPE等同細(xì)胞的來源可由其它非-人物種但經(jīng)過生物改造，使得它們與人細(xì)胞相容而得到。例如，用于本發(fā)明復(fù)合物的視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞可包含至少一種經(jīng)生物改造的細(xì)胞，所述經(jīng)生物改造細(xì)胞在體外經(jīng)誘導(dǎo)而分化成視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。
RPE細(xì)胞或RPE等同細(xì)胞的采集如果RPE或IPE的來源是自體，采集的方法可為對視網(wǎng)膜或虹膜的組織位點(diǎn)進(jìn)行手術(shù)活檢。自體RPE等同細(xì)胞源于成人干細(xì)胞，并可由目的位點(diǎn)如外周血或骨髓得到。如果RPE或IPE的來源是同種異體，無論是來自活個體或尸體，它們將分別獲自供給的組織。同種異基因RPE等同細(xì)胞的其它來源是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的組織培養(yǎng)和移植。
采集或分離RPE或IPE細(xì)胞的方法是常用的，并包含含EDTA或EGTA的非酶溶液或者利用膠原酶或DISPASE溶液的酶促消化。采集或分離通過誘導(dǎo)干細(xì)胞而得到的RPE等同細(xì)胞的方法可在體外利用生長因子和可誘導(dǎo)因子來實施。
本發(fā)明另一實施方案中，構(gòu)想并設(shè)計了用于采集RPE細(xì)胞的裝置的實施方案。所述裝置在本文稱為“BinderRPE采集插管”、“RPE采集插管”或“插管”，其可將對RPE的損傷降到最低并使得采集產(chǎn)量最高。
所述裝置具有數(shù)種下述特征。參考附圖，圖1顯示具有注射器18的采集插管10示例性實施方案，所述注射器18通過柔性或可彎曲的管17連接到常見的、逐漸變細(xì)的LUER陰連接器配件16上。具有遠(yuǎn)端12的吸出管道15通過LUER連接器16與注射器18連接。一種實施方案中，所述采集插管10的外徑在鞏膜位點(diǎn)是標(biāo)準(zhǔn)的20口徑(ga)(0.9mm)以便與目前的玻璃體切除術(shù)裝置相匹配。其近端可連接常規(guī)LUER陰連接器配件以及短的，例如約10cm到約20cm長的柔性管17，所述柔性管17與玻璃注射器18相連，例如0.5cc容量。本文術(shù)語“柔性”指被描述為“柔性”的管可彎曲到足以在手術(shù)中操作所述裝置的程度。柔性管17優(yōu)選由非粘性材料諸如Teflon制成，以防止RPE細(xì)胞粘附到內(nèi)壁并由此最大化采集。
插管遠(yuǎn)端12是彎曲的(例如，曲率半徑大約10mm)。將與視網(wǎng)膜組織接觸的插管遠(yuǎn)端12大約最后5mm，具有平的半月形狀以及中空截面，所述截面的曲率半徑與布魯赫氏膜表面的后極相匹配。所述半徑是約11毫米(mm)。如圖2所示，插管10的遠(yuǎn)端12的局部放大圖顯示尖端12的末端具有大約10度的錐度，形成下唇(lower lip)26以及突出的上唇24。因此，由于所述插管用于手術(shù)，上面的或較高的唇向前突出，并且在整個過程中通過手術(shù)顯微鏡可見(外科醫(yī)師的角度)。圖2還顯示圖3和4的定向圖。當(dāng)使用所述插管時，突出的上唇24與視網(wǎng)膜接觸，所述視網(wǎng)膜被稍抬高，且下唇26與被收集的RPE細(xì)胞接觸。
一種實施方案中，每個唇的厚度為大約75微米，中空的孔為約100微米高，使得所述間端的厚度為約250微米。插管遠(yuǎn)端外表面的寬度可以為約1.5mm，中空的孔可以為約1.35mm。一種實施方案中，所述上面的或較高的唇錐體的末端為光滑的、經(jīng)拋光的3微米圓形末端。由于較高的唇逐漸變細(xì)，且視網(wǎng)膜組織具有一定的彈性或可彎曲性，視網(wǎng)膜切除寬度僅需約1mm。
一種實施方案中，所述RPE采集插管為平半月體形，其具有向前突出的唇，所述唇可在支持所述RPE細(xì)胞的彈性布魯赫氏膜表面滑動。這將在每次通過約1.2mm(approximately 1.2mm per pass)的寬度內(nèi)最大化RPE細(xì)胞采集。由于所述插管的唇的后曲率與布魯赫氏膜的匹配，將最小化對所述膜本身的損傷。即，很少出現(xiàn)或不出現(xiàn)切斷、剝脫或蝕損。因為其截面形狀與視網(wǎng)膜切除術(shù)開口的長度和形狀類似，所以所述插管外壁和視網(wǎng)膜切除術(shù)邊緣之間將很好切合。這將最小化對視網(wǎng)膜的損傷并防止或最小化RPE細(xì)胞回流入玻璃體腔中。例如，圖3以3-3角度顯示圖2的中空內(nèi)置管30的上突唇24、下唇26，所述內(nèi)置管30形成吸出口32。
所述RPE采集插管可由不銹鋼制成，并優(yōu)選由抗粘塑料諸如Teflon-樣物質(zhì)制成。示例性實施方案利用氯-三氟乙烯(chloro-trifluoroethylene)(CTFE)塑料，其優(yōu)勢在于完全透明，使得外科醫(yī)師可見到插管內(nèi)膛的內(nèi)容物。
如圖5所示，RPE采集插管50的另一實施方案具有吸出管道56，以及與其上部相連的輔助輸注管道52。管道52具有位于插管尖端彎曲起始處的輸出口59。輸注LUER 57與1cc注射器54通過短柔性或可彎曲導(dǎo)管17相連。在使用中，當(dāng)采集插管的尖端在視網(wǎng)膜下方時，鹽水的短的脈沖樣輸注自注射器54注入，流經(jīng)輸注管道52，所述輸注管道可由不銹鋼制成并與吸出管道56焊接在一起。鹽水輸注使得視網(wǎng)膜抬高，并由此形成泡，即視網(wǎng)膜下方的空間或孔洞(tent)，使得手術(shù)醫(yī)師可容易地采集RPE細(xì)胞。如果沒有使用，輸入口59應(yīng)由LUER塞封閉以防止回流。
