專利名稱：用于選擇有效動(dòng)物生長(zhǎng)的方法
發(fā)明
背景技術(shù)：
領(lǐng)域本發(fā)明一般性涉及動(dòng)物育種方法。更特別地，本發(fā)明涉及基于動(dòng)物的免疫細(xì)胞亞型(subtype)的數(shù)量和淋巴細(xì)胞的增殖性應(yīng)答的頻率而在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性(robustness)的方法。
背景技術(shù)：
動(dòng)物具有一種復(fù)雜的分子和細(xì)胞防御陣列，統(tǒng)稱為免疫系統(tǒng)，其識(shí)別并攻擊潛在的有害的外源或內(nèi)源但異常的細(xì)胞(分別例如是病原體，如細(xì)菌或病毒，及癌細(xì)胞或病原感染的細(xì)胞)，但其不攻擊而是耐受內(nèi)源的正常細(xì)胞。當(dāng)受到外源或異常生物分子刺激時(shí)，免疫系統(tǒng)經(jīng)歷與外源或異常生物分子相關(guān)的、中和及破壞病原體或癌細(xì)胞或病原感染的細(xì)胞的一系列活性。統(tǒng)稱作免疫應(yīng)答的這些活性可以由細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答、體液(抗體介導(dǎo)的)免疫應(yīng)答或包括細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答和體液應(yīng)答元件的一種免疫應(yīng)答組成。
體液免疫應(yīng)答由特異性結(jié)合外源或異常生物分子并吸引免疫系統(tǒng)的其它成分的抗體，糖蛋白介導(dǎo)。抗體是由B細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白(Ig)分子，B細(xì)胞是起源于鳥(niǎo)類囊(avian bursa)或哺乳動(dòng)物骨髓但遷移至其它器官尤其是脾并在其中成熟的淋巴細(xì)胞(Robertson，1983)。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答是T細(xì)胞活性的結(jié)果，T細(xì)胞是在動(dòng)物的胸腺內(nèi)成熟的淋巴細(xì)胞(Tizard，1988)。T細(xì)胞活性在動(dòng)物體內(nèi)不同的T細(xì)胞亞群(subpopulation)之中變化很大。胞毒性T細(xì)胞識(shí)別并破壞外源細(xì)胞(移植排斥)或者內(nèi)源但異常的細(xì)胞(例如癌細(xì)胞或胞內(nèi)寄生蟲(chóng)如病毒和細(xì)菌感染的細(xì)胞)。輔助T細(xì)胞與B細(xì)胞和胞毒性T細(xì)胞均相互作用并產(chǎn)生影響B(tài)細(xì)胞和胞毒性T細(xì)胞行為的生物分子，以分別促進(jìn)和指導(dǎo)抗體產(chǎn)生及胞毒性活性(Mosier，1967)。還存在其它類別的T細(xì)胞，包括抑制性T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞(Miedema andMelief，1983；Tizard，如前，pp.225-8)。T細(xì)胞的類別在某種程度上基于不同的T細(xì)胞在其表面上展示不同的CD抗原而區(qū)分。
為正確行使功能，動(dòng)物免疫系統(tǒng)的T細(xì)胞和B細(xì)胞必須正確及可靠地鑒別大量的外源的非自身組合物或者內(nèi)源但異常的組合物。免疫系統(tǒng)的識(shí)別和鑒別發(fā)生在分子水平?？乖哂挟a(chǎn)生免疫應(yīng)答潛力的一種分子組合物，是由一或多個(gè)分子大小的鑒別特征即表位組成的。具有包含例如100個(gè)氨基酸的氨基酸序列的一個(gè)多肽抗原可以包含許多表位，其中每個(gè)表位均是被多肽的一部分限定，其包含大約3-大約15個(gè)氨基酸。可衍生自多肽的表位的數(shù)目估計(jì)有大約1千萬(wàn)個(gè)(Tizard，如前，p.25)。
由動(dòng)物的T或B細(xì)胞遭遇到的抗原必須經(jīng)鑒別為是與正常內(nèi)源(即自身)抗原相關(guān)，對(duì)其的免疫應(yīng)答對(duì)動(dòng)物有害，或者與外源或異常(非自身)抗原相關(guān)，對(duì)其應(yīng)該發(fā)生免疫應(yīng)答。可依此類推在人體對(duì)抗中的“友好或敵對(duì)”鑒別。如果免疫系統(tǒng)不能鑒別與非自身的侵襲病原體或腫瘤細(xì)胞相關(guān)的抗原，則這些“敵人”可以逃脫免疫系統(tǒng)的防御。如果免疫系統(tǒng)將一種動(dòng)物的內(nèi)源抗原錯(cuò)誤地鑒別成是非自身的，則動(dòng)物體包含該內(nèi)源抗原的那部分將面臨來(lái)自免疫系統(tǒng)的“善意攻擊”。后者的情況通常已知是“自身免疫疾病”，其中動(dòng)物的免疫系統(tǒng)錯(cuò)誤發(fā)動(dòng)對(duì)抗動(dòng)物體另外的正常部分的細(xì)胞和分子“戰(zhàn)爭(zhēng)”。
作為免疫系統(tǒng)鑒別抗原的手段的一部分，個(gè)體T細(xì)胞和B細(xì)胞產(chǎn)生抗原受體，該受體展示于T或B細(xì)胞表面上并特異性結(jié)合抗原。盡管每個(gè)個(gè)體T或B細(xì)胞均展示相同的抗原受體，但動(dòng)物的不同抗原受體的集合非常多樣。就T或B細(xì)胞而言，抗原與細(xì)胞抗原受體的結(jié)合激活該細(xì)胞，即刺激該細(xì)胞進(jìn)行與產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的或體液免疫應(yīng)答相關(guān)的活性。盡管B細(xì)胞可以直接結(jié)合抗原，但T細(xì)胞僅當(dāng)抗原在通常稱為抗原呈遞細(xì)胞(APC)的其它特殊類別細(xì)胞上展示時(shí)才對(duì)其應(yīng)答。APC，例如巨噬細(xì)胞和樹(shù)狀細(xì)胞，呈遞通過(guò)糖蛋白衍生自多肽的抗原，所述糖蛋白如在APC表面上展示的MHC(主要組織相容性復(fù)合物)蛋白(Bevan et al.，1994)。沒(méi)有MHC蛋白，T細(xì)胞則不能區(qū)分外源或內(nèi)源抗原。
在過(guò)去的十年中，大多數(shù)家畜業(yè)已經(jīng)揭示了估計(jì)育種值(breedingvalue)以可以鑒別最佳的育種動(dòng)物。這些估計(jì)育種值是基于來(lái)自各個(gè)動(dòng)物及其相關(guān)物的一些性狀信息進(jìn)行計(jì)算的，代表最精確的標(biāo)準(zhǔn)以鑒別具有高度遺傳優(yōu)勢(shì)的動(dòng)物。然而，普遍認(rèn)為環(huán)境攻擊如疾病限制了動(dòng)物如豬的“真實(shí)”遺傳潛力的表達(dá)。這也許是由于在與在商業(yè)生產(chǎn)中遭遇的環(huán)境顯著不同的高健康狀態(tài)單位中發(fā)生選擇所致。在許多植物和動(dòng)物系統(tǒng)中觀測(cè)到這種健康狀態(tài)的退化及伴隨的繁殖期間個(gè)體性能的降低。與其它農(nóng)業(yè)系統(tǒng)系統(tǒng)一樣，現(xiàn)代家畜業(yè)需要在不同商業(yè)設(shè)置下表現(xiàn)優(yōu)異的健壯動(dòng)物。
因此，需要揭示可以鑒別和/或分選針對(duì)特定的生產(chǎn)系統(tǒng)最合適的動(dòng)物的工具。由于動(dòng)物免疫系統(tǒng)在其整個(gè)健康狀態(tài)中的重要性，因此在動(dòng)物的優(yōu)良品性與動(dòng)物具有的特異的免疫細(xì)胞的數(shù)量之間存在相關(guān)性是可能的。相似地，在優(yōu)良品性與特殊的免疫細(xì)胞的功能性之間存在相關(guān)性也是可能的。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供了在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的一種方法，所述方法包括提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；確定每個(gè)動(dòng)物中CD16抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量；及選擇CD16抗原表達(dá)細(xì)胞數(shù)量最低的動(dòng)物。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的一種方法，所述方法包括提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；確定每個(gè)動(dòng)物中CD16和CD2雙陽(yáng)性抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量；及選擇CD16和CD2雙陽(yáng)性抗原表達(dá)細(xì)胞數(shù)量最低的動(dòng)物。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供了在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的一種方法，所述方法包括提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；確定每個(gè)動(dòng)物中CD8抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量；及選擇CD8抗原表達(dá)細(xì)胞數(shù)量最低的動(dòng)物。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的一種方法，所述方法包括提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；確定每個(gè)動(dòng)物中MHC-DQ抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量；及選擇MHC-DQ抗原表達(dá)細(xì)胞數(shù)量最高的動(dòng)物。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的一種方法，所述方法包括提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；確定每個(gè)動(dòng)物中表達(dá)由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQB的抗原的細(xì)胞的數(shù)量；及選擇表達(dá)由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQB的抗原的細(xì)胞數(shù)量最高的動(dòng)物。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的一種方法，所述方法包括提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；確定每個(gè)動(dòng)物中表達(dá)由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQD的抗原的細(xì)胞的數(shù)量；及選擇表達(dá)由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQD的抗原的細(xì)胞數(shù)量最高的動(dòng)物。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的一種方法，所述方法包括提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；確定每個(gè)動(dòng)物中CD4抗原表達(dá)細(xì)胞的增殖頻率；及選擇CD4抗原表達(dá)細(xì)胞增殖頻率最低的動(dòng)物。
