專利名稱：玉米根優(yōu)先啟動子及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及玉米啟動子的分離，該啟動子能夠指導與之可操作性相連的外源DNA序列優(yōu)先地、選擇性或?qū)ｉT地在植物(例如玉米植物)根中的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明還涉及嵌合基因用于在植物(例如玉米植物)根中優(yōu)先地或選擇性地表達生物活性目的RNA的用途。還提供了含有與外源DNA序列可操作性相連的玉米根優(yōu)先或選擇性啟動子的植物，例如玉米植物，所述外源DNA序列轉(zhuǎn)錄后會優(yōu)先地或選擇性地在植物根中產(chǎn)生生物活性RNA。
相關(guān)技術(shù)說明轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)中的一項重要考慮是，以優(yōu)先或選擇性的方式在目的組織中獲得足夠高的轉(zhuǎn)基因表達水平。以這種方式，可以避免與轉(zhuǎn)錄物組成型表達有關(guān)的潛在缺陷，例如生產(chǎn)緩慢。對適宜啟動子的選擇是獲得某一特定轉(zhuǎn)基因的目的表達模式的關(guān)鍵。
轉(zhuǎn)基因在植物(特別是谷類植物，例如玉米)根中的選擇性表達，被認為是具有潛在商業(yè)重要性的，例如，對于根組織功能的改變、對于偏好攻擊根的病原體或害蟲的抗性(例如，線蟲、玉米根蟲，等)、對除草劑或不良環(huán)境條件(例如干旱或土壤組成)的抗性。
US 5,633,363描述了一個分離自玉米、命名為ZRP2的、4.7kb上游啟動子區(qū)域，歸結(jié)了該啟動子區(qū)域在驅(qū)動異源基因的根優(yōu)先表達中的特定用途。
WO 97/44448通常涉及植物中的基因表達機制，更特別涉及在植物中以組織特異性方式特別是在根中的基因表達調(diào)控。公開了促成組織優(yōu)先(tissue-preferred)基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的分離方法。
WO 00/15662描述了一種富甘氨酸蛋白(zmGRP3)的啟動子，該蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄物按發(fā)育特異性模式僅在幼玉米秧苗根中累積。
WO 00/070068和WO 00/70066分別描述了玉米RS81和RS324啟動子，它們是在玉米根組織但不在種子組織中表達的基因的啟動子，并且在分子分析中它們被描述為具有根特異性表達模式。
盡管存在玉米根優(yōu)先啟動子(corn root preferentialpromoter)在現(xiàn)有技術(shù)中是可以獲得的這一事實，還是仍然需要一種可以作為替代的、能夠進行優(yōu)先或選擇性根選擇性表達的啟動子，例如對于幾種外源的目的DNA序列的獨立表達而不存在由于使用相同的啟動子而導致出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后沉默的可能性。此外，已知的玉米根優(yōu)先啟動子各自指導特定的時間、空間和/或發(fā)育表達模式，它們并不總是能滿足特定的目的。因此仍然需要新的、能夠控制根中轉(zhuǎn)錄的、根玉米優(yōu)先啟動子，優(yōu)選以更具選擇性的方式控制轉(zhuǎn)錄、以及更優(yōu)選產(chǎn)生高豐度的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

發(fā)明內(nèi)容
概述本發(fā)明的一個目的是提供含有選自下組的核苷酸序列的玉米根優(yōu)先啟動子a)含有SEQ ID No 1自第1位核苷酸至第338位核苷酸的核苷酸序列、或SEQ ID No 2自第11位核苷酸至第1196位核苷酸的核苷酸序列(“GL4啟動子”)的核苷酸序列；
b)含有SEQ ID No 14自第1位核苷酸至第1280位核苷酸的核苷酸序列(“GL5啟動子”)的核苷酸序列；c)含有編碼mRNA的玉米優(yōu)先基因的5′末端約400bp至約1300bpDNA片段核苷酸序列的核苷酸序列，由該mRNA可以制備含有與核苷酸序列SEQ ID No 7或SEQ ID No 8或SEQ ID No 9或SEQID No 10的互補序列的cDNA；d)含有編碼mRNA的玉米優(yōu)先基因的5′末端約400bp至約1300bpDNA片段核苷酸序列的核苷酸序列，由該mRNA可以制備包含編碼具有氨基酸序列SEQ ID No 4或6的多肽的核苷酸序列的cDNA；e)含有編碼mRNA的玉米優(yōu)先基因的5′末端約400bp至約1300bpDNA片段核苷酸序列的核苷酸序列，由該mRNA可以制備含有具有SEQ ID No 3、5或11之中任一核苷酸序列至少75％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％、特別優(yōu)選至少95％、更特別優(yōu)選與之相同的核苷酸序列的cDNA；f)含有具有a)、b)、c)、d)、e)、或f)中所提及的任一所述核苷酸序列至少70％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％、特別優(yōu)選至少95％、更特別優(yōu)選與之相同的核苷酸序列的核苷酸序列；或g)核苷酸序列，其含有在嚴緊條件下與具有a)、b)、c)、d)、e)、或f)中所述核苷酸序列的DNA片段雜交的約400bp至約1300bp DNA片段的核苷酸序列。
玉米根優(yōu)先啟動子可以包含在玉米根優(yōu)先啟動子區(qū)域內(nèi)，并且可以進一步含有SEQ ID No 1自第339位核苷酸至第366位核苷酸的核苷酸序列、或SEQ ID No 14自第1281位核苷酸至第1308位核苷酸的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一個目的是提供含有以下可操作性連接的DNA區(qū)域的嵌合基因本發(fā)明的玉米根優(yōu)先啟動子；編碼生物活性目的RNA的異源DNA區(qū)域；和在植物細胞中有活性的轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化信號。生物活性RNA可以編碼目的蛋白質(zhì)，例如當在植物細胞中表達時會賦予所述植物害蟲或病原體抗性的蛋白質(zhì)。生物活性RNA還可以是對目的靶基因轉(zhuǎn)錄后沉默有用的反義、有義或雙鏈RNA。
還提供了含有本發(fā)明嵌合基因的植物細胞和植物或其種子，特別是谷類植物，例如玉米植物。
另一個目的還是提供優(yōu)先在植物(例如玉米植物)根中表達生物活性RNA的方法，包括步驟提供帶有本發(fā)明嵌合基因的所述植物的根細胞；并使該植物生長。
本發(fā)明進一步提供本發(fā)明玉米根優(yōu)先啟動子用于在植物(例如玉米植物)根中優(yōu)先表達生物活性RNA的用途。
本發(fā)明的另一個目的是提供經(jīng)分離的DNA分子、及其用于分離玉米根優(yōu)先啟動子或啟動子區(qū)域的用途，該分離的DNA分子含有編碼含有氨基酸序列SEQ ID No 4或SEQ ID No 6的蛋白質(zhì)的核苷酸序列、特別是選自SEQ ID No 3、SEQ ID No 5和SEQ ID No 11的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一實施方式中提供了分離玉米根優(yōu)先啟動子區(qū)域的方法，包括步驟鑒定編碼RNA轉(zhuǎn)錄物的基因組片段或功能等同物，由該RNA轉(zhuǎn)錄物可以合成cDNA，該cDNA含有核苷酸序列SEQ ID NO 3或SEQ ID No 5；分離編碼具有氨基酸序列SEQ ID No 4或SEQ IDNo 6的蛋白質(zhì)的核苷酸序列的上游DNA區(qū)域或功能等同物。還提供了由此方法獲得的玉米根優(yōu)先啟動子。
