專利名稱：用于治療癌癥的組合物和方法
用于治療癌癥的組合物和方法相關(guān)申請的交叉參考本申請要求于2007年11月2日提交的美國臨時申請?zhí)朥S60/985，196的利益，該 文獻整體引入作為參考。
背景技術(shù)：
宮頸癌是女性中占第二位最常見的癌癥診斷，當今與高危人型乳頭瘤病毒感染 99. 7%相關(guān)。例如，在2007年，國家癌癥研究所(National Cancer Institute)報道估計 3，670例死亡歸因于這種類型的癌癥，并且在美國女性中診斷出約11，150例新病例。此外， 全世界每年有大約400，000例宮頸癌和接近200，000例死亡。人型乳頭瘤病毒(HPVs)是世 界上最常見的性傳播疾病病因之一?？傮w上，50-75%的性活躍男性和女性在其生命的某個 時間點感染生殖器HPV感染。據(jù)估計，僅在美國每年有550萬人感染HPV，目前至少有2000 萬人被感染。根據(jù)它們與宮頸癌或與良性宮頸損害或結(jié)構(gòu)不良的聯(lián)系，已經(jīng)將超過100種 不同的HPV分離物大概地細分為高危和低危亞型。許多證據(jù)意味著HPV感染是宮頸癌的病原。20世紀80年代的多項研究報道了在宮 頸結(jié)構(gòu)不良(cervical dysplasias)、癌癥和來源于宮頸癌的細胞系中存在HPV變體。其它 研究證實來自致癌HPV 18的基因組的E6-E7區(qū)在宮頸癌細胞中被選擇性地保留(這提示 HPV感染可以是病因)，并且E6-E7區(qū)的連續(xù)表達是維持無限增殖化或癌性狀態(tài)所必需的。 下一年，Sedman等人證實來自HPV 16的E6-E7基因足以使培養(yǎng)物中的人角質(zhì)形成細胞無 限增殖。Barbosa等人證實盡管來自高危HPVs的E6-E7基因可以轉(zhuǎn)化細胞系，但是來自 低?；蚍侵掳┳凅w如HPV 6和HPV 11的E6-E7區(qū)不能轉(zhuǎn)化人角質(zhì)形成細胞。后來，Pillai 等人在623份處于腫瘤發(fā)展各階段的宮頸組織樣品中通過原位雜交檢查了 HPV16和18感 染以及通過免疫細胞化學(xué)檢查了 E6蛋白表達，發(fā)現(xiàn)組織異常和HPV感染之間存在顯著相關(guān) 性。迄今為止所表征的人型乳頭瘤病毒與限于皮膚上皮層或口腔、咽、呼吸道和最重 要的是肛門生殖區(qū)粘膜的損害相關(guān)。特定的人型乳頭瘤病毒類型(包括HPV 6和11)通常 引起良性粘膜損害，而其它類型如HPV 16、18和許多其它病毒株主要在高級別損害和癌癥 中發(fā)現(xiàn)。感染粘膜表面的各類型的人型乳頭瘤病毒(HPV)已經(jīng)在宮頸癌、肛門癌、陰莖癌、 喉癌和口腔癌、偶發(fā)的甲周癌(periimgal carcinomas)以及良性肛門生殖器疣中作為致病 因素被牽涉。對具體HPV類型的鑒別用于鑒別具有癌前損害的患者，這些患者處于發(fā)展為 惡性病的危險中。盡管在一些感染了人型乳頭瘤病毒的人中存在看得見的肛門生殖器損 害，但是大部分具有HPV生殖道感染的個體沒有臨床上明顯的疾病，但是分析宮頸涂片中 存在的細胞形態(tài)學(xué)特征可以用于檢測HPV感染。巴帕尼科拉烏試驗(Papanicolaou test) 是一種有價值的篩選工具，但是它們由于不合宜的假陽性和假陰性試驗結(jié)果而遺漏了大比 例的感染HPV的人。此外，它們不適合在全世界測試，因為對結(jié)果的解釋需要受過訓(xùn)練的病 理學(xué)家。由于巴帕尼科拉烏試驗的應(yīng)用和成功率有限，所以很多感染HPV的個體不能接受 及時的診斷，這一問題阻礙了在出現(xiàn)臨床癥狀前給予治療的努力。對于早期和準確地診斷 致癌HPV感染以及對于針對病因性HPV感染的治療(通過較早地干預(yù)疾病進程來預(yù)防宮頸癌發(fā)展)而言存在明顯未得到滿足的需求。因為治療通常在臨床癥狀發(fā)作后施用，所以目前的治療模式聚焦于實際的宮頸 結(jié)構(gòu)不良而不是潛在的HPV感染。每年，女性由臨床醫(yī)師進行宮頸結(jié)構(gòu)不良篩選，用表面 切除技術(shù)(superficial ablative techniques)、包括低溫外科手術(shù)、激光切除(laser ablation)和割除進行治療。當疾病發(fā)展時，治療選擇變得更具有侵害性，包括次全子宮切 除術(shù)或子宮根治術(shù)、放射或化療法。所有這些治療都是侵害性的，并且可能導(dǎo)致或肯定導(dǎo)致 永久性不育。此外，手術(shù)除去組織由于如下事實不能保證所有被感染的細胞已經(jīng)被清除一 些轉(zhuǎn)化細胞可能還沒有呈現(xiàn)出與HPV感染有關(guān)的形態(tài)學(xué)改變。所要求保護的發(fā)明的概述本發(fā)明提供了符合下文所述通式的化合物。該化合物優(yōu)選抑制HPVE6蛋白與多肽 的結(jié)合，所述多肽包含來自MAGI-I的第一 PDZ結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了包含該化合物的藥物組合物。該組合物優(yōu)選在GMP條件下制備。 優(yōu)選以至少99%純的形式提供本發(fā)明的化合物。本發(fā)明還提供了治療致癌人型乳頭瘤病毒感染或?qū)ζ溥M行預(yù)防的方法，該方法包 括給患有HPV感染或處于HPV感染危險中的受治療者施用前述權(quán)利要求任一項的化合物的 有效方案，其中所述化合物治療感染或其后遺癥或?qū)λ鼈冞M行預(yù)防。在一些方法中，受治療者感染了 HPV。在一些方法中，受治療者患有宮頸癌。在一 些方法中，受治療者患有宮頸結(jié)構(gòu)不良。在一些方法中，受治療者處于HPV感染危險中。本發(fā)明還提供了治療癌癥或?qū)ζ溥M行預(yù)防的方法。該方法要求給患有癌癥或處于 癌癥危險中的受治療者施用權(quán)利要求1-14任一項的化合物的有效方案，其中所述化合物 治療癌癥或?qū)ζ溥M行預(yù)防。在一些這類方法中，受治療者感染了致癌人型乳頭瘤病毒。在一 些這類方法中，癌癥是宮頸癌、陰道癌、肛門癌或頭頸癌。在一些這類方法中，癌癥是乳癌、 卵巢癌、腦癌、白血病或淋巴瘤。本發(fā)明還提供了治療宮頸癌的方法。該方法要求給患有宮頸癌的受治療者施用本 文所述的化合物的有效方案，其中所述化合物治療宮頸癌。附圖簡述