在其中可以選擇健壯性的物種包括但非限于Bos taurus(牛)、Susscrofa(豬)、Ovis aries(綿羊)、Bison bison(野牛)、Babalus babalus(水牛)、Gallus domesticus(雞)、Meleagrus gallopavo(火雞)、Anas rubripes(鴨)和Branta canadensis(鵝)。
預(yù)期本發(fā)明所述的每種方法可以單獨(dú)使用或者彼此組合使用以選擇最健壯動(dòng)物。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法。
定義本文所用術(shù)語(yǔ)“健壯性(robust或robustness)”是指動(dòng)物的一般狀態(tài)，特征在于高于平均水平的(1)一生平均日增重(ADG)，(2)熱胴體測(cè)定及(3)飼料轉(zhuǎn)化。
本文所用術(shù)語(yǔ)“CD”是指分化簇。這個(gè)名稱是已經(jīng)開(kāi)發(fā)了單克隆抗體的白細(xì)胞抗原的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)名稱。
本文所用術(shù)語(yǔ)“抗體”是指在暴露于抗原時(shí)由B細(xì)胞合成的一種蛋白質(zhì)分子，其能與所述抗原特異性組合；術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指由雜交瘤產(chǎn)生的一種抗體分子，其僅含有能與抗原的一個(gè)特殊表位免疫反應(yīng)的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的一個(gè)種類?！俺跫?jí)”抗體是直接結(jié)合抗原的抗體?！岸?jí)”抗體是結(jié)合初級(jí)抗體的抗體。
本文所用術(shù)語(yǔ)“抗原”是指一種分子或組合物，其誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)免疫應(yīng)答，并與動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的抗原識(shí)別成分特異性相互作用。
本文所用術(shù)語(yǔ)“促分裂原”是指一種化合物，其刺激淋巴細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞周期。T細(xì)胞的一種合適的促分裂原是伴刀豆球蛋白A和植物凝集素(PHA)。
確定抗原表達(dá)細(xì)胞的百分比在具有包括表達(dá)CD16、CD2、CD8和MHC-DQ抗原的細(xì)胞以及表達(dá)由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQ亮(B)或MHC-DQ暗(D)抗原的細(xì)胞的動(dòng)物中確定抗原表達(dá)細(xì)胞百分比優(yōu)選通過(guò)如下步驟實(shí)現(xiàn)從動(dòng)物體分離周圍血單核細(xì)胞(PBMC)；將PBMC與特異于感興趣的抗原的一種初級(jí)單克隆抗體溫育；將PBMC用與熒光染料綴合的一種二級(jí)抗體標(biāo)記；計(jì)數(shù)表達(dá)感興趣的抗原的PBMC；及計(jì)算表達(dá)感興趣的抗原的PBMC百分比。
確定抗原表達(dá)細(xì)胞的增殖頻率在具有包括表達(dá)CD4抗原的細(xì)胞的動(dòng)物中確定抗原表達(dá)細(xì)胞增殖頻率優(yōu)選通過(guò)如下步驟實(shí)現(xiàn)從動(dòng)物體分離周圍血單核細(xì)胞(PBMC)；將PBMC用一種合適的熒光染料標(biāo)記；將PBMC用一種合適的母細(xì)胞形成培養(yǎng)基(blastogenic medium)培養(yǎng)；將PBMC與一種促分裂原溫育；將PBMC與特異于感興趣的抗原表達(dá)細(xì)胞的一種單克隆抗體溫育；及確定已經(jīng)增殖的感興趣的抗原表達(dá)細(xì)胞的頻率。
分離PBMCPBMC優(yōu)選使用一種淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基通過(guò)梯度分離而分離。一種合適的淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基是LSM(ICN Biomedicals)。
計(jì)數(shù)抗原表達(dá)細(xì)胞在本發(fā)明中，特異性抗原表達(dá)細(xì)胞的計(jì)數(shù)及表達(dá)該抗原的PBMC百分比的最終確定優(yōu)選通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)實(shí)現(xiàn)，更特別地使用熒光流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)實(shí)現(xiàn)。一般而言，流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)包括在一個(gè)時(shí)間將細(xì)胞一次一個(gè)地穿經(jīng)一個(gè)流槽(flow cell)的感應(yīng)區(qū)。由于細(xì)胞是一次一個(gè)地穿經(jīng)流槽，因此典型地需要在分析之前稀釋細(xì)胞樣品，以便可以分離各個(gè)細(xì)胞進(jìn)行感應(yīng)。
熒光流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)結(jié)合熒光細(xì)胞分析與光散射的原理。一般而言，這需要將細(xì)胞用一種合適的染料染色，或者一種熒光染料標(biāo)記在細(xì)胞表面上共價(jià)地附著于抗原或抗體，因此表明特異性抗原-抗體反應(yīng)的發(fā)生。
在熒光流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)中，將一種預(yù)先染色的或熒光標(biāo)記的顆粒的懸浮液，特別是于血液或其它生物學(xué)液體樣品中的細(xì)胞，轉(zhuǎn)運(yùn)經(jīng)過(guò)一個(gè)流槽，在此處樣品中的各個(gè)顆粒用一或多個(gè)聚光束照亮。用一或多個(gè)檢測(cè)儀檢測(cè)光束與通過(guò)流槽流動(dòng)的標(biāo)記顆粒之間的相互作用。通常，一些檢測(cè)儀被設(shè)計(jì)為測(cè)定熒光發(fā)射，而其它檢測(cè)儀測(cè)定散射強(qiáng)度或脈沖持續(xù)時(shí)間。因此，穿經(jīng)流槽的每個(gè)顆粒均可以定位于一個(gè)特征空間，其軸是發(fā)射顏色，光密度或其它性質(zhì)，即通過(guò)檢測(cè)儀測(cè)定的散射。優(yōu)選地，樣品中的不同顆粒可以定位于特征空間的不同的且不重疊的區(qū)域，使得每個(gè)顆粒均基于其在特征空間的定位而被分析。
增殖頻率的確定在本發(fā)明中，已經(jīng)增殖的抗原表達(dá)細(xì)胞的頻率的確定優(yōu)選通過(guò)在此所述的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)實(shí)現(xiàn)。流式細(xì)胞增殖頻率數(shù)據(jù)分析優(yōu)選使用含有增殖模塊的軟件程序?qū)崿F(xiàn)，如ModFit LT(Verity Software House，Inc.，Topsham，Maine)。增殖頻率測(cè)定基于這樣的原理，即細(xì)胞的每個(gè)世代應(yīng)具有親代細(xì)胞大約一半的染料。
單克隆抗體單克隆抗體組合物典型地展示對(duì)與其免疫反應(yīng)的一特定的蛋白質(zhì)的單一結(jié)合親和性。一種抗原的一個(gè)表位(即CD2)的一個(gè)單克隆抗體可以通過(guò)使用由培養(yǎng)的連續(xù)細(xì)胞系生產(chǎn)抗體分子的技術(shù)而制備。這些技術(shù)包括但非限于最初由Kohler和Milstein描述的雜交瘤技術(shù)，及最近的人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor et al.，1983)，EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole et al.，1985))，及三瘤(trioma)技術(shù)?？捎糜诒景l(fā)明中有效產(chǎn)生單克隆抗體的其它方法包括噬菌體展示技術(shù)(Marks et al.，1992))。
一般地，Kohler和Milstein的雜交瘤技術(shù)是用一種蛋白質(zhì)或其片段對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫而開(kāi)始。免疫典型地通過(guò)為免疫感受態(tài)的哺乳動(dòng)物給予免疫有效量的免疫原而實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物是一種嚙齒動(dòng)物，如兔、大鼠或小鼠。然后將該哺乳動(dòng)物維持足夠長(zhǎng)的一段時(shí)間，使得該哺乳動(dòng)物產(chǎn)生分泌與所述免疫原免疫反應(yīng)的抗體分子的細(xì)胞。這種免疫反應(yīng)通過(guò)篩選如此產(chǎn)生的抗體分子與一種免疫原蛋白制品的免疫反應(yīng)性而檢測(cè)。任選地，可以希望用一種蛋白質(zhì)制品篩選抗體分子，所述蛋白質(zhì)制品是在一個(gè)分析中可以被所述抗體分子檢測(cè)的形式，例如膜結(jié)合形式的抗原(即CD2)。這些篩選方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。接下來(lái)，制備一種產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的懸浮液，該細(xì)胞從分泌所希望的抗體的每個(gè)接種的哺乳動(dòng)物中取出。在足夠的時(shí)間之后，處死該哺乳動(dòng)物并從中獲得體細(xì)胞抗體生產(chǎn)淋巴細(xì)胞。產(chǎn)生抗體的細(xì)胞可以得自接觸過(guò)抗原的動(dòng)物的淋巴結(jié)、脾和外周血。優(yōu)選脾細(xì)胞，可以使用本領(lǐng)域熟知的方法將其在生理耐受的培養(yǎng)基中機(jī)械地分離成單個(gè)的細(xì)胞。小鼠淋巴細(xì)胞提供較高百分比的與下述小鼠骨髓瘤的穩(wěn)定融合體。也可以使用大鼠、兔和青蛙的體細(xì)胞。將編碼希望的免疫球蛋白的脾細(xì)胞染色體通過(guò)將該脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合而無(wú)限增殖化，一般在存在融合劑如聚乙二醇(PEG)的情況下進(jìn)行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，任何數(shù)目的骨髓瘤細(xì)胞系均可以用作一種融合配體。