附圖簡述附

圖1cDNAs GL4、GL5和GL12的核苷酸序列比對。用破折號表示為優(yōu)化比對而引入的缺口。
附圖2來自GL4的短玉米根優(yōu)先啟動子區(qū)域的核苷酸序列。
附圖3來自GL4的長玉米根優(yōu)先啟動子區(qū)域的核苷酸序列。
附圖4來自GL5的玉米根優(yōu)先啟動子區(qū)域的核苷酸序列。
附圖5pTWV011示意圖。LB左側(cè)T-DNA邊界；3′nos胭脂堿合成酶基因3′末端；bar雙丙氨酰膦(bialaphos)抗性編碼區(qū)域；P35S3CaMV 35S轉(zhuǎn)錄物的啟動子區(qū)域；3′35SCaMV 35S轉(zhuǎn)錄物的3′末端；isp1a短芽孢桿菌(Brevibacillus laterosporus)的抗蟲分泌蛋白1a編碼區(qū)域；5′gl4GL4啟動子區(qū)域的前導區(qū)域；Pgl4玉米根選擇性啟動子GL4；isp2a短芽孢桿菌的抗蟲分泌蛋白2a編碼區(qū)域；RB右側(cè)T-DNA邊界區(qū)域；nptI同源區(qū)與輔助Ti-質(zhì)粒同源的區(qū)域；ORI colE1colE1復制起點；ORI pVS1假單胞菌復制起點；PaadA產(chǎn)生鏈霉素和壯觀霉素抗性的氨基糖苷腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的細菌啟動子；aadA氨基糖苷腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因的編碼區(qū)域；3′aadA氨基糖苷腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因3′末端。
附圖6pTWV018示意圖。LB左側(cè)T-DNA邊界；3′nos胭脂堿合成酶基因3′末端；bar雙丙氨酰膦抗性編碼區(qū)域；P35S3CaMV 35S轉(zhuǎn)錄物的啟動子區(qū)域；3′35SCaMV 35S轉(zhuǎn)錄物的3′末端；isp1a短芽孢桿菌的抗蟲分泌蛋白1a編碼區(qū)域；5′gl5GL5啟動子區(qū)域的前導區(qū)域；Pgl5玉米根選擇性啟動子GL5；isp2a短芽孢桿菌的抗蟲分泌蛋白2a編碼區(qū)域；RB右側(cè)T-DNA邊界區(qū)域；nptI同源區(qū)與輔助Ti-質(zhì)粒同源的區(qū)域；ORI colE1colE1復制起點；ORIpVS1假單胞菌復制起點；PaadA產(chǎn)生鏈霉素和壯觀霉素抗性的氨基糖苷腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的細菌啟動子；aadA氨基糖苷腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因的編碼區(qū)域；3′aadA氨基糖苷腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因3′末端。
優(yōu)選實施方式詳述本發(fā)明是以這一發(fā)現(xiàn)為基礎的本文所描述的啟動子特別適于與之可操作性相連的外源DNA在植物(特別是象玉米這樣的谷類植物)根中的優(yōu)先且豐富的表達(即，轉(zhuǎn)錄、或轉(zhuǎn)錄和翻譯)。
在本發(fā)明的一種實施方式中，提供了含有SEQ ID No 1約400bp的核苷酸序列的玉米根優(yōu)先啟動子區(qū)域。在另一種實施方式中，提供了含有SEQ ID No 2約1200bp的核苷酸序列的玉米根優(yōu)先啟動子區(qū)域。還在一種實施方式中，提供了含有SEQ ID No 14自第1位核苷酸至第1280位核苷酸的核苷酸序列玉米根優(yōu)先啟動子區(qū)域。
本文所使用的“玉米(corn)”指玉米(maize)，即玉蜀黍(Zea mays L.)。
如本文所使用的，術(shù)語“啟動子”指在轉(zhuǎn)錄引發(fā)過程中被DNA依賴性RNA聚合酶識別并結(jié)合(直接或間接)的任何DNA。啟動子包括轉(zhuǎn)錄起始位點、以及轉(zhuǎn)錄起始因子和RNA聚合酶的結(jié)合位點，并能夠含有可以結(jié)合基因表達調(diào)控蛋白的各種其它位點(例如，增強子)。
如本文所使用的，術(shù)語“調(diào)控區(qū)域”，意指任何涉及驅(qū)動轉(zhuǎn)錄和控制(即，調(diào)控)給定DNA序列轉(zhuǎn)錄時間和水平的DNA，給定DNA序列例如編碼蛋白質(zhì)或多肽的DNA。例如，5′調(diào)控區(qū)域(或“啟動子區(qū)域”)是位于編碼序列上游(即，5′)的DNA序列，它包括啟動子和5′-非翻譯前導序列。3′調(diào)控區(qū)域位于編碼序列下游的(即3′)DNA序列，它包括適宜的轉(zhuǎn)錄3′末端形成(和/或調(diào)控)信號，包括一個或多個腺苷酸化信號。
術(shù)語“基因”意指在適宜的調(diào)控區(qū)域(例如植物可表達性啟動子區(qū)域)控制下在細胞內(nèi)含有被轉(zhuǎn)錄成RNA分子(例如，mRNA)的DNA區(qū)域(“轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域”)的任何DNA片段。因此基因可能含有幾種可操作性連接的DNA片段，例如啟動子、5′非翻譯前導序列、編碼區(qū)域、和含有多聚腺苷酸化位點的3′非翻譯區(qū)域。內(nèi)源植物基因是在植物物種中天然發(fā)現(xiàn)的基因。嵌合基因是通常不在植物物種中發(fā)現(xiàn)的任何基因，或者是在天然情況下其啟動子與部分或全部轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)域或與該基因的至少一種另一調(diào)控區(qū)域無關(guān)的任何基因。
術(shù)語“基因表達”指其中的DNA區(qū)域在調(diào)控區(qū)域(特別是啟動子)控制下轉(zhuǎn)錄成具有生物活性的RNA的過程，RNA具有生物活性是指該RNA或者能與另一核酸互作或者能被翻譯成生物活性多肽或蛋白質(zhì)。若基因表達的終產(chǎn)物為生物活性RNA，例如反義RNA或核酶，則認為該基因編碼RNA。若基因表達的終產(chǎn)物為生物活性蛋白質(zhì)或多肽，則認為該基因編碼蛋白質(zhì)。
關(guān)于本發(fā)明DNA表達的術(shù)語“根選擇性”，是指，為特定目的，DNA在植物(例如玉米植物(“玉米根選擇性”))根細胞中的高度特異性表達。換言之，植物的不同于根的組織中的DNA轉(zhuǎn)錄物水平要么是無法檢測到的要么是非常低的(每微克總RNA低于約0.2皮克)。
關(guān)于本發(fā)明DNA表達的術(shù)語“根優(yōu)先(root-preferential)”是指，DNA主要在根中表達，但是在植株的其它組織中也能鑒定到表達的表達模式。優(yōu)選地，根中的表達比其它組織中的高約2至10倍。
在已經(jīng)閱讀過這些實施方式后，顯然，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)相同目的能夠容易地鑒定并利用功能上等價的啟動子。
