專利名稱：乙型肝炎病毒的耐藥性的識(shí)別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)確認(rèn)乙型肝炎病毒(HBV)核心啟動(dòng)子區(qū)域的基因型而識(shí)別HBV對(duì)拉米夫定(ラミブジン)等乙型慢性肝炎治療藥的耐藥性的方法。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(HBV)的感染者，全世界估計(jì)已達(dá)到3億人左右。HBV的感染引起急性和慢性肝炎(乙型肝炎)，并且導(dǎo)致肝硬化、肝癌。
乙型肝炎的診斷，除肝組織像以外，還使用ALT、HBsAg、HBsAb、HBcAb、HBeAg、HBeAb、HBV聚合酶、HBV-DNA量等血清標(biāo)記。其中，抗病毒藥的療效判定，重視血中HBV-DNA量。即HBV-DNA量明顯下降或達(dá)到測(cè)定靈敏度以下、并長(zhǎng)期維持該狀態(tài)，其他指標(biāo)也良好時(shí)，可判斷為顯示高度療效。
HBV基因?yàn)橛杉s3200堿基對(duì)組成的環(huán)狀不完全雙鏈DNA。該HBV基因的復(fù)制存在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。復(fù)制過(guò)程大致可分成以下4個(gè)階段。
①由細(xì)胞核內(nèi)的內(nèi)源性DNA聚合酶形成完全雙鏈的環(huán)狀DNA，并閉環(huán)而形成共價(jià)閉環(huán)雙鏈DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)的階段。該cccDNA具有超螺旋結(jié)構(gòu)。
②以cccDNA作模板由細(xì)胞的RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄成mRNA的階段。其中最長(zhǎng)的3.5Kb的RNA作為前基因組RNA，成為逆轉(zhuǎn)錄的模板。該RNA的5’和3’末端存在“ε”信號(hào)(衣殼化信號(hào)，encapsidation signal)，其中5’側(cè)的信號(hào)對(duì)前基因組RNA和病毒聚合酶包裝入核心的粒子內(nèi)起著重要作用。
③經(jīng)核心粒子內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶合成作為引物的寡核苷酸，以前基因組DNA作模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成(-)鏈DNA的階段。
④以殘留在前基因組RNA的5’末端的寡核苷酸作引物，以(-)鏈DNA作模板合成(+)鏈DNA的階段。
一般認(rèn)為通過(guò)抑制這些過(guò)程的某一個(gè)，使HBV的基因復(fù)制中止，便可抑制病毒的增殖。特別是HBV的復(fù)制存在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程，人免疫缺陷病毒(HIV)的增殖也有逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程，因此開(kāi)始篩選依賴RNA的DNA聚合酶抑制劑作為治療藥。
拉米夫定也特異性地抑制人免疫缺陷病毒(HIV)復(fù)制過(guò)程中的逆轉(zhuǎn)錄，當(dāng)初作為HIV治療藥進(jìn)行開(kāi)發(fā)，但發(fā)現(xiàn)對(duì)HBV也有增殖抑制作用，自1992年開(kāi)始作為乙型慢性肝炎的治療藥進(jìn)行開(kāi)發(fā)。
拉米夫定對(duì)HBV的作用機(jī)制并未清楚了解，但據(jù)認(rèn)為有下列機(jī)制。拉米夫定是核苷(胞苷)衍生物類抗病毒藥，在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)磷酸化形成三磷酸衍生物，成為活性型。該藥對(duì)HBV增殖的抑制機(jī)制之一是通過(guò)抑制依賴RNA的DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)而抑制前基因組RNA的逆轉(zhuǎn)錄。
另一機(jī)制認(rèn)為是被摻入病毒DNA鏈，中止其伸長(zhǎng)。此外也有報(bào)告說(shuō)，作為對(duì)免疫系統(tǒng)的間接影響，如果通過(guò)服用拉米夫定而引起病毒減少，則血流中的病毒蛋白減少，T細(xì)胞對(duì)HBV抗原便恢復(fù)低反應(yīng)性(Boni C等，Journal of ClinicalInvestigation，102，968-975，1998)。
