專利名稱：：二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶核酸序列及相關產(chǎn)物的制作方法本申請要求2002年7月31日提交的美國臨時申請60/399,427的優(yōu)先權(quán)和利益，在此引入作為參考。本發(fā)明涉及多肽及其相關核酸序列，以及在遺傳工程應用中純化，獲得以及使用這種分子的方法。更具體地，本發(fā)明涉及與在植物，真菌和哺乳動物中產(chǎn)生三酰甘油相關的多肽。二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(下文稱為DGAT)是整合膜蛋白，其催化在植物，真菌和哺乳動物中產(chǎn)生三酰甘油的最后酶促步驟。DGAT在Harwood，Biochem.Biophysics.Acta，13017-13056(1996)；Daum等.，Yeast，161471-1510(1998)；andColeman等.，Annu.Rev.Nutr.，2077-103(2000)中有總體描述。該酶負責將?；鶊F從酰基-輔酶-A轉(zhuǎn)移到1，2-二酰甘油(DAG)的sn-3位以形成三酰甘油(TAG)。在植物和真菌中，尤其是在油料種子中，DGAT與膜和脂質(zhì)體(lipidbody)部分相關，其有助于儲存碳作為能量儲備。據(jù)認為TAG是細胞能量儲備的重要化學物質(zhì)。已知DGAT可調(diào)節(jié)TAG結(jié)構(gòu)并指導TAG合成。此外，還已知DGAT反應是油合成特異的。在植物中，TAG是植物油的基本成分，種子利用TAG作為能量儲存形式，以便在種子萌發(fā)過程中利用。據(jù)認為高等植物通過類似的代謝途徑合成油，通常稱為Kennedy途徑(Kennedy等.，J.Biol.Chem.，222193(1956)；Finnlayson等.，Arch.Biochem.Biophys.，199179-185(1980))。脂肪酸在質(zhì)體中從乙酰-CoA通過一系列反應形成，所述反應由已知總稱為脂肪酸合酶(FAS)的酶催化。質(zhì)體中產(chǎn)生的脂肪酸輸出到細胞的胞質(zhì)區(qū)，并與輔酶A發(fā)生酯化。這些酰基-CoA是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)上合成甘油脂的底物。甘油脂合成本身是一系列反應，首先形成磷脂酸(PA)和DAG。這些代謝中間體中任何一種均可被導向形成膜磷脂，例如磷脂酰甘油(PG)，磷脂酰乙醇胺(PE)，或磷脂酰膽堿(PC)，或者它們可以被導向形成中性三酰甘油(TAG)。DAG的合成如下通過先后由甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(G3PAT)和溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)催化的兩個步驟從甘油-3-磷酸和脂酰-CoA以產(chǎn)生PA，并隨后由磷脂酸磷酸酶催化附加的水解步驟以產(chǎn)生DAG。在大多數(shù)細胞中，使用DAG產(chǎn)生膜磷脂，第一步是通過CTP-磷酸膽堿二胞苷?；D(zhuǎn)移酶(CTP-phosphocholinecytidylyltransferase)催化合成PC。在產(chǎn)生儲油的細胞中，DAG在DGAT催化的反應中被第三種脂肪酸?；?。已經(jīng)鑒定了兩種不同的DGAT蛋白家族。DGAT蛋白的第一家族(下文稱為DGAT1)與酰基-輔酶A有關膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)，其在文獻中描述(見，例如美國專利6,100,077和6,344,548)。DGAT蛋白的第二家族(下文稱DGAT2)，與前述鑒定的DGAT1蛋白家族無關，并在本發(fā)明中描述。DGAT2蛋白家族在2002年4月15日提交的美國申請10/121,857中描述。獲得能夠在將脂肪酸摻入甘油骨架中以制備油中產(chǎn)生表型結(jié)果的核酸序列有各種困難，包括但不限于目的代謝因子的鑒定，具有有用動力學性質(zhì)的蛋白來源的選擇和表征，純化目的蛋白達到可對其氨基酸進行測序的水平，利用氨基酸序列數(shù)據(jù)獲得能夠用作探針以找到所需DNA序列的核酸序列，以及構(gòu)建體的制備，轉(zhuǎn)化以及所得植物的分析。因此，需要鑒定能夠修飾油結(jié)構(gòu)和質(zhì)量的酶靶點和這種酶所靶向核酸序列的有用組織源。理想地，酶靶點可單獨或和其它核酸序列聯(lián)用而用于一或多種應用，所述其它核酸序列與以下事件有關油產(chǎn)量的增減，TAG結(jié)構(gòu)，脂肪酸庫(pool)中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比值，和/或脂肪酸庫的修飾產(chǎn)生的其它新的油組合物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供遺傳工具，其可改變植物中產(chǎn)生的油的組成，以及其相對于種子其它組分例如其中所含的粉(meal)的百分含量。本發(fā)明包括二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)多肽以及編碼這些多肽的多核苷酸。本發(fā)明的多肽和多核苷酸包括來自植物和真菌來源如拉曼被孢霉(Mortierellaramanniana)，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，以及粗糙鏈孢酶(Neurosporacrassa)的多肽和多核苷酸。本發(fā)明還涉及編碼DGAT蛋白的多核苷酸，以及包含部分或全部DGAT編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明還提供了編碼DGAT2蛋白的多核苷酸，以及包含部分或全部DGAT2編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明還提供了可用于轉(zhuǎn)錄并表達DGAT2的重組DNA構(gòu)建體，包括能夠在植物，和昆蟲宿主細胞中表達DGAT2的構(gòu)建體。本發(fā)明還包括分離的核酸分子，其包含編碼多肽分子的核酸序列，所述多肽分子包含選自SEQIDNO14，18，20，22，24，26，或28的多肽序列。優(yōu)選這種分離的核酸分子包括，例如SEQIDNO11，12，13，16，17，19，21，23，25，和27。本發(fā)明包括分離的核酸分子，其包含編碼與二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶具有同源性的多肽的核酸序列，其中所述核酸分子選自SEQIDNO11，12，13，16，17，19，21，23，25，或27。本發(fā)明還包括含有表達盒的DNA構(gòu)建體，所述表達盒包含在植物細胞中起作用的異源啟動子，所述啟動子與編碼多肽分子的核酸分子可操作地連接，所述多肽分子包含選自SEQIDNO14，18，20，22，或24的多肽序列。在一些具體實施方案中，所述DNA構(gòu)建體還包含第二表達盒，其中所述第二表達盒包含在植物細胞中起作用的第二異源啟動子，所述啟動子與編碼二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的多肽的核酸可操作地連接。優(yōu)選，所述第二啟動子與開始用的異源啟動子不同或相同；更優(yōu)選，所述兩個異源啟動子不同。本發(fā)明還包括含有表達盒的DNA構(gòu)建體，所述表達盒包含在植物細胞中起作用的異源啟動子，所述啟動子與編碼和二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶具有同源性的多肽的核酸分子可操作地連接，其中所述核酸分子選自SEQIDNO11，12，13，16，17，19，21，或23。