專利名稱：通過抑制Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)治療癌癥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制過表達(dá)Wnt蛋白的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。所述方法包括將所述細(xì)胞與一種抑制Wnt蛋白與Frizzled受體(Frizzled receptor)結(jié)合的試劑接觸。
背景技術(shù)：
無翅型(Wnt)Frizzled蛋白受體途徑包括攜帶與初級(jí)腫瘤相關(guān)多態(tài)性的重要調(diào)控基因。在向下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白積累，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，并隨后通過與其他轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物增強(qiáng)基因表達(dá)(Uthoff等，Mol Carcinog，3156-62(2001))。在缺乏Wnt信號(hào)的情況下，游離的β-聯(lián)蛋白結(jié)合在包括軸蛋白、結(jié)腸腺瘤樣息肉(APC)基因產(chǎn)物和糖原合成酶激酶(GSK)-3β的復(fù)合物中。軸蛋白、APC和β-聯(lián)蛋白被GSK-3β的同時(shí)磷酸化導(dǎo)致β-聯(lián)蛋白進(jìn)入泛素途徑并被蛋白酶體降解(Uthoff等，MolCarcinog，3156-62(2001)；Matsuzawa等，Mol Cell，7915-926(2001))。
Disheveled(Dvl)是位于Frizzled受體下游、β-聯(lián)蛋白上游的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)節(jié)子。GSK-3β磷酸化Wnt途徑中的多個(gè)蛋白并在β-聯(lián)蛋白的下游調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。APC基因突變是偶發(fā)的和遺傳的結(jié)直腸腫瘤發(fā)生的起始事件。由于所述異常蛋白是Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的組成部分，APC突變體是與腫瘤發(fā)生相關(guān)的。該蛋白包含多個(gè)作為針對(duì)β聯(lián)蛋白結(jié)合及降解位點(diǎn)的功能結(jié)構(gòu)域。發(fā)生在β聯(lián)蛋白氨基端片段上的突變經(jīng)常涉及磷酸化依賴的、泛素介導(dǎo)的降解以及由此對(duì)β聯(lián)蛋白的穩(wěn)定。在穩(wěn)定的胞質(zhì)聯(lián)蛋白積累的情況下，該蛋白轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，并在那里與調(diào)控如c-myc等致癌基因表達(dá)的Tcf/Lef高遷移性轉(zhuǎn)錄因子組合相互作用。
已知在多種細(xì)胞類型中，Wnt/β-聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞生存(Orford等，J CellBiol，146855-868(1999)；Cox等，Genetics，1551725-1740(2000)；Reya等，Immunity，1315-24(2000)；Satoh等，Nat Genet，24245-250(2000)；Shin等，Journal of BiologicalChemistry，2742780-2785(1999)；Chen等，J Cell Biol，15287-96(2001)；Ioannidis等，Nat Immunol，2691-697(2001))。Wnt信號(hào)途徑也被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)展和/或進(jìn)展相關(guān)(Polakis等，Genes Dev，141837-1851(2000)；Cox等，Genetics，1551725-1740(2000)；Bienz等，Cell，103311-320(2000)；You等，J Cell Biol，157429-440(2002))。Wnt信號(hào)途徑與c-Myc的過表達(dá)或擴(kuò)增相關(guān)，該途徑的異常激活與多種人類癌癥相關(guān)(Polakis等，Genes Dev，141837-1851(2000)；Bienz等，Cell，103311-320(2000)；Brown等，Breast Cancer Res，3351-355(2001)；He等，Science，2811509-1512(1998)；Miller等，Oncogene，187860-7872(1999))。此外，c-Myc被鑒別為結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中β-聯(lián)蛋白/Tcf的轉(zhuǎn)錄靶基因之一(He等，Science，2811509-1512(1998)；de La Coste等，Proc Natl Acad Sci USA，958847-8851(1998)；Miller等，Oncogene，187860-7872(1999)；You等，J Cell Biol，157429-440(2002))。
除了Wnt配體之外，已經(jīng)分離了分泌型Frizzled相關(guān)蛋白(secreted Frizzled-relatedproteins，sFRP)家族。sFRP可以通過與跨膜Frizzled受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分泌型Wnt配體作為Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的可溶的內(nèi)源性調(diào)控子發(fā)揮作用(Melkonyan等，Proc Natl Acad SciUSA，9413636-13641(1997))。sFRP可以通過結(jié)合Wnt蛋白并阻礙其接近細(xì)胞表面信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體拮抗Wnt功能，或可以通過促進(jìn)向Frizzled受體提呈配體增強(qiáng)Wnt活性(Uthoff等，Mol Carcinog，3156-62(2001))。發(fā)現(xiàn)另一種稱為Dickkopf(Dkk)的蛋白也干擾Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并減少胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白的積累(Fedi等，J Biol Chem，27419465-19472(1999)；Moon等，Cell，88725-728(1997))。Dkk-1通過與鄰近Frizzled受體的LDL受體相關(guān)蛋白6(LRP6)的結(jié)合拮抗Wnt誘導(dǎo)的信號(hào)(Nusse等，Nature，411255-256(2001))。最近H.Suzuki等發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系中sFRP是以高頻率過度甲基化的，并且這一過度甲基化與sFRP基本表達(dá)的缺乏相關(guān)聯(lián)(Suzuki等，Nat Genet，31141-149(2002))。Dkk-1的過表達(dá)也被發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)腦瘤細(xì)胞的凋亡(Shou等，Oncogene，21878-889(2002))。
盡管在對(duì)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的理解中取的了最新的進(jìn)展，這一信號(hào)途徑在腫瘤形成中的作用仍不清楚。因而，在先的技術(shù)無法提供調(diào)控這一信號(hào)途徑的化合物能夠用于癌癥治療的明確證據(jù)。本發(fā)明致力于解決這些問題及其他需求。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了抑制過表達(dá)Wnt蛋白的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。所述方法包括將所述細(xì)胞與一種抑制Wnt蛋白與Frizzled受體結(jié)合的試劑接觸。
在有些實(shí)施方式中，所述試劑是一種抗體。例如，所述抗體可以特異性結(jié)合Wnt蛋白、Wnt-1或Wnt-2。在其他實(shí)施方式中，所述抗體特異性結(jié)合一種Frizzled受體，如Frizzled1、Frizzled2、Frizzled3、Frizzled4、Frizzled5、Frizzled6、Frizzled7、Frizzled8、Frizzled9、Frizzled10受體。
本發(fā)明的抗體可以是單克隆抗體并可以用多種方法制備和修飾。例如，所述抗體可以通過重組方式產(chǎn)生。在有些實(shí)施方式中，所述抗體是人源化抗體或單鏈Fv片段(scFv)。
本發(fā)明也提供了處理腫瘤的治療方法。在這些實(shí)施方式中，所述癌細(xì)胞位于患者體內(nèi)并且接觸步驟通過給予該患者所述試劑進(jìn)行。所述方法可以進(jìn)一步包括給予患者諸如化療劑或放射治療的第二種治療試劑。所述癌細(xì)胞可以是乳腺癌細(xì)胞、結(jié)腸直腸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞、或是間皮瘤細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、食道癌細(xì)胞、頭頸癌細(xì)胞、肝細(xì)胞瘤細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞或成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞。
本發(fā)明也提供了包括藥學(xué)上可接受的的賦形劑和特異性結(jié)合Wnt或Frizzled蛋白(例如Wnt1蛋白)的單克隆抗體的藥物組合物。所述抗體可以進(jìn)一步與諸如標(biāo)記、放射性同位素或細(xì)胞毒化學(xué)制品等效應(yīng)組分偶聯(lián)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種對(duì)抑制癌細(xì)胞增殖的試劑進(jìn)行篩選的方法，該方法包括將所述試劑與Dvl蛋白或核酸接觸，測(cè)定Dvl蛋白活性或表達(dá)情況，以及鑒別抑制Dvl蛋白活性或表達(dá)的化合物，從而鑒別抑制癌細(xì)胞增殖的試劑。所述方法可以進(jìn)一步包括將一種經(jīng)鑒別的化合物與癌細(xì)胞接觸，并挑選抑制所述癌細(xì)胞增殖的化合物。在有些實(shí)施方式中，所述癌細(xì)胞是肺癌細(xì)胞或間皮瘤細(xì)胞。
本發(fā)明也提供了一種抑制過表達(dá)Dvl蛋白的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，該方法包括將所述細(xì)胞與抑制Dvl表達(dá)或活性的試劑接觸。在有些實(shí)施方式中，所述癌細(xì)胞是肺癌細(xì)胞或間皮瘤細(xì)胞。所述試劑可以是例如小分子化合物或siRNA。
定義術(shù)語“Wnt蛋白”或“Wnt配體”是指與果蠅體節(jié)極性基因(無翅型)相關(guān)的哺乳動(dòng)物蛋白家族。在人類中，Wnt家族基因通常編碼具有疏水信號(hào)序列和保守的天冬酰胺連接的寡糖共有序列的分子量38-43kDa的富含半胱氨酸的糖蛋白(例如可參見Shimizu等，Cell Growth Differ 81349-1358(1997))。Wnt家族包括至少16個(gè)哺乳動(dòng)物成員。示例性的Wnt蛋白包括Wnt-1、Wnt-2、Wnt-3、Wnt-3A、Wnt-4、Wnt-5A、Wnt-6、Wnt-7A、Wnt-7B、Wnt-8A、Wnt-8B、Wnt-10B、Wnt-11、Wnt-13、Wnt14、Wnt15和Wnt16。本發(fā)明的一些示例性Wnt蛋白序列列舉在序列清單中。此外，特定Wnt蛋白的過表達(dá)已被表明與某些癌相關(guān)。例如，在胃癌和結(jié)腸直腸癌中WNT-2過表達(dá)(Katoh等，Int J Oncol，191003-1007(2001))；在頭頸癌中Wnt-1過表達(dá)，以及在胃癌中WNT-5A和Wnt-8B過表達(dá)(Saitoh等，Int J Mol Med，9515-519(2002)；Saitoh等，Int J Oncol，20343-348(2002))。
術(shù)語“Frizzled蛋白”或“Frizzled受體”是指與果蠅Frizzled基因(在組織極性的發(fā)展中發(fā)揮作用)相關(guān)的哺乳動(dòng)物蛋白家族。Frizzled蛋白家族包括至少10個(gè)哺乳動(dòng)物基因。示例性的人類Frizzled受體包括Frizzled1，F(xiàn)rizzled2、Frizzled3、Frizzled4、Frizzled5、Frizzled6、Frizzled7、Frizzled8、Frizzled9和Frizzled10。示例性Frizzled受體的序列列舉在序列清單中。果蠅Frizzled蛋白的哺乳動(dòng)物同源體共有多個(gè)共同結(jié)構(gòu)基序。位于細(xì)胞外膜表面的N末端后的是一個(gè)信號(hào)序列、一個(gè)含10個(gè)半胱氨酸殘基的恒定花樣的120個(gè)氨基酸構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)由40-100個(gè)高度變化的親水性氨基酸構(gòu)成的高度多樣的區(qū)域。假定的疏水片段形成由親水環(huán)連接的7次跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，以位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的C末端結(jié)束。所述的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CRDs)和跨膜片段是高度保守的，這說明了其中細(xì)胞外CRD通過可變的連接區(qū)域與一束7次跨膜螺旋結(jié)構(gòu)相連的工作模式。因此，具有氨基端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Frizzled蛋白受體具有類似于G-蛋白偶聯(lián)受體的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的動(dòng)力學(xué)模型。Frizzled1，F(xiàn)rizzled2和Frizzled7在肺癌和結(jié)腸直腸癌中(Sagara等，Commun，252117-122(1998))；Frizzled3在包括肺癌、宮頸癌和結(jié)腸直腸癌的人類癌細(xì)胞中(Kirikoshi等，Biochem Biophys Res Commun，2718-14(2000))；Frizzled7在胃癌中(Kirikoshi等，Int J Oncol，19111-115(2001))；Frizzled10在胃癌和結(jié)腸直腸癌中(Kirikoshi等，Int J Oncol，19767-771(2001)；Terasaki等，Int J Mol Med，9107-112(2002))。
除了Wnt配體之外，已經(jīng)分離了分泌型Frizzled相關(guān)蛋白(sFRP)家族。sFRP可以通過與跨膜Frizzled受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分泌型Wnt配體作為Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的可溶的內(nèi)源性調(diào)控子發(fā)揮作用。因此，sFRP對(duì)程序性細(xì)胞死亡發(fā)揮拮抗作用，調(diào)節(jié)凋亡的敏感性。sFRP可以通過結(jié)合Wnt蛋白并阻礙其接近細(xì)胞表面信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體拮抗Wnt功能，或可以通過促進(jìn)向Frizzled受體提呈配體增強(qiáng)Wnt活性。到目前為止，sFRP仍沒有與腫瘤起因相聯(lián)系。
術(shù)語“Dishevelled”或“Dvl”是指Dishevelled蛋白家族成員，其全長(zhǎng)序列通常含有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域一個(gè)存在于Wnt拮抗蛋白軸蛋白上的DIX結(jié)構(gòu)域，一個(gè)參與蛋白之間相互作用的PDZ結(jié)構(gòu)域和一個(gè)在調(diào)節(jié)Rho GTP酶的蛋白中發(fā)現(xiàn)的DEP結(jié)構(gòu)域。Dvl蛋白包括，例如Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3。包括小鼠和人類在內(nèi)的多個(gè)物種的Dvl的核酸和蛋白序列是已知的。示例性的人類Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3蛋白序列可以分別通過參照序列NP_004412、NP_004413和NM_004414得到。
Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)“抑制劑”是指例如與Wnt或Frizzled蛋白結(jié)合、或在已知的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的檢測(cè)方法中(例如，β-聯(lián)蛋白水平測(cè)量，或由Tcf和Lef轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的致癌基因的表達(dá))測(cè)得部分或完全阻礙Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物。抑制劑包括修飾形式的Wnt或Frizzled蛋白，以及天然或合成的配體、拮抗劑、激動(dòng)劑、抗體、小分子化合物等等。后面對(duì)檢測(cè)本發(fā)明抑制劑的方法作了更詳細(xì)描述。
“過表達(dá)Wnt蛋白的癌細(xì)胞”是其中一種特定Wnt蛋白的表達(dá)至少是來自相同組織的正常細(xì)胞中表達(dá)水平的2倍，經(jīng)常是至少5倍的癌細(xì)胞。測(cè)定具體基因表達(dá)水平的方法是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的。這樣的方法包括RT-PCR、使用所述基因產(chǎn)物抗體等等。
這里所使用的“抗體”涉及與具體抗原具有免疫反應(yīng)性的免疫球蛋白分子，包括多克隆和單克隆抗體。該術(shù)語也包括諸如嵌合抗體(如人源化小鼠抗體)和雜合抗體(如雙特異性抗體)等遺傳工程形式的抗體。術(shù)語“抗體”也包括抗體的抗原結(jié)合形式，這包括具有抗原結(jié)合能力的片段(例如Fab’、F(ab’)2、Fab、Fv和rIgG，也可參見Pierce公司(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)的目錄和手冊(cè)，1994-1995；也可參見Kuby，J.所著《免疫學(xué)》第3版(Immunology，W.H.Freeman & Co.，New York(1998))。該術(shù)語也包括重組單鏈Fv片段(scFv)。術(shù)語“抗體”也包括二價(jià)或雙特異性分子、雙功能抗體、三功能抗體和四功能抗體。例如在Kostelny等，(1992)J Immunol 1481547；Pack和Pluckthun(1992)Biochemistry 311579；Hollinger等，1993；Gruber等，(1994)J Immunol5368；Zhu等，(1997)Protein Sci 6781，Hu等，(1996)Cancer Res.563055；Adams等，(1993)Cancer Res.534026；以及McCartney等，(1995)Protein Eng.8301中對(duì)二價(jià)和雙特異性分子進(jìn)行了描述。
與具體抗原具有免疫反應(yīng)性的抗體可以通過諸如在噬菌體或類似載體中的重組抗體文庫的篩選等重組方法(可以參見Huse等，Science 2461275-1281(1989)；Ward等，Nature 341544-546(1989)；以及Vaughan等，Nature Biotech.14309-314(1996))，或通過用抗原或編碼抗原的DNA免疫動(dòng)物產(chǎn)生。
通常，免疫球蛋白具有重鏈和輕鏈。每條重鏈和輕鏈包含恒定區(qū)和可變區(qū)(這些區(qū)域也稱為“結(jié)構(gòu)域”)。輕鏈和重鏈可變區(qū)包含4個(gè)“骨架區(qū)”，其間插入了3個(gè)高變區(qū)(也稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”)。已經(jīng)確定了骨架區(qū)和CDR的范圍。同種內(nèi)不同的輕鏈或重鏈的骨架區(qū)序列相對(duì)保守。構(gòu)成抗體的輕鏈和重鏈的骨架區(qū)的結(jié)合組成抗體的骨架區(qū)，該骨架區(qū)為在三維空間中定位并排列CDR提供支持。
CDR主要負(fù)責(zé)與抗原表位結(jié)合。每條鏈的CDR經(jīng)常是指CDR1、CDR2和CDR3，按順序從N末端開始編號(hào)，并通常也通過具體CDR所位于的鏈加以鑒別。這樣，VHCDR3位于其所在抗體的重鏈可變區(qū)上，而VLCDR1是來自其所在抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR1。
提及的“VH”或“VH”是指抗體的免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)，這包括Fv、scFv或Fab的重鏈。提及的“VL”或“VL”是指免疫球蛋白輕鏈的可變區(qū)，這包括Fv、scFv、dsFv或Fab的輕鏈。