具有本質(zhì)上與含有SEQ ID NO 1第1位核苷酸至第338位核苷酸、或SEQ ID NO 2第11位核苷酸至第1196位核苷酸、或SEQ IDNO 14第1位核苷酸至第1280位核苷酸、或它們具有啟動子活性的部分的核苷酸序列的玉米根優(yōu)先啟動子相似的啟動子活性的DNA序列，是這些啟動子的功能等價物。這些功能等價啟動子能在嚴緊條件下與含有核苷酸序列SEQ ID NO 1或SEQ ID No 2或SEQ ID NO 14的玉米根優(yōu)先啟動子區(qū)域雜交。
本文所使用的“嚴緊雜交條件”意指，如果探針與靶序列間存在至少95％和優(yōu)選至少97％序列同一性通常將會出現(xiàn)雜交。嚴緊雜交條件的實例有在含有5％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhardt’s液、10％硫酸葡聚糖、和20μg/ml變性剪切載體DNA例如鮭魚精子DNA的溶液中孵育過夜，之后于約65℃下在0.1×SSC中洗滌雜交支持物。其它的雜交和洗滌條件是熟知的，并在Sambrook等人，Molecular CloningALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，NY(1989)，特別是第十一章中給出了舉例說明。
其它功能等價啟動子含有這樣的核苷酸序列，即能用含有選自核苷酸序列SEQ ID 1或SEQ ID 2的至少約25、優(yōu)選至少約50、特別是至少約100個連續(xù)核苷酸的寡核苷酸引物在聚合酶鏈式反應中擴增的核苷酸序列。這樣的寡核苷酸引物的實例有GVK 29(SEQ ID No 9)和GVK 30(SEQ ID No 10)。
功能等價啟動子可以分離自例如不同的玉米品種。它們還可以通過對分離的玉米根優(yōu)先啟動子進行核苷酸的添加、取代、缺失或插入修飾來制備。它們也可以被全部或部分合成。
作為選擇，可以利用在植物(例如玉米植株)根中高水平表達的轉(zhuǎn)錄物的cDNA作為分離對應于該cDNA核苷酸序列上游的基因組DNA的探針來分離功能等價啟動子。如本文所使用的，“cDNA”用于表示第一鏈cDNA(與mRNA互補的)及其互補鏈(由此與mRNA相同，除了用T替換U)二者或雙鏈cDNA片段。根據(jù)本發(fā)明，玉米根選擇性cDNA及其對應植物基因組DNA片段可根據(jù)下述進行鑒定1)可以從分離自根的mRNA起始構(gòu)建cDNA文庫，并對該cDNA文庫作示差篩選以鑒定與其它組織，包括但不限于葉、種子、莖、繁殖器官、及類似，相比優(yōu)先存在于根中的mRNA。作為選擇，可以用從某一已分離蛋白質(zhì)的已確定氨基酸序列推定出的寡核苷酸篩選該cDNA文庫，所述已分離的蛋白質(zhì)已被鑒定優(yōu)先存在于根中。此外，可能在巢式PCR步驟中使用與所述相同的寡核苷酸，并用所擴增的片段作為探針來篩選文庫。可以從在不同玉米根發(fā)育階段分離的mRNA池構(gòu)建玉米根優(yōu)先cDNA文庫。一種鑒定和分離在特定組織(例如此處是根)中特別表達的RNA的cDNA 3’末端的方法，是如Prashar和Weismann或US專利5712126(這兩篇文獻都引入本文作為參考)中所描述的、所謂的READS分析或限制性酶消化的cDNA(Restriction-Enzymedigested cDNAs)。
2)可以分離出，反轉(zhuǎn)錄自優(yōu)先在植物(例如玉米植物)根中轉(zhuǎn)錄的RNA的cDNA、或經(jīng)READS差異顯示分析鑒定為優(yōu)先在植物根中表達的cDNA 3’末端，并通過例如核苷酸序列確定進一步鑒定其特征；全長cDNA可以用例如5’RACE(cDNA末端快速擴增法)技術(shù)分離。
3)可將該cDNA或其3’末端用作探針以鑒定和分離植物基因組中含有編碼玉米根優(yōu)先mRNA的核苷酸序列的區(qū)域。作為選擇，例如，可以通過利用從cDNA序列推定的寡核苷酸作反向PCR分離基因組DNA。作為選擇，可以利用TAIL-PCR(如Liu等人所描述的熱不對稱交錯PCR(1995))分離編碼區(qū)域側(cè)翼的基因組序列，TAIL-PCR利用了衍生自所鑒定的cDNA(的5’末端)的核苷酸序列的巢式長特異性寡核苷酸、和短的隨機簡并引物。
4)可選地，在不同植物組織(包括目的根組織)的常規(guī)RNA-RNA原位雜交[參見，例如，De Block等人(1993)，Anal.Biochem.21586]中構(gòu)建并使用對應于cDNA的RNA探針，以驗證由假定根優(yōu)先表達的內(nèi)源植物基因所產(chǎn)生的mRNA在這些根中的優(yōu)先出現(xiàn)。
一旦獲得了玉米根優(yōu)先基因(也即，可以從玉米根優(yōu)先cDNA制備的編碼玉米根優(yōu)先mRNA的基因組DNA片段)，將從編碼由該mRNA所編碼蛋白質(zhì)的第一個氨基酸的密碼子的上游(也即，位于5′)區(qū)域確定為包含玉米根優(yōu)先啟動子的啟動子區(qū)域。優(yōu)選，這樣的啟動子區(qū)域是起始密碼子上游至少約400至500bp、優(yōu)選至少約1000bp、更優(yōu)選約1200bp、尤其是約1300bp、特別地至少約1500至2000bp。為方便起見，優(yōu)選，這樣的啟動子區(qū)域在起始密碼子上游延伸不超過約3000至5000bp?？梢圆糠指鶕?jù)所存在的便利限制性位點來確定片段大小。實際的玉米根優(yōu)先啟動子是玉米根優(yōu)先mRNA編碼區(qū)域上游(也即，5′)的基因組DNA區(qū)域。含有與標記基因編碼區(qū)域可操作性相連的玉米根優(yōu)先啟動子的嵌合基因?qū)?yōu)先在轉(zhuǎn)基因玉米植株的玉米根細胞中產(chǎn)生標記蛋白，該蛋白可以通過常規(guī)的原位組織化學技術(shù)進行檢測。
可以獲得玉米根優(yōu)先啟動子的玉米根優(yōu)先基因的實例是編碼可以優(yōu)先在玉米根中探測到的mRNA的、且大小約為600nt的基因，從該mRNA可以制備cDNA，該cDNA包含對應于寡核苷酸GVK27(SEQ ID No7)核苷酸序列的互補序列和/或寡核苷酸GVK28(SEQ ID No 8)的互補序列；和/或包含寡核苷酸GVK29(SEQ ID No 9)核苷酸序列的互補序列和/或?qū)诠押塑账酖VK30(SEQ ID No 10)的互補序列。這樣的玉米根優(yōu)先cDNA可以包含前述提及的對應于寡核苷酸GVK27和GVK28以及GVK29或GVK30的各序列。
這樣的基因是編碼玉米根優(yōu)先轉(zhuǎn)錄物的基因，從該轉(zhuǎn)錄物可以制備包含編碼具有氨基酸序列SEQ ID 4的蛋白質(zhì)的核苷酸序列的cDNA，且該轉(zhuǎn)錄物可以例如具有SEQ ID No 3的核苷酸序列。其它的玉米根優(yōu)先基因是編碼玉米根優(yōu)先mRNA的基因，從該mRNA可以制備包含SEQ ID No 5或SEQ ID 11的序列、或包含編碼含有氨基酸序列SEQID 6的蛋白質(zhì)的核苷酸序列的cDNA。
本發(fā)明啟動子的一種實施方式是包含在基因組克隆5′調(diào)控區(qū)域中的啟動子，該基因組克隆含有對應于具有SEQ ID No 5、6或11之中任一核苷酸序列的cDNA的核苷酸序列，例如，具有SEQ ID No 2中自第11位核苷酸至第1196位核苷酸的核苷酸序列的5′調(diào)控區(qū)域，或含有SEQ ID No 2中始于第11位核苷酸至第859位核苷酸之間任何位置、并止于第1233位核苷酸(恰好在ATG翻譯起始密碼子之前)的序列的DNA片段，或含有SEQ ID No 14自第1位核苷酸至第1280位核苷酸的序列的DNA片段的核苷酸序列。這樣的啟動子區(qū)域含有本發(fā)明的玉米根優(yōu)先啟動子和5′非翻譯引導區(qū)域，且可用于根優(yōu)先嵌合基因、特別是玉米根優(yōu)先嵌合基因的構(gòu)建。然而，可將較小的DNA片段可用作本發(fā)明的啟動子區(qū)域，據(jù)信可以使用含有翻譯起始密碼子上游至少約400堿基對的任何SEQ ID No 2 DNA片段。