圖1顯示了化合物7291-0042對細胞遷移的作用。圖2A顯示了化合物7291-0042對3YlpBlast E6-16 (野生型)細胞的細胞增殖的作用。圖2B顯示了化合物7291-0042對3YlpBlast E6-16 Δ PL細胞的細胞增殖的作用。圖2C顯示了化合物7291-0042對3YlpBlast細胞的細胞增殖的作用。圖3顯示了化合物7291-0042對E6宮頸癌細胞C33a、HeLa和SiHa的細胞毒性作用。圖4A和4B顯示了用化合物7291-0042處理的和未用化合物處理的HeLa細胞中 的E6蛋白表達。圖5顯示了用化合物7291-0042處理的和未用化合物處理的HeLa細胞中的p53 腫瘤抑制蛋白表達。圖6A顯示了 7291-0042-型藥物的其它二聚體。圖6B顯示了具有COOH模擬物或首基的7291-0042藥物的變體。如果主要骨架保持不變，則可以使用多種首基、包括7291-0042中-0-CH2-C00-。圖7顯示了 7291-0042選擇性誘導(dǎo)HPV-陽性宮頸癌細胞中的細胞凋亡，如在用 7291-0042處理48小時后通過TUNEL分析在HeLa和C33A細胞中所測定的那樣。術(shù)語“人型乳頭瘤病毒”或“HPV”指不同組的基于DNA的病毒，它們是世界上最常 見的性傳播疾病原因之一。宮頸癌被鑒定為由HPV引起。根據(jù)它們與宮頸癌或與良性宮頸 損害或結(jié)構(gòu)不良的聯(lián)系，已經(jīng)將超過100種不同的HPV分離物大概地細分為高危和低危亞 型。這些HPV分離物有時稱為HPV株或型，通常僅以編號或“HPV#”來指定或稱呼，其中“#” 是致癌或?qū)е掳┑幕蛐偷木幪?。“致癌HPV株”是如國家癌癥研究所(NCI，2001)確定的已知導(dǎo)致宮頸癌的HPV株。 示例性的致癌株有HPV16、HPV33、HPV35、HPV52、HPV58和HPV66?？梢詮拿绹鴩疑锛夹g(shù) 信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)的世界范圍網(wǎng)上找 到本文未具體列舉的HPV致癌株?！爸掳〦6蛋白”、“E6”或“E6癌蛋白”可互換使用，是由上述致癌HPV株如高危HPV 16型和18型(例如分別參見NCBI Taxonomy Ids 333760和333761)編碼的E6蛋白。E6 是用于病毒復(fù)制以及宿主細胞無限增殖和轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)。E6與具有PDZ-結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì) 如MAGUK(膜相關(guān)鳥苷酸激酶家族)蛋白(下述)結(jié)合。這些蛋白質(zhì)包括MAGI-l、MAGI-2 和MAGI-3。當E6與MAGI蛋白上的PDZ結(jié)構(gòu)域復(fù)合時，復(fù)合物使DLG蛋白的形狀扭曲，由此 妨礙其功能。E6還結(jié)合p53，p53是一種負性調(diào)節(jié)細胞周期進程、細胞生長和分裂的腫瘤抑 制蛋白。E6與p53的結(jié)合導(dǎo)致p53蛋白遍在化和最終降解，該過程涉及另一種稱為“E6-相 關(guān)蛋白”的細胞蛋白。結(jié)果，表達E6的細胞將具有降低的基線水平的p53。術(shù)語“PDZ結(jié)構(gòu)域”指以與腦突觸蛋白PSD-95、果蠅(Drosophila)分隔連接蛋白 Discs-Large(DLG)和上皮緊密連接蛋白ZOl (ZOl)同源為特征的少于約90個氨基酸(即 約80-90、約70-80、約60-70或約50-60個氨基酸)的蛋白質(zhì)序列(即模塊蛋白結(jié)構(gòu)域)。 PDZ結(jié)構(gòu)域也稱為Discs-Large同源重復(fù)(“DHRs”)和GLGF重復(fù)。PDZ結(jié)構(gòu)域通常顯示保 持核心共有序列(Doyle 1996，Cell85 1067-76)。PDZ結(jié)構(gòu)域在不同的膜相關(guān)蛋白中發(fā)現(xiàn)，包括鳥苷酸激酶同系物的MAGM家族成 員、數(shù)種蛋白磷酸酶和激酶、神經(jīng)元氧化氮合酶、腫瘤抑制蛋白和數(shù)種肌營養(yǎng)蛋白結(jié)合蛋白 (統(tǒng)稱為肌養(yǎng)蛋白結(jié)合蛋白)。術(shù)語“PDZ結(jié)構(gòu)域”還包括序列的變體(例如天然發(fā)生的變體)(例如多態(tài)變體、具 有保守取代的變體等)和來自供選種屬(例如小鼠、大鼠)的結(jié)構(gòu)域。通常，PDZ結(jié)構(gòu)域與 美國專利申請US09/724553中所示的那些基本相同，例如當就最大相應(yīng)性比較和比對時至 少約70%、至少約80%或至少約90%的氨基酸殘基同一性。PDZ結(jié)構(gòu)域可以突變以得到能 夠加強或弱化結(jié)合的氨基酸變化和改變特異性，然而它們?nèi)员Ａ袅?PDZ結(jié)構(gòu)域(Schneider 等人，1998，Nat. Biotech. 17 170-5)。對特定PDZ結(jié)構(gòu)域(例如MAGI-I結(jié)構(gòu)域2)的稱謂 意欲囊括該特定PDZ結(jié)構(gòu)域及其HPV E6-結(jié)合變體，另有指示除外。換言之，如果提到特定 PDZ結(jié)構(gòu)域，該稱謂也囊括如下文所述的與HPV的致癌E6蛋白結(jié)合的該PDZ結(jié)構(gòu)域的變體。 在此方面需要注意的是，蛋白質(zhì)中的PDZ結(jié)構(gòu)域的編號可以改變。術(shù)語“PDZ蛋白”指含有PDZ結(jié)構(gòu)域的天然存在的蛋白質(zhì)。示例性的PDZ蛋白包括 CASK、MPP1、DLGl、DLG2、PSD95、NeDLG, TIP-33、SYNla、TIP-43、LDP、LIM、LIMKl、LIMK2、 MPP2、N0Sl、AF6、PTN-4、prIL 16,41. 8kD、KIAA0559、RGS12、KIAA0316、DVLl、TIP_40、TIAMl、 MINTl、MAGI-I、MAGI-2、MAGI-3、KIAA0303、CBP, MINT3、TIP-2、KIAA0561 和 TIP-1。術(shù)語“PDZ-結(jié)構(gòu)域多肽”指含有PDZ結(jié)構(gòu)域的多肽，例如包括PDZ結(jié)構(gòu)域序列的 融合蛋白、天然存在的PDZ蛋白或分離的PDZ結(jié)構(gòu)域肽。因此，PDZ-結(jié)構(gòu)域多肽的長度可 以是約60個或更多氨基酸、約70個或更多氨基酸、約80個或更多氨基酸、約90個或更多 氨基酸、約100個或更多氨基酸、約200個或更多氨基酸、約300個或更多氨基酸、約500個 或更多氨基酸、約800個或更多氨基酸、約1000個或更多氨基酸、通常至多約2000個或更 多氨基酸。PDZ結(jié)構(gòu)域肽通常不超過約100個氨基酸(例如50-60個氨基酸、60-70個氨基 酸、80-90個氨基酸或90-100個氨基酸)，并且編碼PDZ結(jié)構(gòu)域。術(shù)語“PL蛋白”或“PDZ配體蛋白”指與PDZ-結(jié)構(gòu)域形成分子復(fù)合物的、可以是天 然存在或非天然存在的肽的多肽，或者指其羧基端當與全長蛋白質(zhì)分開表達時(例如作為 4-25個殘基如8、10、12、14或16個殘基的肽)形成這類分子復(fù)合物的蛋白質(zhì)。"MAGI-r'^^^IItB^^if SIifBI 1"(membrane-associated guanylate kinase inverted 1) ,MAGil或“含Wff和PDZ結(jié)構(gòu)域的膜相關(guān)鳥苷酸激酶1 "(membrane associated guanylate kinase, Wff and PDZdomain containing 1) 1月莫才百 # H Sl if _ 胃 iH · (MAGUK)家族成員。MAGW(蛋白參與細胞與細胞接觸區(qū)域的質(zhì)膜內(nèi)表面上的多蛋白復(fù)合物 的裝配。