根據(jù)這樣的作用機(jī)制，拉米夫定作為HBV感染癥的治療藥已被廣泛使用，但也存在血中病毒量難以減少的病例，其后出現(xiàn)耐藥株和肝炎復(fù)發(fā)的問(wèn)題的也很多。為了選擇拉米夫定有效的病例，作為討論病毒基因變化與療效的關(guān)系的研究，主要是很多關(guān)于作為拉米夫定的靶的DNA聚合酶的B和C結(jié)構(gòu)域的研究(Ono-Nita SK等，Hepatology，29，939-945，1999)(Allen MI等，Hepatology，27，1670-1677，1998)，探討其他區(qū)域的報(bào)告很少。
而作為HBV基因型的研究，報(bào)告了比較HBs區(qū)域的序列，確定基因型A-D的基因型的例子(Journal of Medical Virology，2002，68，522-528)。該報(bào)告揭示，由于該基因型的不同，干擾素對(duì)HBr的療效不同。此外，還報(bào)道了核心啟動(dòng)子區(qū)域的基因中HBV-DNA 1896位堿基G突變成A、1899位堿基G突變成A等。然而這些基因的變化，被認(rèn)為不是病毒的基因型，而是感染后的突變，并且與HBV治療的關(guān)系也不清楚(唐澤達(dá)信等、日本臨床增刊號(hào)、分子肝炎病毒學(xué)基礎(chǔ)·臨床·預(yù)防下卷甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒、1995年，52-57)。因此，雖然報(bào)告了核心啟動(dòng)子區(qū)域的基因突變，但沒(méi)有報(bào)告該區(qū)域的突變是HBV基因型的概念。
非專利文獻(xiàn)1Ono-Nita等Hepatology，29，939-945，1999非專利文獻(xiàn)2Allen MI等Hepatology，27，1670-1677，1998非專利文獻(xiàn)3Yuh等Journal of Virology，66，4073-4084，1992
非專利文獻(xiàn)4Honigwachs等，Journal of Virology，63，919-924，1989非專利文獻(xiàn)5Lopez-Cabrera等Proceedings of the national Academy of Sciences of theUnited States of America，87，5069-5073，1990非專利文獻(xiàn)6唐澤達(dá)信等，日本臨床增刊號(hào)、分子肝炎病毒學(xué)基礎(chǔ)·臨床·預(yù)防下卷甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒、1995年，52-57。
發(fā)明的揭示HBV肝炎的藥物治療中，客觀地了解該藥物的效果與HBV的關(guān)系，對(duì)于治療方針和藥物的選擇是有益的信息。本發(fā)明提供從基因工程角度得到對(duì)于HBV肝炎的治療方針與藥物選擇有益的信息的方法。
本發(fā)明者假定HBV肝炎進(jìn)行藥物治療時(shí)的效果受到病毒方面的因素的影響。新發(fā)現(xiàn)參與病毒增殖過(guò)程的基因型的不同，特別是HBV核心啟動(dòng)子區(qū)域的堿基序列的多樣性與藥物對(duì)HBV的效果差異有關(guān)，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明為識(shí)別HBV的耐藥性的方法，包括確認(rèn)乙型肝炎病毒(HBV)核心啟動(dòng)子領(lǐng)域的核酸序列中的基因突變。
而且，本發(fā)明還涉及通過(guò)分離精制血中的HBV-DNA、經(jīng)PCR使HBV核心啟動(dòng)子區(qū)域擴(kuò)增、確定堿基序列，從而鑒定影響藥物療效的核心啟動(dòng)子基因突變的方法。
本發(fā)明還涉及鑒定(檢出)HBV核心啟動(dòng)子核酸序列的變化(突變)幫助預(yù)測(cè)以拉米夫定為代表的有依賴RNA的DNA聚合酶抑制作用的藥物治療乙型肝炎病毒(HBV)感染的效果的方法。特別通過(guò)鑒定(檢出)HBV核心啟動(dòng)子核酸序列的至少一個(gè)突變，幫助預(yù)測(cè)給藥后血中HBV量的下降。