可以構(gòu)建人工啟動子，其含有SEQ ID No 1或SEQ ID No 2或SEQID 14的5’調(diào)控區(qū)域的決定啟動子的玉米根優(yōu)先性的那些啟動子內(nèi)部序列。這些人工啟動子可能包含能在植物中表達的另一啟動子的“核心啟動子”或“TATA盒區(qū)域”，例如WO 93/19188中所述的CaMV35S“TATA盒區(qū)域”。含有這樣的人工啟動子的啟動子區(qū)域的適宜性可以通過它們與報告基因的適當融合以及報告基因在適宜組織、適當發(fā)育階段的表達的檢測進行鑒定。據(jù)信，含有SEQ ID No 1或2的5′調(diào)控區(qū)域那些決定玉米根優(yōu)先性的內(nèi)部部分的、這樣的較小的啟動子和/或人工啟動子可以在玉米根細胞中提供更好的轉(zhuǎn)錄選擇性和/或提高本發(fā)明玉米根優(yōu)先嵌合基因轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄水平。本發(fā)明玉米根優(yōu)先啟動子區(qū)域的這樣的較小部分可以包括與GL4和GL5啟動子區(qū)域具有高度同源性的核苷酸序列例如SEQ ID No 2自第1024位核苷酸至第1105位核苷酸的核苷酸序列(與SEQ ID No 14自第435位核苷酸至第510位核苷酸的核苷酸序列具有80％匹配)；SEQ ID No 2自第866位核苷酸至第994位核苷酸的核苷酸序列(與SEQ ID No 14自第236位核苷酸至第358位核苷酸的核苷酸序列具有77％匹配)；SEQID No 2自第544位核苷酸至第568位核苷酸的核苷酸序列(與SEQID No 15自第198位核苷酸至第222位核苷酸的核苷酸序列具有96％匹配)；SEQ ID No 2自第1122位核苷酸至第1143位核苷酸的核苷酸序列(與SEQ ID No 15自第485位核苷酸至第510位核苷酸的核苷酸序列具有73％匹配)。
除了實際的啟動子，本發(fā)明玉米根優(yōu)先基因的5′調(diào)控區(qū)域還含有編碼位于轉(zhuǎn)錄起始位點和翻譯起始位點之間的RNA 5′非翻譯前導(5′UTL)序列的DNA片段。據(jù)信，GL4啟動子的5′轉(zhuǎn)錄起始位點位于SEQ ID No 2中第1197位附近，形成長約30個核苷酸的5′UTL。據(jù)信，GL5啟動子的5′轉(zhuǎn)錄起始位點位于SEQ ID No 14中第1280位附近，形成長約30個核苷酸的5′UTL。還據(jù)信，該區(qū)域可以用其它的5′UTL替換，例如另一植物表達性基因的5′UTL，而基本不會影響啟動子的特異性。
因此，在本發(fā)明另一實施方式中提供含有選自下組的核苷酸序列的玉米根優(yōu)先啟動子或玉米根優(yōu)先啟動子區(qū)域a)含有SEQ ID No 1自第1位核苷酸至第338位核苷酸的核苷酸序列、或SEQ ID No 2自第11位至第1196位核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列；b)含有SEQ ID No 14自第1位核苷酸至第1280位核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列；c)編碼mRNA的玉米優(yōu)先基因中(5′末端)約400bp至約1300bp的DNA片段的核苷酸序列，該mRNA優(yōu)選大小為約600nt，由該mRNA可以制備含有對應于核苷酸序列SEQ ID No 7、SEQID No 8或SEQ ID No 9或SEQ ID No 10的核苷酸序列的互補序列的cDNA；d)編碼mRNA的玉米優(yōu)先基因5′末端約400bp至約1300bp的DNA片段的核苷酸序列，該mRNA優(yōu)選大小為約600nt，由該mRNA可以制備包含編碼具有氨基酸序列SEQ ID No 4或6的多肽的核苷酸序列的cDNA；e)位于編碼mRNA的玉米優(yōu)先基因5′末端約400bp至約1300bp的DNA片段的核苷酸序列，由該mRNA可以制備含有與SEQ IDNo 3、5或11之中任一核苷酸序列具有至少75％或至少80％或至少90％、或至少95％序列同一性、或與它們相同的核苷酸序列的cDNA；f)與在a)、b)、c)、d)、e)、或f)中所提及的核苷酸序列、特別是在a)中所提及的核苷酸序列具有至少70％或80％或90％或95％序列同一性、或與它們相同的核苷酸序列；或g)約400bp至約1300bp DNA片段的核苷酸序列，該DNA片段在嚴緊條件下會與具有在a)、b)、c)、d)、e)、或f)中所提及的核苷酸序列、特別是在a)中所提及的核苷酸序列的DNA片段雜交。
為本發(fā)明目的，以百分數(shù)表示的兩條相關(guān)核苷酸或氨基酸序列的“序列同一性”是指，兩條經(jīng)過優(yōu)化的比對后的序列中具有相同殘基(×100)位點的數(shù)目除以經(jīng)過比較的位點的數(shù)目。缺口，也就是，比對時某殘基在一條序列中存在而在另一條中卻不存在的位點，被視作具有非相同殘基的位點。根據(jù)Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970)完成兩條序列的比對?？梢杂美鏕AP這樣的標準軟件程序方便地完成上述的計算機輔助的序列比對，GAP是采用了缺口生成罰分為50以及缺口衍生罰分為3的默認記分矩陣的WisconsinPackage Version 10.1(Genetics Computer Group，Madision，Wisconsin，USA)的一部分。
不消說，本發(fā)明的啟動子和啟動子區(qū)域還可以含有已知改進轉(zhuǎn)錄效率的元件，例如增強子、內(nèi)含子，等。
本發(fā)明進一步包括DNA分子，含有與編碼生物活性RNA、肽或蛋白質(zhì)的一個或多個異源區(qū)域可操作性相連的本發(fā)明玉米根優(yōu)先啟動子。本發(fā)明的啟動子可用于表達任何目的異源編碼區(qū)域。
因此在本發(fā)明的另一實施方式中提供了嵌合基因，它含有a)玉米根優(yōu)先啟動子區(qū)域；含有選自下組的核苷酸序列i)SEQ ID No 1自第1位核苷酸至第338位核苷酸的核苷酸序列或SEQ ID No 2自第11位核苷酸至第1196位核苷酸的核苷酸序列；ii)含有SEQ ID No 14自第1位核苷酸至第1280為核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列；iii)編碼mRNA的玉米優(yōu)先基因中(5′末端)約400bp至約1300bp的DNA片段的核苷酸序列，該mRNA優(yōu)選大小為約600nt，從該mRNA可以制備含有對應于核苷酸序列SEQ IDNo 7、SEQ ID No 8或SEQ ID No 9或SEQ ID No 10的核苷酸序列的互補序列的cDNA；iv)編碼mRNA的玉米優(yōu)先基因5′末端約400bp至約1300bp的DNA片段的核苷酸序列，該mRNA優(yōu)選大小為約600nt，從該mRNA可以制備包含編碼具有氨基酸序列SEQ ID No4或6的多肽的核苷酸序列的cDNA；v)位于編碼mRNA的玉米優(yōu)先基因5′末端約400bp至約1300bp的DNA片段的核苷酸序列，從該mRNA可以制備含有與SEQ ID No 3、5或11之中任一核苷酸序列具有至少75％或80％或90％或95％序列同一性、或與它們相同的核苷酸序列的cDNA；vi)與在i)、ii)、iii)、iv)、v)、或vi)中所提及的核苷酸序列、特別是在i)中所提及的核苷酸序列具有至少70％或80％或90％或95％序列同一性、或與它們相同的核苷酸序列；或vii)約400bp至約1300bp DNA片段的核苷酸序列，該DNA片段在嚴緊條件下會與具有在i)、ii)、iii)、iv)、v)、或vi)中所提及的核苷酸序列、特別是在i)中所提及的核苷酸序列的DNA片段雜交。