這種基因的產(chǎn)物在細胞與細胞的連接中可以作為支架蛋白起作用?；蛘?，已經(jīng)鑒定 了編碼不同同工型的剪接轉(zhuǎn)錄物變體。MAGI-I也稱為萎縮蛋白-1-相互作用蛋白3 (AIP3)； BAIl-相關(guān)蛋白1 (BAP1或BAIAP1)；含Wff結(jié)構(gòu)域的蛋白3 (WWP3)；含三核苷酸重復(fù)的基因 19 蛋白(TNRC 19)。參見 Shiratsuchi T 等人(1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 247 597-604。術(shù)語“特異性結(jié)合”指特征如下的兩種分子(例如配體和受體)之間的結(jié)合分子 (配體)與另一種特定分子(受體)即使在很多其它不同分子的存在下也能結(jié)合，即，在分 子的異質(zhì)混合物中能顯示出一種分子與另一種分子的優(yōu)先結(jié)合。配體與受體的特定結(jié)合還 通過在過量未標記配體的存在下(即結(jié)合競爭性實驗)可檢測的標記配體與受體的結(jié)合降 低得以證實?；衔锿ǔ；旧喜缓胁黄谕奈廴疚铩＿@意味著活性劑通常是至少約50% w/w(重量/重量)純的，并且基本上不含干擾污染物，例如在其合成中未反應(yīng)的試劑或副產(chǎn) 物。有時，化合物是至少約80% w/w純的，更優(yōu)選至少90或約95%或99% w/w純的。術(shù)語受治療者包括患有癌癥的人、動物受治療者，特別是家養(yǎng)動物和實驗動物。發(fā)明詳述I.概要與癌發(fā)生相關(guān)的人型乳頭瘤病毒(HPV)和與癌發(fā)生不相關(guān)的HPV株的不同之處在 于與癌發(fā)生相關(guān)的HPV株的E6蛋白具有與細胞PDZ蛋白質(zhì)、包括MAGI-I相互作用的PL 區(qū)。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了抑制該相互作用的化合物。所述化合物可用于治療HPV感染、包 括其后遺癥、特別是宮頸結(jié)構(gòu)不良和宮頸癌或?qū)λ鼈冞M行預(yù)防。無論是否有HPV感染，所述 化合物還增強了腫瘤抑制蛋白P53的表達，因此可用于治療和預(yù)防其它類型的癌癥。II.本發(fā)明的化合物
本發(fā)明提供了式I化合物及其鹽、水合物、溶劑合物、二聚體和異構(gòu)體 其中X各自是具有5-10個環(huán)原子的雜芳基環(huán)系，其中1-4個環(huán)原子是各自獨立地選自 N、0和S的雜原子，其中所述雜芳基環(huán)系被0-6個R1基團取代；R1各自獨立地選自H、CV6烷基、C2_6鏈烯基、C2_6炔基、Cp6烷氧基、鹵素、C^6鹵代 烷基、-C。_6 烷基-ORla, -NRlaRlb, -CN、-C(O) Rla, -C(O) ORla, -OC(O) Rla, -C(O)NRlaRlb, -N(Rla) C (0) Rlb、-OC (0) NRlaRlb、-N (Rla) C (0) ORlb、-NRlaC (0) NRlbRlc、-NO2、-CQ_6 烷基-芳基、雜芳基、環(huán) 烷基和雜環(huán)烷基；Rla、Rlb和Rlc各自獨立地選自H和C1^6烷基；Y是選自CH禾口 N的成員；Z 是選自-OR2、-NR2aR2c、-Cp6 烷基-C (0) OR2a、-C (0) R2a、-C (0) OR2a、-OC (0) R2a、-C (0) NR2aR2b、-N (R2a) C (0) R2b、-OC (0) NR2aR2b、-N (R2a) C (0) OR2b、-NR2aC (0) NR2bR2c、-NR2aS (0) 2R2b、_C0_6 烷基-S(0)2NR2bR2。的成員；R2各自獨立地選自H、CV6烷基、C2_6鏈烯基、C2_6炔基、-C1^6烷基-C (0) OR2a ；R2\ R2b和R2e各自獨立地選自H、C1^6烷基，或者R2b和R2e —起形成雜環(huán)烷基；R3各自獨立地是選自H、CV6烷基和-CH (C (0) O-C1^6烷基)2的成員；R4各自獨立地是選自H、Cp6烷基、C2_6鏈烯基、C2_6炔基、Cp6烷氧基、鹵素和C1^鹵 代烷基的成員；下標η和ο各自獨立地是1或2，以便ο和ρ之和是3 ；下標 ρ 是 0-4。優(yōu)選的化合物以式IA描述 其中 X各自獨立地選自具有5-10個環(huán)原子的雜芳基環(huán)系，其中1-4個環(huán)原子是各自獨 立地選自Ν、0和S的雜原子，其中至少一個環(huán)原子是N，并且其中所述雜芳基環(huán)系被0-4個 R1基團取代。優(yōu)選X各自獨立地選自 任選每個X是相同的,最優(yōu)選X各自是
Z 優(yōu)選是選自-OR2、-NR2aR2。、-C (0) 0R2a、-NR2aS (0) 2R2b 和-CQ_6 烷基-S (0) 2NR2bR2c;的
成員。更優(yōu)選Z是選自-OH、-O-C1,烷基-C00H、-O-C1,烷基、-0-C2_6鏈烯基、-NH6烷
基)2、-NHSO2CH3 和
N^的成員。最優(yōu)選Z是-O-CV6烷基-COOHc l^NH
特別優(yōu)選的化合物包括下列化合物
最優(yōu)選的化合物(7291-0042)具有下式 在一些化合物中，Z包括羧酸。當Z包括羧酸時，本發(fā)明的化合物可以彼此相互作 用形成二聚體，即兩個相同分子通過共價鍵或氫鍵等連接在一起的復(fù)合物。在本發(fā)明中，二 聚體通過羧酸經(jīng)氫鍵形成，例如如下所示 構(gòu)。
其它官能團也能夠形成本發(fā)明的化合物的二聚體。圖6A顯示了其它二聚體的結(jié)
Z還可以是模擬羧酸基團的基團。在科學(xué)文獻中已經(jīng)描述了很多也稱為首基的這 類基團。圖6B中顯示了一些這類基團。如果主要骨架保持不變，則可以使用多種首基、包 括 7291-0042 中-0-CH2-C00-。在所有上述化合物的描述中，對化合物的稱謂包括其鹽、水合物、溶劑合物、二聚 體和異構(gòu)體，除非上下文有明顯說明。III.篩詵系統(tǒng)實施例中描述了證明化合物7291-0042活性的篩選系統(tǒng)?？梢允褂孟嗤土硗獾?篩選方法來證實其它化合物的活性。一些篩選方法包括在適宜的結(jié)合條件下使(i)已知與 致癌HPV E6PL肽結(jié)合的PDZ-結(jié)構(gòu)域多肽(例如MAGI-1)和(ii) PL肽在受試化合物的存 在下接觸。然后檢測是否存在復(fù)合物。在受試化合物存在下的復(fù)合物存在水平在統(tǒng)計學(xué)上 顯著高于沒有受試化合物存在下的存在水平表明該受試化合物是激動劑，而在受試化合物 存在下的復(fù)合物存在水平在統(tǒng)計學(xué)上顯著低于沒有受試化合物存在下的存在水平表明該 受試化合物是拮抗劑或抑制劑。這類分析的詳情在例如美國公開號US 2007/0099199中 有描述。對于細胞中PDZ與PL之間結(jié)合的抑制進行了類似的試驗(例如參見美國專利US 5，569，608 ；6, 297，020 ；和6，403，383)。拮抗劑優(yōu)選使PDZ-PL結(jié)合減少了至少約40%、優(yōu) 選至少約50%、通常至少約70%、甚至多達至少約90%。還測試了化合物在抑制癌細胞和癌癥動物模型中增殖的活性。