圖6顯示插管50的遠(yuǎn)端58的放大圖60，其顯示與圖2相同的外形并加入了輸入管道52和輸入口59。
圖7是插管50的遠(yuǎn)端58的仰視圖70，其取自圖6的7-7角度，并顯示加入的輸入管道52和外-輸入口59。
制備羊膜的方法制備適宜用于本發(fā)明實施方案的低溫保藏人羊膜的方法是本領(lǐng)域已知的，并在例如授予Tseng的美國專利6,152,142和6,326,019B1中描述，其教導(dǎo)的全部內(nèi)容均包含在本文中作為參考。保存羊膜的方法描述于WO01/08716 A1中，其教導(dǎo)的全文包含在本文作為參考。所述羊膜也可為凍干的。
適宜用于本發(fā)明實施方案的羊膜獲自哺乳動物胎盤，具體是人胎盤，其中已從所述胎盤分離出絨毛膜。用于實施方案的羊膜也可來自，例如馬、?；蜓蝰?。適宜用于本發(fā)明實施方案的羊膜通常包含上皮層、基底膜和間質(zhì)，這三層的組合的平均總厚度優(yōu)選為約200μm。羊膜片可切成給定大小，在濾紙上封固，并儲存在保藏液中。所述片可切成給定大小而不在濾紙上進(jìn)行封固，條件是表面的邊界被標(biāo)出。如果是凍干的，所述凍干的片不保存在溶液中。所述保存液包含培養(yǎng)基和高滲劑，其中所述羊膜的水化被維持。所述膜可在保存前或使用前充滿治療劑。
為用于本發(fā)明的實施方案，所述羊膜可為完整(即，沒有其它處理)或經(jīng)上皮剝除處理的(即通過EDTA和機(jī)械手段，如前所述62)。參見GrueterichM，Espana E，Tseng SCG；Connexin 43 expression and proliferation of humanlimbal epithelium on intact and denuded amniotic membrane，Invest OphthalmolVis.Sci.，4363-71(2002)，其全文內(nèi)容包含在本文中作為參考。所述羊膜可為完整的或消融去除了間質(zhì)部分的間質(zhì)側(cè)表面。如果使用經(jīng)上皮剝除處理的膜，在用培養(yǎng)物中的RPE或RPE等同細(xì)胞接種前(見下文)制備經(jīng)剝離的膜。然而，如果羊膜間質(zhì)需要被薄化，所述間質(zhì)應(yīng)在所述培養(yǎng)之前或之后被消融。消融的方法可為激光驅(qū)動的，例如通過準(zhǔn)分子激光器(excimerlaser)。另一實施方案中，所述羊膜可被處理以便使得RPE細(xì)胞更好地粘附于該膜。例如，所述膜可經(jīng)處理而在其上產(chǎn)生出電荷。
在羊膜上培養(yǎng)RPE或RPE等同細(xì)胞的方法采集以后，RPE或RPE等同細(xì)胞培養(yǎng)在含有培養(yǎng)添加物的培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)添加物包含血清及生長因子。一種實施方案中，所述培養(yǎng)基包含低濃度Ca2-，其濃度為約0.01毫摩(mM)到約0.4mM，優(yōu)選0.1mM。另一實施方案中，所述培養(yǎng)基包含添加了生長因子的正常的或高濃度Ca2+。擴(kuò)大培養(yǎng)在所選培養(yǎng)基質(zhì)中進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明實施方案，所述擴(kuò)大培養(yǎng)在低溫保藏的羊膜上進(jìn)行。
標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法根據(jù)本發(fā)明的實施方案進(jìn)行使用。細(xì)胞接種密度可根據(jù)所用羊膜表面積而變化。RPE或RPE等同細(xì)胞達(dá)到亞匯合階段(subconfluentstage)時通常利用胰蛋白酶和/或EDTA通過常規(guī)方法自塑料基質(zhì)轉(zhuǎn)移。分離的RPE或RPE等同細(xì)胞接種在羊膜上皮側(cè)，其基底膜是暴露的或仍由完整羊膜上皮細(xì)胞覆蓋。
在羊膜上的RPE培養(yǎng)物中誘導(dǎo)上皮樣表型的方法根據(jù)所述方法的實施方案，在所述膜上培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞的步驟持續(xù)到所述細(xì)胞達(dá)到匯合(confluent)。理想地，該膜上的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞數(shù)目為每1mm2約4000細(xì)胞。然而，理想數(shù)目有賴于待用移植的復(fù)合物所覆蓋的缺陷的大小。例如，需要約16,000-約20,000高活性細(xì)胞覆蓋4mm2缺陷。