b)目的DNA區(qū)域，其被轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生生物活性RNA；和c)含有在植物細胞中有3′轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化信號功能的DNA區(qū)域。
因此目的DNA區(qū)域、或所轉(zhuǎn)錄的RNA可以編碼蛋白質(zhì)或多肽，但還可以編碼生物活性RNA，例如反義RNA、有義RNA、或同時含有能進行堿基配對并形成雙鏈RNA的有義和反義RNA片段的dsRNA，如WO99/53050(引入本文作為參考)中所描述可用于靶序列的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。
為使植物，例如玉米植物，以根選擇性或根優(yōu)先方式產(chǎn)生玉米根蟲抗性，優(yōu)選為針對Diabrotica barberi、Diabroticaundecimpuncata、Diabrotica virgifera的抗性，與本發(fā)明的玉米根蟲選擇性啟動子可操作性連接的適宜候選DNA區(qū)域包括與PCT公開WO 96/10083的成熟VIP2Aa或VIP2Ab蛋白結(jié)合的成熟VIP1Aa蛋白；Photorhabdus或Xhenorhabdus spp.的玉米根蟲毒素，例如，Photorhabdus luminescens W-14的抗蟲蛋白(Guo等人，1999，J.Biol.Chem.274，9836-9842)；WO 00/26378的CryET70蛋白質(zhì)；如WO 97/40162中所述的由Bt菌株P(guān)S80JJ1、PS149B1和PS167H2產(chǎn)生的抗蟲蛋白，尤其是Bt菌株P(guān)S149B1的約14kD和約44kD的蛋白質(zhì)；US專利6,023,013的Cry3Bb蛋白；如大豆N2和R1半胱氨酸蛋白酶抑制劑這樣的蛋白酶抑制劑(Zhao等人，1996，PlantPhysiol.，111，1299-1306)或oryzastatine例如水稻胱蛋白酶抑制劑(Genbank登錄號S49967)、玉米胱蛋白酶抑制劑(Genbank登錄號D38130、D10622、D63342)例如在由lrie等人所述的植株中表達的玉米胱蛋白酶抑制劑(1996，Plant Mol.Biol.，30，149-157)。還包括所有的等價物和變體，例如上述任一蛋白質(zhì)的保持抗蟲活性的截短的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的一種實施方式中，用于賦以根優(yōu)先方式產(chǎn)生根蟲抗性的嵌合基因含有編碼來自短芽孢桿菌的抗蟲分泌蛋白(ISP)的核苷酸序列，當該抗蟲分泌蛋白與一種ISP互補蛋白組合被昆蟲攝食后，它是具有抗蟲性的，ISP互補蛋白例如是另一種ISP蛋白，如作為WO01/87931公開的PCT申請PCT/EP01/05702中所述(引入本文作為參考；特別是WO 01/87931的DNA序列SEQ ID No 7和9)。編碼ISP蛋白的核苷酸序列可以是經(jīng)過修飾的DNA。
本發(fā)明進一步提供優(yōu)先在植物(例如玉米植物)根中表達外源目的DNA的方法，包括以下步驟
a)提供帶有本發(fā)明嵌合基因的植物細胞，優(yōu)選該嵌合基因在植物細胞基因組(特別是核基因組)中穩(wěn)定整合以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細胞；b)由所述轉(zhuǎn)基因細胞再生出植株。
一種提供帶有本發(fā)明嵌合基因的植物細胞的便利方法是用常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法導入DNA。顯然，轉(zhuǎn)化植物(尤其是谷類植物)的切實方法對于現(xiàn)在描述的方法來說并不重要，并且在現(xiàn)有技術(shù)中可以獲得幾種將外源DNA導入植物細胞基因組的方法，包括但不限于直接原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，對于玉米例如US 5792936，引入本文作為參考)、農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導的轉(zhuǎn)化(參見，對于玉米例如US 6074877或US 6140553，引入本文作為參考)、微粒轟擊、致密胚性愈傷組織的電穿孔(參見，對于玉米例如US 5641664，引入本文作為參考)或硅晶須(silicon whisker)介導的DNA導入。
外源目的DNA與本發(fā)明玉米根優(yōu)先啟動子的可操作性連接，還可以通過同源重組使目的DNA替換玉米根優(yōu)先啟動子天然連接的DNA而實現(xiàn)，如果所述目的DNA含有與玉米根優(yōu)先啟動子天然連接的DNA的同源區(qū)域。通過同源重組將目的DNA導入植物基因組的方法是可以得到的(例如US專利5744336，將其引入本文作為參考)。
可將已經(jīng)獲得的轉(zhuǎn)化植株用于常規(guī)的育種方案，以產(chǎn)生更多具有相同特征的轉(zhuǎn)化植株或?qū)⒈景l(fā)明玉米根優(yōu)先表達嵌合基因?qū)胂嗤蛳嚓P(guān)植物物種的其它品種、或雜交植株中。從轉(zhuǎn)化植物獲得的種子含有作為穩(wěn)定基因組插入的本發(fā)明嵌合基因，并且也包括在本發(fā)明之內(nèi)。
可以理解，本發(fā)明的手段和方法尤其是對玉米有用，但是也可以以類似的效果用于其它植物，尤其是用在谷類植物包括玉米、小麥、燕麥、大麥、黑麥、水稻、草坪草、高梁、谷子或甘蔗。
以下非限制性實施例描述玉米根優(yōu)先啟動子的分離、和在玉米根中選擇性表達的嵌合基因的構(gòu)建。除非在實施例中指明，所有重組DNA技術(shù)都根據(jù)Sambrook等人(1989)Molecular CloningALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，NY，和Ausubel等人(1994)CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols，USA，第1和2卷中所述的標準程序完成。由R.D.D.Croy編著，BIOSScientific Publications Ltd(UK)和Blackwell ScientificPublications，UK聯(lián)合出版的Plant Molecular Biology Labfax(1993)描述了植物分子工作的標準材料和方法。
貫穿整個說明書和實施例，給出了序列表所示的以下序列作參考SEQ ID No 1約400bp玉米根優(yōu)先啟動子(GL4啟動子)的核苷酸序列SEQ ID No 2約1200bp玉米根優(yōu)先啟動子(GL4啟動子)的核苷酸序列SEQ ID No 3在具有SEQ ID No 1(GL4)核苷酸序列的玉米根優(yōu)先啟動子的控制下轉(zhuǎn)錄出的天然相關(guān)mRNA的cDNA的核苷酸序列SEQ ID No 4由cDNA GL4編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列SEQ ID No 5玉米根優(yōu)先cDNA GL5的核苷酸序列SEQ ID No 6由cDNA GL5編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID No 7寡核苷酸引物GVK27SEQ ID No 8寡核苷酸引物GVK28SEQ ID No 9寡核苷酸引物GVK29SEQ ID No 10寡核苷酸引物GVK30SEQ ID No 11玉米根優(yōu)先cDNA GL12的核苷酸序列SEQ ID No 12質(zhì)粒pTWV011的核苷酸序列SEQ ID No 13質(zhì)粒pTWV018的核苷酸序列