在具體的實施方案中，所述DNA構(gòu)建體還包含第二表達盒，其中所述第二表達盒包含在植物細胞中起作用的第二異源啟動子，所述啟動子與編碼二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的多肽的核酸可操作地連接。優(yōu)選，所述第二異源啟動子與開始所用的異源啟動子不同或相同；更優(yōu)選，所述兩個異源啟動子不同。本發(fā)明還包括植物或種子，其含有包含表達盒的DNA構(gòu)建體，所述表達盒包含在植物細胞中起作用的異源啟動子，所述啟動子與編碼和二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶具有同源性的多肽的核酸分子可操作地連接，其中所述核酸分子選自SEQIDNO11，12，13，16，17，19，21，或23。優(yōu)選，所述植物或種子是下組中的一或多種玉米，大豆，canola，油菜(oilseedrape)，棉花(cotton)，芝麻(sesame)，亞麻(flax)，花生，向日葵，紅花(safflower)，橄欖(olive)，和油棕(oilpalm)。本發(fā)明還包括植物或種子，其含有包含表達盒的DNA構(gòu)建體，所述表達盒包含在植物細胞中起作用的異源啟動子，所述啟動子與編碼多肽分子的核酸可操作地連接，所述多肽分子包含選自SEQIDNO14，18，20，22，或24的多肽序列。優(yōu)選，所述植物或種子是下組中的一或多種玉米，大豆，canola，油菜，棉花，芝麻，亞麻，花生，向日葵，紅花，橄欖，和油棕。優(yōu)選，本發(fā)明的植物或種子被加工。更優(yōu)選，所述植物或種子用于生產(chǎn)產(chǎn)品，例如飼料，食物(meal)，油或蛋白。本文所用的植物或種子由DNA構(gòu)建體組成，所述構(gòu)建體包含在植物細胞中起作用的異源啟動子，以及選自SEQIDNO11，12，13，16，17，19，21，或23的核酸分子。在另一實施方案中，本發(fā)明的植物或種子由包含表達盒的DNA構(gòu)建體組成，所述表達盒包含在植物細胞中起作用的啟動子，所述啟動子與編碼多肽分子的核酸分子可操作地連接，其中所述多肽分子包含選自SEQIDNO14，18，20，22，或24的多肽序列。優(yōu)選，本發(fā)明的植物或種子被加工成產(chǎn)品，所述產(chǎn)品可以是飼料，食物，油和蛋白。本發(fā)明還提供了在宿主細胞或其后代中產(chǎn)生DGAT2蛋白的方法。還提供了含有DGAT2的重組細胞。本發(fā)明提供了制備具有改良(enhanced)油組成的植物，包括以下步驟用表達二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞，并將所述植物細胞再生成相對于遺傳背景相似但缺乏導入的核酸分子的植物而言可育(fertile)的植物。本發(fā)明還包括可育植物，其提供相對于遺傳背景相似但缺乏導入的核酸分子的植物而言具有較高油產(chǎn)量的種子。另一方面，本發(fā)明提供編碼多核苷酸，其編碼具有至少一種選自AYVFGYEPHSVXPI(SEQID33)或FXXPXYR(SEQIDNO34)的氨基酸基序的多肽，其中X代表任何氨基酸。這種多肽包括，例如SEQIDNO14，18，20，22，和24。另一方面，本發(fā)明提供具有二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽(包括片段和蛋白)，且所述多肽包含至少一種選自AYVFGYEPHSVXPI(SEQIDNO33)或FXXPXYR(SEQIDNO34)的氨基酸基序，其中X代表任何氨基酸。這種多肽包括，例如SEQIDNO14，18，20，22，和24。序列簡述SEQIDNO1拉曼被孢霉(Mortierellaramanniana)DGAT2A的DNA序列SEQIDNO2拉曼被孢霉DGAT2A的多肽序列SEQIDNO3拉曼被孢霉DGAT2B的DNA序列SEQIDNO4拉曼被孢霉DGAT2B的多肽序列SEQIDNO5釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)DGAT2B的DNA序列SEQIDNO6釀酒酵母DGAT2B的多肽序列SEQIDNO7NcDGAT2的DNA引物SEQIDNO8NcDGAT2的DNA引物SEQIDNO9NcDGAT2的DNA引物SEQIDNO10NcDGAT2的DNA引物SEQIDNO11拉曼被孢霉DAGT2B.nno的DNA序列SEQIDNO12粗糙脈孢霉(Neurosporacrassa)DGAT.nno的DNA序列SEQIDNO13粗糙脈孢霉DGAT2的DNA序列SEQIDNO14粗糙脈孢霉DGAT2的多肽序列SEQIDNO15拉曼被孢霉DGAT2A.nno的DNA序列SEQIDNO16釀酒酵母DGAT2.nno的DNA序列SEQIDNO17大麥(Hordeumvulgare)DGAT2的DNA序列SEQIDNO18大麥DGAT2的多肽序列SEQIDNO19玉米(Zeamays)DGAT2的DNA序列SEQIDNO20玉米DGAT2的多肽序列SEQIDNO21大豆(glycinemax)DGAT2的DNA序列SEQIDNO22大豆DGAT2的多肽序列SEQIDNO23普通小麥(Triticumaestivum)DGAT2的DNA序列SEQIDNO24普通小麥DGAT2的多肽序列SEQIDNO25黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)DGAT的DNA序列SEQIDNO26黑腹果蠅DGAT的多肽序列SEQIDNO27人(Homosapiens)DGAT的DNA序列SEQIDNO28人DGAT的多肽序列SEQIDNO29粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)1DGAT2的多肽序列SEQIDNO30粟酒裂殖酵母2DGAT2的多肽序列SEQIDNO31白色念珠菌(Candidaalbicans)DGAT2的多肽序列SEQIDNO32擬南芥(Arabidopsisthaliana)DGAT2的多肽序列附圖簡述圖1a，1b，和1c總體顯示特定來源的DGAT2多肽序列的序列比對。多肽間的類似的序列可用于鑒定具有相似活性的類似分子。數(shù)種計算機程序可用于鑒定相關分子間保守的序列基序，包括但不限于MEME，或GENESCAN。序列基序一旦被鑒定，其功能可測定。例如，DGAT中的基序序列可用于鑒定其它DGAT多肽。新基序可自本發(fā)明公開的多肽序列衍生，并用于篩選序列數(shù)據(jù)庫或者設計簡并核酸探針來分離編碼DGAT的新DNA分子。利用Clustalmultiple序列比對程序，可比對預測的DGAT2多肽的氨基酸序列。完全保守的殘基用黑影覆蓋，灰影覆蓋的為三或更多序列的共有序列。所有序列都是全長的。比對之上所示的殘基是在?；D(zhuǎn)移酶基序D和E中發(fā)現(xiàn)的高度保守的信號氨基酸(Neuwald，Curr.Biol.，7465-466，(1997))。在該區(qū)域，DGAT2和?；D(zhuǎn)移酶超家族序列共-比對(co-align)，僅顯示共有保守氨基酸殘基。KeyMrDGAT2A(SEQIDNO2)，MrDGAT2B(SEQIDNO4)，ScDGAT2B(SEQIDNO6)；NcDGAT2(SEQIDNO14)，ZmDGAT2(SEQIDNO20)，GmDGAT2(SEQIDNO22)，HvDGAT2(SEQIDNO18)，TaDGAT2(SEQIDNO24)，CaDGAT2(SEQIDNO31)，和AtDGAT2(SEQIDNO32)。圖2顯示圖1的DGAT2家族成員的系統(tǒng)發(fā)生樹。利用DNASTAR軟件構(gòu)建該樹。圖3是用于本發(fā)明的DNA引物分子的列表。圖4是載體pCGN8832的圖示。圖5是載體pMON68762的圖示。圖6是載體pMON68654的圖示。圖7是載體pMON70904的圖示。圖8是載體pMON70920的圖示。圖9是載體pMON70923的圖示。圖10是載體pMON70925的圖示。圖11是載體pMON70927的圖示。圖12a和12b顯示來自本文鑒定的某些真菌物種的DGAT2多肽序列的序列比對。如何閱讀該圖(包括所用簡稱和陰影)的信息同上述圖1a，1b，和1c。陰影和黑影中表示的保守區(qū)通常用于鑒定來自其它物種的其它DGAT2多肽。具體地，這些序列的分析揭示了以下基序FXXPXYR(SEQIDNO34)，其中X表示任何氨基酸，所述基序可用于鑒定其它DGAT2序列，優(yōu)選真菌來源的那些DGAT2序列。圖13顯示來自本文鑒定的具體植物物種的DGAT2多肽序列的序列比對。如何閱讀本圖(包括所用簡稱和陰影)的信息同上述圖1a，1b，和1c。陰影和黑影中表示的保守區(qū)通常用于鑒定來自其它物種的其它DGAT2多肽。具體地，這些序列的分析揭示了以下基序AYVFGYEPHSVXPI(SEQIDNO33)，其可用于鑒定其它DGAT2序列，優(yōu)選植物來源的那些DGAT2序列。