然后將所得細(xì)胞包括希望的雜交瘤在一種選擇培養(yǎng)基如HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其中未融合的親代骨髓瘤或淋巴細(xì)胞最后死亡。只有雜交瘤細(xì)胞存活并可以在限制稀釋條件下生長(zhǎng)以獲得分離的克隆。篩選雜交瘤的上清中所希望的特異性抗體的存在情況，如使用已經(jīng)用于免疫接種的抗原通過(guò)免疫分析技術(shù)進(jìn)行。然后將陽(yáng)性克隆在限制稀釋條件下亞克隆并可以分離產(chǎn)生的單克隆抗體。有許多單克隆抗體的分離和純化方法以使其從其它蛋白質(zhì)或其它污染物中游離出。純化單克隆抗體通常使用的方法包括硫酸銨沉淀、離子交換層析和親和層析(見(jiàn)例如Zola et al.，1982)。根據(jù)這些方法產(chǎn)生的雜交瘤可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)在體外或體內(nèi)增殖(在腹水中)。
通常地，可以將單個(gè)的細(xì)胞系在體外增殖，例如在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)容器中增殖，含有高濃度的單一特異性單克隆抗體的培養(yǎng)基可以通過(guò)傾析、過(guò)濾或離心而收獲?；蛘撸瑔慰寺】贵w的產(chǎn)量可以通過(guò)將一種雜交瘤樣品注射入組織相容的動(dòng)物中而增強(qiáng)，用于提供體細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞以進(jìn)行最初的融合。分泌由融合的雜交細(xì)胞產(chǎn)生的特異性單克隆抗體的腫瘤在經(jīng)注射的動(dòng)物中發(fā)育。動(dòng)物的體液，如腹水或血清提供高濃度的單克隆抗體。
用于制備這些組合物的培養(yǎng)基和動(dòng)物為本領(lǐng)域所熟知并通常是可以商購(gòu)的，包括合成的培養(yǎng)基、近交小鼠等。一種合成的培養(yǎng)基例如是補(bǔ)加了4.5gm/l葡萄糖、20mM谷氨酰胺和20％胎牛血清的Dulbecco′s極限必需培養(yǎng)基(DMEM；Dulbecco et al.，1959)。一種近交小鼠例如是Balb/c。
熒光染料/標(biāo)記可用于確定PBMC樣品中存在的免疫細(xì)胞亞型百分比的熒光標(biāo)記包括但非限于藻紅蛋白(PE)、異硫氰酸熒光素(FITC)、別藻藍(lán)蛋白(APC)、得克薩斯紅(TR，Molecular Probes，Inc.)、多甲藻素葉綠素復(fù)合物(PerCp)、CY5(Biological Detection System)及其與PE偶聯(lián)的綴合物(例如PE/CY5、PE/APC和PE/TR)?？捎糜诖_定免疫細(xì)胞亞型的增殖頻率的熒光標(biāo)記包括但非限于PKH染料，如PKH2、PKH26和PKH67。
在前面的討論中，包含來(lái)自許多專業(yè)雜志和專利的引用用來(lái)參考。所有這種引用在此均以其全文并入?yún)⒖肌?br> 實(shí)施例1動(dòng)物對(duì)199頭豬的生產(chǎn)行為監(jiān)測(cè)大約7個(gè)月。所述豬是3種不同的內(nèi)基因型(internal genotype)的產(chǎn)物AxC、BXC和BXD基因型。在這個(gè)試驗(yàn)中使用總共18頭公豬；8頭公豬有10個(gè)以上的子代，其它10頭子代低于10個(gè)。群體中雄性與雌性比率為1-1.3。
動(dòng)物流程豬在農(nóng)場(chǎng)A，場(chǎng)所I出生。場(chǎng)所I包括飼養(yǎng)、妊娠和生產(chǎn)單位。將小豬用母豬乳汁喂養(yǎng)大約19天。母豬的喂食符合或超過(guò)國(guó)內(nèi)哺乳曲線標(biāo)準(zhǔn)(internal lactation curve guidelines)。
每周通過(guò)生產(chǎn)(farrowing)、保育(nursery)及生長(zhǎng)肥育室進(jìn)行一次豬流程，然后當(dāng)該豬符合特異性目標(biāo)重量時(shí)將豬移至下一個(gè)階段。保育豬的目標(biāo)重量是4-6.5kg，測(cè)試時(shí)期的重量為31.7kg，測(cè)試結(jié)束時(shí)重量為122.31kg。
將所有豬均在出生后24小時(shí)開(kāi)始處理。每頭豬單獨(dú)稱重(Mosdalscale model IQ-plus 390-DC)并用鈕扣狀耳部標(biāo)簽識(shí)別。為每頭豬給予葡聚糖鐵(Durvet，Inc)和青霉素(PfizerpenG，Pfizer)的1cc混合物及1cc慶大霉素(Garacin，Schering Plough)以預(yù)防腹瀉。
在斷奶時(shí)期，即在19天齡左右，將每頭豬單獨(dú)稱重并用顏色標(biāo)記。將豬運(yùn)至場(chǎng)所II的保育室，在此圈養(yǎng)至少7周。場(chǎng)所II包括保育室和生長(zhǎng)肥育室。有9個(gè)保育室，將豬按性別和重量關(guān)入欄中7周，與其它相同年齡和產(chǎn)品基因型的非實(shí)驗(yàn)豬同樣分配圈養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)對(duì)象是共15頭豬/欄。執(zhí)行一個(gè)4階段保育程序以及一個(gè)嚴(yán)格飼料預(yù)算程序。將豬在第10天齡和第24天齡用副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)菌苗(SuvaxynRespifendHps，F(xiàn)ort Dodge Laboratories)接種。
從6-7周齡的每頭豬中通過(guò)前腔靜脈穿刺獲得血液，并收集于含有抗凝劑(EDTA)的兩個(gè)10ml試管中。將血樣在全部時(shí)期均保持在具有冰袋的冷卻器中并通過(guò)連夜交貨遞送服務(wù)送至實(shí)驗(yàn)室處理。血樣收集與實(shí)驗(yàn)室處理之間的時(shí)間為20小時(shí)或更少。將血液取樣11個(gè)批次以便于實(shí)驗(yàn)室處理，每次引流最多取25個(gè)血樣。
在9周齡時(shí)，將豬稱重并將達(dá)到31.7kg目標(biāo)重量的動(dòng)物從保育室中移至生長(zhǎng)/肥育室中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用2-4個(gè)保育室充填一個(gè)生長(zhǎng)/肥育室。將豬與相同年齡和基因型的其它未選擇的豬一起圈養(yǎng)。將每個(gè)欄中選擇的豬同樣地標(biāo)示。在肥育室的一個(gè)房間內(nèi)分配8個(gè)欄的60頭閹過(guò)的公豬和60頭母豬。利用6欄圈養(yǎng)室共圈養(yǎng)720頭豬。將豬在所有房間中溫度最小變化(21.6℃-19.4℃)的條件下圈養(yǎng)并用4階段(four-phase)基于玉米-大豆的飲食程序進(jìn)行喂食。
在測(cè)試時(shí)將每頭豬單獨(dú)稱重(True-Test model 700scale)。另外，使用實(shí)時(shí)超聲(Aloka model SSD-500V)進(jìn)行活體測(cè)定，包括測(cè)定在第一肋的背膘、最后肋(背膘)、最后椎骨及腰肉深度(loin depth)。每?jī)芍軐⒚款^豬稱重直至該豬達(dá)到結(jié)束實(shí)驗(yàn)時(shí)的目標(biāo)重量122.3kg。
在測(cè)試結(jié)束時(shí)，將豬運(yùn)至Swift屠宰設(shè)備(Louisville，KY)屠宰。收集的胴體性狀包括熱胴體重量，fat-o-meter儀測(cè)得的背膘，fat-o-meter儀測(cè)得的腰肉深度和瘦肉百分比。
農(nóng)場(chǎng)健康狀況在實(shí)驗(yàn)期間獸醫(yī)每月視察一次農(nóng)場(chǎng)A。獸醫(yī)對(duì)保育室和生長(zhǎng)/肥育室中的臨床疾病和死亡率的存在情況進(jìn)行評(píng)估。認(rèn)為農(nóng)場(chǎng)A具有低至中等水平的沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)暴露水平，通過(guò)歷史血清學(xué)研究認(rèn)為是豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)陽(yáng)性。
對(duì)農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)以使用愛(ài)荷華州立大學(xué)的Danish MixedELISA檢測(cè)沙門(mén)氏菌屬抗體。沙門(mén)氏菌屬監(jiān)測(cè)結(jié)果(10頭肥育豬/月)表明在本研究期間無(wú)活性血清轉(zhuǎn)化，沙門(mén)氏菌屬的血清轉(zhuǎn)化在前幾年已經(jīng)出現(xiàn)。未觀測(cè)到沙門(mén)氏菌屬的臨床跡象。每年評(píng)估一次豬肺炎支原體血清學(xué)。在這項(xiàng)研究的最后一個(gè)月期間，在明尼蘇達(dá)州大學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室通過(guò)Tween-ELISA試驗(yàn)檢測(cè)到10頭肥育豬中有3頭具有抗豬肺炎支原體的抗體。
藥物/飼料添加程序在保育前及保育飲食中，200g/噸硫酸新霉素和土霉素(Neo-Terramycin，Pfizer)用作常規(guī)飼料添加程序的一部分。
細(xì)胞制備在實(shí)驗(yàn)室中，使用在別處描述的淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基(LSM，Cappel，ICN Biomedicals，Ohio)通過(guò)梯度分離從所有199個(gè)豬血樣中分離周圍血單核細(xì)胞(PBMC)(Solano-Aguilar et al.，2000)。在PBMC分離后，使用錐蟲(chóng)藍(lán)染料排除法計(jì)數(shù)細(xì)胞并將其活細(xì)胞濃度調(diào)整為5×107個(gè)細(xì)胞/ml。不是所有的豬樣品均用于所有免疫鑒定。
細(xì)胞類型和單克隆抗體天然殺傷細(xì)胞(NK)是具有殺死某些腫瘤細(xì)胞及眾多病毒感染的細(xì)胞能力的細(xì)胞。這種殺傷是天然的而不是特異性免疫。在豬中，NK細(xì)胞分別使用CD2和CD16豬單克隆抗體(MAb)MSA3和G7而被鑒別為CD2+/CD16+雙陽(yáng)性細(xì)胞。CD2MAb檢測(cè)T淋巴細(xì)胞，CD16MAb檢測(cè)III型Fcγ受體(FcγRIII)。