本發(fā)明從RPE纖維母細(xì)胞表型誘導(dǎo)上皮表型的實施方案的一種方法是從低鈣離子濃度(例如，從約0.01-約0.4mM，優(yōu)選約0.1mM)提高到約0.5-約2.0mM，優(yōu)選約1.8mM的高鈣離子濃度。根據(jù)實施方案，所述鈣離子濃度可通過將可溶性鈣鹽加入培養(yǎng)基來提高?？蛇x地，諸如鈣離子載體的試劑可用來提高Ca2+濃度，所述試劑可通過與鈣離子結(jié)合或增加細(xì)胞膜脂質(zhì)屏障對鈣離子的通透性而促進(jìn)鈣離子跨細(xì)胞膜脂質(zhì)屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)。另一實施方案包含通過阻斷Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞質(zhì)而提高細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的試劑。另一實施方案中，所述培養(yǎng)基可包含添加生長因子的正?；蚋邼舛菴a2+。根據(jù)另一實施方案，將包含培養(yǎng)在其上的RPE或RPE等同細(xì)胞的羊膜暴露于氣-液界面?？赏瑫r或相繼采用的方法的組合。
包含羊膜上RPE細(xì)胞或RPE等同細(xì)胞的復(fù)合物根據(jù)一種實施方案，復(fù)合物包含完整人羊膜，所述人羊膜包含基底膜和間質(zhì)。本發(fā)明另一實施方案中，所述復(fù)合物的人羊膜是經(jīng)上皮剝除的。
本發(fā)明還涉及這樣的復(fù)合物，其還包含至少一種藥學(xué)活性分子。本發(fā)明一種實施方案中，所述復(fù)合物中的藥學(xué)活性分子是以下物質(zhì)中的一或多種，所述物質(zhì)為生長因子、酶或治療性藥物。
用于治療視網(wǎng)膜疾病的試劑盒另一實施方案包含試劑盒，其包含可以為人羊膜的羊膜、位于所述羊膜上的大量視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞、緩沖介質(zhì)或培養(yǎng)基，以及可選地包含為治療視網(wǎng)膜疾病的說明，所述說明是用于同時、分別或相繼使用該試劑盒的至少一種組分。一個具體實施方案中，所述試劑盒還包含至少一種藥學(xué)活性劑。所述藥學(xué)活性劑可為生長因子、酶和治療性藥物。所述生長因子可包含視網(wǎng)膜色素上皮-來源的生長因子和/或轉(zhuǎn)化型生長因子-β。所述藥學(xué)活性劑可包含白介素-10。所述藥學(xué)活性劑可存在與復(fù)合物中或分開包裝，以便在移植前被加到所述復(fù)合物或視網(wǎng)膜下隙中的靶組織位點(diǎn)，或在移植后向患者給藥。
一種實施方案的試劑盒可包含視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞，所述細(xì)胞是經(jīng)生物工程改造的細(xì)胞。
一種實施方案的試劑盒可包含復(fù)合物，所述復(fù)合物是由羊膜和自體來源的視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞組成，所述細(xì)胞是從目的受體采集后送至實驗室，在所述實驗室中將所述細(xì)胞培養(yǎng)在羊膜上并加到所述復(fù)合物中。
將RPE細(xì)胞移植到視網(wǎng)膜下隙的方法移植RPE細(xì)胞的手術(shù)方法與眼內(nèi)手術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法相似。所述方法包含以下步驟a)睫狀環(huán)玻璃體切除術(shù)(Pars plana vitrectomy)并去除后玻璃體膜；b)第一次視網(wǎng)膜切除術(shù)在CNV膜上方的顳或鼻側(cè)進(jìn)行；c)利用林格氏溶液，對黃斑下CNV膜進(jìn)行水分離(hydro-dissected)并用視網(wǎng)膜下鑷子去除。該步驟中，眼內(nèi)壓升高，且利用全氟碳(PFCL)防止或最小化出血；d)將眼內(nèi)壓降到約15到約20毫米(mm)Hg，并產(chǎn)生輕度視網(wǎng)膜剝離，如果沒有發(fā)生，則在視網(wǎng)膜下注射林格氏溶液；e)通過注射系統(tǒng)或特制的鑷子，將制備的具有RPE單層的羊膜片遞送入中央凹陷區(qū)的視網(wǎng)膜下區(qū)，其中所述的鑷子具有非常光滑表面例如鏡面般完美的(mirror-finish)或抗粘Teflon表面；f)最后，進(jìn)行空氣或氣體添塞以保證移植片位于正確位置；關(guān)閉鞏膜切口；并要求患者在以后的數(shù)天中保持俯臥姿勢。
對于用于步驟“e”中的鑷子，應(yīng)注意是其是未修飾的，可購得的鑷子不能輕易用于將羊膜-RPE移植物轉(zhuǎn)移到視網(wǎng)膜下的位置，因為所述膜可非常好地粘著于不銹鋼使得所述移植物不能被釋放。因此，鑷爪應(yīng)用Teflon樣物質(zhì)包被。注意Teflon包被的鑷爪必須是鏡面般完美的，這是由于任何微小的粗糙都將使其附著或粘附于所述膜，由此阻止所述膜釋放到由手術(shù)創(chuàng)造的視網(wǎng)膜與布魯赫氏膜之間的空間中。在我們的實驗室中制備了用氯化三氟乙烯(chlorotrifluoroethylene)(CTFE)來取代不銹鋼的標(biāo)準(zhǔn)鑷子用于羊膜-RPE復(fù)合物的移植。CTFE具有與Teflon幾乎相同的抗粘性質(zhì)，并且是透明的，這將允許外科醫(yī)師看穿它。CTFE鑷子提供的另一優(yōu)勢在于由于CTFE比不銹鋼更為柔且軟，CTFE鑷爪將最小化對羊膜-RPE移植物的損傷。具有柔性透明CTFE鑷爪的鑷子為約20口徑(ga)。
對于CTFE鑷子，我們利用許多常規(guī)機(jī)制之一來操縱所述鑷爪。這些機(jī)制存在于柄中或柄前，所述柄與約35-50mm長并具有約0.9mm或以下外徑的管相連。所述管的功能是使得鑷子通過鞏膜切口。所述管足夠長以到達(dá)眼睛的后極。眼睛通常為約24mm長，也可能為20-35mm長，這有賴于疾病例如近視、葡萄腫等的存在。當(dāng)閉合時，所述鑷爪具有的直徑等于或小于所述管的直徑。