通過使用標準技術(shù) 如皮下注射、尾靜脈注射、脾移植、腹膜內(nèi)植入、腎囊下植入或orthopin植入將腫瘤細胞導(dǎo) 入同系小鼠，例如將宮頸癌細胞植入宮頸組織中，可以產(chǎn)生動物模型。免疫缺陷小鼠、特別 是裸鼠可特別用于該試驗(例如參見The Nude Mouse in Oncology Research，Ε. Boven和 B. Winograd編輯，CRC出版有限公司，1991)。導(dǎo)入該動物的細胞可以來源于已知的宮頸癌 細胞系如HeLa、SiHa細胞系或其它癌癥的細胞系。腫瘤或癌細胞樣品可以采用標準條件、 包括在液氮中冷凍和貯存從進行手術(shù)的患者獲得?？梢允褂棉D(zhuǎn)基因小鼠研究來檢查化合物對宮頸結(jié)構(gòu)不良和癌發(fā)生的活性。已經(jīng)制 備了在不同啟動子控制下的“高?！盓6-E7小鼠的大量轉(zhuǎn)基因品系。這些模型中的一些產(chǎn) 生了與在子宮頸上皮內(nèi)瘤形成(CIN)中觀察到的惡變前改變相似的損害。一些轉(zhuǎn)基因小鼠 品系表達腫瘤發(fā)生前增殖性的難以分化的上皮損害；一些不形成新生物腫瘤，但是在上皮 中形成增生改變(Griep 等人，1993，J Virol 67 1373-1384 ；Greenhalgh 等人，1994，Cell Growth and Differentiation, 19945 (6) :667_75)。其它癌類型的轉(zhuǎn)基因小鼠模型包括敲 除腫瘤抑制基因的小鼠和具有插入的其它癌基因的小鼠。可以通過測定用受試化合物處理前后腫瘤的大小來確定受試化合物對動物模型 的腫瘤的效力。所植入腫瘤的大小可以用游標卡尺在2或3個方向測定，并采用數(shù)學(xué)公式 轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的體積。IV. i舌合于治療的警治療者適合于治療的受治療者包括癌癥受治療者和尚未患有癌癥、但處于發(fā)生癌癥危險 中的受治療者?？赏ㄟ^該方法治療的癌癥實例包括腎癌、乳癌、腦腫瘤、慢性或急性白血病、 包括急性髓樣白血病、慢性髓樣白血病、急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、淋巴 瘤(例如霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、淋巴細胞淋巴瘤、原發(fā)性CNS淋巴瘤、T-細胞淋巴瘤) 和鼻咽癌(nasopharangeal carcinomas)、黑素瘤(例如轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤)、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮膚或眼內(nèi)惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸 癌、肛門區(qū)癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、食道 癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、 兒童實體瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤、腫瘤血管發(fā)生、脊 柱腫瘤(spinal axis tumor)、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細 胞癌、環(huán)境誘發(fā)的癌癥、包括石棉誘發(fā)的癌癥如間皮瘤和所述癌癥的組合。處于發(fā)生癌癥危險中的受治療者包括如通過遺傳性變體或患有該疾病的親屬所 顯示的那樣具有已知的癌癥遺傳危險的受治療者。處危受治療者還包括具有癌前細胞或患 有使他們易患癌癥的感染的受治療者。處危受治療者還包括已經(jīng)或即將接受帶來癌癥發(fā)生 危險的操作或經(jīng)歷的個體。所述受治療者包括接受用于不同類型癌癥的治療，其中放射和 很多形式的化學(xué)治療本身是致癌的。所述受治療者還包括已經(jīng)接觸放射或致癌化學(xué)物質(zhì)的 那些。本發(fā)明的方法尤其可用于感染了 HPV的致癌株或處于這種感染危險中的受治療 者。感染了致癌HPV的受治療者是具有含致癌HPV的細胞的受治療者。致癌株的實例包括 16、18、31、33和35。細胞中的HPV可能不顯示任何其它表型(即感染了 HPV的細胞不一定 是癌性的)。換言之，感染了 HPV的細胞在其它方面可以是正常細胞、癌前期(宮頸結(jié)構(gòu)不 良)細胞或癌細胞。與HPV感染相關(guān)的癌癥包括宮頸癌以及肛門癌、外陰癌、陰道癌、陰莖 癌和一些類型的頭頸癌。宮頸癌是宮頸惡性癌癥。幾乎所有的宮頸癌受治療者都感染了致癌HPV。但是，感 染致癌HPV不一定導(dǎo)致宮頸癌。感染HPV的細胞可以是并且可以保持是癌前期的。例如， 子宮頸上皮內(nèi)瘤形成或CIN是宮頸中癌前細胞的異常生長。大多數(shù)CIN病例都保持穩(wěn)定或 者未經(jīng)多年的干預(yù)而被患者的免疫系統(tǒng)消除。但是，小百分比的病例發(fā)展為宮頸癌。宮頸 癌的病理類型包括(i)子宮頸上皮內(nèi)瘤形成，它是宮頸癌的前體；(ii)癌性惡性病，例如 鱗狀細胞癌、腺癌、腺鱗狀癌、小細胞癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌；和(iii)非癌性惡性病，例如黑素 瘤和淋巴瘤。宮頸癌前期和早期癌癥通常不顯示癥狀。處于致癌HPV感染危險中的受治療者包括早期具有性經(jīng)驗的受治療者，具有多個 性伴侶的受治療者，與具有多個性伴侶的伴侶發(fā)生性關(guān)系的受治療者，吸煙者，有許多孩 子、長期使用避孕丸或具有HIV感染或衣原體屬(Chlamydia)感染的受治療者。處于已知的宮頸癌遺傳危險的受治療者包括有女性親屬已經(jīng)經(jīng)歷了該疾病的那 些和通過基因或生物化學(xué)標記分析確定了其危險的那些。宮頸癌危險的基因標記可以包括 P53基因中的突變。具體而言，在密碼子72上具有精氨酸的p53蛋白顯示比在密碼子72 上具有脯氨酸的P53更容易出現(xiàn)E6-誘導(dǎo)的體內(nèi)降解，并且精氨酸編碼的等位基因編碼的 純合性在患有HPV-相關(guān)的宮頸鱗癌的個體種系中比在對照群體中以顯著較高的頻率被發(fā) 現(xiàn)。對于P53的精氨酸編碼的等位基因而言純合的受治療者對HPV-相關(guān)的宮頸腫瘤發(fā)生 的易感性比雜合子高7倍(參見Storey等人，1998，Nature 393:229-234)。還包括具有弱 免疫系統(tǒng)的受治療者，他們抗擊HPV感染的能力比其它人低。目前正患有宮頸癌的受治療者可以從宮頸癌測試中識別，例如巴帕尼科拉烏 (Pap)試驗、盆腔檢查、HPV DNA試驗、陰道鏡檢查或?qū)m頸活檢以及上述危險因素的存在。肛門癌是來源于肛門、即胃腸道遠端開口的一類癌癥。肛門癌通常是在接近鱗狀柱狀上皮接合處出現(xiàn)的鱗狀細胞癌。肛門癌的危險因素與宮頸癌類似，并且與宮頸一樣， 肛管含有可以被HPV感染、導(dǎo)致?lián)p害發(fā)生的變性帶。