專利名稱：組氨酸熒光探針及其專用熒光化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組氨酸熒光探針及其專用熒光化合物。
背景技術(shù)：
近年來，一些生物小分子尤其是氨基酸類分子的檢測(cè)成為人們研究的熱點(diǎn)。其中對(duì)于含側(cè)鏈的氨基酸的選擇性檢測(cè)意義尤為重要，因?yàn)樵S多含側(cè)鏈的氨基酸在生物體中具有很重要的生理意義。例如組氨酸可以影響蛋白質(zhì)的構(gòu)成，并且在嬰幼兒及動(dòng)物的生長(zhǎng)過程中起著重要作用，而且也是研究早期生命起源的一個(gè)重要線索。到目前為止，雖然已經(jīng)有報(bào)道采用了一些熒光傳感器來檢測(cè)組氨酸；但是，真正能做到選擇性好，檢測(cè)限低并且能在體液環(huán)境中對(duì)組氨酸即時(shí)檢測(cè)的熒光傳感器還很少。為此探索新的檢測(cè)組氨酸的方法顯得尤為重要。
近年來，置換法被廣泛的應(yīng)用于熒光傳感器分子的設(shè)計(jì)中。其原理是熒光指示分子與金屬離子絡(luò)合，其熒光增強(qiáng)或猝滅；然后加入被分析物，被分析物與金屬離子絡(luò)合，使熒光分子釋放出來，體系熒光恢復(fù)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于(1)熒光探針簡(jiǎn)單，原位生成，可以應(yīng)用于水相；(2)應(yīng)用熒光作為檢測(cè)手段，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高；(3)該方法可以通過調(diào)控?zé)晒夥肿优c金屬離子的絡(luò)合常數(shù)來選擇性的檢測(cè)分析物。組氨酸不僅含有羧基和氨基，而且側(cè)鏈含有咪唑基團(tuán)，使它與其它氨基酸相比，具有對(duì)金屬更好的絡(luò)合能力，這就為檢測(cè)組氨酸提供了一個(gè)很好的可行途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種熒光化合物，由這種熒光化合物構(gòu)成的熒光探針及其制備方法。
本發(fā)明所提供的熒光化合物，其結(jié)構(gòu)如式I所示， (式I)其中，n為1-4的整數(shù)，R為含共軛芳香環(huán)的熒光功能基團(tuán)，M為鉀或者鈉。
這里，R可優(yōu)選為萘基、蒽基或芘基。更優(yōu)選的，在式I結(jié)構(gòu)中R為蒽基，n為1，M為鉀。
該熒光化合物的制備方法，包括如下步驟1)芳香胺與溴代乙酸乙酯在苯溶液中，以碳酸鈉為堿進(jìn)行反應(yīng)，得到羧酸酯類化合物；2)將該羧酸酯類化合物在乙醇溶液中與氫氧化鉀或氫氧化鈉反應(yīng)，得到所述熒光分子。
由本發(fā)明熒光化合物所形成的用于檢測(cè)組氨酸的熒光探針，是式I結(jié)構(gòu)的熒光化合物與二價(jià)銅離子形成的絡(luò)合物。
本發(fā)明發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該探針在水相中對(duì)組氨酸有很好的選擇性及靈敏度，并可以實(shí)現(xiàn)即時(shí)檢測(cè)，是一類很好的熒光傳感器，可廣泛用于檢測(cè)組氨酸。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1、合成熒光化合物所選用的試劑皆為常用試劑，合成步驟簡(jiǎn)單，目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率高，容易分離，純度高。所用反應(yīng)均為經(jīng)典反應(yīng)，試劑簡(jiǎn)單，反應(yīng)產(chǎn)率高，能夠大量生產(chǎn)。
2、熒光化合物有很好的水溶性，并能應(yīng)用于仿生環(huán)境中；3、熒光探針的制備簡(jiǎn)單，用量低，對(duì)組氨酸具有良好的選擇性。檢測(cè)限低，能達(dá)到0.1微摩爾每升。


圖1為1×10-6摩爾每升的熒光分子(R基團(tuán)為蒽，n＝1)在純水中加入銅離子時(shí)，紫外的變化情況；圖2為1×10-6摩爾每升的熒光分子在純水中加入不同銅離子時(shí)，熒光猝滅的情況；圖3為根據(jù)圖2所做的計(jì)算熒光分子與銅離子絡(luò)合常數(shù)的線性關(guān)系圖，其中F0為熒光分子1×10-6摩爾每升時(shí)最初的熒光值；圖4為實(shí)施例2熒光探針加入組氨酸時(shí)紫外的變化；圖5為熒光探針在純水中用組氨酸滴定時(shí)熒光恢復(fù)的情況；圖6為熒光探針在仿生環(huán)境中(0.05M NaCl，KH2PO4-K2HPO4，pH＝7.4)逐漸加入組氨酸時(shí)熒光恢復(fù)的情況；