術(shù)語“單鏈Fv”或“scFv”是指這樣一種抗體，其中傳統(tǒng)雙鏈抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)已連接形成單鏈。通常，在所述兩條鏈之間插入連接肽，以使之正確折疊并建立活性結(jié)合位點(diǎn)。
“嵌合抗體”是這樣一種免疫球蛋白分子，其中(a)改變、取代或交換恒定區(qū)或其部分，從而抗原結(jié)合位點(diǎn)(可變區(qū))與不同的或改變的種類的、效應(yīng)功能和/或物種的恒定區(qū)，或是賦予嵌合抗體全新功能的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生長(zhǎng)因子、藥物等等)相連接；或(b)用具有不同的或改變的抗原特異性的可變區(qū)改變、取代或交換可變區(qū)或其部分。
“人源化抗體”是含有最少源自非人類免疫球蛋白序列的免疫球蛋白分子。人源化抗體包括這樣的人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被來自具有所需特異性、親和力和能力的諸如小鼠、大鼠或兔等非人類種屬(供體抗體)的CDR的殘基所取代。在有些情況下，人類免疫球蛋白的Fv骨架區(qū)殘基被相應(yīng)的非人源殘基所取代。人源化抗體也可以包含既不存在于受體抗體上的、也不存在于引入的CDR或骨架序列中的殘基。通常，人源化抗體應(yīng)包括實(shí)質(zhì)上至少一個(gè)，通常是兩個(gè)完整的可變結(jié)構(gòu)域，其中完整的或?qū)嵸|(zhì)上完整的CDR區(qū)域?qū)?yīng)于非人類免疫球蛋白的CDR區(qū)域，并且完整的或?qū)嵸|(zhì)上完整的骨架(FR)區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的骨架區(qū)。人源化抗體優(yōu)選也應(yīng)包括通常是人免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分((Jones等，Nature 321522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332323-329(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992))。人源化基本上可以按照Winter及其同事的方法，通過用嚙齒動(dòng)物的CDR或CDR序列取代人抗體的相應(yīng)序列進(jìn)行(Jones等，Nature 321522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 2391534-1536(1988))。從而，這樣的人源化抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利No.4,816,567)，其中實(shí)質(zhì)上少于一個(gè)完整的人的可變結(jié)構(gòu)域已被來自非人類種屬的相應(yīng)序列所取代。
“表位”或“抗原決定基”是指抗原上結(jié)合抗體的位置。表位可以是由鄰接的氨基酸或不鄰接的氨基酸通過蛋白的三級(jí)折疊并置形成的。由鄰接的氨基酸構(gòu)成的表位通常在與變性溶劑接觸下得以保持，而由三級(jí)折疊形成的表位在變性溶劑處理下通常會(huì)喪失。表位典型地包括一個(gè)獨(dú)特的空間構(gòu)象中的至少3個(gè)，以及更為常見地至少5個(gè)或8-10個(gè)氨基酸。測(cè)定表位空間構(gòu)象的方法包括，例如，X射線結(jié)晶照相術(shù)和2維核磁共振。參見例如Glenn E.Morris主編的《分子生物學(xué)方法中的表位作圖法》第66卷(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，1996))。
這里所使用的“生物學(xué)樣品”是包含核酸或多肽(例如Wnt蛋白的核酸或多肽)、多核苷酸或轉(zhuǎn)錄本的生物組織或體液的樣品。這樣的樣品包括但不限于分離自靈長(zhǎng)類(例如人)或嚙齒類(例如小鼠和大鼠)的組織。生物學(xué)樣品也可以包括組織切片，諸如活組織切片和剖檢切片樣品、出于組織學(xué)目的獲取的冷凍切片、血液、血漿、血清、唾液、糞便、眼淚、粘液、頭發(fā)、皮膚等等。生物學(xué)樣品也包括源自患者組織的移植物以及初級(jí)的和/或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)物。生物學(xué)樣品典型地得自真核有機(jī)體，最優(yōu)選得自如靈長(zhǎng)類(例如黑猩猩或人)、牛、狗、貓、嚙齒類(例如豚鼠、大鼠、小鼠)、兔等哺乳動(dòng)物；或鳥類；爬行動(dòng)物；或魚類。
“提供一種生物學(xué)樣品”意味著獲得一種用于本發(fā)明所述方法的生物學(xué)樣品。最常見地，這可以通過從動(dòng)物中取出細(xì)胞樣品完成，不過也可以通過使用事先分離的細(xì)胞(例如，由其他人、在其他時(shí)候、以及/或?yàn)槠渌康姆蛛x的細(xì)胞)、或通過在活體內(nèi)實(shí)行本發(fā)明的方法得以完成。具有治療或治療結(jié)果歷史的存檔的組織會(huì)是尤其有用的。
在兩個(gè)或多個(gè)核酸或多肽序列的上下文中，術(shù)語“相同的”或“相同”百分?jǐn)?shù)是指如使用下述默認(rèn)參數(shù)的BLAST或BLAST2.0序列比較運(yùn)算法則或通過手工對(duì)齊排列并目測(cè)(參見，例如NCBI的萬維網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/或其他網(wǎng)址)測(cè)得的，兩個(gè)或多個(gè)序列或亞序列相同或具有具體同一性百分?jǐn)?shù)的氨基酸殘基或核苷酸(例如，當(dāng)相互比較并在一個(gè)對(duì)比窗口或指定區(qū)間上作最大對(duì)應(yīng)度對(duì)齊排列時(shí)，在一個(gè)具體的區(qū)域上約60％相同，優(yōu)選70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)。這樣的序列然后被稱為“幾乎相同的”。這一定義也涉及，或可以用于，對(duì)待測(cè)序列的評(píng)價(jià)。這一定義也包括具有缺失和/或添加，以及那些具有置換的序列，以及天然的(例如多態(tài)性或等位基因變體)和人造的變體。如下所述，優(yōu)選的運(yùn)算法則可以計(jì)算缺口等等。優(yōu)選地，相同性存在于長(zhǎng)度至少為約25個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域上，或更優(yōu)選地，存在于長(zhǎng)度為50-100個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域上。
為了序列比對(duì)，通常一條序列作為參照序列，待測(cè)序列與其比對(duì)。在使用一種序列比對(duì)算法時(shí)，待測(cè)的和參照序列輸入計(jì)算機(jī)，如果需要?jiǎng)t指定亞序列坐標(biāo)，并指定序列算法程序參數(shù)。優(yōu)選地，可以使用默認(rèn)的程序參數(shù)，或可以指定另外的參數(shù)。序列比對(duì)算法隨后在程序參數(shù)的基礎(chǔ)上計(jì)算待測(cè)序列相對(duì)于參照序列的序列相同性百分比。
這里所使用的“比對(duì)窗口”包括從通常包括20到600、經(jīng)常是約50到200、更常見的是約100到150的組中選擇的鄰接位置的編號(hào)之一的片段，其中一段序列可以與具有相同鄰接位置編號(hào)的參照序列在兩段序列最優(yōu)化對(duì)齊后進(jìn)行比對(duì)。序列對(duì)齊排列用于比對(duì)的方法是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的。用于比對(duì)的最佳對(duì)齊排列可以通過，例如Smith & Waterman在Adv.Appl.Math.2482(1981)中報(bào)道的局部同源度算法、通過Needleman & Wunsch在J.Mol.Biol.48443(1970)中報(bào)道的同源排列算法、通過Pearson & Lipman在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444(1988)中報(bào)道的搜尋相似性的方法、通過這些算法的計(jì)算機(jī)化運(yùn)用(威斯康星遺傳學(xué)軟件包(Wisconsin GeneticsSoftware Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA)、或通過手工排列和目測(cè)(參見，例如Ausubel等人主編的《分子生物學(xué)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，1995增刊。
適合于確定序列相同性和序列相似性百分比的優(yōu)選實(shí)施方式包括BLAST和BLAST2.0算法，這些算法在Altschul等，Nuc.Acids Res.253389-3402(1977)和Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990)中作了描述。BLAST和BLAST2.0使用這里所述的參數(shù)用于確定本發(fā)明的核酸與蛋白的序列相同性百分比。進(jìn)行BLAST分析的軟件通過國(guó)家生物技術(shù)信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)向公眾開放。這一算法包括鑒別查詢序列中的長(zhǎng)度短字段W，該短字段與一條數(shù)據(jù)庫序列中相同長(zhǎng)度的字段對(duì)齊排列時(shí)，兩者相匹配或滿足一定的正值閥值T，由此首先鑒別高分值的序列對(duì)(HSPs)。T作為鄰近字段分值界限的參考(Altschul等，同上)。這些初始鄰近字段采樣數(shù)作為啟動(dòng)搜尋將其包含在內(nèi)的更長(zhǎng)的HSPs的依據(jù)。只要累積的排列分值能夠提高，字段采樣數(shù)沿每條序列往兩側(cè)延伸。例如對(duì)于核苷酸序列而言，累積的分值使用參數(shù)M(對(duì)一對(duì)匹配的殘基的加分；總是大于0的)和N(對(duì)不匹配殘基的扣分；總是小于0的)進(jìn)行計(jì)算。對(duì)于氨基酸序列來說，使用計(jì)分矩陣計(jì)算累計(jì)的分值。字段采樣數(shù)在每個(gè)方向上的延伸在以下情況下中斷通過X數(shù)量使累計(jì)排列分值從其達(dá)到的最高值下跌；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)得分殘基排列的累積導(dǎo)致累計(jì)分值達(dá)到0或更低；或達(dá)到了任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定對(duì)齊排列的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)作為默認(rèn)使用字段長(zhǎng)度(W)值11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4，并對(duì)雙鏈進(jìn)行比對(duì)。對(duì)于氨基酸序列來說，BLASTP程序作為默認(rèn)使用字段長(zhǎng)度3、期望值10以及BLOSUM62計(jì)分矩陣(參見Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915(1989))排列值(B)50、期望值10、M＝5、N＝-4，并對(duì)雙鏈進(jìn)行比對(duì)。
BLAST算法也進(jìn)行兩條序列間相似性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(例如參見Karlin & Altschul，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 905873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似度的一種量度是最小概率和(P(N))，這提供了一種兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間偶然匹配的概率的指標(biāo)。例如，一條核酸被認(rèn)為與參照序列相似，如果在待測(cè)序列與參照序列的比對(duì)中最小概率和小于約0.2，更優(yōu)選小于約0.01，最優(yōu)選小于約0.001。對(duì)數(shù)值可以是大的負(fù)數(shù)，例如5、10、20、30、40、70、90、110、150、170等等。
兩個(gè)核酸序列或多肽幾乎相同的一個(gè)標(biāo)志是由第一條核酸編碼的多肽與用第二條核酸編碼的多肽所產(chǎn)生的抗體發(fā)生如下面所描述的免疫交叉反應(yīng)。因而，例如當(dāng)兩段肽只有保守性置換的差異時(shí)，一條多肽通常與第二條多肽幾乎相同。兩個(gè)核酸序列幾乎相同的另一個(gè)標(biāo)志是所述兩個(gè)分子或其互補(bǔ)鏈在如以下所述的嚴(yán)格條件下互相雜交。兩個(gè)核酸序列幾乎相同的另一個(gè)標(biāo)志是可以使用相同的引物擴(kuò)增所述序列。
術(shù)語“分離的”、“純化的”或“生物學(xué)上純凈的”是指與其天然狀態(tài)下被發(fā)現(xiàn)通常伴隨的成分幾乎或基本分開的材料。純度和同質(zhì)度通常使用諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC等分析化學(xué)技術(shù)確定。制劑中主要的種類的蛋白或核酸是充分純化的。具體地說，分離的核酸是與一些與所述基因天然側(cè)面相連并所編碼蛋白與所述基因編碼蛋白不同的開放閱讀框分離的。在有些實(shí)施方式中，術(shù)語“純化的”表示核酸或蛋白在電泳膠上基本上產(chǎn)生單一條帶。優(yōu)選地，這表示所述核酸活蛋白純度至少85％、更優(yōu)選至少95％、最優(yōu)選至少99％。在其他實(shí)施方式中，“純化”表示從進(jìn)行純化的組合物種去除至少一種雜質(zhì)。就這種意義而言，純化不要求經(jīng)純化的化合物是同質(zhì)的，例如100％純凈的。
術(shù)語“多肽”、“肽”或“蛋白”在這里是可以交替使用的，是指氨基酸殘基的聚合物。這一術(shù)語用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是對(duì)應(yīng)于天然氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨基酸聚合物以及天然氨基酸聚合物、包含修飾的殘基以及非天然氨基酸的聚合物。
術(shù)語“氨基酸”包括天然的和合成的氨基酸，以及功能類似于天然氨基酸的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然氨基酸是指那些由遺傳密碼編碼的氨基酸以及那些隨后進(jìn)行修飾的氨基酸(例如羥基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷絲氨酸)。氨基酸類似物包括具有與天然氨基酸相同的基本結(jié)構(gòu)(例如，與1個(gè)氫原子、1個(gè)羧基團(tuán)、一個(gè)氨基團(tuán)和1個(gè)R基團(tuán)相連的α碳原子)的化合物，例如高絲氨酸、正亮氨酸、亞砜甲硫氨酸、甲锍甲硫氨酸。這樣的類似物可以具有經(jīng)修飾的R基團(tuán)(例如正亮氨酸)或經(jīng)修飾的肽骨架，但保持了如天然氨基酸一樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指具有不同于氨基酸通常化學(xué)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)的、但其功能類似于天然氨基酸的化合物。
這里氨基酸可以用其通常使用的3個(gè)字母記號(hào)表示或用IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的單字母記號(hào)表示。同樣地，核苷酸可以用其通用的單字母編碼表示。
“保守修飾變體”用于氨基酸和核酸序列。對(duì)于具體的核酸序列而言，保守修飾變體是指那些編碼相同的或基本相同的氨基酸序列的核酸，或所述核酸不編碼氨基酸序列，例如與天然鄰接序列基本相同或相關(guān)的序列。由于遺傳密碼的兼并，許多功能上相同的核酸編碼大部分蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA，GCC，GCG和GCU都編碼了丙氨酸。因此，每個(gè)位置上由一個(gè)密碼子確定的丙氨酸，該密碼子可以改為所述的另一個(gè)密碼子而不改變所編碼的多肽。這樣的核酸變異是“沉默變異”，是保守修飾變異的一種類型。這里所述每個(gè)編碼多肽的核酸序列也描述了該核酸的沉默變異。精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，在某些上下文中核酸中的每種密碼子(除了AUG通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，以及TGG通常是色氨酸的唯一密碼子)可以進(jìn)行修飾以產(chǎn)生功能上相同的分子。相應(yīng)地，關(guān)于表達(dá)產(chǎn)物而無關(guān)于實(shí)際探針序列，所述序列通常包括編碼多肽的核酸的沉默變異。
正如對(duì)于氨基酸序列而言，精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，對(duì)核酸、肽、多肽或蛋白序列進(jìn)行個(gè)別的、在編碼序列中改變、添加或刪除單個(gè)氨基酸或低百分比氨基酸的置換、刪除或添加是一種“保守修飾變體，如果所述的改變導(dǎo)致用化學(xué)上相似的氨基酸對(duì)氨基酸進(jìn)行置換。提供功能上相似的氨基酸的保守置換表是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的。這樣的保守修飾變體是對(duì)本發(fā)明中多態(tài)性變體、種間同源物和等位基因的補(bǔ)充而不是排斥。典型地相互保守置換是1)丙氨酸(A)和甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；3)天冬酰胺酸(N)和谷酰胺(Q)；4)精氨酸(R)和賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)和甲硫氨酸(M)(參見例如Creighton所著《蛋白質(zhì)》(Proteins，1984))。
諸如多肽結(jié)構(gòu)的大分子結(jié)構(gòu)可以用組織的多種水平的術(shù)語描述。對(duì)這一組織水平的全面討論，可以參見例如Alberts等所著《細(xì)胞分子生物學(xué)》第3版(Molecular Biologyof the Cell(第三版，1994))以及Cantor & Schimmel所著《生物物理化學(xué)》第一部分《生物大分子構(gòu)象》(Biophysical Chemistry Part IThe Conformation of BiologicalMacromolecules(1980))?！俺跫?jí)結(jié)構(gòu)”是指具體肽的氨基酸序列?！岸?jí)結(jié)構(gòu)”是指多肽中局部有序的三維結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)通常稱為結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域是通常形成緊湊單位的多肽的一部分，并且通常長(zhǎng)度為25到大約500個(gè)氨基酸。典型的結(jié)構(gòu)域由諸如β折疊和α螺旋等更低組織水平的結(jié)構(gòu)部分構(gòu)成。“三級(jí)結(jié)構(gòu)”是指多肽單體完整的三維結(jié)構(gòu)?！八募?jí)結(jié)構(gòu)”是指通常通過獨(dú)立的三級(jí)單位的非共價(jià)連接形成的三維結(jié)構(gòu)。各向異性的術(shù)語也稱為能量術(shù)語。
“標(biāo)記”或“可檢測(cè)部分”是能通過分光光度、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、化學(xué)或其他物理手段檢測(cè)到的合成物。例如，有用的標(biāo)記包括熒光染料、電子密度試劑、酶(如經(jīng)常用于ELISA的)、生物素、地高辛或半抗原以及蛋白質(zhì)或其他能夠進(jìn)行檢測(cè)的試劑，例如通過將放射性標(biāo)記組合到肽上，或用于檢測(cè)與所述肽特異性反應(yīng)的抗體。放射性同位素可以是例如3H，14C，32P，35S或125I。在有些情況下，特別是使用針對(duì)本發(fā)明中蛋白的抗體的情況下，放射性同位素如以下所述用作有毒部分。標(biāo)記可以結(jié)合到核酸、蛋白質(zhì)和抗體的任何位置上。任何本領(lǐng)域內(nèi)已知可以用于抗體和標(biāo)記偶聯(lián)的方法均可使用，這些方法包括由Hunter等，Nature，144945(1962)；David等，Biochemistry，131014(1974)；Pain等，J.Immunol.Meth.，40219(1981)；以及Nygren，J.Histochem.and Cytochem.，30407(1982)中描述的那些方法。通過添加穩(wěn)定放射性標(biāo)記肽或抗體并保護(hù)其免受降解的試劑可以延長(zhǎng)放射性標(biāo)記的肽或放射性標(biāo)記的抗體組合物的壽命。可以使用任何穩(wěn)定放射性標(biāo)記肽或抗體的試劑或試劑組合，這包括美國(guó)專利No.5,961,955中所公開的那些試劑。