HPV感染被視為是肛門癌的可能前體 而不是必然原因，因為它是對宮頸癌而言的(Gagne等人，2005，J Acquir Immune Defic Syndr· 40 182-189. ；Frisch 等人，1999，Cancer Res. 59 :753_757)。在與男性發(fā)生性關(guān)系 的性活躍男性中還已經(jīng)報道了肛門鱗狀上皮損害、即肛門癌前體的高發(fā)生率，這可能反映 正在接觸 HPV (Chin-Hong 等人，2005，J Acquir ImmuneDefic Syndr. 40 :463_471)。陰莖癌是在陰莖皮膚上或組織中發(fā)現(xiàn)的惡性生長，通常起源于陰莖頭和/或包 皮。與宮頸癌一樣，在陰莖癌中常發(fā)現(xiàn)HPV 16 (Salazar等人，2005，Arch. Androl. 51: 327-334)。該類受治療者包括具有可導(dǎo)致陰莖癌的致癌HPV感染的受治療者、吸煙受治療 者和未進行環(huán)切的受治療者。陰莖癌的病理學(xué)包括(i)癌前皮膚損害；(ii)原位癌(鮑恩 病、凱拉特增殖性紅斑)；和(iii)陰莖的侵襲癌。外陰癌是一種在外陰(女性外生殖器)中的惡性侵襲性生長，占所有婦科癌癥的 約4%并且通常影響女性的晚年生活。HPV 16感染使發(fā)生外陰癌和侵襲前外陰損害的危險 增加了約4. 5倍。HPV 18感染與發(fā)生侵襲前損害之間的相關(guān)性也已經(jīng)得到證實(Bjorge等 人，1997，BMJ 315:646-649)。外陰癌的病理學(xué)類型包括鱗狀細胞癌、黑素瘤、基底細胞癌、 腺癌和肉瘤。陰道癌是在陰道組織中形成的一類癌。陰道從宮頸(子宮開口)通向身體外部。陰 道癌類型包括鱗狀細胞癌和腺癌。危險因素包括其母親使用己烯雌酚(DES)來預(yù)防流產(chǎn)或 先兆流產(chǎn)的女性受治療者。HPV 16被證明與發(fā)生陰道癌和發(fā)生侵襲前陰道損害危險增加相 關(guān)。HPV 18感染增加了發(fā)生侵襲前損害的危險(Bj0rge等人，1997，BMJ 315:646-649)。術(shù)語“頭頸癌”指一組來源于上呼吸消化道、包括唇、口腔(口)、鼻腔、鼻旁竇、咽 和喉的在生物學(xué)上相似的癌癥。大部分頭頸癌是來源于這些區(qū)域的粘膜內(nèi)層(上皮)的鱗 狀細胞癌。頭頸癌通常擴散至頸淋巴結(jié)，這是該疾病在診斷時的第一(有時是唯一的)表 現(xiàn)。頭頸癌與一些環(huán)境和生活方式危險因素緊密相關(guān)，包括吸煙、飲酒和一些HPV株。一些頭頸癌與HPV感染的相關(guān)性遠比頭頸其它區(qū)域的癌癥密切。在口腔和扁桃體 癌的組織中已經(jīng)檢測到HPV DNA?？谘树[狀細胞癌被證明與HPV感染相關(guān)(D' Souza等人， 2007，N. Engl. J.Med. 356 1944-1956)。還證明了食管癌與 HPV 感染、特別是 HPV 16 相關(guān) (Bj0rge等人，1997，Cancer Res. 57 :3989_3992)。V.治療方法和藥物組合物本發(fā)明的化合物可以用于癌癥、例如上文所述任意類型的癌癥的治療或預(yù)防方 法。在預(yù)防應(yīng)用中，給處于發(fā)生疾病或紊亂危險的個體以有效抑制、延遲或降低發(fā)生該疾病 或紊亂危險的方案(即施用劑量、頻率和途徑)施用本發(fā)明的化合物。例如，對于預(yù)防癌癥， 給處于發(fā)生癌癥危險的個體以有效抑制、延遲或降低發(fā)生該癌癥危險的方案施用化合物。 對于預(yù)防致癌HPV感染，給處于HPV感染危險的個體以有效抑制、延遲或降低HPV感染危險 的方案施用化合物。在治療應(yīng)用中，給懷疑患有或已知患有疾病的個體以有效降低、消除或 抑制該疾病或其后遺癥的至少一種征候或癥狀的進一步發(fā)展的方案施用化合物。例如，對 于治療癌癥，以有效降低或消除癌癥或至少抑制患者狀況由于癌癥進一步惡化的方案施用 化合物。對于治療HPV感染，以有效降低或消除感染或至少抑制感染及其后遺癥的進一步 惡化、例如發(fā)生宮頸結(jié)構(gòu)不良、然后發(fā)生宮頸癌的方案施用化合物。在預(yù)防和治療方案中，通常分數(shù)個劑量施用化合物，例如每日，直到已經(jīng)達到足夠的響應(yīng)。但是，在預(yù)防和治療方 案中，可以以單劑量施用活性化合物。通常，對治療進行監(jiān)測，并且可以給予重復(fù)劑量。施用于受治療者的本發(fā)明組合物的實際劑量可以由臨床醫(yī)師和生理因素如體 重、病癥嚴重性、所治療疾病的類型、在先或并行的治療干預(yù)、受治療者的特發(fā)病以及施用 方式和/或途徑來確定。本發(fā)明化合物的治療有效劑量可以提供治療益處而沒有導(dǎo)致明 顯的毒性?？梢酝ㄟ^標準藥學(xué)方法在細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏袦y定化合物的毒性，例如 通過測定LD5tl(50%群體致死的劑量)或LD1CICI(100%群體致死的劑量)。毒性與治療效果 之間的劑量比是治療指數(shù)(例如參見Fingl等人，1975 :The Pharmacological Basis of Therapeutics,第 1 章，第 1 段)。示例性的劑量包括每次施用約1微克/kg/體重、約5微克/kg/體重、約10微克 /kg/體重、約50微克/kg/體重、約100微克/kg/體重、約200微克/kg/體重、約350微 克/kg/體重、約500微克/kg/體重、約1毫克/kg/體重、約5毫克/kg/體重、約10毫克/ kg/體重、約50毫克/kg/體重、約100毫克/kg/體重、約200毫克/kg/體重、約350毫克 /kg/體k重、約500毫克/kg/體重至1000mg/kg/體重或以上和其中可推導(dǎo)的任意范圍。 示例性的范圍，在來自本文所列數(shù)字的可推導(dǎo)范圍的非限制性實例中，根據(jù)上文所述數(shù)字 可以施用約5mg/kg/體重至約100mg/kg/體重、約5微克/kg/體重至約500毫克/kg/體 重的范圍。 在癥狀可檢測或者甚至是不可檢測時可以間歇地重復(fù)治療。治療可以被單獨提供 或者與有效治療HPV感染或癌癥或?qū)ζ溥M行預(yù)防的其它藥物(如化療、放射或手術(shù))組合 地被提供。本發(fā)明的化合物可以單獨或以藥物組合物的形式施用于受治療者。藥物組合物優(yōu) 選是適于施用于人的形式，包括在FDA或相似主體的GMP規(guī)范下制備。用于胃腸道外施用 的組合物優(yōu)選是基本上等滲的、無菌的和基本上無熱原的，等等?？梢酝ㄟ^常規(guī)的混合、溶 解、制粒、制錠、研磨、乳化、包囊、捕獲或冷凍干燥方法制備包含本發(fā)明化合物的藥物組合 物?？梢圆捎靡环N或多種生理學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或輔助劑(幫助將活性肽 或肽類似物加工成可以在藥學(xué)上使用的制備物)以常規(guī)方法配制藥物組合物。適當?shù)闹苿?取決于所選的施用途徑。就局部施用而言，可以將本發(fā)明的化合物配制成溶液、凝膠、軟膏劑、霜劑、混懸劑寸。