圖7為熒光探針在仿生環(huán)境中(0.05M NaCl，KH2PO4-K2HPO4，pH＝7.4)分別加入3×10-5摩爾每升的絲氨酸、甘氨酸、精氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、谷氨酸、鳥氨酸、3-甲基組氨酸時(shí)，初始熒光和最終熒光變化的情況。
圖8、圖9、圖10分別為熒光分子(1×10-4摩爾每升)、熒光分子加銅離子、熒光分子加銅離子后又加入組氨酸時(shí)的ESI譜圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、熒光化合物1的制備(R為蒽基，n＝1，M為鉀)在本發(fā)明中，所用的式I結(jié)構(gòu)熒光分子可以采用含熒光基團(tuán)的芳香胺和溴代乙酸乙酯為原料合成一類簡(jiǎn)單的羧酸酯類化合物，然后，通過簡(jiǎn)單的堿性水解反應(yīng)，制備其羧酸鹽。以熒光化合物1(R為蒽基，n＝1，M為鉀)為例，其合成反應(yīng)方程式如下 將1.80克碳酸鈉與0.5克9，10-二氨甲基蒽加入到50毫升新蒸苯中，然后將2.83克溴代乙酸乙酯在室溫下慢慢加入到該體系，約15分鐘加完。將該混合物攪拌回流過夜，然后濾出無機(jī)鹽。溶液旋干后用硅膠層析柱提純(淋洗液-乙酸乙酯/二氯甲烷1∶9體積比)，得0.62克淡黃色固體中間產(chǎn)物，產(chǎn)率50.5％。
質(zhì)譜(EI)m/z 580熔點(diǎn)145℃核磁氫譜1H-NMR(300Hz，CDCl3)δ8.69(m，4H)，7.51(m，4H)，4.97(s，4H)，4.14(m，8H)，3.59(s，8H)，1.23(m，12H)元素分析計(jì)算值C32H40N2O8C 66.11，H 6.96，N 4.82；測(cè)量值C 65.95，H 7.04，N4.94.
向10毫升甲醇與10毫升水形成的混合溶液中加入0.35克上面所得中間產(chǎn)物，然后加入0.2克氫氧化鉀。將混合體系攪拌回流過夜，將反應(yīng)液旋干，并用20mL的二氯甲烷及3×5mL的甲醇洗滌，得到0.36克熒光化合物1，產(chǎn)率為96％。
質(zhì)譜(FAB，negative)計(jì)算值581.0133；測(cè)量值581.0136熔點(diǎn)＞300℃核磁氫譜1H-NMR(300Hz，D2O)δ8.69(m，4H)，7.54(m，4H)，4.59(s，4H)，3.16(s，8H)實(shí)施例2、熒光探針的制備向1×10-6摩爾每升的熒光分子1的水溶液中(pH＝7.4)，加入硝酸銅，Cu2+與熒光化合物1的摩爾數(shù)之比為2，充分振蕩搖勻，即形成熒光探針。
實(shí)施例3、熒光探針的光物理性質(zhì)圖1為1×10-6摩爾每升的熒光分子1(R基團(tuán)為蒽，n＝1)在純水中加入銅離子時(shí)(銅離子摩爾數(shù)為熒光分子的2倍)，紫外的變化情況；圖2為1×10-6摩爾每升的熒光分子1在純水中加入銅離子時(shí)(銅離子摩爾數(shù)分別為熒光分子的0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0倍)，熒光猝滅的情況。隨著銅離子的引進(jìn)，在紫外吸收?qǐng)D中，可以觀察到258納米處的峰消失，同時(shí)在262納米處形成一新峰，說明熒光分子與銅離子形成一個(gè)穩(wěn)定的絡(luò)合態(tài)。而在熒光發(fā)射圖中，隨銅離子的加入，熒光逐漸猝滅。圖3為根據(jù)圖2所做的計(jì)算熒光分子與銅離子絡(luò)合常數(shù)的線性關(guān)系圖，熒光分子與銅的絡(luò)合常數(shù)約為5.3×106，其中F0為熒光分子1×10-6摩爾每升時(shí)最初的熒光值。