本發(fā)明還涉及鑒定(檢出)HBV核心啟動(dòng)子核酸序列的特定部分的序列(例如序列編號(hào)2、序列編號(hào)3、序列編號(hào)4、序列編號(hào)5、序列編號(hào)6、序列編號(hào)7記載的序列)的至少一個(gè)突變的方法，較好是鑒定(檢出)序列編號(hào)1記載的7位核酸C、28位核酸T、33位核酸A、57位核酸A、73位核酸T、106位核酸A、107位核酸T、200位核酸A、250位核酸G或253位核酸G中的任一個(gè)或者一個(gè)以上的核酸的變化的方法。
更好的是本發(fā)明涉及鑒定(檢出)序列編號(hào)1記載的7位核酸C變?yōu)門(mén)、或28位核酸T變成C、或33位核酸A變成G、或57位核酸A變成G或C、或73位核酸T變?yōu)镚、或106位核酸A變?yōu)門(mén)或C或G、或107位核酸T變?yōu)镃或G、200位核酸A變?yōu)門(mén)或C、250位核酸G變?yōu)锳、253位核酸G變?yōu)锳中的任一個(gè)或者一個(gè)以上的突變的方法。一般認(rèn)為HBV的耐藥性或敏感性的不同起因于HBV基因型的種類的不同。因此，本發(fā)明提供HBV的核心啟動(dòng)子存在上述任一突變的HBV的基因型，提供利用該基因型的耐藥性預(yù)測(cè)方法。本發(fā)明還提供鑒定HBV基因型的方法。
本發(fā)明的鑒定(檢出)基因突變的方法包括確定核酸序列的方法。還包括以核酸作為探針或引物使核酸相互形成雙鏈(雜交)的方法。
本發(fā)明還提供用于檢出上述HBV核心啟動(dòng)子區(qū)域的基因突變的診斷劑、診斷試劑盒。
本發(fā)明還涉及利用具有HBV核心啟動(dòng)子的序列編號(hào)1或其一部分的基因序列的核酸的新型HBV治療藥。該核酸作為誘餌核酸，使HBV核心啟動(dòng)子的野生株基因序列特異性地結(jié)合于作為靶的蛋白質(zhì)，阻礙原來(lái)的靶即HBV自身的核心啟動(dòng)子與該蛋白質(zhì)結(jié)合，從而具有拮抗作用。因此，通過(guò)將本發(fā)明的誘餌核酸給予機(jī)體，可抑制HBV核心啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，從而抑制HBV的增殖。
關(guān)于HBV的核心啟動(dòng)子區(qū)域，各報(bào)告多少有些差異，基本上將轉(zhuǎn)錄開(kāi)始部位的上游約200bp作為核心啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行鑒定(Yuh CH，等，Journal ofVirology，66，4073-4084，1992；Honigwachs J等，Journal of Virology，63.919-924，1989；Lopez-Cabrer M等，Proceedings of the national Academyof Sciences of the United States of America，87，5069-5073，1990)。
本發(fā)明為了便于說(shuō)明，將HBV的雙鏈DNA的限制酶EcoRI部位GAATTC的第一個(gè)T作為核酸編號(hào)1來(lái)表示堿基序列的編號(hào)。使用該簡(jiǎn)便的編號(hào)時(shí)，本發(fā)明所說(shuō)的HBV核心啟動(dòng)子區(qū)域規(guī)定為從核酸編號(hào)1631到核心蛋白起始氨基酸的核酸編號(hào)1900。
該區(qū)域存在著對(duì)增殖很重要的增強(qiáng)子II區(qū)域(Enh II)及將前基因組RNA包入核心粒子內(nèi)所必需的衣殼化信號(hào)(ε)區(qū)域，成為HBV的DNA聚合酶和肝細(xì)胞特異性核內(nèi)因子的結(jié)合部分，因此認(rèn)為一旦發(fā)生突變，會(huì)使病毒的增殖、復(fù)制發(fā)生重要變化。該ε區(qū)域?qū)τ贖BV的DNA聚合酶的引發(fā)和逆轉(zhuǎn)錄活性是必需的(Urban M.，等Journal of General Virology(1998)，79，1121-2231)。此外，增強(qiáng)子II區(qū)域(Enh II)中存在著以足跡法(footprinting)或者甲基化干擾分析(methylation interference)鑒定的足跡II或Boxα、足跡I、Boxβ的調(diào)節(jié)元件。
本發(fā)明著眼于結(jié)合聚合酶等的區(qū)域，以及對(duì)病毒基因復(fù)制的調(diào)節(jié)起重要作用的增強(qiáng)子區(qū)域，鑒定對(duì)乙型肝炎的治療藥、特別對(duì)拉米夫定的療效產(chǎn)生影響的核心啟動(dòng)子的基因突變。