全身用制劑包括為通過注射如皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鞘內(nèi)或腹膜內(nèi)注射施用而設(shè)計 的制劑和為透皮、透粘膜、口服施用或肺施用而設(shè)計的制劑。對于注射，可以將本發(fā)明的化合物配制成水溶液，優(yōu)選在生理可接受的緩沖液如 Hanks溶液、Ringer溶液或生理鹽水緩沖液中。溶液可以含有配制劑如助懸劑、穩(wěn)定劑和/ 或分散劑?；蛘?，化合物可以是用于在使用前用適宜的溶媒如無菌無熱原的水重構(gòu)的粉末形 式。對于透粘膜施用，在制劑中使用適于欲滲透屏障的滲透劑。該施用途徑可用于將 化合物遞送至鼻腔。對于口服施用，通過將活性肽或肽類似物與可藥用載體合并可以容易地配制化合物。所述載體能夠?qū)⒈景l(fā)明的化合物配制成片劑、丸劑、錠劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿劑、膏 齊U、混懸劑等，用于由所治療患者口服攝入。就口服固體制劑如粉末、膠囊和片劑而言，適宜 的賦形劑包括填充劑，例如糖，如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；纖維素制品，例如玉米淀粉、 小麥淀粉、米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖 維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；制粒劑；和粘合劑。如果需要的話，可以加入崩解劑 如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽如海藻酸鈉。如果需要的話，固體劑型可以采用標準技術(shù)包糖衣或包腸溶衣。就口服液體制劑如混懸液、酏劑和溶液而言，適宜的載體、賦形劑或稀釋劑包括 水、二醇、油、醇。另外，可以加入矯味劑、防腐劑、著色劑等。對于含服施用，化合物可以采取以常規(guī)方式配制的片劑、錠劑等形式。對于吸入施用，根據(jù)本發(fā)明使用的化合物可以方便地使用適宜拋射劑以來自加壓 藥包和噴霧器的氣霧劑形式遞送，所述拋射劑例如有二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟 乙烷、二氧化碳或其它適宜氣體。就加壓氣霧劑而言，劑量單位可以通過提供遞送確定量的 閥門來確定?？梢灾苽溆糜谖肫骰虼等肫鞯睦缑髂z膠囊和藥筒，它們含有化合物和適 宜粉末基質(zhì)如乳糖和淀粉的粉末混合物。還可以將化合物配制成直腸或陰道用組合物如栓劑或滯留型灌腸劑，例如它們含 有常規(guī)的栓劑基質(zhì)如可可脂或其它甘油酯。局部用組合物和含藥載體(例如含藥“棉塞”) 也可用于這種施用途徑。除上述制劑外，還可以將化合物配制成貯庫制劑。這種長效制劑可以通過植入 (例如皮下或肌內(nèi))或通過肌注射施用。因此，例如，可以使用適宜的聚合材料或疏水性材 料(例如配制成在可接受油中的乳劑)或離子交換樹脂配制化合物或者配制成略溶性衍生 物如略溶性鹽。或者，可以使用其它藥物遞送系統(tǒng)。脂質(zhì)體和乳劑是熟知的可用于遞送本發(fā)明的 肽和肽類似物的遞送載體實例。還可以使用一些有機溶劑如二甲亞砜，雖然通常以較大毒 性為代價。另外，可以使用緩釋系統(tǒng)如含有治療劑的固體聚合物的半透性基質(zhì)來遞送化合 物。已經(jīng)確立了多種緩釋材料，它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。緩釋膠囊根據(jù)其化學(xué)性 質(zhì)可以釋放化合物達數(shù)周至100天以上。根據(jù)治療劑的化學(xué)性質(zhì)和生物穩(wěn)定性，可以使用 另外的用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的策略。本發(fā)明的藥物組合物可以包含例如至少約0. 的活性化合物?；钚曰衔锟梢?占單位的例如約2%至約75%重量或約25%至約60%以及其中可推導(dǎo)的任意范圍。P.藥盒還提供了用于實施一種或多種上述方法的藥盒。該藥盒含有本發(fā)明的化合物以及 使用該活性劑來治療或預(yù)防致癌HPV病毒感染的說明書。
實施例實施例1.破壞HPV E6蛋白與MAGI-1PDZ結(jié)構(gòu)域1之間相互作用的化合物的鑒定將MAGI-1PDZ結(jié)構(gòu)域1用作推理性藥物設(shè)計的靶標以鑒定用于治療HPV的化合 物。本實驗以如下發(fā)現(xiàn)為前提HPV的致癌性基于體內(nèi)HPVE6PL與PDZ蛋白之間的相互作 用。特異性破壞這種相互作用的化合物可以提供比目前使用的那些更有效和侵害性更小的治療。進行了采用MAGI-1PDZ結(jié)構(gòu)域1結(jié)構(gòu)的分子模型化，以鑒定能夠破壞HPV E6蛋白 與MAGI-1PDZ1之間相互作用的候選化合物。使用具有Accelrys軟件(Accelrys，圣地亞 哥，加利福尼亞)的In silico篩選來構(gòu)造和?？烤哂蠱AGI-I蛋白的PDZl結(jié)構(gòu)域的分子 文庫(ChemDiv，圣地亞哥，加利福尼亞；Blanca Pharmaceuticals, Mountain View，加利福 尼亞)。分子模型化基于發(fā)現(xiàn)具有與MAGI-1PDZ1經(jīng)由靜電作用、氫鍵和疏水相互作用發(fā)生 相互作用的能力的化合物。將In silico篩選的最佳目標進行矩陣/陣列競爭性分析形式(即在如別處所述 的小分子競爭劑的存在和不存在下評估配體向融合蛋白中固相PDZ結(jié)構(gòu)域的?？康姆治? 的篩選。篩選出抑制PDZ/PL相互作用的化合物。根據(jù)分析的OD45tl讀數(shù)，小分子被視為目標。然后，該分析中目標的最佳者進行滴 定結(jié)合研究，即逐漸增加相同競爭性分析中的化合物以評估IC5tl值。這些篩選的結(jié)構(gòu)示于 表1。表1 根據(jù)In silico篩選，鑒定出各種破壞PDZ/PL相互作用的化合物。如表1所示， 化合物7291-0042以最大的特異性破壞了 HPV E6蛋白與MAGI-1PDZ1之間的相互作用。實施例2.化合物7291-0042對細胞遷移的作用在三種不同細胞系3YlpBlast、3YlpBlast-E6_16 和 3YlpBlast E6-16 Δ PL 上測定 了化合物7291-0042對細胞遷移速率和增殖的作用。采用載體pBlast(InvivoGen，Toulouse,法國)生成 HPV E6_16(野生型)和 HPV E6-16 Δ PL的質(zhì)粒構(gòu)建體。通過本領(lǐng)域已知的重組DNA克隆法生成重組質(zhì)粒。使用LipofectAMINETM2000 試劑(Invitrogen 目錄號11668-027)和伴隨的方案 將這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入大鼠3Y1初級細胞中。將不含插入物的pBlast進行轉(zhuǎn)染作為陰性對 照。將細胞于37°C在含有非必需氨基酸、10% FBS和lug/mL G418的RPMI培養(yǎng)基中孵育直 至匯合(約4天)。