發(fā)明內(nèi)容本文術語三酰甘油組合物指生物體中的化合物，所述化合物包括水溶性的、甘油的脂肪酸三酯，即具有化學式(CH2-R)3，其中R是酯。如本文所述，術語DGAT1指1999年6月4日提交的美國申請09/326,203中所述的DGAT蛋白，所述申請全文包含在本文中作為參考，所述DGAT蛋白與?；鵆oA膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(ACAT)基因家族相關，并負責將?；鶊F從?；?輔酶-A轉(zhuǎn)移到1，2-二酰甘油(DAG)的sn-3位以形成三酰甘油(TAG)。本文術語DGAT2指非-上述DGAT1蛋白，其負責將?；鶑孽；?輔酶-A轉(zhuǎn)移到1，2-二酰甘油(DAG)的sn-3位以形成三酰甘油(TAG)。DGAT2蛋白的分子量通常小于40kD，并通常在33-42kD的范圍內(nèi)。本文術語DGAT2A指具有SEQIDNO2的氨基酸序列的拉曼被孢霉DGAT2。本文術語DGAT2B指具有SEQIDNO4的氨基酸序列的拉曼被孢霉DGAT2本文術語“油組成”指樣品中不同的脂肪酸或油成分的比例。這種樣品可以是植物或者植物的一部分，例如種子。這種樣品可以是植物部分的集合。在優(yōu)選實施方案中，本文術語“百分比含量”指具體組分總重量相對于類似或相關組分的百分數(shù)。本文術語“改良油”包括增加的油產(chǎn)量或改變的油組成。本文中，本發(fā)明的二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT)基因包括任何編碼可從細胞來源獲得的氨基酸(例如蛋白，多肽或肽)的核酸序列，其顯示在酶反應條件下催化從1，2-二酰甘油和脂?；孜锎呋a(chǎn)生三酰甘油的能力?！懊阜磻獥l件”指允許酶起作用的環(huán)境中可獲得任何必要的條件(即，例如溫度，pH，缺乏抑制物等因素)。本發(fā)明涉及?；鵆oA二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(本文稱DGAT)，其可催化產(chǎn)生三酰甘油(TAG)的最后步驟。更具體地，本發(fā)明包括DGAT多肽，和編碼所述DGAT多肽的多核苷酸。本發(fā)明的DGAT多肽和多核苷酸分子是從植物和真菌來源分離的。在昆蟲和植物細胞中表達所述cDNA使得從這些細胞分離的膜上具有高水平的DGAT活性。本發(fā)明提供編碼具有DGAT功能的酶的基因家族，其包括真菌，植物和動物中的成員。DGAT蛋白分離自產(chǎn)油真菌拉曼被孢霉的細胞。細胞裂解后，DGAT活性與脂質(zhì)體部分相關，并且需要清潔劑溶解來釋放膜結(jié)合的蛋白，以允許利用傳統(tǒng)的層析技術對其進行純化。加入清潔劑TritonX-100后，在勻漿中觀察到DGAT活性的刺激。利用五步方案，由SDS-PAGE測定分子量分別為36kD和36.5kD的兩種蛋白，被鑒定為與DGAT有關。這些蛋白分別稱為MrDGAT2A和MrDGAT2B。包含各種蛋白的最純和最活躍的片段的最終比活性回收率分別為1.6％和4.2％?？寺〉腸DNA在昆蟲細胞中的表達證實了DGAT。獲得數(shù)種植物和真菌DGAT同系物的全長克隆，并在昆蟲或植物細胞中評估表達的蛋白。顯示一定水平DGAT活性的受測同系物顯示該家族中的基因在功能上相關。本發(fā)明提供了多種試劑，例如與酶相關的核酸分子和多肽，所述酶負責將?；鶑孽；?輔酶-A轉(zhuǎn)移到1，2-二酰甘油(DAG)的sn-3位以形成三酰甘油(TAG)，并提供了這種試劑的應用。核酸分子本發(fā)明的試劑包括核酸分子。在本發(fā)明優(yōu)選的方面，所述核酸分子包含選自SEQIDNO11，12，13，16，17，19，21，23，25，或27之一的核酸序列。本發(fā)明另一方面，所述核酸分子包含編碼選自SEQIDNO14，18，20，22，24，26或28的氨基酸序列的核酸序列或其片段本發(fā)明優(yōu)選的實施方案涉及利用基序來鑒定其它DGAT基因和蛋白，所述基序即在鑒定的DGAT分子的序列中發(fā)現(xiàn)的保守元件。因此，本領域熟練技術人員可利用基序，例如SEQIDNO33或34，在進行或不進行該基序的反式轉(zhuǎn)錄的情況下，篩選編碼DGAT或具有DGAT活性的其它多肽的其它基因。本發(fā)明的第一核酸序列顯示與對照核酸序列“基本相同”見于下述情況當所述核酸序列與對照序列(或其互補鏈)最佳比對(具有適當?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔В诒容^窗內(nèi)其總數(shù)小于對照序列的20％)時，在至少20個核苷酸位置，優(yōu)選至少50個核苷酸位置，更優(yōu)選至少100個核苷酸的位置，最優(yōu)選第一核酸全長的比較窗中，至少具有約75％核苷酸序列同一性，優(yōu)選至少約80％核苷酸序列同一性，更優(yōu)選至少約85％核苷酸序列同一性，更優(yōu)選至少約90％，且最優(yōu)選約95％核苷酸序列同一性。對于在比較窗中進行比對而言，序列的最佳比對可通過以下方法進行Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.，2482(1981)的局部同源性算法(localhomologyalgorithm)進行；通過Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48443(1970)的同源性比對算法；通過Pearson和Lipman，Proc.Natl.AcadSci.(U.S.A.)852444(1988)的相似性方法檢索；優(yōu)選通過WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0，GeneticsComputerGroup，575ScienceDr.，Madison，Wis中這些算法的計算機化執(zhí)行(GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，和TFASTA)。該對照核酸可以是全長分子或者較長分子的一部分?？蛇x地，如果兩種核酸在嚴謹條件下互相雜交，則它們基本具有核苷酸序列同一性。本發(fā)明另一方面中應理解，由于一或多種氨基酸可以被缺失，取代，或加入而不改變蛋白的功能，所述核酸序列可編碼與所述蛋白中任何一種都不同的蛋白。例如，應理解能夠編碼這種保守氨基酸取代的密碼子是本領域已知的。本發(fā)明核酸分子的子集(subest)是核酸分子片段。核酸分子片段可由本發(fā)明核酸分子的主要部分，或者實際上大部分組成，例如具體公開的那些?？蛇x地，所述片段可包含較小的寡核苷酸片段(具有約15-約400個核苷酸殘基，并優(yōu)選約15-約30個核苷酸殘基，或約50-約100個核苷酸殘基，或約100-200個核苷酸殘基，或約200-約400個核苷酸殘基，或約275-約350個核苷酸殘基)。本發(fā)明一或多種核酸分子的片段可以是探針或具體是PCR探針。PCR探針是當與另一種核酸形成雙鏈結(jié)構(gòu)時能夠啟動聚合酶活性的核酸分子?