壓縮所述柄可將鑷爪拉回所述管，從而關(guān)閉鑷爪；或?qū)⑺龉芤葡蚯胺剑瑥亩P(guān)閉鑷爪。如果所述管移向前方，鑷爪尖端與被夾持的組織或目標(biāo)的距離恒定。一些柄中，位于該柄遠(yuǎn)端或其前方的旋轉(zhuǎn)鈕允許旋轉(zhuǎn)所述鑷爪。其它柄是圓的，并且利用一只手可輕易旋轉(zhuǎn)。由于外科醫(yī)師對柄有個人偏好，我們生產(chǎn)這兩種類型。所有柄均可購得(例如，Storz-B&L Inc，Katena Inc，DORC Inc，Grieshaber-Alcon Inc等)，但CTFE鑷爪不能購得。
可選地，在步驟“e”中，可利用注射系統(tǒng)取代鑷子來將具有RPE細(xì)胞的羊膜片遞送到視網(wǎng)膜下區(qū)。
應(yīng)注意，僅對細(xì)胞采集而言，在視網(wǎng)膜鼻側(cè)實施了視網(wǎng)膜切除。
實施例動物Dutch belted兔獲自Covance Research Products，Inc.(Denver，PA，USA)。所有使用的兔子通過肌內(nèi)注射0.3ml氟胺酮(35mg/kg)以及甲苯噻嗪(5mg/kg)，然后注入1ml的Euthasol(Delmarva Laboratories，Inc.，Midlothian，VA)而安樂死。
材料含有F12營養(yǎng)混合物1∶1(V/V)的Dulbecco′s改良的Eagle′s培養(yǎng)基、分子截留率為10,000道爾頓的經(jīng)透析的胚胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺、L-蛋氨酸、L-賴氨酸、L-亮氨酸、氯化鎂、硫酸鎂、氯化鈣、細(xì)胞培養(yǎng)級水(cellculture grade water)、重碳酸鈉、FITC-偶聯(lián)的山羊抗兔IgG和小鼠單克隆抗-細(xì)胞角蛋白(CK)18(克隆CY-90)均獲自Sigma-Aldrich Chemical Company(St.Louis，MO，USA).酚紅鈉、DMEM/F12、無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、兩性霉素B、錐蟲藍(lán)染色溶液以及胰蛋白酶/EDTA均購自Gibco BRL(GrandIsland，NY，USA)。使用24孔板。239U/mg的(Corning Life Sciences)I型膠原酶購自Worthington Biochemical Corporation(Lakewood，NJ，USA)。青霉素和鏈霉素獲自Bio Whittaker(Walkersville，MD，USA)。山羊抗-大鼠Alexa 546-偶聯(lián)的IgG(H+L)、F(ab)2、山羊抗-小鼠Alexa 488-偶聯(lián)的IgG F(ab)2購自Molecular Probes Inc.(Eugene，OR，USA)。Aqua-Poly/mount獲自PolysciencesInc。(Warrington，PA，USA)。多克隆兔抗-RPE-65抗體由T.Michael Redmond饋贈。單克隆大鼠抗-ZO-1抗體(MAB 1520)獲自Chemicon(Temecula，CA，USA).單克隆小鼠抗-Pancytokeratin K8.13抗體獲自ICN Biomedicals，Inc.(Aurora，OH，USA)。如以前公開的13，使用角膜上皮刷進(jìn)行羊膜上皮剝除(Amoils Epithelial Scrubber；Innova，Innovative Excimer Solutions，Inc.，Toronto，Ontario，Canada)。用于固定羊膜的培養(yǎng)板插入物來自Millipore(Bedford，MA，USA)。
原代RPE培養(yǎng)安樂死后，立刻將眼睛摘出，并且用剪刀在角膜緣后以ca.3-4mm通過環(huán)向切除除去前節(jié)。除了使用了膠原酶之外，按照所報道的48進(jìn)行RPE分離。簡言之，神經(jīng)視網(wǎng)膜通過視網(wǎng)膜下注射無菌PBS，pH7.4，而被剝離，從而促進(jìn)玻璃體殘余物質(zhì)和神經(jīng)視網(wǎng)膜的去除。RPE表面隨后用PBS潤洗3次，并將洗眼杯(eyecup)與1mg/ml I型膠原酶在DMEM/F12中、于37℃在含有5％CO2的保溫箱中保溫1小時。RPE片通過用熱拋光的玻璃吸液管輕柔地刮布魯赫氏膜而采集。所述細(xì)胞在800rpm離心5分鐘，并鋪于在DMEM/F12中的24孔板(5-6孔每眼)，將所述DMEM/F12調(diào)節(jié)為0.1mM Ca2+并補(bǔ)充10％透析過的FBS、100IU/ml青霉素(100g/ml鏈霉素和0.5g/ml兩性霉素B)。在鋪板48小時后通過用新鮮培養(yǎng)基置換50％的所述培養(yǎng)基而使得所述培養(yǎng)物不含沉淀。所述培養(yǎng)基隨后每兩周完全置換一次。