“效應(yīng)子”或“效應(yīng)部分”或“效應(yīng)組分”是指與抗體通過連接物或化學(xué)鍵以共價(jià)方式或通過離子鍵、范德華力、靜電作用或氫鍵以非共價(jià)方式結(jié)合(或連接，或偶聯(lián))的分子?！靶?yīng)子”可以是多種分子，包括例如包括放射性化合物、熒光化合物、酶或底物、如標(biāo)為標(biāo)簽的標(biāo)記物、毒素等檢測(cè)部分；可激活部分，化學(xué)治療劑；脂肪酶；抗生素；或發(fā)射“重”射線(如β射線)的同位素的部分。
在涉及例如細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體時(shí)，術(shù)語“重組”表示所述細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體已經(jīng)通過外源核酸或蛋白質(zhì)的引入或天然核酸或蛋白質(zhì)的改變進(jìn)行改造，或所述細(xì)胞源自這樣改造的細(xì)胞。因此，例如重組細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞在天然(未重組)狀態(tài)下未發(fā)現(xiàn)的基因或表達(dá)以另外方式異常表達(dá)、低表達(dá)或完全不表達(dá)的基因。這里的術(shù)語“重組核酸”表示通常最初在體外形成的核酸，通過核酸操作，例如通過使用聚合酶和內(nèi)切酶，以通常自然界中不存在的形式存在。這樣，實(shí)現(xiàn)了不同序列以可操作方式連接。這樣，分離的線性核酸，或通常不連接的DNA分子通過體外連接形成的表達(dá)載體，均可認(rèn)為是符合本發(fā)明目的的重組子。需要理解的是，一旦制備了重組核酸并將其重新導(dǎo)入宿主細(xì)胞或有機(jī)體，該核酸將以非重組方式復(fù)制，也就是說使用宿主細(xì)胞的體內(nèi)細(xì)胞機(jī)器而不是體外操控方式；然而，這樣的核酸一旦以重組方式產(chǎn)生，雖然隨后以非重組方式復(fù)制，任被認(rèn)為適于本發(fā)明目的的重組子。類似地，“重組蛋白”是使用重組技術(shù)制造(即通過如上所述的重組核酸的表達(dá))的蛋白。
當(dāng)用于提及核酸的部分時(shí)，術(shù)語“異源的”表示所述核酸包括兩個(gè)或多個(gè)亞序列，這些亞序列通常在自然條件下不存在相同的相互關(guān)系。例如，兩個(gè)或多個(gè)序列的所述核酸通常以重組方式產(chǎn)生，例如組織來自無關(guān)基因的序列以形成新的功能性核酸，例如，一種來源的啟動(dòng)子和另一來源的編碼區(qū)。類似地，異源蛋白質(zhì)通常包括自然條件下不存在相互關(guān)系的兩個(gè)或多個(gè)亞序列(例如融合蛋白)。
當(dāng)提及蛋白質(zhì)或肽時(shí)，短語與抗體“特異性(或選擇性)結(jié)合”或“特異性(或選擇性)免疫反應(yīng)”是指在含有蛋白質(zhì)和其他生物樣品的異質(zhì)性種群中由所述蛋白的存在所決定的結(jié)合反應(yīng)。因此，在指定的免疫檢測(cè)條件下，在指定的免疫檢測(cè)條件下，具體的抗體與特定蛋白序列結(jié)合比本底高兩倍、更典型地是比本底高10到100倍。
在這樣的條件下與抗體的特異性結(jié)合需要選擇具有針對(duì)特定蛋白的特異性的抗體。例如，針對(duì)特定蛋白質(zhì)、多態(tài)性變體、等位基因、直向同源基因、以及保守修飾變體、或剪接變體、或其部分產(chǎn)生的多克隆抗體可以進(jìn)行選擇以獲得那些與Wnt或Frizzled蛋白并不與其他蛋白質(zhì)特異性免疫反應(yīng)的多克隆抗體。這一選擇可以通過扣除與其他分子交叉反應(yīng)的抗體實(shí)現(xiàn)。多種免疫檢測(cè)方式可以用于選擇與特定蛋白發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體。例如，固相ELISA免疫檢測(cè)經(jīng)常用于選擇與蛋白質(zhì)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體(至于對(duì)可以用于確定特異性免疫反應(yīng)的免疫檢測(cè)方式和條件的描述，可以參見，例如Harlow & Lane所著《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Antibodies，A Laboratory Manual(1988)))。
“腫瘤細(xì)胞”包括腫瘤中的癌前期細(xì)胞、癌細(xì)胞以及正常細(xì)胞。
組織培養(yǎng)物中的“癌細(xì)胞”、“轉(zhuǎn)化的”細(xì)胞或“轉(zhuǎn)化”是指自發(fā)或誘導(dǎo)的、不必要包括新的遺傳材料的攝取的表型改變。雖然轉(zhuǎn)化可以用轉(zhuǎn)化病毒感染和新的基因組DNA的合并或外源DNA的攝取產(chǎn)生，也可以自發(fā)地或與致癌試劑接觸后從而使內(nèi)源基因發(fā)生突變產(chǎn)生。在本發(fā)明中，轉(zhuǎn)化通常與Wnt和/或Frizzled蛋白的過表達(dá)相關(guān)。轉(zhuǎn)化與其他諸如細(xì)胞永生化、異常生長(zhǎng)調(diào)控、非形態(tài)學(xué)變化和/或惡性等表型改變(參見Freshney所著《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)技術(shù)手冊(cè)》第3版(Culture of Animal Cellsa Manual of Basic Technique(第三版，1994))。
附圖簡(jiǎn)述

圖1說明在多種人類癌細(xì)胞系中抗Wnt-1或抗Wnt-2抗體特異性誘導(dǎo)凋亡。
圖2說明抗Wnt抗體處理后凋亡細(xì)胞死亡的部分(％)。
圖3A說明在多種癌細(xì)胞系中抗Wnt抗體誘導(dǎo)的凋亡與Wnt表達(dá)相關(guān)。圖3B說明Wnt封閉肽對(duì)抗Wnt抗體誘導(dǎo)的凋亡的影響。
圖4顯示肺癌細(xì)胞系中抗Wnt抗體誘導(dǎo)的凋亡的時(shí)間進(jìn)程(圖4A)和劑量進(jìn)程(圖4B)。
圖5顯示體外實(shí)驗(yàn)中抗Wnt-1單克隆抗體在不同人類癌細(xì)胞系中誘導(dǎo)凋亡。a.對(duì)照抗體或抗Wnt-1單克隆抗體處理后，0.5％結(jié)晶紫對(duì)癌細(xì)胞MCF-7(上面兩行)染色約48小時(shí)以及對(duì)H460(下面兩行)染色約72小時(shí)。使用的對(duì)照或抗Wnt-1抗體濃度從左至右分別是0.0、1.0和10.0微克/毫升。b.使用流式細(xì)胞儀的凋亡分析實(shí)例。從上到下，H460分別用5.0微克/毫升對(duì)照抗體、1.0微克/毫升和5.0微克/毫升抗Wnt-1抗體處理約72小時(shí)。FL1-H代表Annexin V-FITC染色，F(xiàn)L3-H代表碘化丙啶(PI)染色。c.H460和MCF-7癌細(xì)胞對(duì)單克隆抗體處理的劑量反應(yīng)。H460孵育72小時(shí)、MCF-7孵育48小時(shí)后進(jìn)行測(cè)量。方框(□)和圓圈(○)分別代表用抗Wnt-1單克隆抗體處理的MCF-7和H460細(xì)胞中細(xì)胞死亡的部分。菱形(◇)和三角形(△)分別代表用對(duì)照抗體處理的MCF-7和H460細(xì)胞中細(xì)胞死亡的部分。結(jié)果是平均值±SD(誤差柱)。
圖6A-6C說明抗Wnt-1單克隆抗體在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)。
圖7顯示了由SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO9中所列肽序列產(chǎn)生的單克隆抗體重鏈和輕鏈區(qū)序列。
圖8顯示ΔPDZ-Dvl在體內(nèi)抑制間皮瘤細(xì)胞的腫瘤形成。ΔPDZ-Dvl轉(zhuǎn)染的惡性胸膜間皮瘤LRK1A和REN細(xì)胞與空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照相比不能在皮下(s.c.)注射裸鼠后生長(zhǎng)。結(jié)果是每組5只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的平均值±SD(誤差柱)。
圖9顯示Dvl siRNA對(duì)NCI-HI703生長(zhǎng)的抑制。細(xì)胞(3×104)平鋪在24-23ll平板上并用Dvl siRNA(方框)或?qū)φ誷iRNA(圓圈)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，每24小時(shí)通過胰蛋白酶化收集生存的細(xì)胞(臺(tái)盼藍(lán)不相容試驗(yàn)，trypan blue exclusion)并計(jì)數(shù)。特別地，轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到顯著抑制(P＜0.05)。
圖10說明Wnt信號(hào)拮抗劑FRP或DKK的過表達(dá)在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。
發(fā)明詳述本發(fā)明是建立在Wnt-Fz信號(hào)途徑在腫瘤形成中發(fā)揮作用這一發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上的。已知在腫瘤中Wnt蛋白經(jīng)常具有高表達(dá)水平。然而，關(guān)于在癌癥中細(xì)胞死亡機(jī)器的Wnt-Fz信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)修飾知之甚少。本發(fā)明公開提供了Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑可以在多種癌細(xì)胞中誘導(dǎo)顯著凋亡的證據(jù)。本發(fā)明可用于任何其中Wnt-Fz信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響癌細(xì)胞生長(zhǎng)或生存的癌癥。本發(fā)明可用于治療諸如乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、肉瘤、間皮瘤、前列腺癌、胰腺癌、宮頸癌、卵巢癌、胃癌、食道癌、頭頸癌、肝細(xì)胞癌、黑素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤或成膠質(zhì)細(xì)胞瘤等癌癥。
這里顯示，封閉Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致Wnt-Fz途徑下游成分的下調(diào)，尤其是Dishevelled(Dvl)和β聯(lián)蛋白。這里提供的證據(jù)也說明，抗體誘導(dǎo)的凋亡通過激活JNK、從線粒體向細(xì)胞質(zhì)釋放Smac/Diablo和細(xì)胞色素C得以發(fā)生。細(xì)胞色素C滅活存活蛋白(survivin，一種凋亡抑制劑)，這導(dǎo)致胱冬酶的活化。本發(fā)明公開進(jìn)一步提供了單克隆抗Wnt-1抗體能夠在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)的證據(jù)。
WNT和Frizzled蛋白抗體如上所述，本發(fā)明提供了抑制癌細(xì)胞中Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法。在本發(fā)明的有些實(shí)施方式中，使用抗體以阻礙Wnt配體與Frizzled受體之間的結(jié)合?？梢陨a(chǎn)針對(duì)Wnt或Frizzled蛋白的抗體。
對(duì)于精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，制備多克隆抗體的方法是已知的(例如，Coligan，同上；Harlow & Lane，同上)。多克隆抗體可以在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生，例如，通過一次或多次注射免疫試劑和(如果需要)佐劑。典型地，免疫試劑和/或佐劑能通過多次皮下或腹膜內(nèi)注射方式注射入哺乳動(dòng)物。免疫試劑可以包括由預(yù)計(jì)的核酸所編碼的蛋白或其片段或其融合蛋白。所述免疫試劑與已知在免疫的哺乳動(dòng)物中具有免疫原性的蛋白質(zhì)偶聯(lián)可能是有用的。這樣的免疫原性蛋白的例子包括但不限于鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白以及大豆胰蛋白酶抑制劑?？梢允褂玫淖魟┑睦影ǜナ贤耆魟┖蚆PL-TDM佐劑(單磷酰基脂A，合成的海藻糖二白喉菌鹽(trehalose dicorynomycolate)。免疫方案可以由精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員無需過分實(shí)驗(yàn)進(jìn)行選擇。
另外，抗體可以是單克隆抗體。單克隆抗體可以使用諸如Kohler & Milstein，Nature256495(1975)中所描述的雜交瘤方法制備。在雜交瘤方法中，小鼠、倉鼠或其他合適的宿主動(dòng)物通常用免疫試劑免疫以誘導(dǎo)產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生與免疫試劑特異性結(jié)合的抗體的淋巴細(xì)胞。另外，所述淋巴細(xì)胞可以在體外進(jìn)行免疫。所述免疫試劑典型地應(yīng)包括由表1-16的核酸編碼的多肽或其片段或其融合蛋白。通常，使用外周血淋巴細(xì)胞(PBL)，如果需要人源細(xì)胞，或是使用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞，如果需要非人源的哺乳動(dòng)物來源。所述淋巴細(xì)胞隨后與永生細(xì)胞系通過使用適當(dāng)?shù)娜诤蟿?如聚乙二醇)融合以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding所著《單克隆抗體原則與實(shí)踐》(MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practice)，59-103頁，1986)。永生化細(xì)胞通常是轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，尤其是嚙齒類、牛和人源的骨髓瘤細(xì)胞。經(jīng)常采用大鼠或小鼠的骨髓瘤細(xì)胞系。雜交瘤細(xì)胞可以在適當(dāng)?shù)?、?yōu)選包含一種或多種抑制未融合的永生化細(xì)胞的生長(zhǎng)或生存的試劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。例如，如果親本細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤培養(yǎng)基通常應(yīng)包含次黃嘌呤、氨喋呤和胸苷(“HAT”培養(yǎng)基)，這些試劑阻礙HGPRT缺失細(xì)胞的生長(zhǎng)。
在一些實(shí)施方式中，使用了單克隆抗體。優(yōu)選的實(shí)施方式是結(jié)合如實(shí)施例11中所述的單克隆抗體相同表位的單克隆抗體。特定抗體與另一種抗體識(shí)別相同表位的能力通常是通過一種抗體競(jìng)爭(zhēng)性抑制第二種抗體與抗原結(jié)合的能力確定的。任何一種競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)試法可以用于測(cè)量?jī)煞N抗體之間對(duì)相同抗原的競(jìng)爭(zhēng)。例如，為此目的可以使用ELISA夾心法。這通過使用一種捕獲抗體來包被反應(yīng)池表面進(jìn)行。隨后在捕獲表面上添加亞飽和濃度的標(biāo)記抗原。這種蛋白會(huì)通過特異性抗體/表位相互作用與抗體結(jié)合。洗滌后，在ELISA中添加第二種以與可檢測(cè)部分(例如，HRP，標(biāo)記的抗體被定義為檢測(cè)抗體)共價(jià)連接的第二種抗體。如果這種抗體識(shí)別與捕獲抗體相同的表位，由于該特定表位不再用于結(jié)合，它將不能結(jié)合靶蛋白。如果第二種抗體識(shí)別靶蛋白上不同的表位，它應(yīng)能結(jié)合并且可以通過使用相關(guān)底物對(duì)活性水平(由結(jié)合的抗體產(chǎn)生)定量而檢測(cè)這一結(jié)合。本底通過使用既作為捕獲抗體又作為檢測(cè)抗體的單一的抗體進(jìn)行定義，其中最大信號(hào)可以通過用抗原特異性抗體捕獲并用針對(duì)抗原上標(biāo)簽的抗體檢測(cè)得以確立。通過使用本底和最大信號(hào)作為參照，抗體可以以成對(duì)方式進(jìn)行評(píng)估以確定表位特異性。
第一種抗體被認(rèn)為競(jìng)爭(zhēng)性抑制第二種抗體的結(jié)合，如果使用上述任何檢測(cè)方法，在第一種抗體存在的條件下，第二種抗體與抗原的結(jié)合降低了至少30％，通常至少約40％、50％、60％或75％，并且經(jīng)常至少約90％。
在有些實(shí)施方式中，本發(fā)明中的單克隆抗Wnt-1抗體與人Wnt-1的氨基酸201-212(HNNEAGRTTVFS)、人Wnt-1的氨基酸39-52(NVASSTNLLTDSKS)、或人Wnt-2的氨基酸49-63(SSQRQLCHRHPDVMR)結(jié)合。例如，這樣的單克隆抗體可能具有如圖7中所示VH和VL鏈的抗體的結(jié)合特異性(也就是說，在這一上下文中，具有相同CDR或幾乎相同的CDR)。本發(fā)明中的抗體因而可以含如圖7中所示VH或VL序列的CDR以及此外可以與所述VH或VL序列至少80％相同、優(yōu)選85％、90％或95％相同。例如，在特定的實(shí)施方式中，抗體可以含圖7的VH和VL序列的CDR以及人骨架區(qū)序列。
在有些實(shí)施方式中，Wnt或Frizzled蛋白抗體是嵌合的人源化抗體。如上所述，人源化形式的抗體是嵌合的免疫球蛋白，其中來自人類抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)殘基被來自如小鼠、大鼠或兔等非人種屬的具有需要的特異性、親和力和能力的CDR的殘基所取代。
人抗體可以使用本領(lǐng)域已知的、包括噬菌體展示文庫(Hoogenboom & Winter，J.Mol.Biol.227381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.222581(1991))的多種技術(shù)生產(chǎn)。Cole等和Boerner等所述的技術(shù)也可以用于人單克隆抗體的制備(Cole等所著《單克隆抗體與癌癥治療》第77頁(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，p.77(1985))以及Boerner等，J.Immunol.147(1)86-95(1991))。類似地，人抗體可以通過在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如其中內(nèi)源的免疫球蛋白基因已被部分或完全滅活的小鼠)內(nèi)導(dǎo)入人免疫球蛋白座位生產(chǎn)。面對(duì)挑戰(zhàn)，觀察到包括基因重排、裝配和抗體儲(chǔ)備的人抗體產(chǎn)生，這非常類似于人體內(nèi)發(fā)生的過程。這一方法在例如美國(guó)專利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016和以下科學(xué)出版物Marks等，Bio/Technology 10779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368856-859(1994)；Morrison，Nature 368812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14826(1 996)；Lonberg & Huszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)中進(jìn)行了描述。
在一些實(shí)施方式中，所述抗體是單鏈Fv(scFv)。scFv抗體的VH和VL區(qū)包括經(jīng)折疊以形成類似于在雙鏈抗體中所見的抗原結(jié)構(gòu)域的一條單鏈。一旦折疊，非共價(jià)相互作用穩(wěn)定單鏈抗體。雖然有些抗體實(shí)施方式的VH和VL區(qū)可以直接連接在一起，精通本領(lǐng)域的人員能認(rèn)識(shí)到，所述區(qū)域可以被由一個(gè)或多個(gè)氨基酸構(gòu)成的肽連接物隔開。肽連接物及其使用是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的。參見，例如Huston等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 85879(1988)；Bird等，Science 2424236(1988)；Glockshuber等，Biochemistry291362(1990)；美國(guó)專利4,946,778和5,132,405以及Stemmer等，Biotechniques14256-265(1993)。所述肽連接物除了連接所述區(qū)域或保持VH和VL之間一些最小距離或其他空間關(guān)系外通常不會(huì)具有特異的生物學(xué)活性。然而，可以選擇構(gòu)成肽連接物的氨基酸以影響這一分子的某些性質(zhì)(如折疊、凈電荷或疏水性)。單鏈Fv(scFv)抗體可選擇性地包含長(zhǎng)度不多于50個(gè)氨基酸、通常不多于40個(gè)氨基酸、優(yōu)選不多于30個(gè)氨基酸、更優(yōu)選不多于20個(gè)氨基酸的肽連接物。在有些實(shí)施方式中，肽連接物是序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser的串聯(lián)體，優(yōu)選是2、3、4、5、6個(gè)這樣的序列。然而，需要認(rèn)識(shí)到，在連接物內(nèi)部可以進(jìn)行有些氨基酸的置換。例如，纈氨酸可以置換成甘氨酸。