將三種轉(zhuǎn)染的細胞系各自在具有供料盤和蓋的96-孔濾板上在具有0. 5 %至10 % FBS梯度和非必需氨基酸的RPMI培養(yǎng)基中接種。將三種不同處理施加于細胞系。將細胞用 40 μ M或60 μ M化合物7291-0042或DMSO處理。濾器插入物各自具有8 μ M孔的聚碳酸酯 膜。保持濾器底面未包被。侵害性和遷移細胞響應(yīng)于化學(xué)誘導(dǎo)物通過濾器的孔遷移，緊貼 至聚碳酸酯膜的底部。通過膜的細胞遷移通過用比色染料(colorometric dye)將粘附至 膜底側(cè)的細胞染色24小時后用微量板讀數(shù)器于OD56tl進行定量。遷移試驗的結(jié)果顯示用化合物7291-0042處理恢復(fù)了基線細胞遷移。換言之，表 達野生型E6蛋白的3YlpBlast-E6-16細胞顯示出細胞遷移增加(參見圖1，DMSO對照)。 但是，當用40 μ M化合物7291-0042處理這些細胞時，細胞遷移速率與缺少E6PL基元的 3YlpBlast E6-16APL相似。參見圖1。已經(jīng)顯示HPV E6-16細胞的細胞遷移是PL依賴性 的，正如E6野生型細胞遷移快于Δ PL細胞所證實的那樣。結(jié)果顯示，化合物7291-0042破 壞了 PL基元與PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合的能力和由此將細胞遷移速率恢復(fù)至Δ PL細胞的細胞遷移 速率。實施例3.化合物7291-0042對細胞增殖的作用通過細胞增殖試驗進一步分析了化合物7291-0042阻斷細胞中發(fā)生其它癌性特 征的能力。將實施例2中所述的三種細胞系接種在12-孔板上，使其粘附和在含有10% FBS和非必需氨基酸的EMEM培養(yǎng)基中生長至匯合(約24小時)。將0 μ Μ、20 μ Μ、40 μ M和 80 μ M濃度的100 μ 1化合物7291-0042應(yīng)用于細胞。在添加化合物后24、48、72和96小時 測定細胞。細胞增殖試驗的結(jié)果顯示，用化合物7291-0042處理恢復(fù)了基線細胞增殖速率。 在未添加化合物7291-0042的情況下，表達野生型Ε6蛋白的3YlpBlast-E6-16細胞顯示 細胞增殖增加。但是，當用40 μ M化合物7291-0042處理這些細胞時，細胞增殖速率與 3YlpBlast E6-16 Δ PL 和 3YlpBlast 相似。參見圖 2A、2B 和 2C。因此，根據(jù)實施例2和3的這些結(jié)果，來自HPV致癌株的E6蛋白上的PL基元是發(fā) 生癌性特征如細胞遷移和細胞增殖所必需的。結(jié)果證實，化合物7291-0042能夠破壞E6PL 基元與PDZ結(jié)構(gòu)域的結(jié)合和由此阻斷細胞中這類癌性特征的發(fā)生。實施例4.化合物7291-0042在細胞中的藥物毒性研究為了測定化合物7291-0042的細胞毒性，在HPV-陽性(E6轉(zhuǎn)化的)宮頸癌細胞系 SiHa和HeLa以及HPV-陰性宮頸癌細胞系C33a中進行了藥物毒性研究。將C33a和SiHa 細胞接種在12-孔板上，使其粘附和生長至10，000個細胞/孔。接種HeLa細胞，使其粘附 和生長至5，000個細胞/孔。鋪板后24小時向細胞中加入60 μ M濃度的100 μ 1化合物 7291-0042或DMS0。通過WST-I比色測試評估了細胞的細胞毒性。簡言之，比色測定以四 唑鐺鹽WST-I通過活細胞中的線粒體琥珀酸鹽-四唑鐺鹽還原酶裂解為甲A替類染料為基 礎(chǔ)。當細胞增殖時，更多WST-I被轉(zhuǎn)化成甲月替產(chǎn)物。甲月替染料的量與代謝活性細胞的數(shù)量 成正比，并且可以通過在多孔板讀數(shù)器上于420-480nm(Amax450nm)測定吸光度進行定量。結(jié)果顯示當用化合物7291-0042處理時，選擇性地殺死了 E6轉(zhuǎn)化宮頸癌細胞系 SiHa和HeLa細胞，而HPV-陰性C33a細胞保持存活。在DMSO對照組中，所有細胞保持存 活。參見圖3。結(jié)果表明化合物7291-0042對E6宮頸癌細胞具有選擇性毒性，這提供了化 合物7291-0042可用作治療宮頸癌的藥物的證據(jù)。
實施例5.化合物7291-0042對E6癌蛋白質(zhì)表汰的作用為了確定化合物7291-0042是否對E6蛋白表達有作用，使用了宮頸癌細胞系 HeLa。接種HeLa細胞，使其粘附和生長至0. 5X IO6個細胞/孔。鋪板后24小時向細胞中 加入60 μ Μ、80 μ Μ、100 μ Μ、120 μ M濃度的化合物7291-0042或DMSO,孵育24小時。未經(jīng)處 理的細胞用作另外的對照。進行蛋白質(zhì)印跡以測定不同樣品中存在的Ε6蛋白的相對量。簡 言之，在裂解緩沖液中勻化細胞，用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)樣品并轉(zhuǎn)移至膜上用于檢測。將 膜與抗-HPV18-E6抗體一起孵育，用二次抗體_酶綴合物標記，檢測。為了確保每一樣品加 載的蛋白質(zhì)的量相似，剝離膜并用識別編碼管家基因的蛋白質(zhì)的抗體進行標記。就本實驗 而言，使用對抗3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的抗體。對蛋白質(zhì)印跡中檢測的信號進行定量。結(jié)果顯示當用化合物7291-0042處理 HeLa細胞時，Ε6癌蛋白的量與DMSO對照和未經(jīng)處理的細胞相比減少(參見圖4Α和4Β)。實施例6.化合物7291-0042對d53腫瘤抑制蛋白表汰的作用為了確定化合物7291-0042是否對p53蛋白質(zhì)表達具有作用，使用了宮頸癌細胞 系HeLa。接種HeLa細胞，使其粘附和生長至0. 5 X IO6個細胞/孔。鋪板后24小時向細胞中 加入80 μ Μ、100 μ Μ、120 μ M濃度的Iml化合物7291-0042或DMS0，孵育24小時。使用抗-p53 單克隆抗體進行免疫細胞化學(xué)測定以測定不同細胞樣品中存在的P53蛋白的相對量。結(jié)果顯示當用化合物7291-0042處理HeLa細胞時，p53腫瘤抑制蛋白的量比 DMSO對照細胞相比增加(參見圖5)。用化合物處理后的細胞的細胞學(xué)顯示出伴有細胞皺 縮的形態(tài)學(xué)改變。實施例7.化合物7291-0042選擇性地誘導(dǎo)HPV-陽性宮頸癌細胞中的細胞凋亡為了確定化合物7291-0042是否誘導(dǎo)HPV-陽性宮頸癌細胞系中的細胞凋亡，使用 了 HeLa細胞和HPV-陰性細胞系C33A。將HeLa和C33A細胞以1-2 X IO6接種在10-cm平 皿中，使其粘附和生長至80-90%匯合。鋪板后24小時向細胞中加入60 μ Μ、80 μ Μ、100 μ Μ、 120 μ M濃度的化合物7291-0042或DMS0，孵育48小時。采用來自普洛麥格(Promega)公 司(Madison，WI)的DeadEnd Fluorometric TUNEL系統(tǒng)進行TUNEL試驗以便對細胞群內(nèi)的 凋亡細胞進行具體定量。簡言之，通過胰蛋白酶消化收集細胞，在PBS中洗滌。然后將細胞 在4%福爾馬林中固定，在含有核苷酸和rTdT酶的緩沖液中于37°C孵育1小時。