，F(xiàn)有技術中存在各種測定PCR探針結(jié)構(gòu)的方法和PCR技術。利用例如GeneUp的程序(Pesole等.，BioTechniques，25112-123(1998))的計算機生成的搜索(computergeneratedresearch)，例如可用來鑒定潛在的PCR引物。本發(fā)明的核酸分子及其片段能夠在特定條件下與其它核酸分子特異性雜交。本發(fā)明的核酸分子包括與具有選自SEQIDNO11，12，13，16，17，19，21，23，25，或27的核酸序列的核酸分子或其互補序列特異性雜交。本發(fā)明的核酸分子還包括與編碼選自SEQIDNO14，18，20，22，24，26，或28的氨基酸序列的核酸分子或其片段特異性雜交的核酸分子。如果一種核酸分子與另一核酸分子顯示完全互補性，則其為后者的“補體”。如本文所述，當一種分子的每個核苷酸都與另一分子的核苷酸互補時，所述分子顯示“完全互補性”。如果兩種分子可以在至少常規(guī)“低嚴謹度”的條件下，以足夠的穩(wěn)定性互相雜交以允許它們保持退火，稱它們“最小互補”。類似地，如果兩種分子在常規(guī)“高嚴謹度”的條件下，以足夠的穩(wěn)定性互相雜交以允許它們保持退火狀態(tài)，稱這它們“互補”。常規(guī)嚴謹條件的描述見Sambrook等.，MolecularCloning，ALaboratoryManual，2ndEd.，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NewYork(1989)，和Haymes等.，NucleicAcidHybridization，APracticalApproach，IRLPress，Washington，DC(1985)所述。偏離完全互補性因此是允許的，只要所述偏離不完全排除所述分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力。因此，為了使核酸分子作為引物或探針，其只需要在序列上足夠互補以能夠在所用具體的溶劑和鹽濃度下形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。適宜的促進DNA雜交的合適嚴謹條件，例如，約45℃、6.0X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，然后在20-25℃用2.0XSSC洗滌，是本領域熟練技術人員已知的，并見于CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，NewYork(1989)，6.3.1-6.3.6。例如，洗滌步驟中鹽的濃度可為低嚴謹度(50℃、約2.0XSSC)到高嚴謹度(65℃、約0.2XSSC)。此外，洗滌步驟中的溫度可以從低嚴謹度的室溫即約22℃到高嚴謹度的約65℃。所述溫度和鹽條件均可變化，或者溫度或鹽條件之一可保持恒定而另一變量改變。在一個優(yōu)選實施方案中，在中度嚴謹條件下(例如約65℃、約2.0XSSC)，本發(fā)明的核酸與一或多種選自SEQIDNO11，12，13，16，17，19，21，23，25，或27的核酸分子或其補體特異性雜交本發(fā)明的核酸分子可編碼同源多肽。本文中的同源多肽分子或其片段是第二物種中的對應蛋白分子或其片段(例如玉米核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基是擬南芥(Arabidopsis)核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基的同系物)。同系物可通過分子進化和DNA改組技術產(chǎn)生，使得分子保持至少一種原始多肽的功能或結(jié)構(gòu)特征(見，例如美國專利5,811,238)。在另一實施方案中，所述同系物選自苜蓿(alfalfa)，擬南芥屬(Arabidopsis)，大麥(barley)，蕓苔(Brassicacampestris)，油菜(oilseedrape)，花椰菜(broccoli)，甘藍(cabbage)，canola，柑桔(citrus)，棉花(cotton)，大蒜(garlic)，燕麥(oat)，蔥屬(Allium)，亞麻(flax)，觀賞植物，花生(peanut)，辣椒(pepper)，馬鈴薯(potato)，油菜籽(rapeseed)，稻(rice)，黑麥(rye)，高梁(sorghum)，草莓(strawberry)，甘蔗(sugarcane)，甜菜(sugarbeet)，馬鈴薯(tomato)，小麥(wheat)，白楊(poplar)，松樹(pine)，杉樹(fir)，桉樹(eucalyptus)，蘋果，萵苣(lettuce)，小扁豆(lentils)，葡萄(grape)，香蕉(banana)，茶(tea)，草坪草(turfgrasses)，向日葵(sunflower)，大豆(soybean)，玉米(corn)，菜豆屬(Phaseolus)，海甘藍(crambe)，芥菜(mustard)，蓖麻子(castorbean)，芝麻(seasam)，棉籽(cottonseed)，亞麻籽(linseed)，紅花(safflower)，和油棕(oilpalm)。更具體地，優(yōu)選的同系物選自canola，玉米，蕓苔，油菜，大豆，海甘藍，芥菜，蓖麻子，花生，芝麻，棉籽，亞麻籽，油菜籽，紅花，油棕，亞麻，或向日葵。在更優(yōu)選的實施方案中，所述同系物選自canola，油菜籽，棉花，蕓苔，油菜，大豆，向日葵，紅花，油棕，和花生。在更具體的優(yōu)選實施方案中，所述同系物是大豆。在尤其優(yōu)選的實施方案中，所述同系物是canola。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述同系物是油菜。由于遺傳密碼的簡并性，不同的核苷酸密碼子可用于編碼具體的氨基酸。宿主細胞通常顯示優(yōu)選模式的密碼子使用。優(yōu)選構(gòu)建結(jié)構(gòu)型核酸序列以利用具體宿主細胞的密碼子利用模式。這通常增強結(jié)構(gòu)型核酸序列在轉(zhuǎn)化后宿主細胞中的表達。任何公開的核酸或氨基酸序列可被修飾以反映包含它們的宿主細胞或生物體的密碼子使用。針對植物中密碼子的應用而進行的結(jié)構(gòu)型核酸序列修飾在例如美國專利5,689,052和5,500,365中描述。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明任何核酸分子可以與在植物細胞中起作用的啟動子區(qū)可操作地連接，以導致mRNA分子的產(chǎn)生，其中連接于所述啟動子的核酸分子和該啟動子異源。本文中“異源”的意思是非天然存在在一起。蛋白和肽分子一類試劑包括一或多種本發(fā)明核酸試劑編碼的多肽分子。另一類試劑包括本發(fā)明的一或多種多肽。尤其優(yōu)選的一類蛋白是具有選自SEQIDNO14，18，20，22，24，26，或28的氨基酸序列的蛋白及其片段。多肽試劑可含有C-末端或N-末端氨基酸序列延伸。本文中“蛋白”，“肽分子”或“多肽”包括任何包含五個或更多個氨基酸的分子。本領域已知蛋白，肽，或多肽分子可經(jīng)過修飾，包括翻譯后修飾，例如但不限于，二硫鍵形成，糖基化，磷酸化或寡聚物化。因此，本文術語“蛋白”，“肽分子”或“多肽”包括任何通過任何生物或非生物方法修飾的蛋白。術語“氨基酸”指任何天然存在的L-氨基酸。該定義意在包括正亮氨酸，正纈氨酸，鳥氨酸，同型半胱氨酸和高絲氨酸。本發(fā)明另一方面，本發(fā)明的DGAT2蛋白已經(jīng)被溶解?！叭芙狻敝笇GAT酶從膜中提取出來，使得所述酶隨后以非膜結(jié)合的酶的方式起作用。還應注意來自多種來源的DGAT蛋白可用來在多種體內(nèi)應用中研究TAG生物合成。由于所有植物種子都似乎通過通常的代謝途徑合成脂質(zhì)，在多種物種中可容易實現(xiàn)一種植物DGAT蛋白在異源植物宿主中的研究或者應用。