NK對(duì)靶細(xì)胞的殺傷需要靶細(xì)胞被特異性免疫球蛋白(IgG)預(yù)先包被，裂解過(guò)程稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的胞毒性。結(jié)合的抗體的識(shí)別通過(guò)白細(xì)胞上IgG Fc的低親和性受體FcγRIII而發(fā)生，所述受體在豬中用CD16MAb檢測(cè)。
SLA(豬主要組織相容性復(fù)合物)分子在抗原識(shí)別中起重要作用。它們靶向于特異的抗原，因此SLA屬于特異性免疫系統(tǒng)。有兩類MHC分子，即I類和II類。CD8+細(xì)胞是胞毒性最強(qiáng)的T淋巴細(xì)胞(CTL)，其識(shí)別細(xì)胞上與I類MHC分子結(jié)合的肽片段，這是CTL的裂解作用的靶位。這些肽通常衍生自內(nèi)源合成的蛋白質(zhì)，如病毒抗原。CD4+細(xì)胞是最強(qiáng)的輔助淋巴細(xì)胞，其識(shí)別其它細(xì)胞，如B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及在豬中激活的T細(xì)胞的一些亞群(subset)表面上與II類MHC分子結(jié)合的肽。II類相關(guān)的肽通常衍生自胞外微生物和可溶的蛋白質(zhì)抗原。CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞亞群可以分別使用74-12-4和76-2-11MAb檢測(cè)。
在人和豬MHC和SLA基因座中，有與眾不同的染色體區(qū)域，如DP、DQ和DR。在豬中，SLA-DQ抗體靶向SLA-II抗原，分別為SLA-DQ總體(T)、亮或活性(B)及暗或低活性(D)。SLA-DQ MAb識(shí)別SLA-DQ分子上的一個(gè)被認(rèn)為是所述區(qū)域的一個(gè)共同成分的單態(tài)決定簇而非識(shí)別一個(gè)多態(tài)決定簇(SLA-DQ基因表達(dá)多態(tài)性產(chǎn)物)。
在從全血中分離PBMC后，在兩種條件下測(cè)試淋巴細(xì)胞。首先，將PBMC等份直接免疫染色并通過(guò)將PBMC與初級(jí)豬MAb一起溫育測(cè)定免疫細(xì)胞亞群的百分比。其次，將PBMC等份與促分裂原伴刀豆球蛋白A(ConA，Sigma，St.Louis，MO)一起培養(yǎng)，使用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)及組合MAb和PKH67染色(Sigma，St.Louis，MO)測(cè)定細(xì)胞亞群的增殖性應(yīng)答。PBMC群中單克隆抗體及其靶細(xì)胞列于表1。這個(gè)研究中應(yīng)用的所有單克隆抗體均是豬特異性的，其靶細(xì)胞特異性已經(jīng)在別處加以描述(Saalmueller et al.，1998和Haverson et al.，2000)。選擇這些MAb，因?yàn)槠浒邢騿魏思?xì)胞和淋巴細(xì)胞上表達(dá)的表面標(biāo)記。一種抗豬泛白細(xì)胞(panleukocyte)標(biāo)記(CD45)和多重IgG同種型對(duì)照MAb分別用作陽(yáng)性和陰性對(duì)照。
在用與FITC或PE(Southern Biotechnology Associates，Birmingham，AL)偶聯(lián)的二級(jí)單克隆抗體標(biāo)記細(xì)胞之后，確定用特異性MAb免疫染色的細(xì)胞的百分比。
表1豬單克隆抗體及PBMC中的靶細(xì)胞


流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析使用在別處描述的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析免疫染色的PBMC(Solano-Aguilar et al.2001)。基于熒光強(qiáng)度計(jì)算染色的細(xì)胞的百分比，使用IgG同種型背景作為對(duì)照。就某些標(biāo)記而言，重要的是區(qū)分暗(D)與亮(B)的免疫熒光，因此報(bào)道了SLA-DQ的總(T)、D和B群。針對(duì)每個(gè)樣品的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析包括16,000-20,000個(gè)結(jié)果。
PKH67染色為進(jìn)行增殖測(cè)試，將PBMC在RPMI 1640培養(yǎng)基中洗滌一次，隨后通過(guò)于17×100ml的聚丙烯錐型試管中的尼龍網(wǎng)過(guò)濾。將細(xì)胞沉淀置于稀釋液C(Sigma，St.Louis，MO)中，達(dá)到5×106個(gè)細(xì)胞/ml的最終懸浮液。然后將該細(xì)胞懸浮液加入等體積的PKH67染料原液中(1.5L染料/1×107個(gè)細(xì)胞)，在室溫溫育3分鐘。預(yù)先確定細(xì)胞濃度以勻質(zhì)及亮地染色細(xì)胞。將等于細(xì)胞+染料總體積的一倍體積的熱滅活的胎牛血清加入該懸浮液中。然后將細(xì)胞離心沉淀3次，第一次用RPMI培養(yǎng)基與血清洗滌，最后一次在母細(xì)胞形成培養(yǎng)基(補(bǔ)加5％FBS，1mM丙酮酸鈉，2mM L-谷氨酰胺，非必需氨基酸，5.5×10-5M2-巰基乙醇，25mM Hepes緩沖液的RPMI 1640)中洗滌，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。染色程序的勻質(zhì)在第0天針對(duì)這些標(biāo)記的細(xì)胞等份通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)。
增殖將總共8×106個(gè)PKH67-標(biāo)記的細(xì)胞鋪板于24孔組織培養(yǎng)板的各個(gè)孔中。在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)向該孔中加入最終劑量為5μg/ml的伴刀豆球蛋白A。培養(yǎng)基對(duì)照孔中無(wú)促分裂原。終體積為2ml/孔。將該平板在37℃于5％CO2中溫育3天。在培養(yǎng)48小時(shí)后，將孔中上部1ml的培養(yǎng)基用1ml新鮮母細(xì)胞形成培養(yǎng)基更換。
收獲細(xì)胞進(jìn)行增殖分析在第3天，收集細(xì)胞，在RPMI培養(yǎng)基中洗滌2次并計(jì)數(shù)。將1×107個(gè)細(xì)胞/ml的濃度進(jìn)行如別處所述的示差免疫染色(differentialimmunostaining)(Solano-Aguilar et al.，2001)。培養(yǎng)后，將細(xì)胞用對(duì)照MAb或CD4或CD8MAb染色。收集的數(shù)據(jù)用于計(jì)算在暴露于ConA后淋巴細(xì)胞的增殖以測(cè)定淋巴細(xì)胞的功能。在與ConA或與培養(yǎng)基一起培養(yǎng)的細(xì)胞之間對(duì)比CD4陽(yáng)性(CD4+)、CD8陽(yáng)性(CD8+)及PKH67摻入(總細(xì)胞增殖)的增殖情況，以確定在刺激后是否任何細(xì)胞亞群均潛在地增加。
免疫細(xì)胞增殖的數(shù)據(jù)分析使用ModFit LT軟件中Proliferation Wizard模塊分析流式細(xì)胞計(jì)量數(shù)據(jù)(Verity Software House，Inc.，Topsham，Maine)。將細(xì)胞根據(jù)淋巴細(xì)胞群的前向散射和側(cè)向散射信號(hào)進(jìn)行門(mén)控以除去細(xì)胞碎片。非增殖性(親代)細(xì)胞的強(qiáng)度通過(guò)分析不與促分裂原一起培養(yǎng)的樣品而確定。每個(gè)細(xì)胞的世代應(yīng)具有大約一半的親代細(xì)胞的PKH67染料。從親代的強(qiáng)度研究中，ModFit軟件以不同的通道間隔用以峰為中心的高斯分布去卷積(Deconvolute)熒光密度柱狀圖(Givan et al.，1999)。使用軟件回報(bào)的在分析時(shí)每個(gè)雌性子代中細(xì)胞的百分比數(shù)據(jù)，計(jì)算已經(jīng)增殖的(前體頻率或PF)原始群體中每個(gè)細(xì)胞亞群(CD4+，CD8+，PKH67+)的各個(gè)頻率。計(jì)算的增殖指數(shù)(PI)是所有世代中的細(xì)胞總和除以未刺激的群體中理論上存在的原始親代細(xì)胞數(shù)。PI是實(shí)驗(yàn)期間(3天)培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)增加的一種測(cè)定方法。使用的前體頻率和增殖指數(shù)是淋巴細(xì)胞增殖的測(cè)定，而且在這個(gè)研究中認(rèn)為是功能性分析。
作為生長(zhǎng)指標(biāo)的免疫參數(shù)的測(cè)試評(píng)估的生產(chǎn)參數(shù)包括在如下生長(zhǎng)階段的平均日增重(ADG)a)測(cè)試期，b)從出生至斷奶期，c)從出生至測(cè)試結(jié)束期或者一生日增重，d)斷奶至測(cè)試結(jié)束期，及e)斷奶至測(cè)試期。對(duì)額外的生產(chǎn)參數(shù)如活體和胴體測(cè)定、飼料攝入量及飼料轉(zhuǎn)化也進(jìn)行分析。
增殖分析(PF和PI)和免疫表型(表達(dá)CD16、CD2等的細(xì)胞的百分比)對(duì)生產(chǎn)參數(shù)的作用通過(guò)將其在一個(gè)混和模型分析中作為回歸量而加以評(píng)估。
使用一個(gè)混和模型(SAS Proc.MIXED)確定當(dāng)評(píng)估生長(zhǎng)性狀的作用時(shí)應(yīng)該應(yīng)用哪些參數(shù)。使用的一個(gè)完整模型包括產(chǎn)品、種公畜(嵌套在產(chǎn)品內(nèi))、保育室、肥育室、性別、母豬的胎次(parity of sow)，其中公畜是一個(gè)隨機(jī)作用，所有其它因素均是固定的。種公畜由于部分混雜而嵌套在產(chǎn)品內(nèi)。當(dāng)針對(duì)產(chǎn)品內(nèi)的種公畜測(cè)試時(shí)未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品是顯著的，因此從最終的模型中排除。保育室和肥育室是非?；祀s的，因此最終模型中只包括保育室，因?yàn)槠洚a(chǎn)生最顯著的作用。
評(píng)估免疫細(xì)胞亞型標(biāo)記對(duì)增殖分析和生產(chǎn)性狀的預(yù)期作用以及增殖分析對(duì)生產(chǎn)性狀的預(yù)期作用。這些作用的最終模型示于表2。
表2參數(shù)模型

結(jié)果通過(guò)使用ModFit程序進(jìn)行的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析的數(shù)據(jù)表明99.37％的細(xì)胞被PKH67染色，論證了該程序的高效力。用CD45泛白細(xì)胞MAb獲得的結(jié)果表明平均92.04％的分離的細(xì)胞由CD45單克隆抗體識(shí)別為白細(xì)胞，表明一種適當(dāng)?shù)牧馨烷T(mén)控。背景染色通過(guò)使用IgG同種型對(duì)照物而對(duì)照。所有使用的MAb均示出比背景對(duì)照更高的值，表明該檢測(cè)系統(tǒng)是有效的。