制備scFv抗體的方法已有描述。參見Huse等，同上；Ward等，同上；以及Vaughan等，同上。簡(jiǎn)而言之，分離來自免疫動(dòng)物的B細(xì)胞的mRNA并制備cDNA。使用針對(duì)免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)的引物擴(kuò)增所述的cDNA。純化PCR產(chǎn)物并連接核酸序列。如果需要肽連接物，在重鏈和輕鏈核酸序列之間插入編碼肽的核酸序列。編碼scFv的核酸插入載體并在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)。特異性結(jié)合所需抗原的scFv通常通過噬菌體展示文庫的篩選發(fā)現(xiàn)。篩選可以通過幾種方法中的任何一種進(jìn)行。篩選可以便利地通過使用在其表面表達(dá)所需抗原的細(xì)胞或使用用所需抗原包被的固體表面進(jìn)行。方便地，所述表面可以是一種磁珠。未結(jié)合的噬菌體從固體表面上洗去并洗脫結(jié)合的噬菌體。
無論選擇的篩選方法，由噬菌體展示提供的基因型和表型之間的物理聯(lián)系使其能用于測(cè)試cDNA文庫每個(gè)成員與抗原的結(jié)合，即便對(duì)于巨大的克隆文庫而言。
在有些實(shí)施方式中，所述抗體是雙特異性抗體。雙特異性抗體是具有針對(duì)至少兩種不同抗原的結(jié)合特異性或具有針對(duì)相同抗原上兩個(gè)表位的結(jié)合特異性的單克隆的、優(yōu)選是人源或人源化的抗體。在一種實(shí)施方式中，所述結(jié)合特異性之一是針對(duì)Wnt或Frizzled蛋白的，另一種針對(duì)另一種癌抗原。另外，四聚物類技術(shù)可以創(chuàng)建多價(jià)試劑。
在有些實(shí)施方式中，所述抗體與效應(yīng)部分偶聯(lián)。效應(yīng)部分可以是任何數(shù)量的分子，包括如放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記的標(biāo)記部分，或可以是治療部分。如果效應(yīng)部分是治療部分，通常會(huì)是細(xì)胞毒性試劑。在這種方法中，向癌細(xì)胞引導(dǎo)細(xì)胞毒性試劑導(dǎo)致靶細(xì)胞的定向殺傷。這種實(shí)施方式通常使用Frizzled受體的抗體實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞毒試劑是多變的并包括但不限于細(xì)胞毒藥物或毒素或這樣的毒素的活性片段。適當(dāng)?shù)亩舅丶捌湎鄳?yīng)片段包括白喉毒素A鏈、外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、瀉果素、巴豆毒素、酚霉素、依諾霉素、auristatin等。細(xì)胞毒試劑也包括通過放射性同位素與Wnt或Frizzled蛋白抗體偶聯(lián)、或放射性核素與已經(jīng)共價(jià)連接抗體的螯合劑結(jié)合制備的放射性化合物。
本發(fā)明中抗體的結(jié)合親和力靶抗原的結(jié)合親和力典型地通過諸如Biacore競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)、飽和檢測(cè)、或如ELISA或RIA等免疫檢測(cè)等常規(guī)的抗體-抗原檢測(cè)方法測(cè)量或確定。
這樣的測(cè)試法可以用于測(cè)定抗體的解離常數(shù)。短語“解離常數(shù)”是指抗體對(duì)抗原的親和力?？贵w和抗原之間存在結(jié)合的特異性，如果抗體的解離常數(shù)(KD＝1/K，其中K是親和常數(shù))＜1μM，優(yōu)選＜100nM，最優(yōu)選＜0.1nM?？贵w分子通常應(yīng)具有較低區(qū)間內(nèi)的KD值。KD＝[Ab-Ag]/(Aberle等，EMBO Journal，163797-3804(1997))，其中[Ab]是抗體的平衡濃度，[Ag]是抗原的平衡濃度，[Ab-Ag]是抗體-抗原復(fù)合物的平衡濃度。典型地，抗原和抗體之間的結(jié)合相互作用包括可逆的非共價(jià)結(jié)合，例如靜電吸引、范德華力和氫鍵。
本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合Wnt或Frizzled蛋白。這里的“特異性結(jié)合”意味著抗體以至少約0.1mM、更經(jīng)常地至少約1μM、優(yōu)選至少約0.1μM或更低、最優(yōu)選以0.01μM或更低的KD值與蛋白結(jié)合。
診斷測(cè)試法本發(fā)明也提供了用于檢測(cè)Wnt或Frizzled蛋白過表達(dá)的診斷測(cè)試法。如上所述，這些基因的過表達(dá)可用于鑒別癌細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，感興趣的Wnt或Frizzled基因的活性通過測(cè)量基因轉(zhuǎn)錄本(例如mRNA)、測(cè)量翻譯的蛋白質(zhì)數(shù)量或測(cè)量基因產(chǎn)物的活性確定。
使用核酸雜交技術(shù)檢測(cè)和/或定量基因轉(zhuǎn)錄本(mRNA或cDNA)的方法對(duì)于精通本領(lǐng)域的人員來說是已知的。例如，Northern印跡轉(zhuǎn)移是估計(jì)mRNA存在、缺失或?qū)ζ涠康囊环N方法。
探針可以是編碼蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)核酸序列或小于全長(zhǎng)的核酸序列。較短的探針經(jīng)驗(yàn)性地測(cè)試其特異性。優(yōu)選的核酸探針長(zhǎng)度為20個(gè)堿基或更長(zhǎng)。雜交部分的顯影允許對(duì)mRNA的存在或缺失進(jìn)行定量確定。
在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄本(例如mRNA)可以使用如上所述基于擴(kuò)增(例如PCR)的方法測(cè)量從而直接估算DNA拷貝數(shù)。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄本水平通過使用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)估算。
Wnt或Frizzled基因的“活性”也可以通過檢測(cè)或定量表達(dá)的多肽進(jìn)行檢測(cè)和定量。多肽可以通過對(duì)于精通本領(lǐng)域人員來說所熟知的任何方法進(jìn)行檢測(cè)和定量。這可以包括如電泳、毛細(xì)管電泳、高效液相色譜(HPLC)、薄層層析(TLC)、超擴(kuò)散層析等等分析生物化學(xué)方法。分離的蛋白質(zhì)也可以按照常規(guī)技術(shù)測(cè)序以鑒別多態(tài)性。
使用任何熟知的免疫結(jié)合測(cè)試法(參見，例如美國(guó)專利4,366,241；4,376,110；4,517,288和4,837,168)，本發(fā)明的抗體也可以用于檢測(cè)Wnt或Frizzled蛋白，或表達(dá)它們的細(xì)胞。至于通用免疫測(cè)試法的回顧，也可參見Asai主編的《細(xì)胞生物學(xué)方法》第37卷(Methods in Cell Biology，卷37，Asai編，Academic Press，Inc.New York(1993))和Stites & Terr主編的《基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)》第7版(Basic and Clinical Immunology，第7版，Stites & Terr編，(1991))。
這樣，本發(fā)明提供了對(duì)過表達(dá)Wnt或Frizzled蛋白的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)的方法。在一種方法中，對(duì)受試者進(jìn)行活組織切片并在體外檢測(cè)收集的組織。組織或來自組織的細(xì)胞隨后與本發(fā)明的抗Wnt或抗Frizzled蛋白抗體接觸。任何形成的免疫復(fù)合物表明在活組織切片樣品中存在靶蛋白。為了便于這樣的檢測(cè)，所述抗體可以放射性標(biāo)記或與作為可檢測(cè)標(biāo)記(如放射性標(biāo)記)的效應(yīng)分子偶聯(lián)。在另一種方法中，使用典型的成像系統(tǒng)可以在體內(nèi)檢測(cè)所述細(xì)胞。隨后，標(biāo)記物的定位通過任何已知的檢測(cè)標(biāo)記物的方法確定?？梢允褂靡环N顯現(xiàn)診斷成像的常規(guī)方法。例如，順磁性放射性同位素可以用于核磁共振成像?？贵w的內(nèi)化可能對(duì)于延伸其在有機(jī)體內(nèi)相對(duì)通過胞外結(jié)合所提供的壽命是重要的，后者會(huì)對(duì)由與循環(huán)清除相連的細(xì)胞外酶環(huán)境介導(dǎo)的清除敏感。
WNT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的鑒別在藥物篩選測(cè)試法中可以使用Wnt或Frizzled蛋白(或表達(dá)它們的細(xì)胞)或Wnt信號(hào)途徑的成員(例如Dvl)以鑒別抑制Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的試劑。因而本發(fā)明提供了篩選抑制癌癥的組合物的新方法。
Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的測(cè)試法可設(shè)計(jì)為檢測(cè)和/或定量Wnt信號(hào)途徑的任何部分。例如可以測(cè)量一種試劑影響細(xì)胞內(nèi)β聯(lián)蛋白水平或在靶細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的能力。下面描述了適于這些目的的測(cè)試法。
測(cè)試法可以包括那些用于測(cè)試與Wnt配體、Frizzled受體、或Wnt信號(hào)級(jí)聯(lián)另一成員(例如Dvl)結(jié)合活性的方法。這些測(cè)試法在鑒別調(diào)控Wnt活性的試劑中尤其有用。事實(shí)上在這樣的測(cè)試法中可以檢測(cè)任何試劑。這樣的試劑包括但不限于天然或合成多肽、抗體、天然或合成小有機(jī)分子、核酸等等。
如上所述，分泌型Frizzled相關(guān)蛋白(sFRP)家族通過與Frizzled受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分泌型Wnt配體作為Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的可溶內(nèi)源性調(diào)控子發(fā)揮作用。因而，在有些形式上，戴車試劑基于Frizzled受體的天然配體(例如，Wnt配體或sFRP)。
任何檢測(cè)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的測(cè)試法滿足高通量篩選。高通量測(cè)試法、結(jié)合測(cè)試法和報(bào)道基因測(cè)試法是同樣熟知的。因此，例如，美國(guó)專利5,559,410公開了蛋白質(zhì)的高通量篩選方法，美國(guó)專利5,585,639公開了篩選核酸結(jié)合的高通量方法(即陣列)，而美國(guó)專利5,576,220和5,541,061公開了篩選配體/抗體結(jié)合的高通量方法。
除此之外，高通量篩選系統(tǒng)可通過商業(yè)獲得(例如可見Zymark Corp.，Hopkinton，MA；Air Technical Industries，Mentor，OH；Beckman Instruments，Inc.Fullerton，CA；Precision Systems，Inc.，Natick，MA等等)。這些系統(tǒng)通常實(shí)現(xiàn)包括全部樣品和試劑的移液、液體分配、定時(shí)孵育以及在適于測(cè)試法的探測(cè)器中微平板的最終讀數(shù)在內(nèi)的整個(gè)步驟自動(dòng)化操作。這些可配置的系統(tǒng)提供了高通量和快速啟動(dòng)以及高度的適應(yīng)性和定制化。這樣的系統(tǒng)的制造商提供了多種高通量系統(tǒng)的詳細(xì)方案。因而，例如，Zymark Corp.提供了描述用于檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、配體結(jié)合等等的篩選系統(tǒng)的技術(shù)公報(bào)。
可用于本發(fā)明的其他測(cè)試法是那些為檢測(cè)癌細(xì)胞的腫瘤表型而設(shè)計(jì)的方法。這些測(cè)試法包括在細(xì)胞軟瓊脂上生長(zhǎng)；錨著依賴性；生長(zhǎng)的接觸抑制及密度限制；細(xì)胞增殖；細(xì)胞死亡(凋亡)；細(xì)胞轉(zhuǎn)化；生長(zhǎng)因子或血清依賴；腫瘤特異標(biāo)志水平；重組基質(zhì)膠(Matrigel)入侵；體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；經(jīng)歷轉(zhuǎn)移的細(xì)胞中mRNA和蛋白表達(dá)以及其他癌細(xì)胞特征。
待測(cè)試劑抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的能力也可以通過將待測(cè)試劑導(dǎo)入動(dòng)物疾病模型并評(píng)估體內(nèi)癌細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)行評(píng)估。例如，可以將人腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入如“裸鼠”等免疫損害動(dòng)物。將待測(cè)試劑(例如小分子或抗體)對(duì)動(dòng)物給藥并將腫瘤細(xì)胞形成腫瘤的能力(通過在動(dòng)物中形成的腫瘤的數(shù)量和大小進(jìn)行評(píng)估)與沒有接觸該試劑的對(duì)照動(dòng)物中的腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)行比較。
基因表達(dá)的抑制劑本發(fā)明的一個(gè)方面，Wnt信號(hào)途徑的抑制劑(例如Dvl抑制劑)可以包括抑制所述途徑中靶蛋白表達(dá)的核酸分子。可以使用常規(guī)的病毒或非病毒基因轉(zhuǎn)移方法向哺乳動(dòng)物細(xì)胞或目標(biāo)組織導(dǎo)入編碼設(shè)計(jì)的多肽(例如該蛋白的顯性陰性形式)的核酸或另外的核酸(例如諸如siRNA或反義RNA等靶蛋白表達(dá)的抑制劑)。非病毒載體轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)包括DNA質(zhì)粒、裸DNA以及與如脂質(zhì)體等轉(zhuǎn)運(yùn)工具復(fù)合的核酸。病毒載體轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)包括DNA和RNA病毒，它們?cè)谵D(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中后具有游離的或整合的基因組。至于基因治療過程的回顧，參見Anderson，Science 256808-813(1992)；Nabel &Feigner，TIBTECH 11211-217(1993)；Mitani & Caskey，TIBTECH 11162-166(1993)；Dillon，TIBTECH 11167-175(1993)；Miller，Nature 357455-460(1992)；Van Brunt，Biotechnology 6(10)1149-1154(1988)；Vigne，Restorative Neurology and Neuroscience835-36(1995)；Kremer & Perricaudet，British Medical Bulletin 51(1)31-44(1995)；Doerfler和Bohm主編的《微生物學(xué)和免疫學(xué)現(xiàn)有主題》(Current Topics in Microbiologyand Immunology)一書中Haddada等所著章節(jié)(1995)以及Yuetal，Gene Therapy 113-26(1994)。
在有些實(shí)施方式中，使用了小分子干擾RNA。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，長(zhǎng)的雙鏈RNA(＞30核苷酸)的導(dǎo)入經(jīng)常引起有效的抗病毒反應(yīng)，表現(xiàn)為蛋白合成的非特異性抑制和RNA降解。RNA干擾現(xiàn)象在例如Bass，Nature 411428-29(2001)；Elbahir等，Nature 411494-98(2001)；以及Fire等，Nature 391806-l1(1998)中進(jìn)行了描述和討論，其中也探討了制備干擾RNA的方法。siRNA抑制劑小于100個(gè)堿基對(duì)，通常30bp或更短，并通過本領(lǐng)域已知的手段制備。按照本發(fā)明的示例性的siRNA可以具有直到29bp、25bp、22bp、21bp、20bp、15bp、5bp或任何在其附近或在其之間的長(zhǎng)度。
非病毒轉(zhuǎn)運(yùn)方法本發(fā)明的編碼設(shè)計(jì)的多肽的核酸的非病毒轉(zhuǎn)運(yùn)方法包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、微注射、基因槍、病毒顆粒、脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、聚陽離子或脂質(zhì)核酸偶合體、裸DNA、人工病毒粒以及DNA的抗原增強(qiáng)攝取。脂轉(zhuǎn)染(Lipofection)在例如美國(guó)專利5,049,386、4,946,787和4,897,355中有所描述，并且脂轉(zhuǎn)染試劑可通過商業(yè)獲得(例如TransfectamTM和LipofectinTM)。適于多核苷酸的有效的受體識(shí)別脂轉(zhuǎn)染的陽離子和中性脂質(zhì)包括Felgner在WO 91/17424和WO 91/16024所述的那些。可以向細(xì)胞(離體給藥)或目標(biāo)組織(體內(nèi)給藥)轉(zhuǎn)運(yùn)。
包括如免疫脂質(zhì)復(fù)合物的脂質(zhì)核酸復(fù)合物的制備對(duì)于精通本領(lǐng)域的人員來說是熟知的(參見例如Crystal，Science 270404-410(1995)；Blaese等，Cancer Gene Ther.2291-297(1995)；Behr等，Bioconjugate Chem.5382-389(1994)；Remy等，BioconjugateChem.5647-654(1994)；Gao等，Gene Therapy 2710-722(1995)；Ahmad等，CancerRes.524817-4820(1992)；美國(guó)專利4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028以及4,946,787)。
病毒轉(zhuǎn)運(yùn)方法使用RNA或DNA病毒系統(tǒng)來運(yùn)送目標(biāo)Wnt途徑蛋白(例如Dvl)抑制劑是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。轉(zhuǎn)運(yùn)這樣的核酸抑制劑的常規(guī)病毒系統(tǒng)可以包括用于基因轉(zhuǎn)移的逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒(lentivirus)、腺病毒、腺相關(guān)病毒以及單純皰疹病毒載體。
在許多基因治療應(yīng)用中，希望基因治療載體以高特異性轉(zhuǎn)運(yùn)到特定組織類型(例如肺癌組織)。病毒載體通常進(jìn)行改造使之通過表達(dá)與病毒外表面上的包膜蛋白融合的配體具有針對(duì)給定的細(xì)胞類型的特異性。選擇具有與在感興趣細(xì)胞類型上已知存在的受體具有親和力的配體。例如，Han等在PNAS929141-9151(1995)中報(bào)道了可以改造小鼠白血病病毒以表達(dá)與gp70融合的人調(diào)蛋白(heregulin)，并且重組病毒感染某些表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體的人乳腺癌細(xì)胞。這一原理可以延伸到其他表達(dá)配體融合蛋白的病毒和表達(dá)受體的靶細(xì)胞對(duì)。例如，可以改造絲狀噬菌體以展示具有針對(duì)事實(shí)上任何選擇的細(xì)胞受體特異性結(jié)合親和力的抗體片段(例如Fab或Fv)。雖然上面的描述主要用于病毒載體，相同的原理可以用于非病毒載體?？梢愿脑爝@樣的載體以包含認(rèn)為有助于被具體靶細(xì)胞攝取的特異攝取序列。
基因治療載體可以通過對(duì)單獨(dú)患者給藥、如下所述典型地通過全身給藥(例如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或顱內(nèi)灌輸)或局部應(yīng)用進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。另外，載體可以離體轉(zhuǎn)運(yùn)給細(xì)胞，比如從單獨(dú)患者移植的細(xì)胞。
對(duì)于精通本領(lǐng)域的人員而言，用于診斷、研究或基因治療的離體細(xì)胞轉(zhuǎn)染(例如，通過將轉(zhuǎn)染細(xì)胞重新輸入宿主有機(jī)體)是熟知的。在有些實(shí)施方式中，細(xì)胞從受試者機(jī)體分離，用抑制劑核酸轉(zhuǎn)染并重新輸回受試者機(jī)體(例如患者)。多種適于離體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型對(duì)于精通本領(lǐng)域的人員來說是熟知的(參見，例如Freshney等所著的《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)技術(shù)手冊(cè)》(Culture of Animal Cells，A Manual of Basic Technique)，第3版，1994))以及為說明如何從患者分離并培養(yǎng)細(xì)胞所引用的參考文獻(xiàn))。