羊膜制備人羊膜(AM)由Bio-Tissue，Inc.(Miami，F(xiàn)L)饋贈，其制備如前述方法(美國專利6,152,142和6,326,019)，并在使用前保存在-80℃的DMEM和甘油(1∶1)中。使用時，將AM在室溫解凍并用無菌Hanks平衡的鹽溶液(HBSS)潤洗以去除過量的甘油，并用4-0絲質(zhì)外科縫線縫合(Alcon Surgical，USA)和/或用橡皮環(huán)收緊，使得上皮側(cè)如前所述63面對24孔板培養(yǎng)插入物。在分離的實驗中，如前所述62，AM通過在無菌0.02％EDTA的PBS中保溫45分鐘，然后用上皮刷(Amoils Epithelial Scrubber；Innova，InnovativeExcimer Solutions，Inc.，Toronto，Ontario，Canada)輕柔拋光而進(jìn)行上皮剝除。用無菌HBSS潤洗3次后，這些AM在接種RPE細(xì)胞之前，保存在DMEM/F12中3-4天。
RPE細(xì)胞傳代RPE細(xì)胞的第一代如下獲得用0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA在無Ca2+和Mg2+的HBSS中處理處于晚期對數(shù)期的所述細(xì)胞8分鐘，并在DMEM/F12中按照5,000-20,000存活RPE細(xì)胞/cm2(通過錐蟲藍(lán)染色估計)接種在塑料的、經(jīng)上皮剝除的AM或完整AM上，所述DMEM/F12中的Ca2+濃度調(diào)至0.1mM、并補(bǔ)充了10％透析過的FBS、100IU/ml PNS和0.5(μg/ml兩性霉素B。將細(xì)胞靜置36小時以進(jìn)行附著，并隨后每兩周更換一次培養(yǎng)基。
鈣轉(zhuǎn)換(Calcium Switch)當(dāng)上述每種培養(yǎng)的RPE細(xì)胞達(dá)到匯合，通過加入可溶鈣鹽將培養(yǎng)基中的Ca2+濃度調(diào)節(jié)到1.8mM。
評估在鋪板后36小時、匯合、以及在鈣轉(zhuǎn)換1周后和4周后用相差顯微鏡下觀察每種培養(yǎng)物。在不同的時間間隔，通過去除培養(yǎng)基并用無菌PBS潤洗所述細(xì)胞3次來終止培養(yǎng)。隨后，將所述培養(yǎng)物置于預(yù)冷卻的(-20℃)甲醇中5min以固定細(xì)胞角蛋白，或在4℃置于4％多聚甲醛10分鐘(固定RPE-65、ZO-1)。隨后再在PBS中潤洗3次。隨后將所述組織保存在4℃、含0.01NaN3的PBS中約2周直至進(jìn)一步的加工。原代抗體在以下濃度條件下在4℃保溫過夜1/100的Pancytokeratin(K8.13)、1/3000的細(xì)胞角蛋白18(CY-90)(都根據(jù)[25])、1/200的ZO-1和1/200的RPE-65。隨后在PBS中洗滌3次并使用各自與FITC(用于RPE-65)、Alexa 546(用于ZO-1)、Alexa488(用于Pancytokeratin和細(xì)胞角蛋白18)偶聯(lián)的第二抗體保溫2h，其中所述第二抗體的稀釋度為1/200。所有抗體均在含1％BSA和0.1％Triton x-100的PBS中稀釋。所述樣品在PBS中洗滌3次并立刻在Aqua-Poly/mount封固培養(yǎng)基中封固。所述染色隨后用Zeiss Axiophot熒光顯微鏡(Zeiss，Oberkochen，Germany)分析，所述顯微鏡與CCD Optronics相機(jī)連接。隨后用Adobe Photoshop 5.5軟件增強(qiáng)圖像。為進(jìn)行免疫染色，上述抗體的特異性已經(jīng)在dutch belted兔組織中證實。簡言之，以前用于另一隨后需要安樂死的方法中的動物在安樂死時用4％多聚甲醛進(jìn)行灌注。隨后，經(jīng)玻璃體注入含4％多聚甲醛的PBS，并將眼睛浸入相同固定劑中并在冰上保持2h。解剖前節(jié)并盡可能移去玻璃體。用眼科剪從眼后極和角膜切出樣品，在具有10、20和30％連續(xù)蔗糖梯度的PBS中保溫，包埋在OCT中并用液氮迅速冷凍。組織切片在Reichert Cryostat上切成8μm。
結(jié)果生長在不同基質(zhì)上、低Ca2+條件下的RPE的形態(tài)學(xué)外觀兔RPE細(xì)胞以約5,000-約20,000存活RPE細(xì)胞/cm2接種在塑料(plastic)(P)、在低Ca2+DMEM/F12中經(jīng)上皮剝除的人羊膜(dAM)或完整人羊膜(iAM)上。在dAM上約7-9天之內(nèi)達(dá)匯合，其比在塑料上快9-10天。這三種培養(yǎng)物上的RPE細(xì)胞通常為紡錘形，與在塑料培養(yǎng)物以及dAM上的相比較在達(dá)匯合時在兩種基底上均勻分布，而在iAM上的RPE細(xì)胞似乎更呈鱗狀且為多角形且分布不均勻。此外，黑脂褐素(melanolipofuscin)顆粒的色素沉著在部分塑料培養(yǎng)物上很快消失，這是部分由于細(xì)胞分裂的稀釋，該現(xiàn)象是已知的33。然而，dAM上的RPE細(xì)胞保持一些顆粒樣外觀，盡管其著色也變淺，而iAM上的RPE細(xì)胞仍保持較深的著色。
Ca2+轉(zhuǎn)換一周后RPE的形態(tài)外觀當(dāng)RPE細(xì)胞在dAM上達(dá)匯合時，所述培養(yǎng)基更換成高Ca2+DMEM/F12。Ca2+轉(zhuǎn)換一周后，塑料培養(yǎng)物上的RPE細(xì)胞保持紡錘形，但沒有形成明顯的顆粒，只是一些著色可能重現(xiàn)。反之，生長在dAM上的RPE細(xì)胞呈現(xiàn)上皮樣外觀以及多角形(6角形)，并顯示大量在細(xì)胞質(zhì)中具有色素沉著的顆粒。iAM上的RPE細(xì)胞也呈現(xiàn)多角形并著色很深。作為對比，dAM以及低鈣上的RPE細(xì)胞仍保持紡錘形并顯示更多著色。