圖4為實(shí)施例2所得熒光探針，加入組氨酸時(shí)紫外的變化(組氨酸摩爾數(shù)為熒光探針的20倍)。圖5為熒光探針在純水中用組氨酸滴定時(shí)熒光恢復(fù)的情況。圖8、圖9、圖10分別為熒光分子(1×10-4摩爾每升)、熒光分子(1×10-4摩爾每升)加銅離子(銅離子摩爾數(shù)為熒光分子的2倍)、熒光分子加銅離子后又加入組氨酸時(shí)(銅離子摩爾數(shù)為熒光分子的2倍，組氨酸摩爾數(shù)為熒光分子的30倍)的ESI譜圖。圖4圖5圖8圖9圖10揭示了熒光探針與組氨酸作用的原理。由于組氨酸與銅離子的絡(luò)合常數(shù)較大，隨著組氨酸的加入，熒光探針發(fā)生解離，從而使熒光分子1游離出來，體系的熒光恢復(fù)。在圖4和圖5中，均能觀察到分子1吸收光譜和發(fā)射光譜恢復(fù)的過程，并且根據(jù)圖5可以計(jì)算出組氨酸對(duì)銅的競(jìng)爭(zhēng)絡(luò)合在一定范圍內(nèi)所形成的絡(luò)合物為1∶1絡(luò)合。從圖8、圖9、圖10可以明顯看到熒光分子1離子峰的變化。
圖6為實(shí)施例2熒光探針在仿生環(huán)境中(0.05M NaCl，KH2PO4-K2HPO4，pH＝7.4))逐漸加入組氨酸時(shí)熒光恢復(fù)的情況。圖7為實(shí)施例2熒光探針在仿生環(huán)境中(0.05M NaCl，KH2PO4-K2HPO4，pH＝7.4)分別加入3×10-5摩爾每升的絲氨酸、甘氨酸、精氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、谷氨酸、鳥氨酸、3-甲基組氨酸時(shí)，初始熒光值和最終熒光值的變化情況，圖中1-9分別代表絲氨酸、甘氨酸、精氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、谷氨酸、鳥氨酸、3-甲基組氨酸；兩組數(shù)據(jù)中，前者為初始熒光值，后者為最終熒光值。圖6、圖7揭示了該熒光探針在仿生環(huán)境中對(duì)各種常見陰離子的選擇性的比較，從圖7中可以看出，該熒光探針對(duì)組氨酸有很好的選擇性。
另外，由圖5、圖6中可見，本發(fā)明探針具有很低的檢測(cè)限，能達(dá)到0.1微摩爾每升。
以上數(shù)據(jù)表明，該探針在水相中對(duì)組氨酸有很好的選擇性及靈敏度，并可以實(shí)現(xiàn)即時(shí)檢測(cè)，是一類很好的熒光傳感器，可廣泛用于檢測(cè)組氨酸。
在本發(fā)明熒光探針中，R基團(tuán)提供熒光源，可以選擇多種的含共軛芳香環(huán)的熒光功能基團(tuán)，如萘、蒽、芘等；含氮羧酸鹽是絡(luò)合基團(tuán)，而作用機(jī)理是重金屬離子與分子絡(luò)合猝滅熒光。該化合物中R為其他取代基時(shí)化合物的合成，可以參考R為蒽基時(shí)化合物的合成(實(shí)施例1)，由于芳香胺與溴代乙酸乙酯的反應(yīng)及酯的水解反應(yīng)均為經(jīng)典反應(yīng)，類似化合物均易于合成。所以當(dāng)R為萘和芘時(shí)，熒光探針仍然對(duì)組氨酸有很好的選擇性。
權(quán)利要求
1.式I結(jié)構(gòu)的化合物， (式I)其中，n為1-4的整數(shù)，R為含共軛芳香環(huán)的熒光功能基團(tuán)，M為鉀或者鈉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于所述R為萘基、蒽基或芘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于所述R為蒽基，n為1。
4.權(quán)利要求3所述化合物的制備方法，包括如下步驟1)芳香胺與溴代乙酸乙酯在苯溶液中，以碳酸鈉為堿進(jìn)行反應(yīng)，得到羧酸酯類化合物；2)將該羧酸酯類化合物在乙醇溶液中與氫氧化鉀或氫氧化鈉反應(yīng)，得到所述化合物。
5.一種檢測(cè)組氨酸的熒光探針，是由式I化合物與二價(jià)銅離子形成的絡(luò)合物；
6.權(quán)利要求5所述熒光探針在檢測(cè)組氨酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了組氨酸熒光探針及其專用熒光化合物。本發(fā)明所提供的熒光化合物，其結(jié)構(gòu)如式I所示，其中，n為1－4的整數(shù)，R為含共軛芳香環(huán)的熒光功能基團(tuán)，M為鉀或者鈉。本發(fā)明熒光化合物合成簡(jiǎn)單，水溶性好，與Cu
文檔編號(hào)G01N33/52GK101037595SQ20061005759
公開日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2006年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月16日
發(fā)明者李洪祥, 胡文平, 付艷艷 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所