為實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)變異，含治療性核酸的載體(例如，逆轉(zhuǎn)錄蛋白、腺病毒、脂質(zhì)體等等)也可以直接對(duì)有機(jī)體給藥。另外，可以給予裸DNA。通過任何通常用于導(dǎo)入分子以與血液或組織細(xì)胞最終接觸的途徑給藥。對(duì)于精通本領(lǐng)域的人員而言，給予這樣的核酸的適當(dāng)方法是可用的并且熟知的，并且，雖然多種途徑可用于特定組合物的給藥，特定途徑經(jīng)常比其他途徑提供更快捷、更有效的反應(yīng)。
藥學(xué)上可接受的的載體部分由給藥的特定組合物以及用于給予該組合物的特定方法決定。相應(yīng)地，如下所述，存在本發(fā)明的藥物組合物的多種適當(dāng)?shù)膭┬?參見，例如，《雷明頓制藥科學(xué)》(Remington′sd Pharmaceutical Sciences)，第17版，1989))。
在診斷、研究和治療性應(yīng)用中的試劑盒使用如上所述，本發(fā)明提供了某些癌中特定Wnt或Frizzled蛋白過表達(dá)的證據(jù)。因而，可以使用試劑盒來檢測(cè)這里所公開的特定核酸或蛋白質(zhì)。在診斷和研究應(yīng)用中，這樣的試劑盒可以包括任何或全部以下成分檢測(cè)試劑、緩沖液、Wnt特異性或Frizzled蛋白特異性核酸或抗體、雜交探針和/或引物等等。治療性產(chǎn)品可以包含無菌鹽溶液或其他藥學(xué)上可接受的的乳液和懸液基礎(chǔ)。
此外，所述試劑盒可以包括含實(shí)踐本發(fā)明的方法的說明書(即使用方案)在內(nèi)的指導(dǎo)材料。雖然指導(dǎo)材料典型地包括書面或打印材料，但不僅限于此。任何能夠存儲(chǔ)這樣的說明書并能與最終使用者溝通的介質(zhì)都包括在本發(fā)明中。這樣的介質(zhì)包括但不限于電子存儲(chǔ)介質(zhì)(例如磁盤、磁帶、芯片)、光介質(zhì)(例如CD-ROM)等等。這樣的介質(zhì)可以包括提供這樣的指導(dǎo)材料的互聯(lián)網(wǎng)址的地址。
本發(fā)明也提供了用于篩選Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑的試劑盒。這樣的試劑盒可以由易于獲得的材料與試劑進(jìn)行制備。例如，這樣的試劑盒可以包括一種或多種以下材料Wnt或Frizzled多肽或多核苷酸、反應(yīng)試管以及測(cè)試所需要Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能(例如β聯(lián)蛋白水平)的說明書。
治療方法抑制劑給藥抑制Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的試劑(例如抗體)可以通過多種方法給藥，這些方法包括但不限于非經(jīng)腸道的(例如靜脈內(nèi)的、肌內(nèi)的、皮內(nèi)的、腹膜內(nèi)的和皮下途徑)、局部的、口服的、或透皮給藥。這些方法可用于預(yù)防性和/或治療性治療。
如上所述，本發(fā)明的抑制劑可以用于治療與Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的癌癥。用以給藥的組合物一般會(huì)包含溶于藥學(xué)上可接受的的載體(優(yōu)選是水性載體)的抑制劑?？梢允褂枚喾N水性載體，例如緩沖鹽溶液等等。這些溶液是無菌的并通常不含有不需要的試劑。這些組合物可以包含藥學(xué)上可接受的的、接近生理?xiàng)l件所需的輔助試劑，諸如pH調(diào)節(jié)和緩沖試劑、毒性調(diào)節(jié)試劑等等，例如，醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等等。這些劑型中活性試劑的濃度可以變化很大，并且按照選擇的給藥模式和患者需求，主要在液體體積、粘性、體重等基礎(chǔ)上選擇。
因而，用于靜脈內(nèi)給藥的典型的藥物組合物應(yīng)是每位患者每天大約0.1到10毫克。每位患者每天可以給予0.1到大約100毫克的劑量，尤其是當(dāng)對(duì)隱蔽位置給藥并不進(jìn)入血流的情況下，諸如對(duì)體腔或器官內(nèi)腔給藥。在局部用藥中可以使用更高的劑量。對(duì)于精通本領(lǐng)域的人員而言，制備非經(jīng)腸道給藥的組合物的實(shí)際方法是已知的或顯而易見的，并且在如《雷明頓制藥科學(xué)》第15版(Remington′s Pharmaceutical Science，第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania(1980))等出版物上有更詳細(xì)的描述。
取決于給藥方法，所述藥物組合物可以用多種單位劑型給藥。例如，適于口服給藥的單位劑型包括但不限于粉末、片劑、丸、膠囊以及錠劑。需要認(rèn)識(shí)到，抗體在口服給藥條件下應(yīng)受到保護(hù)以免遭消化。這通常通過所述分子與組合物復(fù)合使之對(duì)酸性和酶水解耐受，或通過將所述分子包裝在適當(dāng)?shù)哪褪茌d體(如脂質(zhì)體或保護(hù)屏障)中實(shí)現(xiàn)。保護(hù)試劑免受消化的方法是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的。
含本發(fā)明的抑制劑的組合物(例如抗體)可以為治療性或預(yù)防性治療給藥。在治療性應(yīng)用中，用足以治療或至少部分阻止疾病及其并發(fā)癥的量的組合物對(duì)遭受疾病(例如乳腺癌)折磨的患者用藥。足以實(shí)現(xiàn)這一目的的量被定義為“治療有效劑量”。這一使用的有效量取決于疾病的嚴(yán)重性以及患者的健康綜合狀況。取決于患者需要和耐受的劑量和頻率，組合物可以一次或多次給藥。在任何情況下，所述組合物應(yīng)當(dāng)提供充分?jǐn)?shù)量的本發(fā)明的試劑以對(duì)患者進(jìn)行有效治療。能夠防止或延緩患者中癌癥發(fā)展的抑制劑數(shù)量稱為“預(yù)防性有效劑量”。預(yù)防性治療所需要的特定劑量會(huì)取決于醫(yī)療條件以及患者病史、需要防止的特定癌癥、以及如年齡、體重、性別、給藥途徑、有效性等其他因素。這樣的預(yù)防性治療可以用于，例如先前得過癌癥的患者以防止癌癥的再次發(fā)生，或被懷疑具有發(fā)展癌癥的重要可能性的患者。
對(duì)于本發(fā)明的目的而言，“患者”包括人和其他動(dòng)物，尤其是哺乳動(dòng)物。這樣，所述方法可以用于人類治療和獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，患者是哺乳動(dòng)物、優(yōu)選是靈長(zhǎng)類動(dòng)物，并且在最優(yōu)選的實(shí)施方式中患者是人。
其他已知的癌癥治療方法可以與本發(fā)明的方法組合使用。例如，Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑也可以用于向其他癌癥治療劑(如5FU、長(zhǎng)春堿、放射菌素D、順鉑、氨甲葉酸等等)引導(dǎo)或敏化細(xì)胞。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法可以與放射治療等等一起使用。
在有些情況下，所述抗體屬于當(dāng)與跨膜蛋白復(fù)合時(shí)激活血清補(bǔ)體的亞型，從而介導(dǎo)細(xì)胞毒性或抗原依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)。這樣，通過給予患者抗癌細(xì)胞表面的Frizzled蛋白的抗體可以治療癌癥?？贵w標(biāo)記可以激活輔助毒素、聚集毒素有效荷載或以其他方式提供局部消融細(xì)胞的方法。在這些實(shí)施方式中，所述抗體與效應(yīng)部分偶聯(lián)。效應(yīng)部分可以是任何數(shù)量的分子，包括諸如放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記的標(biāo)記部分，或可以是治療性部分，如細(xì)胞毒試劑。
將Wnt或Frizzled多肽用作疫苗除了用Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑給藥之外，Wnt或Frizzled蛋白或其免疫原性片段可以作為疫苗組合物給藥以激活HTL、CTL以及抗內(nèi)源蛋白的抗體反應(yīng)。這樣的疫苗組合物可以包括，例如，脂化肽(參見例如Vitiello等，(1995)J.Clin.Invest.95341-349)、裝入聚丙交脂-乙交脂(PLG)微球膠囊的肽組合物(參見，例如，Eldridge等，(1991)Molec.Immunol.28287-294；Alonso等(1994)Vaccine 12299-306；Jones等(1995)Vaccine 13675-681)、包含在免疫激活復(fù)合體中的肽組合物(ISCOMS；參見，例如，Takahashi等(1990)Nature 344873-875；Hu等(1998)Clin.Exp.Immunol.113235-243)、多抗原肽系統(tǒng)(MAPs；參見例如Tarn(1988)Proc.Nat′l Acad Set USA855409-5413；Tam(1996)J.Immunol.Methods 19617-32))、病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體(Kaufmann主編的《疫苗發(fā)展概念》(Concepts in Vaccine Development de Gruyter，1996)中379頁P(yáng)erkus等所著的內(nèi)容；Chakrabarti等(1986)Nature 320535-537；Hu等(1986)Nature 320537-540；Kieny等(1986)AIDS Bio/Technology 4790-795；Top等(1971)J.Infect.Dis.124148-154；Chanda等(1990)Virology 175535-547)、病毒或合成來源的顆粒(參見，例如Kofler等(1996)J.Immunol.Methods 19225-35；Eldridge等(1993)Sem.HematoL 3016-24；Falo等(1995)Nature Med.7649-653)。
疫苗組合物經(jīng)常包含佐劑。許多佐劑包含用于保護(hù)抗原免受快速分解代謝的試劑，諸如氫氧化鋁或礦物油，以及免疫應(yīng)答激活劑，諸如脂質(zhì)A、短小棒狀桿菌或結(jié)核分支桿菌來源的蛋白。某些佐劑有可通過商業(yè)獲得，如例如弗氏不完全佐劑和完全佐劑(Difco Laboratories，Detroit，MI)、默克佐劑65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)、AS-2(SmithKline Beecham，Philadelphia，PA)、如氫氧化鋁膠體或磷酸鋁的鋁鹽、鈣鹽、鐵鹽或鋅鹽、?；野彼岬牟豢扇軕乙?、?；?、陽離子或陰離子衍生化的多糖、聚磷脂、生物降解微球、單磷酰基脂質(zhì)A和quil A。諸如GM-CSF、白介素2、7、12及其他類似生長(zhǎng)因子的細(xì)胞因子也可以用作佐劑。
疫苗可以作為核酸組合物給藥，其中給予患者編碼Wnt或Frizzled多肽的DNA或RNA或其片段。參見例如Wolff等(1990)Science 2471465-1468；美國(guó)專利5,580,859、5,589,466、5,804,566、5,739,118、5,736,524、5,679,647；以及WO 98/04720?；贒NA的轉(zhuǎn)運(yùn)技術(shù)的實(shí)例包括“裸DNA”、促進(jìn)(布比卡因、聚合體、肽-介導(dǎo)的)轉(zhuǎn)運(yùn)、陽離子脂質(zhì)復(fù)合物以及顆粒介導(dǎo)的(基因槍)或壓力介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)(參見例如美國(guó)專利5,922,687)。
使用象DNA疫苗的基因的方法是熟知的，并包括將希望的基因或其部分置于可調(diào)控的啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子控制之下使之在患者體內(nèi)表達(dá)。用作DNA疫苗的基因可以編碼全長(zhǎng)Wnt或Frizzled蛋白，或可以編碼所述蛋白的一部分。
在有些實(shí)施方式中，DNA疫苗包括編碼佐劑分子的基因和DNA疫苗。這樣的佐劑分子包括提高針對(duì)DNA疫苗所編碼多肽的免疫原性反應(yīng)的細(xì)胞因子。
為了治療性或預(yù)防性免疫目的，本發(fā)明的肽可以用病毒或細(xì)菌載體表達(dá)。表達(dá)載體的例子包括減毒病毒宿主，如牛痘或鳥痘。這一方法包括使用牛痘病毒，例如，作為表達(dá)編碼Wnt或Frizzled多肽或多肽片段的核苷酸序列的載體。導(dǎo)入宿主之后，重組牛痘病毒表達(dá)免疫原性肽，并由此引起免疫應(yīng)答。例如在美國(guó)專利4,722,848中描述了用于免疫方案的牛痘載體和方法。另一種載體是BCG。在Stover等(1991)Nature 351456-460中描述了BCG載體。多種其他可用于治療性給藥或免疫的載體，例如腺病毒和腺相關(guān)病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒沙門氏菌載體、去毒炭疽毒素載體等等會(huì)是顯而易見的。參見例如Shata等(2000)Mol.Med.Today 666-71；Shedlock等(2000)J.Leukoc.Biol.68793-806；以及Hipp等(2000)In Vivo 14571-85。
實(shí)施例以下實(shí)施例用于舉例說明，而不是限制本發(fā)明。
材料和方法細(xì)胞系人非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞系((NCI-H460，NCI-H838和NCI-A549)、正常肺細(xì)胞系(CCL-75，成纖維細(xì)胞)、人乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7和SKBR-3)、人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480以及人間皮瘤癌細(xì)胞系H28得自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)(Manassas，VA)。其他人類間皮瘤癌細(xì)胞系NCI-H290得自NTH(Frederick，MD)以及REN由賓西法尼亞大學(xué)(University of Pennsylvania，Philadelphia，PA)的Steven Albelda博士的實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。正常的間皮細(xì)胞系LP-9得自哈佛大學(xué)(Harvard University，Boston，MA)的細(xì)胞培養(yǎng)核心機(jī)構(gòu)。人骨肉瘤癌細(xì)胞系Saos-2得自UCSF的細(xì)胞培養(yǎng)機(jī)構(gòu)。小鼠乳腺細(xì)胞系用空載體(C57MG)和用Wnt-1(C57Wnt-1)轉(zhuǎn)染的C57MG由UCSF癌癥中心的Frank McCormick博士的實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。除了CCL-75、LP-9和Saos-2以外，這些細(xì)胞在添加10％胎牛血清、100國(guó)際單位/毫升和100微克/毫升的RPMI1640中培養(yǎng)。CCL-75在添加含2mM L-谷氨酸、1.0mM丙酮酸鈉、0.1mM非必須氨基酸、1.5克/升碳酸氫鈉和10％胎牛血清的Earle BSS的MEM中培養(yǎng)。LP-9在含15％CS加上10納克/毫升EGF加0.4微克/毫升HC的M199中培養(yǎng)。Saos-2在補(bǔ)充了2mM L-谷氨酸和15％胎牛血清的McCoy′s 5a培養(yǎng)基中培養(yǎng)。正常的人小氣管上皮細(xì)胞(SAEC)和支氣管上皮細(xì)胞(BEC)得自Clonetics(Walkersville，MD)并在CloneticsSAGMTMBullet試劑盒中培養(yǎng)。所有細(xì)胞在5％CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。
抗體與細(xì)胞孵育實(shí)驗(yàn)前一天細(xì)胞平鋪于6孔平板上。隨后用含多種濃度抗體的培養(yǎng)基代替正常培養(yǎng)基并在5％CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)細(xì)胞。在不同時(shí)間點(diǎn)使用常規(guī)方案收集細(xì)胞用于進(jìn)一步分析。純化的抗Wnt-1和抗Wnt-2多克隆抗體(羊IgG)得自SantaCruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。作為對(duì)照，在平行實(shí)驗(yàn)中使用了純化的抗SOCS-3(SOCS-3是一種胞質(zhì)蛋白)多克隆抗體(羊IgG，也得自Santa CruzBiotechnology(Santa Cruz，CA))。
Western印跡使用了如以前所述的常規(guī)方案(Yoshikawa等，Nat Genet，2829-35(2001))?？笵vl3、抗存活蛋白以及抗Bcl-2抗體得自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)?？闺锥?、抗胱冬酶9抗體得自O(shè)ncogene(Cambridge，MA)?？功录?dòng)蛋白、抗Smac/Diablo和抗β聯(lián)蛋白抗體得自Cell Signaling Technology，Inc.(Beverly，MA)?？辜?xì)胞色素C抗體得自BD Biosciences?？笰ctive-JNK抗體得自Promega(Madison，WI)。為檢測(cè)β聯(lián)蛋白的變更，制備了胞質(zhì)提取物并如先前所述的進(jìn)行檢驗(yàn)(Wang等，Mol Cell Biol，195923-5929(1999))。
凋亡分析按照生產(chǎn)商的方案，通過胰蛋白酶消化收集細(xì)胞并用Annexin V FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(Oncogene，Cambridge，MA)進(jìn)行染色。隨后，染色的細(xì)胞立即通過流式細(xì)胞儀(FACScan；Decton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lake，NJ)分析。具有暴露的磷脂酰絲氨酸但完整細(xì)胞膜的早期凋亡細(xì)胞與Annexin V-FITC結(jié)合卻排斥碘化丙啶。處于壞死或凋亡后期階段的細(xì)胞用Annexin V-FITC和碘化丙啶兩者均可標(biāo)記。
RNA干擾分析實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)用不含抗生素的新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞平鋪于6孔平板。離子交換HPLC純化的siRNA(Wnt-1 siRNA和非沉默的siRNA對(duì)照，純度＞97％)購自Qiagen-Xeragon(Germantown，Maryland)。凍干的siRNAs溶解于退火緩沖液并再次加熱至95℃1分鐘，隨后37℃溫育1小時(shí)。siRNA分析如對(duì)先前所述的方案((Elbashir等，Methods 26，199-213，2002)進(jìn)行一些改進(jìn)進(jìn)行。siRNA轉(zhuǎn)染以后，在進(jìn)行進(jìn)一步分析之前，平板37℃孵育3到5天。
體內(nèi)腫瘤抑制研究如前一部分所述培養(yǎng)人NSCLC細(xì)胞系H460和人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7。對(duì)5-10周齡的雌性裸鼠的背部區(qū)域注射體積100微升的4×106個(gè)腫瘤細(xì)胞。隨后用100微升體積的單克隆抗Wnt-1抗體、對(duì)照單克隆抗體、或PBS緩沖液腹膜內(nèi)注射動(dòng)物。單克隆抗Wnt-1抗體和對(duì)照單克隆抗體的注射劑量均為50微克。每種注射每周一次。每組由5只小鼠組成。腫瘤大小按照常規(guī)技術(shù)以周間隔進(jìn)行確定。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示的數(shù)據(jù)代表平均值(+S.E.M.)。為比較不同的處理方式和細(xì)胞系，使用了Excel程序中的不配對(duì)T檢驗(yàn)。
結(jié)果實(shí)施例1抗Wnt抗體特異性誘導(dǎo)多種不同人癌細(xì)胞中的凋亡我們檢驗(yàn)了通過使用抗Wnt抗體中和Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是否可以抑制這些癌中的細(xì)胞生存。當(dāng)我們將多種癌細(xì)胞系與抗Wnt-1或Wnt-2抗體(10微克/毫升)孵育約32小時(shí)(我們檢驗(yàn)了3株NSCLC、2株乳腺癌、2株結(jié)腸直腸癌、1株肉瘤和2株間皮瘤細(xì)胞系)，我們發(fā)現(xiàn)除了1株結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系SW480(僅4-8％)之外，兩種抗體均能引起顯著的細(xì)胞死亡(從30％到97％)(圖1)。相反，抗胞質(zhì)蛋白(SOCS3)抗體(10微克/毫升)在絕大部分這些細(xì)胞系中沒有表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性(從4％到45％)(圖1)。有意思地是，沒有一種抗體對(duì)我們檢驗(yàn)的兩株正常細(xì)胞系(一株是正常的肺成纖維細(xì)胞(CCL-75)，另一株是正常的間皮細(xì)胞系(LP-9))具有顯著影響(從2％到8％)(圖1)。