通過免疫染色對產(chǎn)生的上皮表型進(jìn)行定性CK18染色通過抗體對CK18(細(xì)胞角蛋白18)進(jìn)行染色，所述CK18是鑒定RPE細(xì)胞上皮來源的標(biāo)記。結(jié)果表明在低Ca2+濃度條件下保溫在塑料培養(yǎng)物上的真正RPE具有上皮來源，這是由于所有細(xì)胞都是陽性的。生長在完整和經(jīng)剝除的膜上的RPE顯示強(qiáng)陽性染色，并顯示明顯的細(xì)胞骨架模式，當(dāng)Ca2+升高時比生長在塑料培養(yǎng)物上的對應(yīng)物中的更為明顯。
RP65染色對RP65進(jìn)行染色，所述RP65是RP分化的新標(biāo)志。獲得在體內(nèi)兔視網(wǎng)膜中的RPE陽性染色的正常模式，染色照片顯示在光感受器(上方)和絨毛毛細(xì)管(下方)之間有單層RPE，且所述RPE細(xì)胞具有色素沉著。
RP65染色RP65染色顯示生長在塑料培養(yǎng)物上的RPE即使在Ca2+轉(zhuǎn)換1.5周后仍為陰性。反之，生長在完整AM和經(jīng)剝除的AM上的RPE細(xì)胞對RP65呈強(qiáng)陽性。當(dāng)保溫延長到3.5周時該結(jié)果持續(xù)。陽性染色通過綠色熒光顯示，而紅色染色為PI的核復(fù)染。
ZO-1染色ZO-1染色是針對RPE形成的緊密連接復(fù)合物。在體內(nèi)，ZO-1抗體在RPE和光感受器復(fù)合物中為陽性(紅色熒光)。ZO-1染色在生長在塑料和完整羊膜、以及經(jīng)剝除的AM上的RPE細(xì)胞中也為陽性。
對比文件據(jù)信，外科醫(yī)師、科學(xué)家以及研究人員將從以下文獻(xiàn)提供的信息獲益。
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等同物雖然本發(fā)明已經(jīng)具體由優(yōu)選實施方案顯示并參考其進(jìn)行描述，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)理解可進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)上的改變而不偏離本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解或能夠利用常規(guī)實驗而確定本文所述具體實施方案的等同物。所述等同物意在包含在以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.復(fù)合物，其包含a)羊膜；和b)存在于所述羊膜的大量視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中所述羊膜是經(jīng)上皮剝除處理的。
3.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中所述羊膜是包含基底膜和間質(zhì)的完整羊膜。
4.權(quán)利要求3的復(fù)合物，其中所述羊膜為至少一側(cè)經(jīng)過處理的膜。
5.權(quán)利要求4的復(fù)合物，其中所述處理是應(yīng)用準(zhǔn)分子激光器消融以薄化間質(zhì)側(cè)或應(yīng)用準(zhǔn)分子激光器消融以薄化基底膜側(cè)。
6.權(quán)利要求4的復(fù)合物，其中所述處理是激光處理以改變間質(zhì)側(cè)的厚度。
7.權(quán)利要求4的復(fù)合物，其中所述處理是將間充質(zhì)細(xì)胞添加到間質(zhì)側(cè)。
8.權(quán)利要求7的復(fù)合物，其中所述細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中所述羊膜是人羊膜。
10.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中存在于所述羊膜的視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞的數(shù)量為約16,000到約20,000每4mm2。
11.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中存在于所述羊膜的視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞的數(shù)量為約4000每4mm2。
12.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中所述視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞包含虹膜色素上皮細(xì)胞。
13.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中所述視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞的來源包含通過病毒劑或非病毒劑而被永生化的細(xì)胞。
14.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中所述視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞的來源包含至少一種干細(xì)胞，所述干細(xì)胞通過在體外誘導(dǎo)而分化成視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14的復(fù)合物，其中所述干細(xì)胞包含成人干細(xì)胞。
16.權(quán)利要求14的復(fù)合物，其中所述干細(xì)胞包含胚胎干細(xì)胞。