在其它應用中，植物DGAT蛋白可用于DGAT蛋白的天然植物來源以外，以增加在體外產(chǎn)生或合成的TAG的產(chǎn)量和/或修飾其組成。序列同一性的百分比是通過在比較窗中比較兩種最佳比對的序列來測定的，其中與用于兩條序列的最佳比對的對照序列相比(不包含添加或缺失)，比較窗中的多核苷酸或氨基酸序列部分可包含添加或缺失(即，缺口)。所述百分比是通過確定相同的核酸堿基或氨基酸殘基出現(xiàn)在兩個序列中的位點數(shù)以產(chǎn)生配對位置數(shù)，用配對位點數(shù)除以比較窗的總位置數(shù)，并用100乘以所得結(jié)果以產(chǎn)生序列同一性百分比。多肽或多核苷酸分子可以和相關分子基本相同或基本同源。這些與相關分子具有基本同一性的同源物通常包含至少一段多肽序列或者一段核苷酸序列，所述序列與其它多肽序列或多核苷酸序列相比具有至少70％的序列同一性。利用來自GeneticsComputerGroupInc.的WISCONSINPACKAGEversion10.0-UNIX中的Gap程序，根據(jù)Needleman和Wunsch的方法(J.Mol.Biol.，48443-453(1970))，利用成對比較的一套默認參數(shù)(對于氨基酸序列比較缺口產(chǎn)生罰分(GapcreationPenalty)＝8，缺口延伸(Extension)罰分＝2；對于核苷酸序列比較缺口產(chǎn)生罰分＝50；缺口延伸罰分＝3)；或利用BLAST2.2.1軟件組(Altschul等.，NucleicAcidsRes.，253389-3402)的TBLASTN程序，利用BLOSUM62基質(zhì)(HenikoffandHenikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，8910915-10919(1992))，以及用于成對比較的一套默認參數(shù)(缺口產(chǎn)生代價(gapereationcost)＝11，缺口延伸代價(gapextensioncost)＝1)。在BLAST中，E-值或期望值，代表不同的比對數(shù)，其值等于或優(yōu)于原始比對得分(rawalignmentscore)，S，預計其偶然出現(xiàn)在數(shù)據(jù)庫搜索中。E值越低，配對越明顯。由于數(shù)據(jù)庫大小是E值計算的因素，對于任何查詢/登陸配對(query/entrymatch)，通過對公共數(shù)據(jù)庫如GenBank進行″BLASTing″獲得的E值通常隨時間增加。對蛋白質(zhì)而言，同一性百分比指存在于通過BLAST算法比對的序列部分的長度上的相同配對氨基酸殘基的百分比。本發(fā)明的一個方面提供了包含核苷酸序列的分離多核酸分子或其互補序列，其中所述核苷酸序列編碼基本同源于本發(fā)明的蛋白氨基酸序列的多肽，其中基本同源定義為與選自SEQIDNO14，18，20，22，或24的序列具有至少約50％，或至少約60％，或至少約70％，或至少約75％，或至少約80％序列同一性，或至少約85％或至少約90％序列同一性，或至少約95％序列同一性，或至少約98％序列同一性。本發(fā)明的試劑包括蛋白及其片段，所述蛋白或其片段包含本發(fā)明蛋白的至少約10個連續(xù)氨基酸區(qū)域，優(yōu)選包含至少約20個連續(xù)氨基酸區(qū)域，甚至更優(yōu)選包含至少25，35，50，75，或100個連續(xù)氨基酸區(qū)域。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的蛋白包括約10到約25個連續(xù)氨基酸區(qū)域，更優(yōu)選約20到約50個連續(xù)氨基酸區(qū)域，甚至更優(yōu)選約40到約80個連續(xù)氨基酸區(qū)域。除了其它DGAT蛋白或基因的分離，其它相關?；D(zhuǎn)移酶蛋白的基因也可通過利用序列信息從本發(fā)明DGAT序列和相關的核酸或氨基酸序列獲得。例如，公開了包含氨基酸SEQIDNO29和30的DGAT2蛋白的粟酒裂殖酵母氨基酸序列同系物。在另一實施例中，其它?；D(zhuǎn)移酶類涉及植物脂質(zhì)生物合成，包括溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶(LPCAT)，溶血磷脂酰絲氨酸?；D(zhuǎn)移酶(LPSAT)，溶血磷脂酰乙醇胺?；D(zhuǎn)移酶(LPEAT)，磷脂酰膽堿二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(PDAT)，和溶血磷脂酰肌醇?；D(zhuǎn)移酶(LPIAT)。DNA構(gòu)建體和植物轉(zhuǎn)化體本發(fā)明的一或多種核酸分子可用于植物轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。外源性遺傳物質(zhì)可導入植物細胞中，而且所述植物細胞再生成完整的、可育，或不可育的植物。外源性遺傳物質(zhì)是任何遺傳物質(zhì)，其可天然存在或來自能夠被插入任何生物體中的來源。細菌質(zhì)粒維持(maintainance)元件是DNA構(gòu)建體的組分。這些元件包含抗生素標記物，即aadA基因(SPC/STR，spectomycin，和鏈霉素抗性)，Ec.nptII(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，卡那霉素抗性)；復制起點或控制質(zhì)粒拷貝數(shù)的元件，即，Ec.oriV，Ec.ori322，ORI-PUC，和Ec.ROP。這些元件的其它信息可從Sambrook等.，MolecularCloning，ALaboratoryManual，2ndEd.，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NewYork(1989)等獲得。本發(fā)明優(yōu)選的方面，所述外源性遺傳物質(zhì)包含選自SEQIDNO11，12，13，16，17，19，21或23的核酸序列或其互補序列或片段。本發(fā)明另一方面，所述外源性遺傳物質(zhì)包含編碼選自SEQIDNO14，18，20，22或24的氨基酸序列的核酸序列或其片段。在本發(fā)明的實施方案中，由一或多種基因組成的外源性遺傳物質(zhì)被導入植物。在另一實施方案中，優(yōu)選的基因組合包括，但不限于一或多種以下基因MrDGAT2A(SEQIDNO1)，MrDAGAT2A.nno(SEQIDNO15)，MrDGAT2B(SEQIDNO3)，MrDGAT2B.nno(SEQIDNO11)，ScDGAT2(SEQIDNO5)，ScDGAT2.nno(SEQIDNO16)，NcDGAT2(SEQIDNO13)，和NcDGAT.nno(SEQIDNO12)。在另一實施方案中，優(yōu)選的基因組合包括，但不限于在兩種分離啟動子控制下表達的下述基因之一MrDGAT2A(SEQIDNO1)，MrDAGAT2A.nno(SEQIDNO15)，MrDGAT2B(SEQIDNO3)，MrDGAT2B.nno(SEQIDNO11)，ScDGAT2(SEQIDNO5)，ScDGAT2.nno(SEQIDNO16)，NcDGAT2(SEQIDNO13)，和NcDGAT.nno(SEQIDNO12)。在這種組合中，一或多種基因產(chǎn)物可定位于細胞質(zhì)中。這種基因可，例如以單順反子或多順反子排列導入單個構(gòu)建體，在相同的轉(zhuǎn)化事件中導入不同的構(gòu)建體，或者導入分離的植物然后進行一或多次雜交以產(chǎn)生所需的基因組合。