為了確定抗Wnt抗體介導(dǎo)的細(xì)胞死亡是否是由于凋亡的改變，細(xì)胞在抗體處理后用Annexin V-FITC和碘化丙錠(PI)染色32小時(shí)，隨后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡分析。如圖2所示，我們發(fā)現(xiàn)在我們檢驗(yàn)的癌細(xì)胞系中大部分的細(xì)胞死亡是通過凋亡的(從28％到91％)。此外，在兩株正常細(xì)胞系中，抗體孵育后沒有檢測(cè)到凋亡(僅2％到6％)(圖2)。這些結(jié)果表明，通過使用抗Wnt抗體阻礙Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以特異性誘導(dǎo)癌細(xì)胞中但不是正常細(xì)胞中的凋亡。
實(shí)施例2抗Wnt抗體誘導(dǎo)的凋亡與該Wnt表達(dá)相關(guān)為研究抗Wnt抗體誘導(dǎo)的凋亡作用是否與該Wnt蛋白的狀況相關(guān)，我們檢驗(yàn)了我們所測(cè)試的細(xì)胞系中的Wnt的表達(dá)。如圖3A所示，我們發(fā)現(xiàn)在對(duì)抗Wnt-1抗體處理敏感的癌細(xì)胞系中，Wnt-1具有高水平表達(dá)。然而，在對(duì)抗體處理不敏感的正常肺細(xì)胞系CCL-75中(見圖1)，只檢測(cè)到微量Wnt-1表達(dá)。在兩種初級(jí)正常肺細(xì)胞(小氣管上皮細(xì)胞(SAEC)和支氣管上皮細(xì)胞(BEC))(圖3)以及正常的間皮細(xì)胞系(LP-9)(未公開數(shù)據(jù))中沒有檢測(cè)到Wnt-1的表達(dá)。相對(duì)Wnt-2表達(dá)獲得了相似的觀察結(jié)果。
作為對(duì)照，我們檢驗(yàn)了NSCLC細(xì)胞系中抗Wnt抗體與抗Wnt抗體封閉肽共孵育的凋亡誘導(dǎo)。孵育約24小時(shí)后，我們發(fā)現(xiàn)抗Wnt抗體誘導(dǎo)的凋亡可被其封閉肽顯著抑制(P＜0.01)?？偠灾@些結(jié)果表示，抗Wnt抗體誘導(dǎo)的凋亡與我們檢驗(yàn)的細(xì)胞中該Wnt表達(dá)相關(guān)。
實(shí)施例3抗Wnt-1抗體誘導(dǎo)的凋亡是一個(gè)快速過程并是劑量依賴的對(duì)兩種NSCLC細(xì)胞系H838和A549(圖4A和圖4B)，我們進(jìn)行了劑量和時(shí)間進(jìn)程實(shí)驗(yàn)?？筗nt抗體孵育約32小時(shí)后的流式細(xì)胞儀分析說明，1微克/毫升的抗體可以誘導(dǎo)凋亡。20微克/毫升濃度的任一抗體引起顯著的凋亡性細(xì)胞死亡?？筗nt-1抗體(以8微克/毫升的濃度)誘導(dǎo)的凋亡可以最早在6小時(shí)孵育后檢測(cè)到，50小時(shí)孵育后，發(fā)現(xiàn)幾乎所有細(xì)胞經(jīng)受凋亡或壞死。相反，在平行實(shí)驗(yàn)中，參照的抗SOCS3抗體對(duì)那些癌細(xì)胞無效。抗Wnt-1抗體與正常肺細(xì)胞系(CCL-75)孵育也對(duì)時(shí)間或劑量不敏感。
實(shí)施例4抗Wnt抗體誘導(dǎo)的凋亡與Dvl-3和胞質(zhì)β聯(lián)蛋白的下調(diào)相關(guān)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)已證明通過Dvl激活β聯(lián)蛋白/Tcf介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也穩(wěn)定胞質(zhì)β聯(lián)蛋白。這樣，我們測(cè)定了抗Wnt抗體誘導(dǎo)的凋亡是否依賴于Dvl和胞質(zhì)β聯(lián)蛋白的不穩(wěn)定。我們發(fā)現(xiàn)在我們所檢驗(yàn)的癌細(xì)胞系中，抗Wnt抗體處理后Dvl和胞質(zhì)β聯(lián)蛋白水平均顯著下調(diào)。相反，在正常細(xì)胞中，抗Wnt抗體處理后沒有發(fā)現(xiàn)Dvl和胞質(zhì)β聯(lián)蛋白水平的變化。我們也檢測(cè)了用阻礙CK-1活性(導(dǎo)致抑制Dvl活性)的Apigenin處理癌細(xì)胞后的凋亡。Apigenin處理下調(diào)胞質(zhì)β聯(lián)蛋白水平。這些結(jié)果說明，抗Wnt抗體誘導(dǎo)的凋亡至少部分地是通過抑制Wnt/Frizzled信號(hào)途徑下游成分Dvl/β聯(lián)蛋白的功能。
實(shí)施例5抗Wnt抗體通過存活蛋白表達(dá)下調(diào)及隨后的胱冬酶-3活化誘導(dǎo)凋亡接下來，我們檢驗(yàn)了癌細(xì)胞中這一特異的抗Wnt抗體誘導(dǎo)的凋亡的分子機(jī)制。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胱冬酶-9的活化開啟凋亡途徑并且激活的胱冬酶-9通過切割并活化如胱冬酶-3的下游執(zhí)行胱冬酶放大凋亡途徑。存活蛋白(凋亡抑制劑IAP家族成員之一)在抑制胱冬酶-3和胱冬酶-9的活化中發(fā)揮重要作用。在對(duì)抗Wnt抗體處理敏感的癌細(xì)胞中，切割形式的(激活的)胱冬酶-3和胱冬酶-9均被上調(diào)。我們也發(fā)現(xiàn)，在這些細(xì)胞中存活蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。相反，在對(duì)抗Wnt抗體不敏感的正常細(xì)胞系CCL-75中，我們沒有檢測(cè)到兩種切割形式的胱冬酶蛋白的上調(diào)和存活蛋白表達(dá)的下調(diào)。這些結(jié)果表明，抗Wnt抗體通過抑制凋亡抑制劑-存活蛋白并激活胱冬酶-9和胱冬酶-3誘導(dǎo)凋亡。
實(shí)施例6抗Wnt抗體誘導(dǎo)的凋亡與從線粒體向細(xì)胞質(zhì)中釋放Smac/Diablo和細(xì)胞色素C以及JNK活化相關(guān)在凋亡過程中，Smac/Diablo(第2個(gè)線粒體來源的具有低pI值的胱冬酶/直接IAP結(jié)合蛋白的激活劑)功能在于去除IAP介導(dǎo)的胱冬酶抑制。凋亡活化引起Smac/Diablo和細(xì)胞色素C從線粒體的內(nèi)膜空間釋放到細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞色素C直接激活A(yù)paf-1和胱冬酶-9，并且Smac/Diablo與多種IAP相互作用以消除IAP介導(dǎo)的啟動(dòng)胱冬酶和效應(yīng)胱冬酶的抑制。與以上結(jié)果(其中在癌細(xì)胞中但不是在正常細(xì)胞中胱冬酶-3活性提高)相一致，我們發(fā)現(xiàn)抗Wnt抗體處理后，在癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中但不是在正常細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中Smac/Diablo和細(xì)胞色素C的水平提高。我們的結(jié)果表示Smac/Diablo和細(xì)胞色素C可能通過分別消除存活蛋白和/或其他IAP介導(dǎo)的抑制和胱冬酶的直接激活參與抗Wnt抗體誘導(dǎo)的凋亡。
為了進(jìn)一步確定這一特異的抗Wnt抗體誘導(dǎo)的凋亡是如何調(diào)控的，我們檢驗(yàn)了凋亡途徑的其他成分。令人驚訝地，我們發(fā)現(xiàn)處理后的癌細(xì)胞中JNK活性顯著提高。相反，在對(duì)抗Wnt抗體不敏感的正常細(xì)胞系CCL-75中沒有檢測(cè)到JNK活性的提高。我們也發(fā)現(xiàn)了在正常間皮細(xì)胞系中Dvl的過表達(dá)下調(diào)JNK活性。除此以外，通過使用Apigenin以封閉CK-1活性的Dvl的抑制也可以提高JNK活性。綜上所述，抗Wnt抗體誘導(dǎo)的凋亡涉及可能通過滅活Dvl的封閉Wnt信號(hào)途徑后的JNK活化和JNK活性的提高。
實(shí)施例7Wnt-1轉(zhuǎn)染的小鼠乳腺細(xì)胞中抗Wnt抗體特異性誘導(dǎo)凋亡作為參照，由于對(duì)這些細(xì)胞已描述了其游離的β聯(lián)蛋白庫，我們比較了在小鼠C57MG和Wnt-1轉(zhuǎn)染的C57MG細(xì)胞中抗Wnt抗體孵育誘導(dǎo)的凋亡作用。已知在Wnt-1轉(zhuǎn)染的C57MG細(xì)胞中Wnt-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)開啟，但在未轉(zhuǎn)染或空載體轉(zhuǎn)染的C57GM細(xì)胞中關(guān)閉?？筗nt-1抗體孵育42小時(shí)后流式細(xì)胞分析表明在未轉(zhuǎn)染或空載體轉(zhuǎn)染的C57GM細(xì)胞中沒有明顯作用(孵育后少于10％的細(xì)胞死亡)。然而，在Wnt-1轉(zhuǎn)染的C57MG細(xì)胞中觀察到顯著的細(xì)胞死亡(大于85％細(xì)胞死亡，P＜0.001)。
Wnt-1轉(zhuǎn)染的C57MG細(xì)胞中抗Wnt-1誘導(dǎo)的凋亡可能也與Dvl-3和胞質(zhì)β聯(lián)蛋白下調(diào)相關(guān)，并通過存活蛋白表達(dá)下調(diào)和隨后的胱冬酶-3活化，并通過Smac/Diablo及細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞質(zhì)中以及JNK活化。Wnt-1轉(zhuǎn)染的C57MG細(xì)胞系作為我們發(fā)明的理想?yún)⒄漳Ｐ?，這些數(shù)據(jù)為我們?cè)谌税┘?xì)胞中的發(fā)現(xiàn)提供了更多支持。
實(shí)施例8抗Wnt-1單克隆抗體在體外在不同人癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡并在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)產(chǎn)生針對(duì)源自人Wnt-1的肽的抗體。尤其是用序列編號(hào)2和序列編號(hào)4產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞系。一種單克隆抗體針對(duì)對(duì)應(yīng)于人Wnt-1的201-212氨基酸(醋酸鹽-HNNEAGRTTVFS-酰胺)的合成肽產(chǎn)生?？贵w使用蛋白質(zhì)A親和純化。使用這一單克隆抗體評(píng)估了多種人類細(xì)胞系中Wnt-1的表達(dá)。細(xì)胞系包括了3株乳腺癌細(xì)胞系(HuL100、MCF-7和SKBR-3)、5株惡性間皮瘤細(xì)胞系(REN，H513，H290，MS-1，和H28)、4株非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞系(A549，H460，H838，和HI703)、2株肉瘤細(xì)胞系(MES-SA和Saos-2)、1株結(jié)腸癌細(xì)胞系Sw480、以及4株正常細(xì)胞(小氣管上皮細(xì)胞(SAEC)和正常人支氣管上皮細(xì)胞(NHBE)、LP-9和CCL-75)。我們發(fā)現(xiàn)除了不表達(dá)或最低表達(dá)Wnt-1的A549，MES-SA，H513，SKBR-3和SW480之外，在大部分這些細(xì)胞系中Wnt-1表達(dá)水平較高。在兩種初級(jí)正常肺細(xì)胞(SAEC和NHBE)中沒有觀察到Wnt-1表達(dá)。在正常肺成纖維細(xì)胞CCL-75和正常間皮細(xì)胞系(LP-9)中僅檢測(cè)到最低水平的Wnt-1表達(dá)。
作為參照實(shí)驗(yàn)，使用相同的單克隆抗體我們?cè)赪nt-1轉(zhuǎn)染的小鼠乳腺細(xì)胞(C57Wnt-1)、但沒有在空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中(C57mv7)發(fā)現(xiàn)了Wnt-1表達(dá)。
為了測(cè)試所述抗Wnt-1單克隆抗體是否能夠特異性結(jié)合培養(yǎng)的細(xì)胞中的天然形式的Wnt-1，我們單獨(dú)使用單克隆抗體或通過用封閉肽(30倍于抗體量)事先孵育封閉的單克隆抗體在多種細(xì)胞系的細(xì)胞提取物中進(jìn)行了免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。C57Wnt-1和C57mv7細(xì)胞分別作為陽性和陰性對(duì)照。NSCLC(H460)和乳腺癌(MCF-7)細(xì)胞系也進(jìn)行了測(cè)試。C57Wnt-1、H460和MCF-7細(xì)胞中的Wnt-1蛋白與抗Wnt-1單克隆抗體沉淀。相反，當(dāng)抗Wnt-1單克隆抗體與封閉肽事先孵育時(shí)，這些細(xì)胞中所述抗體與Wnt-1蛋白共沉淀的能力受到阻礙。在陰性對(duì)照中，沒有Wnt-1蛋白與單獨(dú)的抗Wnt-1抗體或用封閉肽事先孵育的單克隆抗體共沉淀。這些數(shù)據(jù)說明，所述抗Wnt-1單克隆抗體特異性結(jié)合天然形式的Wnt-1蛋白。
其次，我們用這種單克隆抗體處理了NSCLC細(xì)胞系H460和乳腺癌細(xì)胞系MCF-7。孵育約48-72小時(shí)后，我們?cè)谶@兩種細(xì)胞系中均發(fā)現(xiàn)了明顯的細(xì)胞死亡(在10微克/毫升濃度下大于60％的細(xì)胞死亡，P＜0.001)(圖5A)。然而我們?cè)谟脤?duì)照單克隆抗體處理后的這兩種細(xì)胞系中均沒有看到明顯作用。細(xì)胞損傷很大程度上是由于凋亡的誘導(dǎo)(圖5B)。由這種單克隆抗體誘導(dǎo)的凋亡是劑量和時(shí)間依賴的(H460中10微克/毫升抗體孵育約72小時(shí)后大于60％的細(xì)胞死亡，MCF-7中10微克/毫升抗體孵育約48小時(shí)后大于40％的細(xì)胞死亡)(圖5C)。我們也處理了其他過表達(dá)Wnt-1的癌細(xì)胞系，包括乳腺癌HuL100、NSCLC HI703，間皮瘤H28和REN，以及肉瘤Saos-2。我們發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果。
作為特異性對(duì)照，我們檢驗(yàn)了H460、MCF-7和HI703中通過使用經(jīng)封閉肽(30倍于抗體量)過夜孵育所封閉的單克隆抗體的凋亡誘導(dǎo)。孵育48小時(shí)后，我們發(fā)現(xiàn)抗Wnt-1抗體誘導(dǎo)的凋亡可以被其封閉肽明顯抑制(P＜0.003)。相同劑量的封閉肽單獨(dú)不影響這些細(xì)胞的生存(8.0微克/毫升48小時(shí))。作為陰性對(duì)照，我們使用沒有Wnt-1顯著表達(dá)的A549細(xì)胞。單獨(dú)用單克隆抗體(8.0微克/毫升)或用經(jīng)封閉肽(30倍于抗體)事先孵育而封閉的單克隆抗體處理約48小時(shí)后，沒有檢測(cè)到顯著的凋亡誘導(dǎo)。這一結(jié)果與A549細(xì)胞的Wnt-1表達(dá)狀況一致。
所述抗Wnt-1單克隆抗體抑制Wnt/β聯(lián)蛋白信號(hào)途徑并通過釋放細(xì)胞色素C、存活蛋白表達(dá)下調(diào)和隨后的胱冬酶-3活化誘導(dǎo)凋亡我們發(fā)現(xiàn)，在檢驗(yàn)的癌細(xì)胞中，抗Wnt-1單克隆抗體處理后Dvl-3和胞質(zhì)β聯(lián)蛋白以及Cyclin D1水平下調(diào)。在這些細(xì)胞中我們也進(jìn)行了TOP/FOP試驗(yàn)并發(fā)現(xiàn)，在單克隆抗體處理后，TCF依賴的轉(zhuǎn)錄活性下降。相反，在正常細(xì)胞或缺乏(或具有最低)Wnt-1表達(dá)的癌細(xì)胞中，抗Wnt-1單克隆抗體處理后沒有發(fā)現(xiàn)Dvl、胞質(zhì)β聯(lián)蛋白水平或TCF依賴的轉(zhuǎn)錄活性的改變。這些結(jié)果說明，抗Wnt-1單克隆抗體誘導(dǎo)的凋亡至少部分是通過抑制Dvl/β聯(lián)蛋白依賴的轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的。
在其中抗Wnt-1單克隆抗體誘導(dǎo)凋亡的H460細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)切割(活性)形式的胱冬酶-3上調(diào)。與胱冬酶-3活性一致，我們?cè)诳筗nt-1單克隆抗體處理后H460細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到了增高的細(xì)胞色素C水平。此外，我們發(fā)現(xiàn)，抗體處理后這些H460細(xì)胞中存活蛋白表達(dá)下調(diào)。
其他人已經(jīng)表明，Wnt-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在C57Wnt-1細(xì)胞中開啟，但在C57mv7細(xì)胞中關(guān)閉。作為對(duì)照，我們檢測(cè)了抗Wnt-1單克隆抗體是否能夠抑制C57Wnt-1細(xì)胞中Wnt/β聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。C57mv7的Western印跡分析表明，抗Wnt-1單克隆抗體處理(8.0微克/毫升48小時(shí))后C57Wnt-1細(xì)胞中胞質(zhì)β聯(lián)蛋白和Cyclin D1水平下調(diào)，但在C57mv7細(xì)胞中沒有檢測(cè)到Cyclin D1表達(dá)?？筗nt-1單克隆抗體處理后，C57mv7中胞質(zhì)β聯(lián)蛋白水平也保持不變。一致地，C57Wnt-1細(xì)胞中通過TOP/FOP試驗(yàn)測(cè)得的TCF依賴的轉(zhuǎn)錄活性也降低，但在C57mv7細(xì)胞中保持不變。這些數(shù)據(jù)表明，抗Wnt-1單克隆抗體抑制檢驗(yàn)的細(xì)胞系中的Wnt/β聯(lián)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
RNA干擾我們按照Elbashir等人描述的方案(Elbashir等，Methods 26，199-213，2002)通過使用RNAi來研究沉默Wnt-1表達(dá)的作用。與所述的單克隆抗Wnt-1抗體類似，用Wnt-1 siRNA處理3-5天在表達(dá)Wnt-1的癌細(xì)胞系(如MCF-7細(xì)胞)中誘導(dǎo)凋亡。100nMWnt-1 siRNA誘導(dǎo)明顯凋亡，但非沉默siRNA對(duì)照(100nM)或轉(zhuǎn)染試劑均不能誘導(dǎo)凋亡。通過Western印跡分析(非沉默siRNA作為對(duì)照(100nM 72小時(shí)))我們證實(shí)Wnt-1siRNA處理后(100nM 72小時(shí))Wnt-1表達(dá)的沉默。為了確認(rèn)凋亡作用是否與Wnt-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制相關(guān)，我們也說明了Wnt-1 siRNA處理后Dvl-3、胞質(zhì)β聯(lián)蛋白以及存活蛋白表達(dá)水平下調(diào)。
體內(nèi)癌生長(zhǎng)的抑制隨后我們測(cè)試了所述單克隆抗Wnt-1抗體是否能夠在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)。我們用H460和MCF-7細(xì)胞分別注射裸鼠。動(dòng)物隨后通過每周一次的腹膜內(nèi)注射接受50微克單克隆抗Wnt-1抗體、對(duì)照單克隆抗體或PBS。圖6A顯示，雖然對(duì)照抗體沒有明顯抑制，這樣劑量的單克隆抗Wnt-1抗體顯著抑制所述兩種腫瘤的生長(zhǎng)(P＜0.001)。不僅在腫瘤細(xì)胞接種后立即開始單克隆抗Wnt-1抗體注射的情況下(圖6A)，而且在腫瘤已經(jīng)建立后開始抗體處理的情況下(腫瘤細(xì)胞接種后一周)，均能觀察到腫瘤生長(zhǎng)的抑制(P＜0.005)(圖6B)。在使用MCF-7細(xì)胞的研究中(圖6C)，用抗Wnt-1單克隆抗體和對(duì)照單克隆抗體處理3周后，測(cè)量腫瘤體積。每組中5只動(dòng)物。用抗Wnt-1單克隆抗體注射處理的動(dòng)物沒有發(fā)展出腫瘤。然而，5只對(duì)照動(dòng)物中有3只發(fā)展出腫瘤。(MCF-7細(xì)胞接種一周后腹膜內(nèi)注射每周一次進(jìn)行)。
測(cè)定了上述研究中使用的抗Wnt-1單克隆抗體的VH和VL區(qū)序列。來自雜交瘤細(xì)胞系的CDR和骨架區(qū)通過RT-PCR擴(kuò)增并通過瓊脂糖膠進(jìn)行分析。圖7中顯示了所述VH和VL區(qū)序列。
實(shí)施例9Wnt-2表達(dá)和Wnt-2單克隆抗體誘導(dǎo)的凋亡分析了多種人類腫瘤和相應(yīng)的非腫瘤組織樣品中Wnt-2基因表達(dá)。放射性標(biāo)記的Wnt-2 cDNA探針與含19種不同類型人類腫瘤與相配的非腫瘤組織樣品的癌掃描陣列II(BD Biosciences，Inc.)雜交。與其正常的配對(duì)物相比，Wnt-2主要在結(jié)腸、胃部、直腸和甲狀腺腫瘤中過表達(dá)。
生產(chǎn)了針對(duì)對(duì)應(yīng)于人Wnt-2的49-63氨基酸(SSQRQLCHRHPDVMR)的合成肽的單克隆抗體?？贵w使用蛋白質(zhì)A進(jìn)行親和純化。在人黑素瘤FEMX和LOX細(xì)胞中測(cè)定了Wnt-2單克隆抗體對(duì)凋亡的作用。結(jié)果顯示，抗Wnt-2單克隆抗體在FEMX和LOX人黑素瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。如同實(shí)施例8中的抗Wnt-1單克隆抗體，所述抗體也誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HCT-116和SW480細(xì)胞中的凋亡。
確定了上述研究中使用的抗Wnt-2單克隆抗體的VH和VL區(qū)序列。來自雜交瘤細(xì)胞系的CDR和骨架區(qū)(FR)通過RT-PCR擴(kuò)增并通過瓊脂糖凝膠進(jìn)行分析。圖7中顯示了VH和VL區(qū)的序列。