SEQ ID No 14約1300bp玉米根優(yōu)先啟動子(GL5啟動子)的核苷酸序列SEQ ID No 15寡核苷酸引物GVK22SEQ ID No 16寡核苷酸引物GVK23SEQ ID No 17寡核苷酸引物GVK24SEQ ID No 18寡核苷酸引物GVK25SEQ ID No 19寡核苷酸引物GVK26SEQ ID No 20寡核苷酸引物GVK31SEQ ID No 21寡核苷酸引物GVK32SEQ ID No 22寡核苷酸引物GVK33SEQ ID No 23寡核苷酸引物GVK38SEQ ID No 24寡核苷酸引物GVK39SEQ ID No 25寡核苷酸引物GVK45SEQ ID No 26寡核苷酸引物MDB285SEQ ID No 27寡核苷酸引物MDB286SEQ ID No 28寡核苷酸引物MDB363SEQ ID No 29寡核苷酸引物MDB364SEQ ID No 30寡核苷酸引物MDB552SEQ ID No 31寡核苷酸引物MDB556
實施例實施例1.根優(yōu)先玉米cDNA的分離利用已知為READS的差異RNA cDNA顯示法(Prashar和Weismann，1999，Methods in Enzymology 303258-272)鑒定了在玉米根中優(yōu)先表達的RNA轉(zhuǎn)錄物標簽。
之后，從獲自不同發(fā)育階段(從64日齡的植株到成熟植株)的玉米植株制備了不同組織(根、莖、葉)的總RNA樣品。根據(jù)Prashar和Weismann(1999，supra)的描述，對各樣品用嚴緊PCR條件和寡核苷酸擴增了經(jīng)不同內(nèi)切限制性核酸酶消化的cDNA分子的3′末端片段。
對由各RNA樣品產(chǎn)生的cDNA限制性片段3′末端的凝膠圖形進行比較，使得能夠?qū)τ趦H在玉米根組織RNA樣品中出現(xiàn)、或在根組織RNA中比在其它玉米組織中更顯著的片段作出初級鑒定。分離這些3′末端片段并進行測序。將它們的核苷酸序列與公共或私有數(shù)據(jù)庫比較，并且僅將新序列用于進一步的Northern分析，該分析利用來自不同玉米組織的RNA樣品作為起始物、各分離的cDNA 3′末端片段為探針。分析雜交的RNA轉(zhuǎn)錄物的大小、豐度、和特異性。表1中歸納了在玉米根中具有最高特異性的3′末端結(jié)果，表1中的豐度和特異性以降序排列。
表1.

1以皮克/μg總RNA表示2以核苷酸表示進一步分析了與在玉米根中具有最高特異性表達的最高豐度RNA轉(zhuǎn)錄物雜交的3′末端(GL4；GL5和GL12)。
用CLONTECH Laboratories的SMARTTMRACE cDNA擴增試劑盒和巢式寡核苷酸引物分離了GL4和GL5的全長cDNA，GL4的巢式引物是GVK22(SEQ ID No 15)/GVK23(SEQ ID No 16)，GL5的巢式引物是GVK24(SEQ ID No 17)/GVK25(SEQ ID No 18)。全長cDNA的核苷酸序列分別示于SEQ ID 3和5。對兩條核苷酸序列進行的比較顯示，GL4和GL5具有約89％的序列同一性。
在所述二序列中都可以鑒定出一個小的ORF(對于GL4，始于SEQID 3第32位核苷酸至第319位核苷酸；對于GL5，始于SEQ ID 5第27位核苷酸至第307位核苷酸)。由該ORF編碼的多肽的氨基酸序列示于SEQ ID No 4或6。GL4和GL5 cDNA間，ORF編碼區(qū)域中的核苷酸序列比片段中的其它部分更為保守。
GL4 cDNA核苷酸序列為查詢序列，鑒定了一條在322個核苷酸重疊區(qū)中與之具有91％序列同一性的核苷酸序列(WO 00/32799的SEQID No 19)。未曾描述WO 00/32799中所述的源自玉蜀黍的SEQ IDNo 19以根選擇性或根優(yōu)先的方式被轉(zhuǎn)錄。此外，鑒定到一條具有99％序列同一性的大于582nt的核苷酸序列(來自苗(seedling)和絲(silk)cDNA文庫的克隆MEST23-CO7.T3)。
以GL5 cDNA核苷酸序列為查詢序列，鑒定了一條與來自玉蜀黍的FtsZ1相關(guān)序列(Geneseq中的A47325)具有85％序列同一性的核苷酸序列。未曾描述該序列以根選擇性或根優(yōu)先的方式被轉(zhuǎn)錄。此外，鑒定到一條具有100％序列同一性的大于525nt的核苷酸序列(來自苗和絲cDNA文庫的克隆MEST523-G12(3′))。
實施例2.轉(zhuǎn)錄mRNA的基因的玉米根優(yōu)先啟動子區(qū)域的分離，該mRNA的cDNA對應于GL4或GL5 cDNA。
如Liu等人所述(1995，The Plant Journal 8(3)457-463)，用熱不對稱交錯PCR分離了GL4 cDNA和GL5 cDNA對應序列的上游基因組片段，該片段含有啟動子區(qū)域。
根據(jù)Dellaporte等人所述，純化了用作起始模板DNA的玉米基因組DNA。用于TAIL-PCR以分離位于GL4 cDNA序列所對應的基因組DNA序列上游的基因組片段的特異性巢式寡核苷酸序列示于SEQ ID No7(GVK27)、SEQ ID No 8(GVK28)和SEQ ID No 9(GVK29)；各獨立反應中所使用的非特異性簡并引物是6個簡并引物MDB285、MDB286、MDB363、MDB364、MDB552或MDB556中的各個引物。PCR條件如Liu等人所述(1995，supra)。
分離了約400bp的基因組片段(對應于用引物對(GVK29/MDB285)獲得的擴增產(chǎn)物)，將其克隆進了pGEM-T Easy并測序。
根據(jù)約400bp片段的核苷酸序列，設計了新的巢式引物寡核苷酸(GVK31/SEQ ID No 20；GVK32/SEQ ID No 21和GVK33/SEQID No 22)，并與上述簡并引物結(jié)合用于分離所分離的啟動子區(qū)域片段更上游的相鄰DNA區(qū)域。由此分離了一個約350nt的DNA片段(對應于用引物對GVK33/MDB286獲得的擴增產(chǎn)物)。在第三個循環(huán)中，將新的特異性巢式寡核苷酸組GVK33/SEQ ID No 22、GVK38/SEQID No 23和GVK39/SEQ ID No 24與上述簡并引物(對應于用引物對GVK39/MDB363獲得的擴增產(chǎn)物)聯(lián)用分離了約800nt的相鄰上游DNA片段。
為了驗證所分離的基因組上游片段的連續(xù)性，用GVK29和GVK45(SEQ ID 25)引物擴增了完整的1200bp DNA片段，并克隆進pGEM-T Easy。約1200bp上游DNA片段的完整核苷酸序列示于SEQ ID2。
引物GVK27、GVK28和GVK30(SEQ ID No 10)與上述簡并引物結(jié)合使用。擴增了一條約1300nt、具有序列SEQ ID NO 14的片段(對應于MDB364和GVK30的擴增產(chǎn)物)。
實施例3.用所分離的GL4/GL5玉米根優(yōu)先啟動子區(qū)域構(gòu)建嵌合基因。