這種遺傳物質(zhì)可以導入單子葉植物或雙子葉植物，包括但不限于canola，棉花，大豆，擬南芥，菜豆屬，花生，紫花苜蓿，小麥(wheat)，稻(rice)，燕麥(oat)，高梁(sorghum)，油菜籽，黑麥(rye)，tritordeum，黍類(millet)，酥油草(fescue)，多年生黑麥草(perennialryegrass)，甘蔗(sugarcane)，越桔(cranberry)，番木瓜(papaya)，香蕉，紅花，油棕，亞麻，香瓜(muskmelon)，蘋果，黃瓜，石槲蘭(dendrobium)，唐菖蒲屬(gladiolus)，菊花(chrysanthemum)，百合屬(liliacea)，棉花，桉樹，向日葵，蕓苔，油菜，草坪草，甜菜，咖啡，和薯蕷屬(dioscorea)(Christou，InParticleBombardmentforGeneticEngineeringofPlants，BiotechnologyIntelligenceUnit，AcademicPress，SanDiego，California(1996)，其中優(yōu)選canola，棉花，蕓苔，油菜，油菜籽，大豆，海甘藍，芥菜，蓖麻子，花生，芝麻，棉籽，亞麻籽，紅花，油棕，亞麻，和向日葵，并更優(yōu)選canola，油菜籽，棉花，蕓苔，油菜，大豆，向日葵，紅花，油棕，和花生。在優(yōu)選的實施方案，所述同系物選自玉米，大豆，canola，棉籽，芝麻，亞麻，花生，向日葵，紅花，或油棕。在更優(yōu)選的實施方案中，所述遺傳物質(zhì)被導入canola。在另一更優(yōu)選的實施方案中，所述遺傳物質(zhì)導入油菜。在另一特別優(yōu)選的實施方案，所述遺傳物質(zhì)被導入大豆。編碼蛋白的核酸分子的導入可導致所述多肽在轉(zhuǎn)化后細胞或轉(zhuǎn)基因植物中的表達或過度表達。本發(fā)明核酸分子編碼的一或多種蛋白或其片段可以在轉(zhuǎn)化后細胞或轉(zhuǎn)化后植物中過度表達。這種表達或過度表達可以是所述外源性遺傳物質(zhì)的瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)移的結(jié)果。在一個優(yōu)選的實施方案，與遺傳背景相似的未轉(zhuǎn)化植物相比，本發(fā)明多肽在植物中的表達或過度表達與該植物中的DGAT活性增加有關。產(chǎn)物的水平增加可出現(xiàn)在整個生物體例如植物中，或者局限于該生物體的一或多種具體器官或組織中。例如，產(chǎn)物水平可在植物的一或多種組織和器官中增加，所述組織或器官包括但不限于根，塊莖，莖，葉，柄(stalk)，果實，漿果，堅果，樹皮，莢，種子和花。優(yōu)選的器官是種子。在優(yōu)選的方面，相似遺傳背景指其中被比生物體具有約50％或以上的共同細胞核遺傳物質(zhì)。在更優(yōu)選的方面，相似遺傳背景指其中被比生物體具有約75％或以上，甚至更優(yōu)選約90％或以上的共同細胞核遺傳物質(zhì)。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，相似遺傳背景指其中所述被比生物體是植物，且除了最初利用植物轉(zhuǎn)化技術導入的任何遺傳物質(zhì)以外，所述植物是同基因的。構(gòu)建體或載體可包括植物啟動子以表達所選多肽。在優(yōu)選的實施方案，本文所述任何核酸分子可以與啟動子區(qū)可操作地連接。所述啟動子區(qū)可在植物中起作用以導致mRNA分子的產(chǎn)生。例如，可沒有限制地使用任何在植物細胞中起作用以導致mRNA分子產(chǎn)生的啟動子，例如本文所述的那些啟動子。在優(yōu)選的實施方案，所述啟動子是植物啟動子。其它啟動子也可用于在具體組織例如種子或果實中表達多肽。實際上，在優(yōu)選的實施方案，所用啟動子是種子特異性啟動子。這種啟動子的實例包括來自以下基因的5′調(diào)控區(qū)napin(Kridl等.，SeedSci.Res.，1209219(1991))，菜豆蛋白(phaseolin)(Bustos等.，PlantCell，1(9)839-853(1989))，大豆胰蛋白酶抑制物(Riggs等.，PlantCell，1(6)609-621(1989))，ACP(Baersonetal.，PlantMol.Biol.，22(2)255-267(1993))，硬脂酰-ACP去飽和酶(Slocombe等，PlantPhysiol，104(4)167-176(1994))，β-伴大豆球蛋白(conglycinin)的大豆a’亞基(P-Gm7S，見，例如Chenetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，838560-8564(1986))，蠶豆(Viciafaba)USP(P-Vf.Usp，見，例如SEQIDNO1，2，和3，美國專利申請10/429,516)，和玉米L3油質(zhì)蛋白(oleosin)啟動子(P-Zm.L3，見，例如Hong等.，PlatztMol.Biol.，34(3)549-555(1997))。還包括玉米醇溶蛋白(zeins)，其是谷物內(nèi)胚乳(cornendosperm)中發(fā)現(xiàn)的一組儲存蛋白。已經(jīng)分離了來自玉米醇溶蛋白基因的基因組克隆(Pedersen等.，Cell，291015-1026(1982)，andRussell等.，TransgenicRes.，6(2)157-168)，并且也可使用來自這些克隆的啟動子(包括15kD，16kD，19kD，22kD，27kD的)和基因。其它已知例如在谷物中起作用的啟動子包括以下基因的啟動子waxy，Brittle，Shrunken2，分支化酶(branchingenzymes)I和II，淀粉合酶，去分支化酶，油質(zhì)蛋白，谷蛋白，和蔗糖合酶。尤其優(yōu)選的谷物內(nèi)胚乳表達啟動子是來自稻的谷蛋白基因啟動子，更具體為Osgt-1啟動子(Zheng等.，Mol.CellBiol.，135829-5842(1993))。適合在小麥中表達的啟動子實例包括以下物質(zhì)的啟動子ADP葡萄糖pyrosynthase(ADPglucosepyrosynthase)(ADPGPP)亞基，顆粒結(jié)合的和其它淀粉合酶，分支化和去分支化酶，胚胎發(fā)生-富集型蛋白，麥醇溶蛋白(gliadin)，麥谷蛋白(glutenin)。稻中這種啟動子的實例包括以下物質(zhì)的啟動子ADPGPP亞基，顆粒結(jié)合的和其它淀粉合酶，分支化酶，去分支化酶，蔗糖合酶，和谷蛋白。尤其優(yōu)選的啟動子是稻谷蛋白Osgt-1的啟動子。大麥的這種啟動子的實例包括以下物質(zhì)的啟動子ADPGPP亞基，顆粒結(jié)合的和其它淀粉合酶，分支化酶，去分支化酶，蔗糖合酶，大麥醇溶蛋白(hordein)，胚胎球蛋白，和糊粉特異性蛋白。在種子中優(yōu)選的表達啟動子是napin啟動子，本文稱P-Br.Snap2。另一種優(yōu)選的表達啟動子是Arcelin5啟動子(美國專利公開2003/0046727)。更優(yōu)選的啟動子是大豆7S啟動子(P-Gm.7S)和大豆7Sα′β-伴大豆球蛋白啟動子(P-Gm.Sphasl)。導致本發(fā)明的多肽過度表達的啟動子通常是本領域已知的，例如病毒啟動子(P-CaMV35S，美國專利5,352,605；P-FMV35S及其增強子元件E-FMV35S，所述增強子元件被鑒定為不具有轉(zhuǎn)錄天然起點的P-FMV35S5′部分，美國專利5,378,619和5,018,100)；和嵌合啟動子分子，其在美國專利6,462,258中描述為SEQIDNO28，并在本發(fā)明中稱為E-FMV35S/P-At.Tsfl)，以及各種植物來源的啟動子，例如植物肌動蛋白啟動子(P-Os.Actl，以及由其衍生的遺傳元件，美國專利5,641,876和6,429,357)。其它可利用的啟動子的描述見，例如美國專利5,378,619；5,391,725；5,428,147；5,447,858；5,608,144；5,608,144；5,614,399；5,633,441；5,633,435；和4,633,436。此外，可使用組織特異性增強子(Fromm等.，ThePlantCell，1977-984(1989))。構(gòu)建體和載體還包括具有目的編碼區(qū)的核酸序列，所述核酸序列的全部或部分起終止該區(qū)的轉(zhuǎn)錄的作用。已分離多種這樣的序列，包括Tr73′序列和NOS3′序列(Ingelbrecht等.