在血液中檢測(cè)的免疫標(biāo)記的比例是針對(duì)一個(gè)典型的豬(豬1867)給定的CD4(14.92％)、CD8(48.24％)、CD4/CD8(8.32％)SWC3(4.12％)、SLADQ T(46.4％)SLADQB(16.34％)、SLADQ D(30.06％)、CD16(20.16％)CD2(63.32％)、CD2/CD16(18.98％)、CD21(7.26％)。對(duì)照物百分比是IgGa/Ig2b(0.4/0％)、Ig2a/IgG1(0.22/.06，CD45(98.38)。正如所期望的，一些免疫細(xì)胞亞群，如CD8、CD16、CD2/CD16是相對(duì)富集的。其它標(biāo)記如SWC3和CD21的相對(duì)百分比在循環(huán)血中較低，但仍有時(shí)高于背景水平。
平均斷奶期重量為6.4kg±0.16，平均斷奶齡是19.4天±0.2。在斷奶時(shí)，76％的小豬重量處于9.0-14.5磅的重量范圍；其余的，1％的豬重量＜8.9磅，23％的豬重量＞14.6磅。平均開(kāi)始測(cè)試時(shí)重量為33.3kg±0.5，平均開(kāi)始測(cè)試時(shí)齡為70.8天±0.6。平均測(cè)試結(jié)束時(shí)重量為123.1kg±0.7，平均測(cè)試結(jié)束時(shí)齡為166.8天±0.9。
這些發(fā)現(xiàn)是在豬初始生產(chǎn)階段重量相似而不是年齡相似進(jìn)行的豬流程下觀測(cè)的。認(rèn)為對(duì)豬流程中的重量加以標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)在豬中對(duì)比性能是重要的，其中ADG和胴體評(píng)估是測(cè)定的性狀，因?yàn)樨i的重量將影響日增重。相似地，針對(duì)胴體性狀進(jìn)行的關(guān)聯(lián)分析考慮到在測(cè)定時(shí)的動(dòng)物重量。
線性模型分析的結(jié)果表明全部增殖分析受到種公畜和性別的影響；增重性狀受到種公畜、保育室和肥育室、性別及母豬胎次的影響?；铙w和胴體測(cè)定受到產(chǎn)品、種公畜、性別和母豬胎次的影響。
在考慮了各種來(lái)源的差異之后，在免疫標(biāo)記與生產(chǎn)效能之間發(fā)現(xiàn)顯著關(guān)聯(lián)。這些關(guān)聯(lián)是在涵括取血樣時(shí)期(保育室)的特殊生產(chǎn)階段發(fā)現(xiàn)的，但是它們與其它生產(chǎn)階段也關(guān)聯(lián)，提示這些標(biāo)記可以在豬的整個(gè)生產(chǎn)壽命期預(yù)測(cè)生產(chǎn)效能。
淋巴細(xì)胞增殖發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞亞型標(biāo)記是淋巴細(xì)胞增殖的良好指征?？偧?xì)胞增殖頻率(PKH67PF)受到CD4+(p＝0.09)和SLA-DQT+細(xì)胞(p＝0.009)的百分比的影響?？偧?xì)胞增殖指數(shù)(PKH67PI)顯著受到SLA-DQB+細(xì)胞的百分比(p＝0.009)影響。最后，CD8+細(xì)胞的增殖頻率受到CD4+/CD8+細(xì)胞(p＝0.07)、CD8+(p＝0.03)和SLA-DQD+(p＝0.06)的百分比的影響。
日增重免疫細(xì)胞亞型標(biāo)記預(yù)示ADG。三種表型與豬的終生ADG顯著相關(guān)，包括CD16+細(xì)胞(p＝0.02)、CD2+/CD16+細(xì)胞(p＝0.0053)、CD8+細(xì)胞(p＝0.04)(表3)。一種功能性分析與豬的終生ADG相關(guān)CD4PF(p＝0.08)。這四種表型與生長(zhǎng)負(fù)相關(guān)，標(biāo)記的較高百分比與較低的ADG相關(guān)。
研究標(biāo)記對(duì)生長(zhǎng)的影響的另一種方式是對(duì)比tails或extremes。然而必須指出的是如上述使用的回歸模型是比查看extremes更好的指示，因?yàn)槠浒袛?shù)據(jù)。然而，為評(píng)估CD2+/CD16+細(xì)胞的頻率對(duì)終生ADG的影響，在示出這些細(xì)胞亞群的最高百分比的30頭豬與示出最低百分比的30頭豬之間對(duì)比增重和出欄的平均天數(shù)。計(jì)算增重是將ADG乘以達(dá)到測(cè)試結(jié)束時(shí)重量所必需的平均天數(shù)(所有豬平均為166.8±0.9天)。計(jì)算出欄平均天數(shù)是將測(cè)試結(jié)束時(shí)的目標(biāo)重量116kg除以相對(duì)于所述最低百分比的30頭豬的最高的ADG。
結(jié)果表明在CD2+/CD16+細(xì)胞中增加1％預(yù)期使終生ADG降低0.0018kg。最低30個(gè)應(yīng)答者的CD2+/CD16+細(xì)胞平均為5.4％，最高的30個(gè)平均為33.1％。這意味著終生增重的預(yù)測(cè)差異是(33.1-5.4)×0.0018＝0.0498kg/天。就167天而言，CD2+/CD16+細(xì)胞的高和低％之間的差異為大約8.32kg。
具有較高比例雙陽(yáng)性細(xì)胞的豬的ADG為0.7556kg，因此達(dá)到測(cè)試結(jié)束時(shí)116kg的目標(biāo)重量需要平均156天。表達(dá)高比例CD2+/CD16+細(xì)胞的豬需要166天達(dá)到同樣的目標(biāo)重量，在組之間有10天的差異。
一些表型標(biāo)記和增殖性應(yīng)答與在特定的生產(chǎn)階段、而非豬的整個(gè)生產(chǎn)終生ADG顯著相關(guān)。這些包括CD4+細(xì)胞與從出生至斷奶的ADG相關(guān)(p＝0.04)，SLA-DQB+細(xì)胞與從斷奶至測(cè)試時(shí)的ADG相關(guān)(p＝0.08)，及SWC3+細(xì)胞與測(cè)試時(shí)ADG(p＝0.07)及從斷奶至測(cè)試時(shí)ADG(p＝0.09)相關(guān)。所有這些關(guān)聯(lián)均具有正相關(guān)，較高的細(xì)胞百分比對(duì)應(yīng)較好的ADG(表3和4)。
胴體測(cè)定發(fā)現(xiàn)活體測(cè)定與細(xì)胞亞型標(biāo)記及增殖分析之間的顯著關(guān)聯(lián)。這些關(guān)聯(lián)包括在測(cè)試時(shí)CD4+/CD8+細(xì)胞與最后的椎骨(p＝0.015)，在測(cè)試結(jié)束時(shí)CD8PF與第一肋骨(p＝0.08)及在測(cè)試時(shí)SLA-DQD與背膘(p＝0.08)之間的關(guān)聯(lián)(表4)。當(dāng)在屠宰場(chǎng)評(píng)估同一組的動(dòng)物的胴體性狀時(shí)，這些關(guān)聯(lián)不明顯。
表達(dá)豬白細(xì)胞抗原(SLA)II型或SLA-DQ標(biāo)記的細(xì)胞的比例顯著影響重要的胴體性狀。SLA-DQB+和SLA-DQT+細(xì)胞的比例與熱胴體重量關(guān)聯(lián)(p＝0.04)。該相關(guān)性是正的，較高比例的SLA-DQB和T陽(yáng)性細(xì)胞與較高的熱胴體重量相關(guān)(表4)。
飼料攝取與效力飼料攝取與SLA-DQD+細(xì)胞(p＝0.04)和SLA-DQT+細(xì)胞(p＝0.06)的比例顯著關(guān)聯(lián)。SLA-DQ標(biāo)記與飼料轉(zhuǎn)化也關(guān)聯(lián)。SLA-DQB+(p＝0.05)，SLA-DQD+(p＝0.06)和SLA-DQT(p＝0.015)與飼料轉(zhuǎn)化顯著關(guān)聯(lián)。具有較高SLA-DQ陽(yáng)性細(xì)胞百分比的豬示出較好的飼料轉(zhuǎn)化。高水平的CD8PF與較差的飼料轉(zhuǎn)化相關(guān)(p＝0.09)。
在生產(chǎn)參數(shù)與CD2+、CD21+、CD4PI、CD8PI、PKH67PI或PKH67PF之間發(fā)現(xiàn)無(wú)關(guān)聯(lián)性。
總而言之，得自經(jīng)濟(jì)學(xué)觀點(diǎn)的更多相關(guān)結(jié)果是免疫表型與豬的終生ADG、胴體性狀及飼料轉(zhuǎn)化之間的顯著相關(guān)。因此，將闡述由參與這些關(guān)鍵關(guān)聯(lián)的抗體靶向的免疫細(xì)胞或細(xì)胞亞群的生物學(xué)方面的內(nèi)容。
在豬的整個(gè)生產(chǎn)壽命期間，在CD2+/CD16+細(xì)胞與增重性狀之間發(fā)現(xiàn)顯著關(guān)聯(lián)。這些雙陽(yáng)性細(xì)胞最可能是NK細(xì)胞。NK細(xì)胞具有殺死某些腫瘤細(xì)胞和廣泛的病毒感染的細(xì)胞的能力。這種殺傷不是由特異的抗原誘導(dǎo)的，因此是天然免疫性而不是特異性免疫性的一部分。NK細(xì)胞能裂解多種靶細(xì)胞。NK介導(dǎo)的胞毒性的水平典型地不是由抗原調(diào)節(jié)的，而是由細(xì)胞因子和激素，如白細(xì)胞介素-2、干擾素(IFN)、促乳素及生長(zhǎng)激素調(diào)節(jié)的。NK細(xì)胞還分泌IFN-γ，其激活單核細(xì)胞發(fā)育為巨噬細(xì)胞。
在豬的整個(gè)生產(chǎn)壽命期間，在CD16+細(xì)胞與增重性狀之間發(fā)現(xiàn)顯著關(guān)聯(lián)。在許多情況中，NK對(duì)靶細(xì)胞的殺傷需要該靶細(xì)胞預(yù)先用特異的IgG包被，該裂解過(guò)程稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的胞毒性。結(jié)合的抗體的識(shí)別通過(guò)白細(xì)胞上IgG Fc的一種低親和性受體發(fā)生，該受體稱為Fcγ受體III(FcγRIII)，其由CD16MAb檢測(cè)。
盡管不存在鑒別豬中的NK細(xì)胞的絕對(duì)的標(biāo)記，但作者相信從現(xiàn)今可以獲得的單克隆抗體中，CD2/CD16抗體的組合似乎是最合適的。在人體中CD2表達(dá)出現(xiàn)在胸腺細(xì)胞、外周T細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞上。其在50％的胸腺B細(xì)胞上也表達(dá)，在成熟B細(xì)胞上的表達(dá)有爭(zhēng)議。CD16檢測(cè)FcγRIII。對(duì)于豬而言，一個(gè)NK細(xì)胞亞群據(jù)認(rèn)為是CD2+/CD16+。CD16細(xì)胞亞群主要是由T和NK細(xì)胞表達(dá)的，但B細(xì)胞也可表達(dá)它。B和NK細(xì)胞是CD3陰性的。豬中的NK細(xì)胞分為CD8-和CD8暗淡細(xì)胞(dull cell)。B細(xì)胞在這個(gè)研究中作為CD16+細(xì)胞亞群來(lái)源的作用不顯著，因?yàn)樵贐細(xì)胞抗原(CD21)與ADG之間無(wú)關(guān)聯(lián)。
CD8+細(xì)胞是最胞毒性的T淋巴細(xì)胞(CTL)，其識(shí)別與是CTL的裂解作用目標(biāo)的細(xì)胞上I型MHC分子結(jié)合的肽片段。這些肽通常衍生自內(nèi)源合成的蛋白質(zhì)，如病毒抗原。在這個(gè)研究中未研究MHC I型抗原。