用標準重組DNA方法制備了位于GL4啟動子區(qū)域或GL5啟動子區(qū)域控制下的以下嵌合ISP1A/ISP2A構(gòu)建體含有以下DNA片段的GL4∷ISP1A●GL4啟動子區(qū)域(SEQ ID No 2)●編碼來自短芽孢桿菌的isp1A蛋白的DNA片段(SEQ ID 12自第2003位核苷酸至第4511位核苷酸的核苷酸序列的互補序列)；●35S轉(zhuǎn)錄物的3′末端片段(SEQ ID No 12自第1767位核苷酸至第1991位核苷酸的核苷酸序列的互補序列)。
含有以下DNA片段的GL4∷ISP2A●GL4啟動子區(qū)域(SEQ ID No 2)●編碼來自短芽孢桿菌的isp2A蛋白的DNA片段(SEQ ID 12自第6001位核苷酸至第7228位核苷酸的核苷酸序列的互補序列)；●35S轉(zhuǎn)錄物的3′末端片段(SEQ ID No 12自第5765位核苷酸至第5989位核苷酸的核苷酸序列的互補序列)。
含有以下DNA片段的GL5∷ISP1A●GL5啟動子區(qū)域(SEQ ID No 13自第4518位核苷酸至第5822位核苷酸的核苷酸序列的互補序列)●編碼來自短芽孢桿菌的ispA1蛋白的DNA片段(SEQ ID 13自第2003位核苷酸至第4511位核苷酸的核苷酸序列的互補序列)；●35S轉(zhuǎn)錄物的3′末端片段(SEQ ID No 13自第1767位核苷酸至第1991位核苷酸的核苷酸序列的互補序列)。
含有以下DNA片段的GL5∷ISP2A●GL5啟動子區(qū)域(SEQ ID No 13自第8628位核苷酸至第7324位核苷酸的核苷酸序列的互補序列)●編碼來自短芽孢桿菌的isp2A蛋白的DNA片段(SEQ ID No12自第6090位核苷酸至第7317位核苷酸的核苷酸序列的互補序列)；●35S轉(zhuǎn)錄物的3′末端片段(SEQ ID No 12自第5765位核苷酸至第5989位核苷酸的核苷酸序列的互補序列)。
實施例4.含有GL4和GL5啟動子的嵌合基因在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的玉米植株中的表達分析。
將實施例3中所描述的嵌合基因與嵌合bar基因一起導入了T-DNA載體(例如US專利5,561,236中所述的)以產(chǎn)生pTWV011(GL4啟動子構(gòu)建體)和pTWV018(GL5啟動子構(gòu)建物)。將這些T-DNA載體導入含有輔助Ti-質(zhì)粒pGV4000或pEHA101的土壤根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)。
用US 6,140,553中所述的農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得了用上述嵌合基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的玉米植株。
如US 5,767,367中所述將DNA直接轉(zhuǎn)移至玉米原生質(zhì)體也可以獲得用上述嵌合基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的玉米植株。
從這些(體外或體內(nèi)生長的)玉米植株的根、葉、莖組織分離了RNA，并以ISP1A特異性探針對它們作Northern分析。各獨立結(jié)果示于表2。
總之，用核糖體RNA探針雜交載樣修正后，GL5啟動子區(qū)域平均在根中的啟動轉(zhuǎn)錄是葉中的11倍、是莖中的19倍。GL4啟動子區(qū)域平均在根中的啟動轉(zhuǎn)錄是葉中的2倍、是莖中的10倍(盡管個別轉(zhuǎn)化體可能表現(xiàn)一種更顯著的玉米根選擇性表達發(fā)方式)。
表1.GL4/GL5轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)總結(jié)

表2.Northern分析數(shù)據(jù)總結(jié)玉米系Isp1a mRNApTWV018 (pg/μg總RNA)GL5啟動子1G2ZM3598-004 根體外1.07

1.570.15根/葉 10.20.06根/莖 26.25G2ZM3595-014 根體外2.17

1.100.15根/葉 7.30.10根/莖 119G2ZM3595-018 根體外1.39
1.280.07根/葉18.30.04根/莖3213G2ZM3596-016 根體外0.73 ＜0.06＜0.06 根/葉 nd＜0.06 根/莖 ndisp1a mRNA(pgpTWV011 /μg總RNA)GL4啟動子1G2ZM3592-029根 體外 0.53 0.720.08 根/葉9＜0.06 根/莖＞125G2ZM3592-030根體外 1.45 2.601.45 根/葉 1.8＜0.06 根/莖 ＞439G2ZM3593-002根體外 0.34 0.430.31 根/葉 1.4＜0.06 根/莖 ＞7.2
實施例5.含有GL4和GL5啟動子的嵌合基因在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的玉米植株子代中的表達分析。
將實施例4含有GL4和GL5啟動子的玉米植株的各九個轉(zhuǎn)基因T0系與未經(jīng)轉(zhuǎn)化的B73雜交，對T1植株作DNA印跡、RNA印跡和ELISA分析以檢測不同植株部分中ISP1 mRNA或蛋白質(zhì)的存在。
在V4期做了Southern分析以確定轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)。除了兩個含有兩個轉(zhuǎn)基因拷貝的品系之外，所有的分析事件都是單拷貝事件。
如實施例4，對源自V11-V13期的根、葉和莖材料的RNA做了Northern分析。用圖像定量分析對轉(zhuǎn)錄物水平進行了定量。用核糖體探針做了載樣誤差修正。
對于帶有GL4啟動子的含轉(zhuǎn)基因植物，估計isp1 mRNA介于0.17至0.74pg/μg總RNA之間。根中的平均isp1a mRNA水平(n＝9)為0.42pg/μg總RNA(SE＝0.18)。根vs葉的isp1a mRNA平均比率(n＝9)＞6.3。根vs莖的isp1a mRNA平均比率(n＝8)＞7.1。除了一個樣品的根/莖比率是1.9之外，在莖中未見表達。
對于帶有GL5啟動子的含轉(zhuǎn)基因植物，估計isp1 mRNA介于0.95至2.55pg/μg總RNA之間。根中的平均isp1a mRNA水平(n＝9)為1.57pg/μg總RNA(SE＝0.53)。根vs葉的isp1a mRNA平均比率(n＝9)＞17.6。根vs莖的isp1a mRNA平均比率(n＝8)＞26.6。在莖中未見表達。
在蛋白質(zhì)水平用ELISA分析在V8期收獲的根、葉和莖材料中ISP1a蛋白質(zhì)的存在。各事件分析了兩個植株。作為陰性對照，檢查了wtB73的根、葉和莖材料的ISP1A蛋白質(zhì)。在對照試驗中沒有探測到ISP1A蛋白質(zhì)。
對于所有事件在葉或莖中都沒有探測到ISP1A蛋白質(zhì)表達。
在根中探測到的ISP1A蛋白質(zhì)水平平均值是-0.07pg/ml，對應于含有由GL4啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因的植物的根的約0.024％總蛋白質(zhì)水平(n＝18)。
-0.12pg/ml，對應于含有由GL5啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因的植物的根的約0.041％總蛋白質(zhì)水平(n＝18)。
在蛋白質(zhì)水平用ELISA分析在開花期收獲的根、葉、莖和花粉材料中ISP1a蛋白質(zhì)的存在。各事件分析了一個植株。作為陰性對照，檢查了wtB73的根、葉和莖和花粉材料的ISP1A蛋白質(zhì)。在對照試驗中沒有探測到ISP1A蛋白質(zhì)。
對于所有事件在花粉中都沒有探測到ISP1A蛋白質(zhì)表達。