根據(jù)本發(fā)明檢出對(duì)乙型慢性肝炎患者的治療前診斷有用的HBV核心啟動(dòng)子的基因突變，可對(duì)耐藥株和肝炎復(fù)發(fā)少的テイラ一メ一ド醫(yī)療作出貢獻(xiàn)，并可開(kāi)發(fā)新的診斷劑。此外，由于能鑒定以拉米夫定等逆轉(zhuǎn)錄抑制劑難于取得療效的病毒，因此通過(guò)使用這樣的突變病毒序列可開(kāi)發(fā)對(duì)此類病毒也有較高療效的新型抗HBV藥物。
本發(fā)明具體為包括確認(rèn)核心啟動(dòng)子區(qū)域的核酸序列而鑒定HBV的基因突變?cè)趦?nèi)的方法。該區(qū)域?qū)Σ《驹鲋呈侵匾牟课唬捎诨蛐蛄械牟煌?，?duì)于用于HBV治療的藥物的敏感性不同，本發(fā)明者的研究推論證明了這一關(guān)系。該研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)通過(guò)確認(rèn)核心啟動(dòng)子區(qū)域中6個(gè)短的區(qū)域、并且是其中特定的核酸序列的變化，可簡(jiǎn)便地識(shí)別HBV耐藥性的不同。
以下，以具有代表性的HBV治療藥拉米夫定為例說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于拉米夫定的治療。
用具有代表性的治療藥拉米夫定治療HBV，在顯示血中病毒量的HBV-DNA量以及反映肝細(xì)胞內(nèi)病毒量的標(biāo)記即HBe抗原量的高效價(jià)病例中存在很多病毒量難以減少的病例，很多在其后出現(xiàn)耐藥株和肝炎復(fù)發(fā)的問(wèn)題。
然而，在HBV-DNA量和HBe抗原量的高效價(jià)病例中也存在拉米夫定奏效、血中HBV-DNA量迅速減少、肝炎靜止化的病例。
本發(fā)明者用接受拉米夫定治療的乙型慢性肝炎患者的治療前血清和治療開(kāi)始6個(gè)月后的血清，以TMA法測(cè)定血中的HBV-DNA量，在治療6個(gè)月后HBV-DNA量下降至檢出限以下(5000拷貝/ml以下)時(shí)，判定為病毒陰性組，在檢出限以上時(shí)作為病毒陽(yáng)性組，通過(guò)差異顯著性檢定尋找預(yù)后因子。
然后，通過(guò)六波羅等的方法(Journal of Medical Virology，62，471-478，2000)，用市售的核酸提取試劑盒從采集的治療前血清樣本提取HBV-DNA，以PCR法使HBV核心啟動(dòng)子區(qū)域擴(kuò)增，在3％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳后，從凝膠中切出陽(yáng)性條帶，精制核酸，用直接測(cè)序法確定堿基序列。再將治療前的核心啟動(dòng)子區(qū)域的堿基序列與野生株比較，選出發(fā)生基因突變的部位，對(duì)治療6個(gè)月后的病毒陽(yáng)性組與陰性組進(jìn)行指標(biāo)的差異顯著性檢定，分析可預(yù)測(cè)拉米夫定療效的基因突變部位。
其結(jié)果是，發(fā)現(xiàn)以前報(bào)告的HBe抗原陽(yáng)性、HBV-DNA量可作為有意義的預(yù)后標(biāo)記，但年齡、性別、以往病史、病型、血小板值、白蛋白值、ALT值、膽紅素值未見(jiàn)顯著差異。分析核心啟動(dòng)子區(qū)域的基因突變，檢出3個(gè)位置上與拉米夫定治療效果有顯著相關(guān)性的基因突變。
而且，該HBV核心啟動(dòng)子區(qū)域的基因突變至少有一個(gè)時(shí)，也發(fā)現(xiàn)6個(gè)月后的病毒陽(yáng)性組與陰性組之間有顯著差異(P＜0.0001)，證明通過(guò)確認(rèn)該突變可以預(yù)測(cè)拉米夫定的療效?？烧J(rèn)為有該基因突變的HBV與沒(méi)有該突變的HBV是不同基因型的HBV。該基因型的不同可能與HBV的增殖能力等生物學(xué)機(jī)能相關(guān)。
這樣，已闡明本發(fā)明的HBV核心啟動(dòng)子區(qū)域的突變與跟HBV的DNA聚合酶和肝細(xì)胞特異性核內(nèi)因子有關(guān)的HBV增殖、復(fù)制的抑制效果相關(guān)，通過(guò)鑒定該變異，可促使拉米夫定治療的有效率提高。因而，HBV的核心啟動(dòng)子區(qū)域的基因突變可用作拉米夫定治療效果的預(yù)測(cè)標(biāo)記。