CD4+淋巴細(xì)胞是最主要的輔助細(xì)胞，識(shí)別與其它細(xì)胞如B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及在豬中一些激活的T細(xì)胞亞群的表面上的II型MHC分子結(jié)合的肽。II型相關(guān)的肽通常衍生自胞外微生物和可溶的蛋白質(zhì)抗原。
SLA-DQ+細(xì)胞的比例示出與胴體性狀和飼料轉(zhuǎn)化的顯著關(guān)聯(lián)。SLA或豬MHC分子在抗原識(shí)別中起重要作用。SLA-DQ豬MAb靶向SLA II型抗原，認(rèn)為其與鼠MHC II型基因座，I-E和人HLA-DQ相當(dāng)。在基因水平，DQ區(qū)域包含α和β鏈基因座；SLA-DQ通常是一個(gè)α鏈和一個(gè)β鏈的異源二聚體，其是通過(guò)抗體檢測(cè)的表面表達(dá)的產(chǎn)物。SLA-DQ單克隆抗體識(shí)別SLA-DQ分子上的一個(gè)單態(tài)決定簇，認(rèn)為其是SLA-DQ基因中一個(gè)基因的保守序列。
SWC3 MAb與在限制生產(chǎn)階段中的ADG相關(guān)。SWC3靶向單核細(xì)胞。單核細(xì)胞是這樣的細(xì)胞群，其在天然免疫性中是關(guān)鍵性的，而且在特異的獲得性免疫性中也起關(guān)鍵作用。單核細(xì)胞的一些功能是對(duì)外源顆粒的吞噬作用，產(chǎn)生殺死微生物并控制感染擴(kuò)散的介質(zhì)，產(chǎn)生細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，抗原呈遞細(xì)胞功能及促進(jìn)T細(xì)胞激活。
淋巴細(xì)胞高度增殖對(duì)生產(chǎn)參數(shù)如ADG和飼料轉(zhuǎn)化具有有害作用。已經(jīng)報(bào)道了在急性的沙門(mén)氏菌的攻擊下，淋巴細(xì)胞增殖是沙門(mén)氏菌抗性和生長(zhǎng)的一個(gè)良好指征。在該項(xiàng)研究中，在攻擊之前血淋巴細(xì)胞的較高增殖性應(yīng)答與在實(shí)驗(yàn)條件下疾病抗性和生長(zhǎng)降低相關(guān)(VanDiemen et al.，submitted)。在本研究中，高增殖性應(yīng)答與對(duì)包括生長(zhǎng)的生產(chǎn)參數(shù)的有害作用相關(guān)，其可能與亞臨床疾病的抗性相關(guān)。最重要地，這種有害作用在商業(yè)背景的無(wú)特殊急性疾病的畜群中觀測(cè)到，這可能是健壯性的指征。
微生物暴露發(fā)生在不完全無(wú)菌的任何環(huán)境中。微生物暴露在最清潔的商業(yè)操作中也的確存在。在這個(gè)研究中未評(píng)估豬暴露于特異的病原體，但是關(guān)聯(lián)結(jié)果(ADG)指出關(guān)鍵的免疫細(xì)胞參與應(yīng)答病毒(NK細(xì)胞，CD8+細(xì)胞)和細(xì)菌感染(CD4+，SLA-DQ+，單核細(xì)胞)。這似乎甚至在一種如在農(nóng)場(chǎng)A的情況中的其中沒(méi)有明顯病毒感染臨床跡象的環(huán)境中是相關(guān)的。
一些因素可影響血液中存在的免疫標(biāo)記的百分比，其中一種因素是接種。在保育前及保育階段在10天齡和24天齡接種副豬嗜血桿菌菌苗。在收集血液進(jìn)行細(xì)胞鑒定之前至少3周進(jìn)行第二次接種。因?yàn)樵诘诙谓臃N后在收集血樣進(jìn)行免疫染色之前的時(shí)間為至少3周，因此推測(cè)接種對(duì)免疫細(xì)胞群體無(wú)顯著影響。
獸醫(yī)的報(bào)道表明在農(nóng)場(chǎng)A，場(chǎng)所II中一些豬在研究期間的保育中示出臨床疾病。這些跡象包括偶然看起來(lái)病態(tài)的豬，其發(fā)育不好，及咳嗽。整個(gè)保育及生長(zhǎng)/肥育死亡率分別為1-2％和2％。這些百分比在商業(yè)操作中是在正常的死亡率范圍內(nèi)。因此，其測(cè)試免疫細(xì)胞的98％的豬存活至測(cè)試結(jié)束時(shí)。199頭進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的豬中只有4頭未存活至測(cè)試結(jié)束時(shí)。
在農(nóng)場(chǎng)A進(jìn)行的處理包括根據(jù)性別分欄，飼養(yǎng)方案，接種疫苗，豬密度，與許多商業(yè)操作相似。同樣，暴露于沙門(mén)氏菌屬和支原體的程度是在許多豬操作方案中共有的。因此，得自這個(gè)研究的結(jié)論可以推斷相似的操作。在這個(gè)研究中的免疫細(xì)胞在其它動(dòng)物物種中具有保守功能，這些細(xì)胞亞型標(biāo)記可以潛在地用于更廣泛的動(dòng)物宿主譜系中。
表3免疫細(xì)胞亞型(CD16，CD2/CD16，CD4，CD8)與增殖性應(yīng)答、平均日增重、胴體性狀及飼養(yǎng)參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)

1p＜0.01水平的顯著性表4SLA-DQ亞型對(duì)胴體性狀及飼養(yǎng)參數(shù)的作用


1p＜0.01水平的顯著性實(shí)施例2將研究的豬群體的大小增加至額外286頭豬。目的是收集更多的數(shù)據(jù)以證實(shí)免疫表型(CD16，CD2/CD16，CD8)與生產(chǎn)性能(生長(zhǎng))之間的關(guān)聯(lián)。這個(gè)研究中的豬源自兩個(gè)不同的農(nóng)場(chǎng)，一個(gè)農(nóng)場(chǎng)與實(shí)施例1的相同。動(dòng)物的管理、生產(chǎn)性能的記錄及免疫學(xué)性狀的測(cè)定與實(shí)施例1所述相似。同樣地，以與實(shí)施例1所述相同的方式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。針對(duì)第1年報(bào)道的關(guān)聯(lián)分析包括139頭動(dòng)物。第1年和第2年的結(jié)果是共425頭動(dòng)物。見(jiàn)下表5。
表5免疫表型對(duì)平均日增重(ADG)的作用。使用的統(tǒng)計(jì)模型為種公畜(產(chǎn)品)+保育室(年)+性別+胎次。對(duì)于這個(gè)大小的數(shù)據(jù)集，p值＞0.1的結(jié)果認(rèn)為是顯著的。粗體表示的結(jié)果代表第1年和第2年是合并在一起的。非粗體表示的結(jié)果是僅來(lái)自第1年。
CD16

CD2/CD16

CD8

上表5中重要的是指出如下內(nèi)容這些額外的結(jié)果提供了這樣的證據(jù)，即CD16陽(yáng)性細(xì)胞的百分比與豬的整個(gè)生產(chǎn)壽命期間的生長(zhǎng)相關(guān)(p＞0.09)。
另外，這些結(jié)果提供了這樣的證據(jù)，即CD2+/CD16+細(xì)胞的百分比與生長(zhǎng)相關(guān)。在這種情況中，這種相關(guān)對(duì)于從斷奶至測(cè)試結(jié)束時(shí)的ADG是顯著的(p＞0.096)，但對(duì)終生ADG不是必需的。
再者，這些結(jié)果提供了這樣的證據(jù)，即CD8陽(yáng)性細(xì)胞的百分比與豬的生長(zhǎng)相關(guān)。在這種情況中，這種相關(guān)對(duì)于從斷奶至測(cè)試結(jié)束時(shí)的ADG是顯著的(p＞0.002)，但對(duì)終生ADG不是必需的。
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本領(lǐng)域技術(shù)人員借助于本發(fā)明的揭示，可以對(duì)本文所述的方法和組合物進(jìn)行多種改變、以等價(jià)物取代或者進(jìn)行其它變化，以實(shí)施本發(fā)明。因此，除了如下權(quán)利要求書(shū)所述的內(nèi)容之外，本發(fā)明的保護(hù)范圍不被其它內(nèi)容所限定。
權(quán)利要求
1.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；確定每個(gè)動(dòng)物中CD16抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量；及選擇CD16抗原表達(dá)細(xì)胞數(shù)量最低的動(dòng)物，從而在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性。
2.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；確定每個(gè)動(dòng)物中CD16和CD2雙陽(yáng)性抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量；及選擇CD16和CD2雙陽(yáng)性抗原表達(dá)細(xì)胞數(shù)量最低的動(dòng)物，從而在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性。
3.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；確定每個(gè)動(dòng)物中CD8抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量；及選擇CD8抗原表達(dá)細(xì)胞數(shù)量最低的動(dòng)物，從而在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性。
4.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；確定每個(gè)動(dòng)物中MHC-DQ抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量；及選擇MHC-DQ抗原表達(dá)細(xì)胞數(shù)量最高的動(dòng)物，從而在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性。
5.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；確定每個(gè)動(dòng)物中表達(dá)由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQB抗原的細(xì)胞的數(shù)量；及選擇表達(dá)由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQB抗原的細(xì)胞數(shù)量最高的動(dòng)物，從而在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性。
6.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；確定每個(gè)動(dòng)物中表達(dá)由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQD抗原的細(xì)胞的數(shù)量；及選擇表達(dá)由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQD抗原的細(xì)胞數(shù)量最高的動(dòng)物，從而在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性。