實(shí)施例10間皮瘤通過Dvl活化具有β聯(lián)蛋白過表達(dá)，并且β聯(lián)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性與腫瘤形成相關(guān)我們進(jìn)一步研究了Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在間皮瘤中的作用。我們發(fā)現(xiàn)，大部分間皮瘤細(xì)胞過表達(dá)Dvl-3。使用western印跡研究了間皮瘤細(xì)胞中Dvl-3和胞質(zhì)β聯(lián)蛋白的表達(dá)。Western印跡分析顯示，與其同源相配的正常胸膜組織對(duì)照相比，10個(gè)新鮮的惡性間皮瘤組織中的8個(gè)過表達(dá)Dvl-3蛋白并具有提高的胞質(zhì)β聯(lián)蛋白。而且，5種檢測(cè)的附加惡性間皮瘤細(xì)胞(兩種初級(jí)惡性胸膜間皮瘤培養(yǎng)細(xì)胞和三種細(xì)胞系LRKIA、REN和H513)與正常胸膜對(duì)照相比，具有高水平的Dvl-3和胞質(zhì)β聯(lián)蛋白。多種腫瘤細(xì)胞的免疫組化分析證明了胞質(zhì)、核及膜結(jié)合β聯(lián)蛋白。我們發(fā)現(xiàn)在13種間皮瘤組織中(包括用western印跡檢測(cè)的病例和兩例惡性滲出病例)β聯(lián)蛋白的外顯子3中沒有突變。選擇外顯子3進(jìn)行突變分析是由于其編碼了β-聯(lián)蛋白的NH2-末端的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，以前發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域含活化突變。此外，在三株間皮瘤細(xì)胞系(LRK1A，REN和H513)中我們?cè)讦?聯(lián)蛋白的完全編碼區(qū)中沒有檢測(cè)到突變。
使用Tcf依賴的熒光素酶報(bào)道基因，也檢驗(yàn)了β-聯(lián)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。使用了western印跡分析以證實(shí)在研究的所有腫瘤中APC、GSK-3β和Tcf4的表達(dá)。由Tcf-β-聯(lián)蛋白復(fù)合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性測(cè)定為顯著過表達(dá)Dvl和胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白的間皮瘤細(xì)胞系中與報(bào)道基因活性的比率。細(xì)胞用pTOPFLASH或pFOPFLASH報(bào)道構(gòu)件瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，這些構(gòu)件在螢火蟲熒光素酶cDNA上游包含多聚體化的野生型或突變體Tcf結(jié)合基序與含海參熒光素酶(Renilla Luciferase)cDNA的pRL-TK內(nèi)參照?qǐng)?bào)道構(gòu)件。Tcf介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄通過24小時(shí)后pTOPFLSH∶pFOPFLLASH熒光素酶活性的比率確定，其中每種活性針對(duì)pRL-TK報(bào)道基因的熒光素酶活性進(jìn)行校正。
包括來自惡性胸膜間皮瘤滲出物的細(xì)胞、LREL1A、REN和H513細(xì)胞系在內(nèi)的具有高水平胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白的間皮瘤細(xì)胞表現(xiàn)出β-聯(lián)蛋白Tcf介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄活性(pTOPFLASH/pFOPFLASH)的顯著倍增(1.5-2.4倍，P＜0.01)。相反，胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白最低表達(dá)的正常的間皮細(xì)胞沒有表現(xiàn)出差異。
根據(jù)在Tcf-β-聯(lián)蛋白介導(dǎo)的報(bào)道檢測(cè)中β-聯(lián)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性(由Gal4-β-聯(lián)蛋白融合蛋白的表達(dá)情況下報(bào)道檢測(cè)所證實(shí))將間皮瘤細(xì)胞分類，分成陽性或陰性轉(zhuǎn)錄活性。在間皮瘤細(xì)胞中，β-聯(lián)蛋白的胞質(zhì)表達(dá)被添加apigenin所抑制但被野生型Dvl增強(qiáng)，apigenin能夠通過酪蛋白激酶II和PDZ-Dvl的降解而降解Dvl。此外，PDZ-Dvl抑制Tcf依賴的轉(zhuǎn)錄活性。PDZ-Dvl的穩(wěn)定表達(dá)抑制具有β-聯(lián)蛋白陽性轉(zhuǎn)錄活性的間皮瘤細(xì)胞的集落形成，而具有β-聯(lián)蛋白陰性轉(zhuǎn)錄活性的間皮瘤細(xì)胞表現(xiàn)出穩(wěn)定的集落形成。我們證實(shí)了Tcf依賴的轉(zhuǎn)錄及Gal4-β-聯(lián)蛋白融合蛋白與間皮瘤細(xì)胞中腫瘤形成的結(jié)果良好相關(guān)。
間皮瘤細(xì)胞中Dvl-3穩(wěn)定胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白。我們通過Western印跡分析已經(jīng)證實(shí)，來自胸膜滲出物的新鮮的惡性間皮瘤細(xì)胞表現(xiàn)出Dvl-3蛋白的過表達(dá)與胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白的表達(dá)。除了含β-聯(lián)蛋白區(qū)純合子缺失的H28細(xì)胞系，所有其他具有Dvl-3高表達(dá)的檢測(cè)的惡性細(xì)胞表現(xiàn)出比來自正常胸膜組織的細(xì)胞顯著更高的胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白表達(dá)。這些結(jié)果說明，間皮瘤細(xì)胞中Dvl-3的激活將胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白從膜轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。
β-聯(lián)蛋白激活間皮瘤細(xì)胞中的Tcf依賴型轉(zhuǎn)錄。由Tcf-β-聯(lián)蛋白復(fù)合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活通過具有顯著過表達(dá)Dvl和胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白的間皮瘤細(xì)胞中與另一種由于純合缺失而缺乏β-聯(lián)蛋白表達(dá)但表達(dá)Dvl的間皮瘤細(xì)胞系(H28)中的報(bào)道基因分析進(jìn)行確定和比較。細(xì)胞用pTOPFLASH或pFOPFLASH報(bào)道構(gòu)件瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，這些構(gòu)件在螢火蟲熒光素酶cDNA上游包含多聚體化的野生型或突變體Tcf結(jié)合基序與含海參熒光素酶(Renilla Luciferase)cDNA的pRL-TK內(nèi)參照?qǐng)?bào)道構(gòu)件。Tcf介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄通過24小時(shí)后pTOPFLSH∶pFOPFLLASH熒光素酶活性的比率確定，其中每種活性針對(duì)pRL-TK報(bào)道基因的熒光素酶活性進(jìn)行校正。高表達(dá)胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白的間皮瘤細(xì)胞、間皮瘤患者的惡性滲出物、LRKIA和REN在pTOPFLASH報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄活性中表現(xiàn)出1.8-2.4倍的提高，H290和H513表現(xiàn)出1.4-1.5倍的提高。相反，不表達(dá)或少量表達(dá)胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白的H28和正常間皮細(xì)胞在pTOPFLASH和pFOPFLASH活性之間沒有表現(xiàn)出差異。這樣的結(jié)果表明，在間皮瘤細(xì)胞中大量的β-聯(lián)蛋白可以作為遞質(zhì)。
Gal4-β-聯(lián)蛋白在間皮瘤細(xì)胞中激活pG5。此外，使用Gal4-β-聯(lián)蛋白構(gòu)件測(cè)量間皮瘤細(xì)胞中β-聯(lián)蛋白調(diào)控的轉(zhuǎn)錄活性以排除間皮瘤細(xì)胞系缺乏所需的轉(zhuǎn)錄機(jī)器的可能性。共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄Gal4-β-聯(lián)蛋白融合蛋白和pG5(CAT報(bào)道構(gòu)件)的pSG424-Gal4-β-聯(lián)蛋白以后，測(cè)定了Gal4-β-聯(lián)蛋白介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄。這些活性按照pG5報(bào)道構(gòu)件的CAT活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以排除活化的本底水平。通過使用標(biāo)簽抗體的Western印跡分析確定Gal4-β-聯(lián)蛋白在所有轉(zhuǎn)染的間皮瘤中表達(dá)。LRKIA、REN和H28在用pSG424-Gal4-β-聯(lián)蛋白和pG5共轉(zhuǎn)染后表現(xiàn)出相較于pG5對(duì)照轉(zhuǎn)染后活性提高了10-25倍。HeLa細(xì)胞表現(xiàn)出25倍的提高。相反，H513表現(xiàn)出數(shù)倍的提高，H290只表現(xiàn)出本底活性。這些高活性證實(shí)，中大量β-聯(lián)蛋白的間皮瘤有助于LRKIA和REN中的轉(zhuǎn)錄活性，但這在H290不可能，即便其具有對(duì)Tcf依賴型轉(zhuǎn)錄的更高活化。
Apigenin誘導(dǎo)Dvl的降解，這導(dǎo)致胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白的穩(wěn)定。Apigenin通過對(duì)乳腺上皮細(xì)胞中酪蛋白激酶II的抑制促進(jìn)Dvl和β-聯(lián)蛋白的降解，這導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制。通過在培養(yǎng)基中添加Apigenin在48小時(shí)的降解Dvl和胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白的處理期間抑制了LRKIA、REN和H290的生長(zhǎng)。這些結(jié)果說明，由酪蛋白激酶II介導(dǎo)的Dvl的激活部分地調(diào)控間皮瘤細(xì)胞中β-聯(lián)蛋白的轉(zhuǎn)移。
PDZ-Dvl抑制間皮瘤細(xì)胞中內(nèi)源Dvl的功能及胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白的穩(wěn)定性。Dvl蛋白具有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域一個(gè)存在于Wnt拮抗蛋白軸蛋白中的dix結(jié)構(gòu)域；一個(gè)參與蛋白之間相互作用的PDZ結(jié)構(gòu)域以及在調(diào)節(jié)Rho GTP酶的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的DEP結(jié)構(gòu)域。哺乳動(dòng)物中β-聯(lián)蛋白的上調(diào)和LEF-1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活需要三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的功能。按照其他研究者的發(fā)現(xiàn)，pCS-小鼠Dvl-1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞導(dǎo)致β-聯(lián)蛋白的Tcf介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄活性提高15倍。這一活性被pCS-小鼠Dvl-1構(gòu)件通過編碼ΔPDZDvl-1的pCS-cDNA共轉(zhuǎn)染而抑制。而且，LRKIA中Tcf依賴的β-聯(lián)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性被pCS-ΔPDZ-Dvl-1的轉(zhuǎn)染而降低(從2.1倍到1.3倍，P＜0.05)，然而pCS-Dvl-1的轉(zhuǎn)染增強(qiáng)了Tcf依賴的β-聯(lián)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性(從2.1倍到3.8倍，P＜0.05)，這表明在這些細(xì)胞中β-聯(lián)蛋白的Tcf介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄明顯被Dvl.b調(diào)控。
為了檢驗(yàn)惡性胸膜間皮瘤中附加Wnt途徑激活，我們用逆轉(zhuǎn)錄病毒將ΔPDZ-Dvl-1和野生型Dvl-1分別轉(zhuǎn)染LRK1A、REN和H513細(xì)胞系。pLXN-ΔPDZ-Dvl-1的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)ΔPDZ-Dvl-1蛋白的表達(dá)，該蛋白在所有檢測(cè)的細(xì)胞中明顯比對(duì)照降低了胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白的表達(dá)(P＜0.05)。這些結(jié)果說明，Dvl調(diào)節(jié)間皮瘤細(xì)胞中的胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白。
使用Atlas人癌癥1.2陣列顯示REN中c-myc表達(dá)被ΔPDZ-Dvl-1轉(zhuǎn)染下調(diào)。另一方面，使用Western印跡分析，經(jīng)證實(shí)是Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑的一個(gè)靶基因的COX-2被ΔPDZ-Dvl-1轉(zhuǎn)染下調(diào)。
ΔPDZ-Dvl轉(zhuǎn)染在軟瓊脂和無胸腺小鼠中抑制間皮瘤細(xì)胞系的腫瘤形成我們檢驗(yàn)了Dvl/β-聯(lián)蛋白途徑在與惡性胸膜間皮瘤細(xì)胞系中細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系中的作用。我們通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染在LRK1A、REN和H513中誘導(dǎo)ΔPDZ-Dvl-1表達(dá)，使用空載體作為對(duì)照。選擇后細(xì)胞平鋪在0.35％的軟瓊脂上并在28天后集落計(jì)數(shù)。與對(duì)照相比，用ΔPDZ-Dvl-1轉(zhuǎn)染的LRK1A和REN中的集落形成顯著下降(P＜0.01)。H513不能在軟瓊脂上生長(zhǎng)。此外，與對(duì)照相比，用ΔPDZ-Dvl-1突變體轉(zhuǎn)染顯著抑制了無胸腺小鼠中LRK1A和REN皮下腫瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)(分別P＜0.05和P＜0.005；圖8)。
實(shí)施例11Dvl活化在非小細(xì)胞肺癌中的作用隨后我們檢驗(yàn)了Dvl活化在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的作用。本實(shí)施例說明，Dvl-3在新鮮切除的NSCLC和建立的NSCLC細(xì)胞系中過表達(dá)。實(shí)施例也提供了通過規(guī)范的β-聯(lián)蛋白途徑的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是由上游事件(如Dvl表達(dá))引起的附加證據(jù)。
為了評(píng)價(jià)NSCLC中Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能，我們分析了Dvl表達(dá)和功能。8例NSCLC新鮮腫瘤(4例扁平細(xì)胞癌和4例腺癌)及其同源匹配的正常肺組織得自接受腫瘤切除作為對(duì)早期I期NSCLC治療的一部分的患者?；颊呶唇邮苋魏吻捌谥委?例如化療)。這些樣品的Western印跡分析顯示，所有檢測(cè)的癌細(xì)胞的75％(4例扁平細(xì)胞癌中的3例以及4例腺癌中的3例)過表達(dá)Dvl-3，而相應(yīng)的匹配的正常肺組織沒有顯示Dvl-3的表達(dá)。而且，通過Western印跡分析，6例過表達(dá)Dvl-3的NSCLC腫瘤中的5例表現(xiàn)出Wnt-1或Wnt-2的較高表達(dá)。沒有檢測(cè)到Dvl-1或Dvl-2的表達(dá)。
為進(jìn)一步檢驗(yàn)Dvl功能，我們合成了能抑制Dvl-1、-2和-3的Dvl的小干擾RNA(siRNA)。我們通過用Dvl siRNA和對(duì)照siRNA處理，檢測(cè)了Dvl在肺癌細(xì)胞系HI703中的功能。我們選了HI703是因?yàn)槠浔磉_(dá)Dvl-3并表現(xiàn)出Tcf依賴的β-聯(lián)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。siRNA處理后，Dvl-3表達(dá)被抑制，同時(shí)Dvl-1和Dvl-2仍不表達(dá)。需要指出，在處理的細(xì)胞中，伴隨著Tcf依賴的轉(zhuǎn)錄活性的顯著降低(P＜0.05)，β-聯(lián)蛋白表達(dá)相應(yīng)降低。最終，Dvls的siRNA在24孔板中明顯抑制了H1703細(xì)胞生長(zhǎng)(P＜0.05)(圖9)。此外，100mm平皿中的集落形成也被明顯抑制(P＜0.05)。在與H1703相比具有更低水平的Dvl表達(dá)的其他細(xì)胞系(諸如A549(肺癌細(xì)胞系)和SW480(由于APC突變使Wnt信號(hào)途徑異?；罨慕Y(jié)腸癌細(xì)胞系))中，細(xì)胞生長(zhǎng)不受Dvl siRNA的影響。
討論如上所述，關(guān)于Wnt配體在人類腫瘤形成中的作用所知甚少。這里所展現(xiàn)的數(shù)據(jù)說明，Wnt信號(hào)在人類癌細(xì)胞中發(fā)揮起因性作用從而是癌癥治療靶點(diǎn)。
上面提供的數(shù)據(jù)說明，抗Wnt-1和抗Wnt-2抗體都可以誘導(dǎo)人類癌細(xì)胞中的凋亡。而且，我們的數(shù)據(jù)表示，抗腫瘤作用是由Wnt信號(hào)途徑的封閉引起的?？筗nt抗體誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞死亡不但與Wnt蛋白表達(dá)相關(guān)，而且與檢測(cè)的人腫瘤細(xì)胞中Dvl和胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白表達(dá)減少一致。相反，在正常細(xì)胞系中，抗Wnt抗體處理后Dvl和胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白維持相同水平?？贵w對(duì)正常細(xì)胞系沒有表現(xiàn)出可檢測(cè)的作用，這說明抗Wnt-1或抗Wnt-2抗體能特異性誘導(dǎo)癌細(xì)胞中但不是正常細(xì)胞中的凋亡。鑒于多克隆抗體可能產(chǎn)生非特異作用，我們使用了抗Wnt-1單克隆抗體來進(jìn)一步研究抗Wnt抗體作用的特異性。抗Wnt-1單克隆抗體能夠在過表達(dá)Wnt-1蛋白的人類癌細(xì)胞系(例如人類肺癌細(xì)胞系H460和人類乳腺癌細(xì)胞系MCF-7)中誘導(dǎo)凋亡。與從多克隆抗體研究獲得的結(jié)果類似，在這些腫瘤細(xì)胞中，在抗Wnt-1單克隆抗體處理后，Dvl和胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白減少。然而，抗Wnt-1單克隆抗體比抗Wnt-1多克隆抗體表現(xiàn)出高得多的特異性，例如，抗Wnt-1單克隆抗體只在過表達(dá)Wnt-1蛋白的腫瘤細(xì)胞(H460和MCF-7)中誘導(dǎo)凋亡，并在表達(dá)Wnt-2蛋白的腫瘤細(xì)胞中沒有可檢測(cè)的作用；抗Wnt-1多克隆抗體在過表達(dá)Wnt-1或Wnt-2的腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡性細(xì)胞死亡。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，抗Wnt抗體處理可以誘導(dǎo)腫瘤特異性凋亡并下調(diào)人癌細(xì)胞中Wnt-Dvl-β聯(lián)蛋白信號(hào)途徑。
通過Frizzled受體和Dvl蛋白，Wnt信號(hào)激活兩條不同途徑規(guī)范途徑(即β聯(lián)蛋白途徑)與JNK途徑。Dvl蛋白具有3個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域DIX、PDZ和DEP。其中，DIX和PDZ結(jié)構(gòu)域是規(guī)范途徑所必需的，而DEP結(jié)構(gòu)域?qū)τ贘NK途徑的激活是重要的。已表明JNK活化在啟動(dòng)凋亡中起關(guān)鍵作用(Wang等，Mol Cell Biol，195923-5929(1999))。最近，Chen等證明，Wnt-1通過激活β聯(lián)蛋白和TCF轉(zhuǎn)錄抑制凋亡(Chen等，J Cell Biol，15287-96(2001))。在本研究中，抗Wnt抗體處理后，既觀察到了β聯(lián)蛋白過表達(dá)，由觀察到了提高的JNK活性，這說明規(guī)范途徑和JNK途徑都參與了抗Wnt抗體誘導(dǎo)的凋亡。此外，正常間皮細(xì)胞系中Dvl過表達(dá)下調(diào)了JNK活性，并且通過使用Apigenin以封閉CK-1活性的Dvl的抑制提高了JNK活性。很有可能，抗Wnt抗體處理后JNK的活化是通過Dvl的。