發(fā)明的實(shí)施方式本發(fā)明的基因突變的鑒定(檢出)方法，例如可通過(guò)確定HBV的核心啟動(dòng)子區(qū)域的核酸序列而進(jìn)行。確定核酸序列的方法基本上使用Maxam及Gilbert法或雙脫氧法的改良法。其詳細(xì)解說(shuō)見(jiàn)《Molecular CloningA Laboratory Manual，ThirdEdition(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)》或《新生化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座2核酸II構(gòu)造與性質(zhì)，p.59-100》。此外，許多廠商銷售各種試劑盒，也可以加以利用。
確定核酸序列所用的DNA，可以用PCR使本發(fā)明的核心啟動(dòng)子區(qū)域擴(kuò)增，直接用直接測(cè)序法確定核酸序列。也可以將PCR產(chǎn)物一次克隆進(jìn)載體之后確定序列?；蛘呖梢允褂冒l(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變的測(cè)序法。
本發(fā)明的核酸序列的突變的檢出方法，除確定基因序列以外，也可使用能檢出一個(gè)至幾個(gè)堿基的不同的任何方法。例如，可利用SSCP、DGGE、CFLP、RFLP等基因突變的檢出法。此外，還可利用用于一堿基突變的SNP的檢出的invader法。另外，利用互補(bǔ)核酸形成雙鏈的雜交原理的突變檢出法也可被使用。這些基因、核酸突變的檢出法，有使用探針或引物的方法或者將兩者組合的方法。這些探針或引物不限于核酸，包括可與靶核酸通過(guò)雜交而結(jié)合的探針或引物。
以下的實(shí)施例是本發(fā)明的例證，但本發(fā)明的范圍不限于這些。
實(shí)施例<實(shí)施例1>與拉米夫定治療和病毒轉(zhuǎn)陰有關(guān)的預(yù)后因子的尋找給慢性乙型肝炎感染患者53人(男性40例，女性13例，平均年齡49.8±9.4歲，慢性肝炎38例，肝硬化15例)連日口服拉米夫定，每日100mg，分析給藥前的數(shù)據(jù)和給藥后的數(shù)據(jù)。服用拉米夫定6個(gè)月時(shí)，用TMA法測(cè)定的HBV-DNA降至低于靈敏度(3.7LGE/ml以下)時(shí)，判定為病毒轉(zhuǎn)陰。
對(duì)于病毒陰轉(zhuǎn)和仍為陽(yáng)性的患者的年齡、性別、HBeAg陽(yáng)性率、治療前的HBV-DNA量、以往病史、病型、血小板值、白蛋白、ALT、膽紅素值等，以Fisher的直接法、Mann-Mhitney U檢定法檢定差異的顯著性，探討其是否可成為療效的預(yù)測(cè)因子。
表1

根據(jù)表1找出以前報(bào)告的HBe抗原陽(yáng)性、HBV-DNA量可作為有意義的預(yù)后標(biāo)記，而年齡、性別、以往病史、病型、血小板值、白蛋白值、ALT值、膽紅素值未見(jiàn)顯著差異。
<實(shí)施例2>確定HBV核心啟動(dòng)子區(qū)域的堿基序列在實(shí)施例1進(jìn)行拉米夫定治療的53例中，從43例的治療前患者血清50μl中用DNA提取試劑盒(スマイテスト，(株)ゲノムサイエンス研究所)按使用說(shuō)明提取病毒NDA。
在反應(yīng)液(200μM dNTP，50mM KCl，10mM Tris·HCl[pH 8.3]，2.0mM MgCl2，0.001％明膠)25μl中加入提取的DNA 2μl、0.5U的AmpliTaq Gold(PE appliedBiosystems)，用下列引物各0.25mM進(jìn)行擴(kuò)增，即，is 25’-GAG ACC ACC GTG ACCGCC CA(1611-1630)和CB45’-AAA AGA GAG TAA CTC CAC AG(1954-1935)。
PCR方案是在預(yù)熱后進(jìn)行94℃30秒、55℃1分鐘的循環(huán)，重復(fù)43個(gè)循環(huán)。循環(huán)變溫加熱器使用DNA Engine(MJ Research Corp.Watertown，MA)。PCR陰性樣本是用outer primer set進(jìn)行第一次PCR后，第二次PCR重復(fù)30個(gè)循環(huán)。該P(yáng)CR陰性的樣本是用es25’-ACG TCG CAT GGA GAC CAC CG(1601-1620)、CB25’-GGAAAG AAG TCA GAA GGC AA(1974-1955)作為outer primer set進(jìn)行第一次PCR后，用is2和CB4這兩個(gè)引物重復(fù)30個(gè)循環(huán)，進(jìn)行第二次PCR。