添加EDTA 終止反應(yīng)后，將細胞用PBS洗滌，用Triton X_100進行滲透化處理，加入碘化丙啶以染色所 有細胞。然后通過流式細胞術(shù)分析細胞。通過在520士20nm測定熒光素-12-dUTP的綠色 熒光和在> 620nm測定碘化丙啶的紅色熒光對細胞凋亡信號進行定量。如圖7所示，7291-0042在120M在20%的HeLa細胞中誘導(dǎo)了細胞凋亡，而在該濃 度下僅4%的C33A細胞發(fā)生細胞凋亡。該結(jié)果證實7291-0042選擇性地誘導(dǎo)HPV-陽性癌 細胞的細胞凋亡。盡管已經(jīng)為清楚理解的目的詳細描述了上述本發(fā)明，但是顯而易見可以在所附權(quán) 利要求的范圍內(nèi)實施一些變通。本文引用的所有出版物和專利文件以如同各自單獨表示的 那樣相同的程度整體引入本文作為所有目的的參考。本發(fā)明的任意實施方案、元素、特征或 步驟可以與任意其它實施方案、元素、特征或步驟組合使用，上下文明顯地指出除外。由上 文顯而易見的是，本發(fā)明提供了多種用途。例如，本發(fā)明提供了任意上述化合物在治療、預(yù) 防或診斷疾病、特別是癌癥和/或HPV感染及其后遺癥中的用途。
權(quán)利要求
治療致癌人型乳頭瘤病毒(HPV)感染或?qū)ζ溥M行預(yù)防的方法，該方法包括給具有HPV感染或處于HPV感染危險中的受治療者施用治療該感染或其后遺癥或?qū)ζ溥M行預(yù)防的化合物及其鹽、水合物、溶劑合物、二聚體和異構(gòu)體的有效方案，所述化合物具有式I結(jié)構(gòu)其中X各自是具有5 10個環(huán)原子的雜芳基環(huán)系，其中1 4個環(huán)原子是各自獨立地選自N、O和S的雜原子，其中所述雜芳基環(huán)系被0 6個R1基團取代；R1各自獨立地選自H、C1 6烷基、C2 6鏈烯基、C2 6炔基、C1 6烷氧基、鹵素、C1 6鹵代烷基、 C0 6烷基 OR1a、 NR1aR1b、 CN、 C(O)R1a、 C(O)OR1a、 OC(O)R1a、 C(O)NR1aR1b、 N(R1a)C(O)R1b、 OC(O)NR1aR1b、 N(R1a)C(O)OR1b、 NR1aC(O)NR1bR1c、 NO2、 C0 6烷基 芳基、雜芳基、環(huán)烷基和雜環(huán)烷基；R1a、R1b和R1c各自獨立地選自H和C1 6烷基；Y是選自CH和N的成員；Z是選自 OR2、 NR2aR2c、 C1 6烷基 C(O)OR2a、 C(O)R2a、 C(O)OR2a、 OC(O)R2a、 C(O)NR2aR2b、 N(R2a)C(O)R2b、 OC(O)NR2aR2b、 N(R2a)C(O)OR2b、 NR2aC(O)NR2bR2c、 NR2aS(O)2R2b、 C0 6烷基 S(O)2NR2bR2c的成員；R2各自獨立地選自H、C1 6烷基、C2 6鏈烯基、C2 6炔基、 C1 6烷基 C(O)OR2a；R2a、R2b和R2c各自獨立地選自H、C1 6烷基，或者R2b和R2c一起形成雜環(huán)烷基；R3各自獨立地是選自H、C1 6烷基和 CH(C(O)O C1 6烷基)2的成員；R4各自獨立地是選自H、C1 6烷基、C2 6鏈烯基、C2 6炔基、C1 6烷氧基、鹵素和C1 6鹵代烷基的成員；下標n和o各自獨立地是1或2，以便o和p之和是3；下標p是0 4。FPA00001176822200011.tif
2.權(quán)利要求1的方法，其中化合物具有式IA結(jié)構(gòu)其中 X各自獨立地選自具有5-10個環(huán)原子的雜芳基環(huán)系，其中1-4個環(huán)原子是各自獨立地 選自Ν、0和S的雜原子，其中至少一個環(huán)原子是N，并且其中所述雜芳基環(huán)系被0-4個R1基 團取代。
3.權(quán)利要求2的方法，其中X各自獨立地選自
4.權(quán)利要求3的方法，其中每個X是相同的<
5.權(quán)利要求3的方法，其中X各自是
6.權(quán)利要求1 的方法，其中 Z 是選自-OR2、-NR2aR2。、-C (0) 0R2a、-NR2aS (0) 2R2b 和 _CQ_6 燒 基-S(0)2NR2bR2。的成員。
7.權(quán)利要求6的方法，其中Z是選自-OH、-O-CV6烷基-C00H、-O-C1^6烷基、_0_C2_6鏈烯基、-N (-C1^6 烷基)2、-NHSO2CH3 和 的成員
8.權(quán)利要求7的方法，其中Z是-O-Cp6烷基-COOHc
9.權(quán)利要求1的方法，其中化合物選自
10.權(quán)利要求1的方法，其中化合物具有下式結(jié)構(gòu)
11.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述化合物抑制HPVE6蛋白與多肽的結(jié)合，所 述多肽包含來自MAGI-I的第一 PDZ結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
12.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中受治療者感染了HPV。
13.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中受治療者患有宮頸癌。
14.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中受治療者患有宮頸結(jié)構(gòu)不良。
15.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中受治療者處于HPV感染危險中。
16.前述權(quán)利要求任一項的方法，該方法包括給患有癌癥或處于癌癥危險中的受治療 者施用化合物的有效方案，由此所述化合物治療癌癥或?qū)ζ溥M行預(yù)防。
17.權(quán)利要求16的方法，其中受治療者感染了致癌人型乳頭瘤病毒。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述癌癥是宮頸癌、陰道癌、肛門癌或頭頸癌。
19.權(quán)利要求16的方法，其中所述癌癥是乳癌、卵巢癌、腦癌、白血病或淋巴瘤。
20.權(quán)利要求16的方法，其中所述癌癥是宮頸癌。
21.前述權(quán)利要求任一項的化合物。
22.用于治療癌癥或?qū)ζ溥M行預(yù)防的權(quán)利要求21的化合物。
23.用于治療HPV感染或?qū)ζ溥M行預(yù)防的權(quán)利要求21的化合物。
24.權(quán)利要求21的化合物在制備治療癌癥或?qū)ζ溥M行預(yù)防的藥物中的用途。
25.權(quán)利要求21的化合物在制備治療HPV感染或?qū)ζ溥M行預(yù)防的藥物中的用途。全文摘要
本發(fā)明提供了可用于治療癌癥、特別是宮頸癌或?qū)ζ溥M行預(yù)防的化合物。
文檔編號A61K31/405GK101909620SQ200880123670
公開日2010年12月8日 申請日期2008年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日
發(fā)明者A·A·范塔耶, J·施維澤, M·P·貝爾馬里斯, P·S·盧, 王晶晶 申請人:阿爾伯維塔公司