7.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；確定每個(gè)動(dòng)物中CD4抗原表達(dá)細(xì)胞的增殖頻率；及選擇CD4抗原表達(dá)細(xì)胞增殖頻率最低的動(dòng)物，從而在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Sus scrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrusgallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
9.權(quán)利要求2的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Sus scrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrusgallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
10.權(quán)利要求3的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
11.權(quán)利要求4的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
12.權(quán)利要求5的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
13.權(quán)利要求6的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
14.權(quán)利要求7的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
15.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；確定每個(gè)動(dòng)物中CD16抗原表達(dá)細(xì)胞、CD16和CD2雙陽(yáng)性抗原表達(dá)細(xì)胞、CD8抗原表達(dá)細(xì)胞、MHC-DQ抗原表達(dá)細(xì)胞、表達(dá)由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQB抗原的細(xì)胞及由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQD抗原的細(xì)胞的數(shù)量；確定每個(gè)動(dòng)物中CD4抗原表達(dá)細(xì)胞的增殖頻率；及選擇CD16抗原表達(dá)細(xì)胞數(shù)量最低、CD16和CD2雙陽(yáng)性抗原表達(dá)細(xì)胞數(shù)量最低、CD8抗原表達(dá)細(xì)胞數(shù)量最低、MHC-DQ抗原表達(dá)細(xì)胞數(shù)量最高、表達(dá)由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQB抗原的細(xì)胞數(shù)量最高、由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQD抗原的細(xì)胞數(shù)量最高及CD4抗原表達(dá)細(xì)胞的增殖頻率最低的動(dòng)物，從而在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
17.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；確定每個(gè)動(dòng)物中CD16抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量；確定動(dòng)物的CD16抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量與健壯性之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著關(guān)聯(lián)；及基于所述關(guān)聯(lián)選擇動(dòng)物以改良健壯性。
18.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；確定每個(gè)動(dòng)物中CD16和CD2雙陽(yáng)性抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量；確定動(dòng)物的CD16和CD2雙陽(yáng)性抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量與健壯性之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著關(guān)聯(lián)；及基于所述關(guān)聯(lián)選擇動(dòng)物以改良健壯性。
19.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；確定每個(gè)動(dòng)物中CD8抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量；確定動(dòng)物的CD8抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量與健壯性之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著關(guān)聯(lián)；及基于所述關(guān)聯(lián)選擇動(dòng)物以改良健壯性。
20.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；確定每個(gè)動(dòng)物中MHC-DQ抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量；確定動(dòng)物的MHC-DQ抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量與健壯性之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著關(guān)聯(lián)；及基于所述關(guān)聯(lián)選擇動(dòng)物以改良健壯性。
21.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；確定每個(gè)動(dòng)物中表達(dá)由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQB抗原的細(xì)胞的數(shù)量；確定動(dòng)物的表達(dá)由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQB抗原的細(xì)胞數(shù)量與健壯性之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著關(guān)聯(lián)；及基于所述關(guān)聯(lián)選擇動(dòng)物以改良健壯性。
22.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；確定每個(gè)動(dòng)物中表達(dá)由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQD抗原的細(xì)胞數(shù)量；確定動(dòng)物的表達(dá)由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQD抗原的細(xì)胞數(shù)量與健壯性之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著關(guān)聯(lián)；及基于所述關(guān)聯(lián)選擇動(dòng)物以改良健壯性。
23.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；確定每個(gè)動(dòng)物中CD4抗原表達(dá)細(xì)胞的增殖頻率；確定動(dòng)物的CD4抗原表達(dá)細(xì)胞的增殖頻率與健壯性之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著關(guān)聯(lián)；及基于所述關(guān)聯(lián)選擇動(dòng)物以改良健壯性。
24.權(quán)利要求17的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
25.權(quán)利要求18的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
26.權(quán)利要求19的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
27.權(quán)利要求20的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
28.權(quán)利要求21的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
29.權(quán)利要求22的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
30.權(quán)利要求23的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
31.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；從動(dòng)物中獲得生物學(xué)樣品，其中所述樣品包含全血；確定每個(gè)動(dòng)物中CD16抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量；及選擇CD16抗原表達(dá)細(xì)胞數(shù)量最低的動(dòng)物，從而在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性。
32.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；從動(dòng)物中獲得生物學(xué)樣品，其中所述樣品包含全血；確定每個(gè)動(dòng)物中CD16和CD2雙陽(yáng)性抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量；及選擇CD16和CD2雙陽(yáng)性抗原表達(dá)細(xì)胞數(shù)量最低的動(dòng)物，從而在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性。
33.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；從動(dòng)物中獲得生物學(xué)樣品，其中所述樣品包含全血；確定每個(gè)動(dòng)物中CD8抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量；及選擇CD8抗原表達(dá)細(xì)胞數(shù)量最低的動(dòng)物，從而在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性。