，ThePlantCell，1671-680(1989)；Bevan等.，NucleicAcidsRes.，11369-385(1983))。調(diào)控性轉(zhuǎn)錄終止區(qū)也可在本發(fā)明的植物表達構(gòu)建體中提供。轉(zhuǎn)錄終止區(qū)可由編碼目的基因的DNA序列來提供，或者來自不同基因來源的方便的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，例如天然與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)相連的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)來提供。熟練技術人員將認識到能夠在植物細胞中終止轉(zhuǎn)錄的任何方便的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)可用于本發(fā)明的構(gòu)建體。載體或構(gòu)建體也可以包括其它調(diào)控元件。實例包括從矮牽?；?petunia)種間雜交體Hsp70基因分離的翻譯前導序列(L-Ph.DnaK，美國專利5,362,865)，Adh內(nèi)含子1(Callis等.，GenesandDevelop.，11183-1200(1987))，蔗糖合酶內(nèi)含子(Vasiletal.，PlaatPhysiol.，911575-1579(1989))，稻肌動蛋白內(nèi)含子(I-Os.Actl美國專利5,641,876)，以及TMVω元件(Gallie等.，ThePlantCell，1301-311(1989))。轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，例如來自蕪青(Brassicarapa)的3’非翻譯區(qū)即T-Br.Snap2。適當時可包含這些和其它調(diào)控元件。載體或構(gòu)建體還可包含選擇標記物?？蛇x擇標記物還可用于選擇含有異源遺傳物質(zhì)的植物或植物細胞。這種標記物的實例包括但不限于nptII基因(Potrykus等.，Mol.Gen.Genet.，199183-188(1985))，其編碼卡那霉素抗性并可用卡那霉素，RptII，G418，hpt等選擇；編碼bialaphos抗性的bar基因；突變EPSP合酶基因(Hinchee等.，BiolTechnology，6915-922(1988)；Reynaerts等，SelectableandScreenableMarkers.InGelvinandSchilperoort；PlantMolecularBiologyManual，Kluwer，Dordrecht(1988)；Reynaerts等.，SelectableandScreenableMarkers.InGelvinandSchilperoort；PlantMolecularBiologyManual，Kluwer，Dordrecht(1988))；腈水解酶(nitrilase)基因，其賦予對溴苯腈(bromoxynil)的抗性(salker等.，J.Biol.Chem.，2636310-6314(1988))；突變乙酰乳酸合酶基因(ALS)，其賦予咪唑啉酮(imidazolinone)或磺脲抗性(歐洲專利申請154,204(Sept.11，1985))，ALS(D′Halluin等，Bio/Technology，10309-314(1992))，和甲氨蝶呤抗性DHFR基因(Thillet等.，J.Biol.Chem.，26312500-12508(1988))。尤其優(yōu)選的標記物是草甘膦(glyphosate)耐受性，所述耐受性可通過在植物內(nèi)表達草甘膦抗性EPSPS，例如來自根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的aroA-CP4編碼序列(美國專利5,633,435)實現(xiàn)，所述序列在下文稱為AGRtu.aroA。所述AGRtu.aroA編碼序列連接于葉綠體轉(zhuǎn)運肽(CTP)，例如分離自擬南芥(Arabidopsis)ShkF基因的CTP2編碼序列(下文稱TS-At.ShkF-CTP2)。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，表達所需蛋白的轉(zhuǎn)基因植物待產(chǎn)生。將編碼所需蛋白的所需多核苷酸序列導入植物細胞中的各種方法是本領域熟練技術人員可得并已知的，所述技術包括，但不限于(1)物理方法例如顯微注射，電穿孔，和微粒介導的遞送(生物彈(biolistics)或基因槍技術)；(2)病毒介導的遞送方法；和(3)土壤農(nóng)桿菌(Agrobacterium)-介導的轉(zhuǎn)化方法。最常用的植物細胞轉(zhuǎn)化法是土壤桿菌-介導的DNA轉(zhuǎn)移法，以及生物彈或微粒攻擊介導的方法(即基因槍)。通常，細胞核轉(zhuǎn)化是需要的，但需要特異性轉(zhuǎn)化質(zhì)體例如葉綠體或造粉體時，可利用所需多核苷酸的微粒介導的遞送轉(zhuǎn)化所述植物質(zhì)體。土壤桿菌-介導的轉(zhuǎn)化通過利用遺傳改造的土壤桿菌屬土壤細菌實現(xiàn)。具有Ti或Ri質(zhì)粒的多種野生型和改造型根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)和發(fā)根土壤桿菌(Agrobacteriumrhizogene)菌株可用來將基因?qū)胫参??；蜣D(zhuǎn)移通過將已知為“T-DNA”的特定DNA轉(zhuǎn)移到許多植物種類中進行，所述“T-DNA”可經(jīng)遺傳改造以攜帶任何所需的DNA片段。所述轉(zhuǎn)基因在DNA質(zhì)粒載體中構(gòu)建，并通常與土壤桿菌Ti質(zhì)粒右邊緣DNA區(qū)(RB)和左邊緣DNA區(qū)(LB)鄰接(border)。在土壤桿菌介導的轉(zhuǎn)化過程中，所述DNA質(zhì)粒由VirD1和VirD2核酸內(nèi)切酶在右和左邊緣區(qū)切割，且所述T-DNA區(qū)被插入植物基因組。。土壤桿菌-介導的植物遺傳轉(zhuǎn)化涉及多個步驟。第一步，首先使烈性(virulent)土壤桿菌和植物細胞互相接觸，通常稱為“接種”。接種后，所述土壤桿菌和植物細胞/組織在適合生長和T-DNA轉(zhuǎn)移的條件下一起生長數(shù)小時到數(shù)天或更長的時間。該步驟稱為“共培養(yǎng)”。共培養(yǎng)和T-DNA遞送后，所述植物細胞用殺細菌劑或細菌抑制劑處理，以殺死與所述外植體保持接觸的和/或含有所述外植體容器中的土壤桿菌。如果在缺乏任何選擇劑來促進轉(zhuǎn)基因植物細胞相對于非轉(zhuǎn)基因植物細胞的優(yōu)先生長的條件下進行，則上述步驟稱為“延遲(delay)”步驟。如果在存在利于轉(zhuǎn)基因植物細胞的選擇壓力下進行，則上述步驟稱為“選擇”步驟。當利用“延遲”時，通常隨后進行一步或多步“選擇”。對于微粒攻擊(美國專利5,550,318；5,538,880；和5,610,042；其全文均包含在本文中作為參考)，所述微粒用核酸包被并通過推動力遞送入細胞中。示例性微粒包括鎢，鉑，和優(yōu)選的金。微粒攻擊技術廣泛應用，并實際上可用于轉(zhuǎn)化任何植物種類。通過微粒攻擊轉(zhuǎn)化的物種的實例包括單子葉植物種類，例如玉米，大麥，小麥(美國專利5,563,055，其全文引入在本文中作為參考)，稻，燕麥，黑麥，甘蔗和高梁；以及多種雙子葉植物，通常包括煙草，大豆(美國專利5,322,783，其全文包含在本文中作為參考)，向日葵，花生，棉花，番茄和豆科植物(legume)(美國專利5,563,055，其全文引入在本文中作為參考)。為對轉(zhuǎn)化后植物細胞進行選擇或評分而不考慮轉(zhuǎn)化方法，所述DNA被導入含有在可再生植物組織中起作用的基因的細胞，以產(chǎn)生使得所述植物組織對其它毒性化合物具有抗性的化合物。