該P(yáng)CR產(chǎn)物以3％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，從凝膠切出條帶，用GFX PCR DNA andGel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia Biotec Inc)精制。測(cè)序則采用雙脫氧法，用Taq Dye Deoxy Terminator cycle sequencing kit使之反應(yīng)，以fluorescent DNA sequencer(Applied Biosystems)進(jìn)行分析。確定了序列的43例患者的核心啟動(dòng)子區(qū)域序列如

圖1-1～圖1-3表示。
H5至262共31個(gè)樣本是經(jīng)拉米夫定治療6個(gè)月后血中DNA量減少到檢出限以下的患者的序列。A17至A5共11個(gè)樣本是DNA未減少到檢出限以下、拉米夫定的療效小的患者的序列。
各圖最上面一列表示作為基礎(chǔ)的序列(野生型)的序列?？梢?jiàn)各圖上面31個(gè)樣本和下面12個(gè)樣本其序列存在差異。并可見(jiàn)其不同集中于一定的區(qū)域。拉米夫定有效組(有效組)中，堿基編號(hào)1671～1682位的區(qū)域(序列編號(hào)2)有較多樣本具有與作為基礎(chǔ)的序列不同的序列。特別是1674位(序列編號(hào)1的28位)的核酸T變?yōu)镃、1679位(序列編號(hào)1的33位)的A變?yōu)镚，而拉米夫定無(wú)效組(無(wú)效組)未見(jiàn)這樣的變化。
此外，拉米夫定有效組中，在堿基編號(hào)1701～1721位的區(qū)域(序列編號(hào)3)有較多樣本具有與作為基礎(chǔ)的序列不同的序列。特別是1703位(序列編號(hào)1的57位)的核酸A變成C或G、1719位(序列編號(hào)1的73位)的T變?yōu)镚，在拉米夫定不顯現(xiàn)治療效果的無(wú)效組未見(jiàn)這樣的變化。
同樣，在有效組中堿基編號(hào)為1736～1761位的區(qū)域(序列編號(hào)4)有較多樣本具有與作為基礎(chǔ)的序列不同的序列。特別是1752位(序列編號(hào)1的106位)的核酸A變?yōu)門(mén)或C或G，1753位(序列編號(hào)1的107位)的T變成G或C，在無(wú)效組未見(jiàn)這樣的變化。
此外，有效組中堿基編號(hào)1799～1817的區(qū)域(序列編號(hào)5)有較多樣本具有與作為基礎(chǔ)的序列不同的序列，在1802位、1803位、1809位、1810位、1811位、1812位、1814位出現(xiàn)變化，而無(wú)效組未見(jiàn)這樣的變化。并且，有效組在1843～1860位的區(qū)域(序列編號(hào)6)有較多樣本具有與作為基礎(chǔ)的序列不同的序列。特別是1846位(序列編號(hào)1的200位)的核酸A變?yōu)門(mén)或C，在無(wú)效組未見(jiàn)這樣的變化。有效組在1893～1902位的區(qū)域(序列編號(hào)7)有較多樣本具有與作為基礎(chǔ)的序列不同的序列。特別是1896位(序列編號(hào)1的250位)的核酸G變?yōu)锳、1899位(編號(hào)1的253位)的G變?yōu)锳，在無(wú)效組未見(jiàn)這樣的變化。
<實(shí)施例3>根據(jù)核心啟動(dòng)子區(qū)域的基因突變進(jìn)行分析(A)根據(jù)基因突變部位進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析再按實(shí)施例1的方法，對(duì)有效患者9人和無(wú)效患者2的樣本確定核心啟動(dòng)子區(qū)域的序列，考慮總共53個(gè)樣本的拉米夫定的療效與核酸序列變化(突變)的關(guān)系，用Fisher的直接法檢定差異的顯著性。表2表示有顯著差異的突變以及陽(yáng)性組未見(jiàn)、而在轉(zhuǎn)陰組出現(xiàn)的突變。
表2

表2的轉(zhuǎn)陰組(n＝40)是拉米夫定治療有效組，陽(yáng)性組(n＝13)是拉米夫定治療無(wú)效組。因此顯示幾個(gè)點(diǎn)出現(xiàn)顯著差異。
此外，對(duì)于核心啟動(dòng)子突變(A1762T、G1764A)，轉(zhuǎn)陰組、陽(yáng)性組分別有82.5％、84.6％，未見(jiàn)顯著差異。