此外，siRNA介導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞中Dvl表達(dá)的抑制減少了β-聯(lián)蛋白介導(dǎo)的Tcf轉(zhuǎn)錄，這進(jìn)一步支持在有些肺癌細(xì)胞中Dvl過表達(dá)對(duì)于規(guī)范的Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑是重要的。Dvl抑制也抑制了NSCLC細(xì)胞中的細(xì)胞生長(zhǎng)和集落形成，這說明Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中異常的上游事件與NSCLC中的腫瘤形成相關(guān)。
由siRNA介導(dǎo)的Dvl降解導(dǎo)致了H1703但不是A549細(xì)胞的的生長(zhǎng)抑制。兩者都是扁平細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，但H1703具有突變滅活的p53而A549具有野生型p53。這樣，p53的狀態(tài)至少可以部分解釋這兩種處理的扁平細(xì)胞肺癌細(xì)胞系之間Dvl功能的差異。
為了進(jìn)一步說明在人類癌細(xì)胞中抗Wnt抗體誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制，我們檢驗(yàn)了凋亡途徑中其他可能的成分。例如，在這些用Wnt抗體處理的腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到了Smac/Diablo釋放到細(xì)胞質(zhì)中。Smac/Diablo(第2種線粒體來源的具有低pI值的胱冬酶/直接IAP結(jié)合蛋白激活因子)(Du等，Cell，10233-42(2000)；Verhagen等，Cell，10243-53(2000))通過釋放IAP介導(dǎo)的胱冬酶抑制起作用。凋亡的激活引起Smac/Diablo連同細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)膜空間釋放到細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞色素C直接激活A(yù)paf-1和胱冬酶-9并且Smac/Diablo與多個(gè)IAPs相互作用以去除IAP介導(dǎo)的對(duì)啟動(dòng)和效應(yīng)胱冬酶的抑制(Chai等，Nature，406855-862(2000)；Srinivasula等，JBiol Chem，27536152-36157(2000))。與上述的癌細(xì)胞中但不是正常細(xì)胞中胱冬酶-3活性提高的結(jié)果相一致，我們發(fā)現(xiàn)抗Wnt抗體處理后在癌細(xì)胞但不是正常細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中Smac/Diablo和細(xì)胞色素C的水平的提高。我們的結(jié)果表明，分別通過去除存活蛋白和/或其他IAPs介導(dǎo)的抑制及直接激活胱冬酶，Smac/Diablo和細(xì)胞色素C都可能參與了這一抗Wnt抗體誘導(dǎo)的凋亡。
以上發(fā)現(xiàn)說明，Wnt抗體可能不僅直接誘導(dǎo)過表達(dá)Wnt蛋白的癌細(xì)胞中的凋亡，而且通過恢復(fù)這些腫瘤細(xì)胞的正常凋亡機(jī)器去除可能的抗藥性。腫瘤細(xì)胞中抗藥性的基礎(chǔ)最可能是凋亡機(jī)制的破壞。凋亡抑制劑存活蛋白的過表達(dá)是大部分人類癌癥的共有特征。已經(jīng)證明，對(duì)存活蛋白的靶向作用提高腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒藥物的敏感并且反義存活蛋白足以引起人間皮瘤細(xì)胞中的凋亡。而且，也已報(bào)道了反義存活蛋白與化療之間的增效作用。
我們已經(jīng)證實(shí)，Wnt抗體處理顯著減少存活蛋白的水平。綜上所述，Wnt抗體能增強(qiáng)并協(xié)同加強(qiáng)人類癌細(xì)胞中常規(guī)化療的效果。
Wnt信號(hào)或Frizzled受體的其他拮抗劑也會(huì)通過Dvl誘導(dǎo)凋亡。例如，sFRP作為Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的可溶性調(diào)控因子通過與Frizzled受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分泌型Wnt配體發(fā)揮功能(Melkonyan等，Proc Natl Acad Sci USA，9413636-13641(1997))。具體來說，sFRP可以通過與Wnt蛋白結(jié)合并阻礙其接近細(xì)胞表面信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體來拮抗Wnt的功能，或能通過促進(jìn)向Frizzled受體提呈配體增強(qiáng)Wnt活性(Uthoff等，Int J Oncol，19803-810(2001))。Frizzled受體拮抗劑(例如，針對(duì)其胞外結(jié)構(gòu)域的特異性抗體或針對(duì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的特異性小分子)能誘導(dǎo)過表達(dá)Wnt/Frizzled蛋白的人類癌細(xì)胞中的凋亡。的確，圖10顯示，Wnt信號(hào)拮抗劑FRP或DKK的過表達(dá)在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。因而，這樣的拮抗劑也可以用于治療癌癥，例如肺癌、間皮瘤、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、頭頸癌、肝細(xì)胞癌、黑素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、白血病或淋巴瘤。
總之，我們的結(jié)果表明，Wnt單克隆抗體可能通過規(guī)范途徑和JNK途徑，能夠誘導(dǎo)人類癌細(xì)胞中的腫瘤特異性凋亡。我們的數(shù)據(jù)說明，對(duì)于癌癥治療而言，Wnt/Frizzled是有用的治療靶點(diǎn)，并且來自異種移植小鼠模型的結(jié)果顯示，Wnt單克隆抗體是腫瘤靶向癌癥治療的良好候選試劑。
實(shí)施例12Dachsous(ds)基因和Fat基因的沉默機(jī)制分析及其對(duì)人類癌組織中wnt-frizzled信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)關(guān)于癌組織中Wnt-Fz信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)機(jī)器所知甚少。Dachsous(Ds)和Fat蛋白是鈣粘素(cadherin)超家族的兩個(gè)成員(Mahoney等，Cell 67853-868，1991；Clark，H.F等，Genes Dev，91530-1542，1995)。有數(shù)據(jù)顯示它們參與了果蠅發(fā)育中的Fz信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Yang等，Cell，108675-688，2002)。沒有關(guān)于Ds和Fat在癌組織中作用的報(bào)道。
在本實(shí)施例中，我們說明了在新鮮的人類癌組織(包括肺癌和間皮瘤)和人類細(xì)胞系(包括乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌和間皮瘤)中Fat表達(dá)上調(diào)并且Ds表達(dá)下調(diào)。我們也鑒別了與人類癌組織中Ds轉(zhuǎn)錄沉默相關(guān)的Ds啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島中的異常甲基化。此外，我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)z活性與Fat的上調(diào)與Ds的下調(diào)相關(guān)。Ds的恢復(fù)與Fat的封閉可以調(diào)節(jié)Fz信號(hào)途徑的活性并抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。
本發(fā)明極大地有助于人類癌癥治療的治療策略。例如，使用上述方法，可以封閉Fat活性。這樣的方法包括，例如，封閉Fat轉(zhuǎn)錄和/或其活性的反義寡核苷酸或小化合物分子。另外，使用已知的基因治療方法，可以恢復(fù)Ds活性。此外，本發(fā)明可以用作診斷工具。甲基化是癌形成的早期事件之一。使用熟知的技術(shù)(例如，甲基化特異性PCR)對(duì)Ds啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島的甲基化檢測(cè)可以用于癌癥早期診斷。
實(shí)施例13Frizzled(fz)基因和LRP(LDL相關(guān)蛋白)基因的遺傳改變和在癌癥中使用不同方法對(duì)這些受體的突變體和/或截?cái)嘈问竭M(jìn)行靶向LRPs(LDL相關(guān)蛋白；LRP-1到-5)是Wnt配體的共受體。已經(jīng)表明，Wnt、Fz和LRP蛋白在多種癌組織(包括乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等等)中高表達(dá)(Liu等，Cancer Res，601961-1967，2000；Laurencot等，Int J Cancer，721021-1026，1997；Berger，W等，Int J Cancer，88293-300，2000；Schneider等，Breast Cancer Res，3183-191，2001；Schneider等，Anticancer Res，20 4373-4377，2000)。此外。這一信號(hào)被認(rèn)為在癌癥中組成型開啟下游轉(zhuǎn)錄活性。然而，癌癥中這一組成型開啟的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制仍然是未知的。
在本實(shí)施例中，我們說明了frizzled(fz)基因和/或LRP(LDL相關(guān)蛋白)基因中的遺傳改變導(dǎo)致癌組織中所有Fz受體和/或LRP共受體(胞外的、跨膜的、和/或胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)域)的突變體和/或截?cái)嘈问降男纬?。我們檢測(cè)的癌類型包括乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌、間皮瘤和肉瘤。上述的遺傳改變包括染色體缺失(純合或雜合的)、染色體易位、染色體斷裂、染色體倒位、內(nèi)部少量缺失、插入和點(diǎn)突變。這些Fz受體和/或LRP共受體的突變和/或截?cái)嘈问綄?dǎo)致不管Wnt配體存在的組成型信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這依次導(dǎo)致了癌組織中組成型的下游轉(zhuǎn)錄活性。相反，在正常組織/細(xì)胞中不存在Fz受體和/或LRP共受體的突變形式。
本發(fā)明表明，Wnt信號(hào)途徑的Fz受體和/或LRP共受體的突變和/或截?cái)嘈问绞前┨禺愋缘?。它們具有用作開發(fā)治療性藥物(例如，如上所述的小分子、化合物、抗體、反義寡核苷酸或RNAi)靶點(diǎn)的很大可能性。這些藥物可以僅靶向癌組織而不是正常細(xì)胞。因而，本發(fā)明會(huì)對(duì)治療多種如上所述包括結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌(如NSCLC)、間皮瘤和肉瘤等等在內(nèi)的癌癥的治療策略具有很大幫助。
需要理解，這里所述的實(shí)施例和實(shí)施方式僅出于說明的目的，精通本領(lǐng)域的人員據(jù)此提出的多種改造或改變包括在本申請(qǐng)的精神和范圍以及附屬的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。這里所引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)通過參考完整地、全面地結(jié)合在本申請(qǐng)中。
序列表序列表Seq ID No1人Wnt-1肽序列#1MGLWALLPGWVSATLLLALAALPAALAANSSGRWWGIVNVASSTNLLTDSKSLQLVLEPSLQLLSRKQRRLIRQNPGILHSVSGGLQSAVRECKWQFRNRRWNCPGAPGPHLFGKIVNRGCRETAFIFAITSAGVTHSVARSCSEGSIESCTCDYRRRGPGGPDWHWGGCSDNIDFGRLFGREFVDSGEKGRDLRFLMNLHNNEAGRTTVFSEMRQECKCHGMSGSCTVRTCWMRLPTLRAVGDVLRDRFDGASRVLYGNRGSNRASRAELLRLEPEDPAHKPPSPHDLVYFEKSPNFCTYSGRLGTAGTAGRACNSSSPALDGCELLCCGRGHRTRTQRVTERCNCTFHWCCHVSCRNCTHTRVLHECLSeq ID No2人Wnt-1肽序列#239 NVASSTNLLTDSKS(C)52Seq ID No3人Wnt-1肽序列#3131 SAGVTHSVARSC 142Seq ID No4人Wnt-1肽序列#4200 HNNEAGRTTVFS(C)212Seq ID No5人Wnt-1肽序列#5274 LEPEDPAHKPPSP(C)286Seq ID No6人Wnt-1肽序列#6332 DGCELLCCGRGHRTRTQVTERC347Seq ID No7人Wnt-1肽序列#7354 HVSCRNCTHTRVLHHECL 370Seq ID No8人Wnt-2肽序列#1MNAPLGGIWLWLPLLLTWLTPEVNSSWWYMRATGGSSRVMCDNVPGLVSSQRQLCHRHPDVMRAISQGVAEWTAECQHQFRQHRWNCNTLDRDHSLFGRVLLRSSRESAFVYAISSAGVVFAITRACSQGEVKSCSCDPKKMGSAKDSKGIFDWGGCSDNIDYGIKFARAFVDAKERKGKDARALMNLHNNRAGRKAVKRFLKQECKCHGVSGSCTLRTCWLAMADFRKTGDYLWRKYNGAIQVVMNQDGTGFTVANERFKKPTKNDLVYFENSPDYCIRDREAGSLGTAGRVCNLTSRGMDSCEVMCCGRGYDTSHVTRMTKCGCKFHWCCAVRCQDCLEALDVHTCKAPKNADWTTATSeq ID No9人Wnt-2肽序列#2
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權(quán)利要求
1.一種抑制過表達(dá)Wnt蛋白的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其特征在于，所述方法包括將所述細(xì)胞與抑制所述Wnt蛋白與Frizzled受體結(jié)合的試劑接觸。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述試劑是一種抗體。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗體特異性結(jié)合所述Wnt蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述Wnt蛋白是Wnt-1。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述Wnt蛋白是Wnt-2。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗體特異性結(jié)合一種Frizzled受體。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述Frizzled受體是Frizzled1、Frizzled2、Frizzled3、Frizzled4、Frizzled5、Frizzled6、Frizzled7、Frizzled8、Frizzled9和Frizzled10受體。
8.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗體是一種單克隆抗體。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗體是重組方式產(chǎn)生的。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗體是一種人源化抗體。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗體是一種單鏈Fv片段(scFv)。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌細(xì)胞位于患者體內(nèi)并且接觸步驟通過給予患者所述試劑進(jìn)行。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述試劑是一種抗體。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法進(jìn)一步包括給予患者第二種治療劑。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述第二種治療劑是化療劑。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述第二種治療劑是放射治療。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞、結(jié)腸直腸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞、間皮瘤細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、食道癌細(xì)胞、頭頸癌細(xì)胞、肝細(xì)胞癌細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞、白血病細(xì)胞或淋巴瘤細(xì)胞。
18.一種抗Wnt單克隆抗體，其特征在于，所述抗體特異性結(jié)合SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO9的肽。
19.如權(quán)利要求18所述的單克隆抗體，其特征在于，所述抗體包含圖7所示的VH或VL。
20.如權(quán)利要求18所述的單克隆抗體，其特征在于，所述VH包含圖7所示VH鏈的1個(gè)CDR。
21.如權(quán)利要求20所述的單克隆抗體，其特征在于，所述VH包含圖7所示VH鏈的全部3個(gè)CDR。
22.如權(quán)利要求18所述的單克隆抗體，其特征在于，所述VL包含圖7所示VL區(qū)的1個(gè)CDR。
23.如權(quán)利要求22所述的單克隆抗體，其特征在于，所述VL包含圖7所示VL區(qū)的全部3個(gè)CDR。
24.一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含藥學(xué)上可接受的的賦形劑和特異性結(jié)合Wnt-1或Wnt-2的單克隆抗體。
25.如權(quán)利要求24所述的藥物組合物，其特征在于，所述抗體進(jìn)一步與一種效應(yīng)組分結(jié)合。
26.如權(quán)利要求24所述的藥物組合物，其特征在于，所述效應(yīng)組分是一種熒光標(biāo)記物。
27.如權(quán)利要求24所述的藥物組合物，其特征在于，所述效應(yīng)組分是一種放射性同位素或一種細(xì)胞毒化學(xué)制品。
28.一種篩選抑制癌細(xì)胞增殖的試劑的方法，其特征在于，所述方法包括將該試劑與Dvl蛋白接觸，測(cè)定Dvl蛋白的活性或表達(dá)，以及鑒別抑制Dvl蛋白或活性的化合物，從而鑒別一種抑制癌細(xì)胞增殖的試劑。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述方法進(jìn)一步包括將經(jīng)鑒別的化合物與癌細(xì)胞接觸，并選擇抑制癌細(xì)胞增殖的化合物。
30.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述癌細(xì)胞是肺癌細(xì)胞。
31.一種抑制過表達(dá)Dvl蛋白的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其特征在于，所述方法包括將所述細(xì)胞與一種抑制Dvl表達(dá)或活性的試劑接觸。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述癌細(xì)胞是肺癌細(xì)胞。
33.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述試劑是一種小分子。
34.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述試劑是一種siRNA。
35.一種抑制過表達(dá)wnt或Frizzled蛋白的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其特征在于，所述方法包括將所述細(xì)胞與一種結(jié)合Frizzled受體胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的試劑接觸，從而抑制該Frizzled受體與胞內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑制過表達(dá)Wnt蛋白的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。所述方法包括將所述細(xì)胞與抑制Wnt蛋白與Frizzled受體結(jié)合的試劑接觸。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK1722953SQ200380105084
公開日2006年1月18日 申請(qǐng)日期2003年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月4日
發(fā)明者何飚, 尤亮, 徐志東, D·M·雅布隆斯 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)