在含有由GL4啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因植株的根、葉和莖中探測到的平均ISP1A蛋白質(zhì)水平是平均值(n＝9)-根0.286μg isp1a/ml～0.116％isp1a總蛋白質(zhì)水平-葉0.018μg isp1a/ml～0.0022％isp1a總蛋白質(zhì)水平(6％根水平)-莖0.020μg isp1a/ml～0.0043％isp1a總蛋白質(zhì)水平(7％根水平)在含有由GL4啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因植株的根、葉和莖中探測到的平均ISP1A蛋白質(zhì)水平是平均值(n＝9)-根0.265μg isp1A/ml～0.142％isp1a總蛋白質(zhì)水平
-葉0.013μg isp1A/ml～0.0015％isp1a總蛋白質(zhì)水平(5％根水平)-莖0.024μg isp1A/ml～0.0058％isp1a總蛋白質(zhì)水平(9％根水平)結(jié)籽后，檢測了轉(zhuǎn)基因植株核仁中的ISP1A蛋白質(zhì)水平。在轉(zhuǎn)基因植株種子中不能檢測到ISP1A蛋白質(zhì)，在wtB73對照中也不能。
權(quán)利要求
1.玉米根優(yōu)先啟動子片段，其含有選自下組核苷酸序列的核苷酸序列a)含有SEQ ID No 1自第1位核苷酸至第338位核苷酸、或SEQ ID No 2自第11位核苷酸至第1196位核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列；b)含有SEQ ID No 15自第1位核苷酸至第1280位核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列；c)含有編碼mRNA的玉米優(yōu)先基因的5′末端約400bp至約1300bp DNA片段核苷酸序列的核苷酸序列，由該mRNA可以制備含有與核苷酸序列SEQ ID No 7或SEQ ID No 8或SEQ ID No9或SEQ ID No 10的互補序列的cDNA；d)含有編碼mRNA的玉米優(yōu)先基因的5′末端約400bp至約1300bp DNA片段核苷酸序列的核苷酸序列，由該mRNA可以制備包含編碼具有氨基酸序列SEQ ID No 4或6的多肽的核苷酸序列的cDNA；e)含有編碼mRNA的玉米優(yōu)先基因的5′末端約400bp至約1300bp DNA片段核苷酸序列的核苷酸序列，由該mRNA可以制備含有具有SEQ ID No 3、5或11之中任一核苷酸序列至少75％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％、特別優(yōu)選至少95％的序列同一性、更特別優(yōu)選與之相同的核苷酸序列的cDNA；f)含有具有a)、b)、c)、d)、e)、或f)中所提及的任一所述核苷酸序列至少70％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％、特別優(yōu)選至少95％的序列同一性、更特別優(yōu)選與之相同的核苷酸序列的核苷酸序列；或g)核苷酸序列，其含有在嚴緊條件下與具有a)、b)、c)、d)、e)、或f)中所述核苷酸序列的DNA片段雜交的約400bp至約1300bp DNA片段的核苷酸序列。
2.含有根據(jù)權(quán)利要求1的玉米根優(yōu)先啟動子的玉米根優(yōu)先啟動子區(qū)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的玉米根優(yōu)先啟動子區(qū)域，進一步含有SEQID No 1的自第339位核苷酸至第366位核苷酸的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的玉米根優(yōu)先啟動子區(qū)域，進一步含有SEQID No 14的自第1281位核苷酸至第1308位核苷酸的核苷酸序列。
5.含有以下可操作性連接DNA區(qū)域的嵌合基因a)根據(jù)權(quán)利要求1的玉米根優(yōu)選啟動子；b)編碼目的生物活性的RNA的異源DNA區(qū)域；c)轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化信號。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的嵌合基因，其中所述生物活性RNA編碼目的蛋白質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的嵌合基因，其中所述蛋白質(zhì)是一種當其在植物細胞中表達后會賦予所述植物對害蟲或病原體抗性的蛋白質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的嵌合基因，其中所述蛋白質(zhì)是短芽孢桿菌的ISPA1或ISPA2。
9.含有根據(jù)權(quán)利要求5至8之中任一權(quán)利要求的嵌合基因的植物細胞。
10.在其細胞中含有根據(jù)權(quán)利要求5至8之中任一權(quán)利要求的嵌合基因的植物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的植物，它是玉米植物。
12.在其細胞中含有根據(jù)權(quán)利要求5至8之中任一權(quán)利要求的嵌合基因的植物種子。
13.優(yōu)先在植物根中表達生物活性RNA的方法，所述方法包括a)提供帶有根據(jù)權(quán)利要求5-8之中任一項的嵌合基因的所述植物的根細胞；和b)使該植物生長。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述植物是玉米植物。
15.權(quán)利要求1的玉米根優(yōu)先啟動子用于在植物根中優(yōu)先表達生物活性RNA的用途。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其中所述植物是玉米植物。
17.含有編碼含有氨基酸序列SEQ ID No 4或SEQ ID No 6的蛋白質(zhì)的核苷酸序列的分離的DNA分子。
18.含有選自SEQ ID No 3、SEQ ID No 5和SEQ ID No 11的核苷酸序列的分離的DNA分子。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18之中任一權(quán)利要求的分離的DNA分子用于分離玉米根優(yōu)先啟動子或啟動子區(qū)域的用途。
20.分離玉米根優(yōu)先啟動子區(qū)域的方法，包括步驟a)鑒定編碼RNA轉(zhuǎn)錄物的基因組片段或功能等同物，由該RNA轉(zhuǎn)錄物可以合成cDNA，所述cDNA含有核苷酸序列SEQ ID 3或SEQ ID5；b)分離編碼具有氨基酸序列SEQ ID No 4或SEQ ID No 6的蛋白質(zhì)的核苷酸序列的上游DNA區(qū)域或功能等同物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法獲得的玉米根優(yōu)先啟動子。
全文摘要
提供了來自玉米的啟動子，該啟動子優(yōu)先在植物根中，例如玉米植物根中，啟動轉(zhuǎn)錄。
文檔編號C12N15/82GK1671739SQ03818391
公開日2005年9月21日 申請日期2003年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月31日
發(fā)明者G·范德基姆潘, G·范埃爾迪克, F·穆勒瓦特 申請人:拜爾生物科學股份有限公司