(B)整個(gè)核心啟動(dòng)子區(qū)域的突變的統(tǒng)計(jì)分析對(duì)于出現(xiàn)表2所示的核酸變化的樣本和完全未見(jiàn)變化的樣本是否能預(yù)測(cè)拉米夫定的療效，以Fisher的直接法檢定差異的顯著性。
表3

P＜0.0001出現(xiàn)某一變化的患者，53人中有38人，其中35人的拉米夫定治療具有效果。而一個(gè)變化也未見(jiàn)的患者有15人，其中10人未見(jiàn)療效。這表明該核心啟動(dòng)子區(qū)域的核酸序列的變化與拉米夫定療效有顯著關(guān)聯(lián)。拉米夫定具有抑制依賴RNA的DNA聚合酶的作用，可認(rèn)為其參與HBV的增殖抑制。
根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)在治療前或治療中檢出病毒基因突變，可預(yù)測(cè)以拉米夫定為代表的HRV治療的效果，提高治療成績(jī)或者可預(yù)期控制耐藥株和肝炎復(fù)發(fā)等的效果。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明圖1-1表示進(jìn)行拉米夫定治療的患者的HBV核心啟動(dòng)子區(qū)域的核酸序列的比較。最上列表示作為基礎(chǔ)的序列，上面31個(gè)樣本表示拉米夫定有療效的樣本，下面12個(gè)樣本表示無(wú)治療效果的樣本。
圖1-2表示進(jìn)行拉米夫定治療的患者的HBV核心啟動(dòng)子區(qū)域的核酸序列的比較。最上列表示作為基礎(chǔ)的序列，上面31個(gè)樣本表示拉米夫定有療效的樣本，下面12個(gè)樣本表示無(wú)治療效果的樣本。
圖1-3表示進(jìn)行拉米夫定治療的患者的HBV核心啟動(dòng)子區(qū)域的核酸序列的比較。最上列表示作為基礎(chǔ)的序列，上面31個(gè)樣本表示拉米夫定有療效的樣本，下面12個(gè)樣本表示無(wú)治療效果的樣本。
序列表<110>株式會(huì)社先端生命科學(xué)研究所(Advanced Life Science Institute，Inc.)<120>乙型肝炎病毒的耐藥性的識(shí)別方法<130>SAP 705-PCT<150>JP 2002359372<130>2002-12-11<160>7<210>1<211>299<212>DNA<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)<400>1gtcttacata agaggactct tggactctca gcaatgtcaa cgaccgacct tgaggcatac 60ttcaaagact gtttgtttaa agactgggag gagttggggg aggagattag gttaaaggtc 120tttgtactag gaggctgtag gcataaattg gtctgttcac cagcaccatg caactttttc 180acctctgcct aatcatctca tgttcatgtc ctactgttca agcctccaag ctgtgccttg 240ggtggctttg gggcatggac attgacccgt ataaagaatt tggagcttct gtggagtta 299<210>2<211>12<212>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)<400>2ctctcagcaa tg12<210>3<211>21<212>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)
<400>3gcatacttca aagactgttt g 21<210>4<211>27<212>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)<400>4ggagttgggg gaggagatta ggttaaa 27<210>5<211>19<212>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)<400>5ctgttcacca gcaccatgc19<210>6<211>18<212>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)<400>6ctcatgttca tgtcctac18<210>7<211>12<212>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)<400>7gctttggggc at1權(quán)利要求