17.權(quán)利要求15的復(fù)合物，其中所述成人干細(xì)胞包含外周血細(xì)胞或骨髓細(xì)胞。
18.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中所述視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞的來源包含至少一種經(jīng)生物工程改造的細(xì)胞，所述經(jīng)生物工程改造的細(xì)胞在體外經(jīng)誘導(dǎo)而分化成視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。
19.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中所述視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞保持視網(wǎng)膜色素上皮表型。
20.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中存在于所述羊膜的視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞包含培養(yǎng)的細(xì)胞。
21.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中所述視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞包含源于神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞或睫狀體的細(xì)胞。
22.權(quán)利要求21的復(fù)合物，其中所述神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞包含視桿細(xì)胞或視錐細(xì)胞。
23.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其進(jìn)一步包含藥學(xué)活性分子。
24.權(quán)利要求23的復(fù)合物，其中所述藥學(xué)活性分子包含至少一種物質(zhì)，所述物質(zhì)獨(dú)立選自生長因子、酶和治療性藥物。
25.權(quán)利要求24的復(fù)合物，其中所述生長因子是選自源于視網(wǎng)膜色素上皮的生長因子和轉(zhuǎn)化型生長因子-β。
26.權(quán)利要求23的復(fù)合物，其中所述藥學(xué)活性分子是白介素-10。
27.試劑盒，其包含a)羊膜；b)大量存在于所述羊膜的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞；c)緩沖介質(zhì)或培養(yǎng)基；和d)可選地，同時、分別或相繼使用所述試劑盒的至少一種成分來治療視網(wǎng)膜疾病的說明。
28.權(quán)利要求27的試劑盒，其進(jìn)一步包含至少一種藥學(xué)活性劑。
29.權(quán)利要求28的試劑盒，其中所述藥學(xué)活性劑包含至少一種物質(zhì)，所述物質(zhì)獨(dú)立選自生長因子、酶和治療性藥物。
30.權(quán)利要求29的試劑盒，其中所述生長因子是選自源于視網(wǎng)膜色素上皮的生長因子或轉(zhuǎn)化型生長因子-β。
31.權(quán)利要求28的試劑盒，其中所述藥學(xué)活性劑是白介素-10。
32.權(quán)利要求27的試劑盒，其中所述視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞包含經(jīng)生物工程改造的細(xì)胞。
33.形成復(fù)合物的方法，其包含以下步驟a)將至少一種視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞施予在羊膜上；和b)在適宜生長一段時間的條件下，在所述膜上培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞，所述時間足以產(chǎn)生大量培養(yǎng)的細(xì)胞。
34.權(quán)利要求33的方法，其中位于所述膜上的培養(yǎng)的細(xì)胞的數(shù)量為約16,000到約20,000每4mm2。
35.誘導(dǎo)切除的或培養(yǎng)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞以表達(dá)或保持視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞表型的方法，所述方法包含以下步驟a)將羊膜與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞接觸；b)在適宜生長一段時間的條件下，在所述膜上培養(yǎng)所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞，所述時間足以產(chǎn)生大量培養(yǎng)的細(xì)胞；和c)將所述培養(yǎng)的細(xì)胞與有效量的試劑接觸，所述試劑可將細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加到足以誘導(dǎo)或保持視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的所述表型的水平；或d)將包含培養(yǎng)的細(xì)胞的所述膜暴露于氣-液界面一段時間，所述時間足以誘導(dǎo)或保持視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的所述表型。