34.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；從動(dòng)物中獲得生物學(xué)樣品，其中所述樣品包含全血；確定每個(gè)動(dòng)物中MHC-DQ抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量；及選擇MHC-DQ抗原表達(dá)細(xì)胞數(shù)量最高的動(dòng)物，從而在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性。
35.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；從動(dòng)物中獲得生物學(xué)樣品，其中所述樣品包含全血；確定每個(gè)動(dòng)物中表達(dá)由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQB抗原的細(xì)胞的數(shù)量；及選擇表達(dá)由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQB抗原的細(xì)胞數(shù)量最高的動(dòng)物，從而在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性。
36.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；從動(dòng)物中獲得生物學(xué)樣品，其中所述樣品包含全血；確定每個(gè)動(dòng)物中表達(dá)由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQD抗原的細(xì)胞的數(shù)量；及選擇表達(dá)由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQD抗原的細(xì)胞數(shù)量最高的動(dòng)物，從而在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性。
37.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；從動(dòng)物中獲得生物學(xué)樣品，其中所述樣品包含全血；確定每個(gè)動(dòng)物中CD4抗原表達(dá)細(xì)胞的增殖頻率；及選擇CD4抗原表達(dá)細(xì)胞增殖頻率最低的動(dòng)物，從而在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性。
38.權(quán)利要求31的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
39.權(quán)利要求32的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
40.權(quán)利要求33的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
41.權(quán)利要求34的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
42.權(quán)利要求35的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
43.權(quán)利要求36的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
44.權(quán)利要求37的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
45.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；從動(dòng)物中獲得生物學(xué)樣品，其中所述樣品包含全血；確定每個(gè)動(dòng)物中CD16抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量；確定動(dòng)物的CD16抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量與健壯性之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著關(guān)聯(lián)；及基于所述關(guān)聯(lián)選擇動(dòng)物以改良健壯性。
46.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；從動(dòng)物中獲得生物學(xué)樣品，其中所述樣品包含全血；確定每個(gè)動(dòng)物中CD16和CD2雙陽(yáng)性抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量；確定動(dòng)物的CD16和CD2雙陽(yáng)性抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量與健壯性之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著關(guān)聯(lián)；及基于所述關(guān)聯(lián)選擇動(dòng)物以改良健壯性。
47.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；從動(dòng)物中獲得生物學(xué)樣品，其中所述樣品包含全血；確定每個(gè)動(dòng)物中CD8抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量；確定動(dòng)物的CD8抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量與健壯性之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著關(guān)聯(lián)；及基于所述關(guān)聯(lián)選擇動(dòng)物以改良健壯性。
48.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；從動(dòng)物中獲得生物學(xué)樣品，其中所述樣品包含全血；確定每個(gè)動(dòng)物中MHC-DQ抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量；確定動(dòng)物的MHC-DQ抗原表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量與健壯性之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著關(guān)聯(lián)；及基于所述關(guān)聯(lián)選擇動(dòng)物以改良健壯性。
49.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；從動(dòng)物中獲得生物學(xué)樣品，其中所述樣品包含全血；確定每個(gè)動(dòng)物中表達(dá)由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQB抗原的細(xì)胞的數(shù)量；確定動(dòng)物的表達(dá)由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQB抗原的細(xì)胞的數(shù)量與健壯性之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著關(guān)聯(lián)；及基于所述關(guān)聯(lián)選擇動(dòng)物以改良健壯性。
50.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；從動(dòng)物中獲得生物學(xué)樣品，其中所述樣品包含全血；確定每個(gè)動(dòng)物中表達(dá)由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQD抗原的細(xì)胞的數(shù)量；確定動(dòng)物的表達(dá)由MHC-DQ抗體靶向?yàn)镸HC-DQD抗原的細(xì)胞的數(shù)量與健壯性之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著關(guān)聯(lián)；及基于所述關(guān)聯(lián)選擇動(dòng)物以改良健壯性。
51.一種在兩或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法，所述方法包括如下步驟提供相同物種的兩或多個(gè)動(dòng)物；從動(dòng)物中獲得生物學(xué)樣品，其中所述樣品包含全血；確定每個(gè)動(dòng)物中CD4抗原表達(dá)細(xì)胞的增殖頻率；確定動(dòng)物的CD4抗原表達(dá)細(xì)胞的增殖頻率與健壯性之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著關(guān)聯(lián)；及基于所述關(guān)聯(lián)選擇動(dòng)物以改良健壯性。
52.權(quán)利要求45的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
53.權(quán)利要求46的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
54.權(quán)利要求47的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
55.權(quán)利要求48的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
56.權(quán)利要求49的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
57.權(quán)利要求50的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
58.權(quán)利要求51的方法，其中所述物種選自Bos taurus、Susscrofa、Ovis aries、Bison bison、Babalus babalus、Gallus domesticus、Meleagrus gallopavo、Anas rubripes和Branta canadensis。
全文摘要
本發(fā)明一般性涉及動(dòng)物育種方法。更特別地，本發(fā)明涉及基于動(dòng)物中免疫細(xì)胞亞型的數(shù)量及淋巴細(xì)胞的增殖性應(yīng)答的頻率而在兩個(gè)或多個(gè)動(dòng)物之中選擇健壯性的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK1717586SQ03819134
公開(kāi)日2006年1月4日 申請(qǐng)日期2003年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月21日
發(fā)明者盧西納·克琳娜－潘托哈, 約翰·巴斯蒂安森, 馬莎·A.·梅林坎普 申請(qǐng)人:豬改良英國(guó)有限公司