1.識(shí)別HBV耐藥性的方法，其特征在于，確認(rèn)乙型肝炎病毒(HBV)核心啟動(dòng)子區(qū)域的核酸序列中的基因突變。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于，乙型肝炎病毒(HBV)的耐藥性是對(duì)具有依賴RNA的DNA聚合酶抑制作用的藥物的耐藥性。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征還在于，具有依賴RNA的DNA聚合酶抑制作用的藥物是拉米夫定。
4.如權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征還在于，核心啟動(dòng)子區(qū)域的核酸序列是序列編號(hào)1記載的序列。
5.如權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征還在于，確認(rèn)HBV核心啟動(dòng)子區(qū)域的核酸序列內(nèi)的相當(dāng)于序列編號(hào)2、序列編號(hào)3、序列編號(hào)4、序列編號(hào)5、編號(hào)6或序列編號(hào)7所示的核酸序列的部分序列的至少一部分中的基因突變。
6.如權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征還在于，確認(rèn)序列編號(hào)1的7位核酸C、28位核酸T、33位核酸A、57位核酸A、73位核酸T、106位核酸A、107位核酸T、200位核酸A、250位核酸G或253位核酸G中的任一個(gè)或一個(gè)以上的核酸發(fā)生了變化的基因突變。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征還在于，確認(rèn)序列編號(hào)1記載的7位核酸C變?yōu)門(mén)、28位核酸T變?yōu)镃、33位核酸A變?yōu)镚、57位核酸A變?yōu)镚或C、73位核酸T變?yōu)镚、106位核酸A變?yōu)門(mén)或C或G、107位核酸T變?yōu)镃或G、200位核酸A變?yōu)門(mén)或C、250位核酸G變?yōu)锳或253位核酸G變?yōu)锳中的任一個(gè)或一個(gè)以上的基因突變。
8.鑒定HBV基因型的方法，其特征在于，HBV基因型具有序列編號(hào)1記載的7位核酸C、28位核酸T、33位核酸A、57位核酸A、73位核酸T、106位核酸A、107位核酸T、200位核酸A、250位核酸G或253位核酸G中的任一個(gè)或一個(gè)以上的核酸的基因突變。
9.鑒定HBV基因型的方法，其特征在于，HBV基因型具有序列編號(hào)1記載的7位核酸C變?yōu)門(mén)、28位核酸T變?yōu)镃、33位核酸A變?yōu)镚、57位核酸A變?yōu)镚或C、73位核酸T變?yōu)镚、106位核酸A變?yōu)門(mén)或C或G、107位核酸T變?yōu)镃或G、200位核酸A變?yōu)門(mén)或C、250位核酸G變?yōu)锳或253位核酸G變?yōu)锳中的任一個(gè)或一個(gè)以上的基因突變。
10.如權(quán)利要求1～9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征還在于，通過(guò)確定HBV的堿基序列進(jìn)行基因突變的確認(rèn)或基因型的鑒定。
11.如權(quán)利要求1～9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征還在于，通過(guò)使用了探針或引物的方法進(jìn)行基因突變的確認(rèn)或基因型的鑒定。
12.HBV治療藥，其特征在于，使用了由序列編號(hào)1～7中任一項(xiàng)所述的核酸序列或其一部分組成的核酸。
全文摘要
提供HBV耐藥性的簡(jiǎn)便識(shí)別方法。該識(shí)別HBV耐藥性的方法就是確認(rèn)乙型肝炎病毒(HBV)核心啟動(dòng)子區(qū)域的核酸序列中的基因突變。
文檔編號(hào)C12N15/51GK1726287SQ20038010591
公開(kāi)日2006年1月25日 申請(qǐng)日期2003年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月11日
發(fā)明者六波羅明紀(jì), 松本晶博, 田中栄司, 清澤研道 申請(qǐng)人:株式會(huì)社先端生命科學(xué)研究所