36.權(quán)利要求35的方法，其中步驟c和d都被實施。
37.權(quán)利要求35的方法，其中在步驟c中，所述細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度被提高到約0.5mM-約2.0mM。
38.權(quán)利要求35的方法，其中在步驟c中，所述細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度被提高到約1.8mM。
39.權(quán)利要求35的方法，其中在所述膜上培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞的步驟持續(xù)到所述細(xì)胞達(dá)匯合。
40.人羊膜在促進(jìn)至少一種視網(wǎng)膜色素上皮等同細(xì)胞生長和分化成大量細(xì)胞中的用途，其中所述大量細(xì)胞表達(dá)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的表型。
41.將大量視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞遞送到需要其的個體的視網(wǎng)膜下隙中靶位點(diǎn)的方法，其包含a)在所述個體的視網(wǎng)膜上形成至少一個孔，或至少部分剝離視網(wǎng)膜以到達(dá)視網(wǎng)膜下隙；b)將包含羊膜和存在于該膜上的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的復(fù)合物插入所述孔；和c)將所述復(fù)合物置于所述靶位點(diǎn)。
42.治療視網(wǎng)膜疾病的方法，其包含將包含羊膜和大量位于該膜上的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的復(fù)合物插入需要其的患者的視網(wǎng)膜下隙。
43.權(quán)利要求42的方法，其中存在所述膜上的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞數(shù)為約16,000至約20,000每4mm2。
44.權(quán)利要求42的方法，其中所述被治療的視網(wǎng)膜疾病是老年性黃斑變性。
45.權(quán)利要求42的方法，其中所述被治療的視網(wǎng)膜疾病選自視網(wǎng)膜剝離、腦回狀萎縮和無脈絡(luò)膜。
46.權(quán)利要求42的方法，其中所述羊膜是人羊膜。
47.權(quán)利要求42的方法，其中所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞包含在所述羊膜上培養(yǎng)的細(xì)胞。
48.權(quán)利要求42的方法，其中所述復(fù)合物進(jìn)一步包含藥學(xué)活性分子。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述藥學(xué)活性分子選自生長因子、酶和治療性藥物。
50.人羊膜在將視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或虹膜色素上皮細(xì)胞移植到視網(wǎng)膜下隙，以防止或減少接受者對同種異體抗原以及視網(wǎng)膜速色素上皮-特異性自體抗原的過敏中的用途。
51.人羊膜在抑制將視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或虹膜色素上皮細(xì)胞移植到視網(wǎng)膜下隙后的纖維化中的用途。
52.人羊膜和至少一種視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞在制備組合物中的用途，其中所述組合物用于治療患有視網(wǎng)膜疾病或有危險發(fā)展成視網(wǎng)膜疾病的患者中視網(wǎng)膜疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在眼睛的視網(wǎng)膜下隙中進(jìn)行移植的組合物，所述組合物包含羊膜，所述羊膜可為低溫保藏的人羊膜，并且在該羊膜上存在大量視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞或RPE等同細(xì)胞。所述羊膜可為完整的、經(jīng)上皮剝除處理的或通過其它方式處理的羊膜。本發(fā)明包含羊膜在在其上培養(yǎng)RPE細(xì)胞以形成用于置換布魯赫氏基底膜的外科移植物中的用途，以及在將RPE細(xì)胞移植到視網(wǎng)膜下隙中的用途。所述組合物不激發(fā)對同種異體抗原或RPE特異性自體抗原的免疫反應(yīng)；并顯示抗炎、抗血管生成以及抗疤痕形成效應(yīng)。本發(fā)明包含用于制備或利用包含羊膜和RPE細(xì)胞的復(fù)合物的方法和試劑盒。本發(fā)明還公開了用于采集RPE細(xì)胞的裝置。
文檔編號C12N5/00GK1720055SQ200380105195
公開日2006年1月11日 申請日期2003年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月4日
發(fā)明者蘇珊尼·賓德, 謝弗·C·G·曾 申請人:組織技術(shù)公司