用作可選擇，可篩選，或可評分標志物的目的基因可包括但不限于，GUS，綠色熒光蛋白(GFP)，螢光素酶(LUX)，抗生素或除莠劑耐受基因?？股啬褪芑虬ㄇ嗝顾?，卡那霉素(和新霉素，G418，博來霉素)；甲氨蝶呤(和甲氧芐啶(trimethoprim))；氯霉素；卡那霉素；和四環(huán)素。植物從各種轉(zhuǎn)化的外植體的再生，發(fā)育和培養(yǎng)是本領域已知的。這種再生和生長方法通常包括以下步驟選擇轉(zhuǎn)化的細胞并培養(yǎng)那些獨立化的細胞使其經(jīng)過通常的胚發(fā)育到生根的幼苗期。轉(zhuǎn)基因胚和種子也類似產(chǎn)生。生成的轉(zhuǎn)基因生根幼苗隨后植入適當?shù)闹参锷L培養(yǎng)基中例如土壤。在暴露于選擇劑的過程中存活下來的細胞，或者在篩選實驗中評分為陽性的細胞，可以在支持植物再生的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。發(fā)育的幼苗可轉(zhuǎn)移到土壤較少的植物培養(yǎng)混合物中，并且使其茁壯后將其轉(zhuǎn)移到溫室或生長小室中以便成熟。本發(fā)明可利用任何可轉(zhuǎn)化的細胞或組織。本文的可轉(zhuǎn)化指能夠進一步繁殖生成植物的細胞或組織。本領域熟練技術人員認識到許多植物細胞或組織是可轉(zhuǎn)化的，其中插入外源DNA并在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下，所述植物細胞或組織可形成分化的植物。適合這些目的的組織可包括但不限于未成熟的胚，盾片組織(scutellartissue)，懸浮細胞培養(yǎng)物，未成熟花序(immatureinflorescence)，苗分生組織(shootmeristem)，結(jié)節(jié)狀外植物，愈傷組織，下胚軸組織，子葉(cotyledons)，根和葉?？墒褂萌魏芜m宜的植物培養(yǎng)基。適宜的培養(yǎng)基的實例可包括，但不限于，基于MS的培養(yǎng)基(MurashigeandSkoog，Physiol.Plant，15473-497(1962))或基于N6的培養(yǎng)基(Chu等.，ScientiaSinica，18659(1975))，所述培養(yǎng)基補充了附加植物生長調(diào)節(jié)物包括但不限于植物生長素，細胞分裂素，ABA和赤霉素。本領域熟練技術人員熟悉各種組織培養(yǎng)基，其在適當補充時支持植物組織生長和發(fā)育，并適宜植物轉(zhuǎn)化和再生。這些組織培養(yǎng)基可作為商品購買，或定制，并且是修飾的。本領域熟練技術人員應理解，用于轉(zhuǎn)化和再生培養(yǎng)基和培養(yǎng)基添加物例如營養(yǎng)物質(zhì)和生長調(diào)節(jié)物，以及其它培養(yǎng)條件例如溫育過程中的光強度，pH，和溫育溫度可根據(jù)各種目的進行最優(yōu)化。利用土壤桿菌轉(zhuǎn)化方法形成的轉(zhuǎn)基因植物通常含有位于一個染色體上的單基因。這種轉(zhuǎn)基因植物對加入的基因是雜合的。更優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物是對加入的結(jié)構(gòu)基因純合的，例如含有兩種加入的基因的轉(zhuǎn)基因植物，其中一種基因位于染色體對的每條染色體的相同位點。雜合轉(zhuǎn)基因植物可通過使含有單個加入基因的獨立分離的轉(zhuǎn)基因植物進行兩性配對(自交)來獲得，使一些產(chǎn)生的種子發(fā)芽，并分析為目的基因而產(chǎn)生的植物。應理解兩種不同的轉(zhuǎn)基因植物也可配對以產(chǎn)生含有兩種獨立分離的，外源基因的子代。適宜的子代自交可產(chǎn)生這樣的植物，其對加入的兩種編碼目的多肽的外源基因是雜合的。還涉及與親代植物的回交以及與非轉(zhuǎn)基因植物的遠交，例如無性繁殖。通過含有反義方向的目的基因DNA的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化進行導入來反義抑制對植物中的基因，在美國專利5,107,065；5,453,566；5,759,829；5,874,269；5,922,602；5,973,226；和6,005,167中公開；所有這些文獻的內(nèi)容在此引入作為參考。通過用于細胞質(zhì)表達的、包含有義方向的目的基因DNA的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化進行導入來共抑制基因，在例如美國專利5,034,323；5,231,020；5,283,184；和6,271,033中公開，所有這些文獻的內(nèi)容包含在本文中作為參考。反義方法(approaches)是通過靶向遺傳物質(zhì)而抑制或降低基因功能的方法(Mol等.，F(xiàn)EBSLett.，268427-430(1990))。反義方法的目的是利用與靶基因互補的序列來封閉其表達，并產(chǎn)生其中單個選擇的蛋白的水平被選擇性降低或消除的突變細胞系或生物體。與其它“反向遺傳”方法相比，反義技術具有多種優(yōu)勢。失活位點及其發(fā)育效應可通過選擇用于反義基因的啟動子或者通過體外應用或顯微注射的時機來控制。反義可通過選擇靶基因的獨特區(qū)或者其與其它相關基因共享同源性的區(qū)來操作其特異性(Hiatt等.，InGeneticEngineering，Setlow(ed.)，NewYorkPleumn1149-63(1989))。本發(fā)明還提供了本發(fā)明植物的一部分，尤其是可繁殖的或這儲存性的部分。植物的部分，非限制性地包括種子，內(nèi)胚乳，胚珠，和花粉。在本發(fā)明尤其優(yōu)選的實施方案中，所述植物部分是種子。在一個實施方案中，所述種子是動物飼料的組分。本發(fā)明的任何植物或其部分可提供加工后的產(chǎn)品，包括飼料，食物(meal)，蛋白，面粉，纖維，可提取的營養(yǎng)物，或者油制備物。用于此目的的尤其優(yōu)選植物部分是種子。在優(yōu)選的實施方案，加工后產(chǎn)品是為牲畜動物和/或人設計的。制備飼料，食物，蛋白和油制品的方法是本領域已知的。見，例如美國專利4,957,748；5,100,679；5,219,596；5,936,069；6,005,076；6,146,669；和6,156,227，包含在本文中作為參考。在優(yōu)選的實施方案，所述蛋白制品是高蛋白制品。這種高蛋白制品優(yōu)選具有的蛋白含量超過5％w/v，更優(yōu)選10％w/v，且更優(yōu)選15％w/v。在優(yōu)選的油制品中，所述油制品是高油制品，其中所含油來自本發(fā)明的植物或其一部分，其含量大于5％w/v，更優(yōu)選10％w/v，且更優(yōu)選15％w/v。在優(yōu)選的實施方案，所述油制品是液體，且體積大于1，5，10，或50升。本發(fā)明提供了從本發(fā)明的植物產(chǎn)生，或者通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的油。這種油顯示增強的氧化穩(wěn)定性。而且這種油還是任何產(chǎn)生的產(chǎn)品的次要或主要成分。此外，這種油還可和其它油混合。在優(yōu)選的實施方案，從本發(fā)明的植物產(chǎn)生或者通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的油，占任何產(chǎn)品的油組分的0.5％，1％，5％，10％，25％，50％，75％，或90％以上的體積或重量。在另一實施方案中，所述油制品可以混合，并構(gòu)成混合物體積的10％，25％，35％，50％，或75％以上。從本發(fā)明的植物制備的油可以和一種或多種有機溶劑或石油餾分混合。本發(fā)明的植物可以是育種程序的一部分或由該程序產(chǎn)生。育種方法的選擇有賴于植物繁殖的方式，改良特性的遺傳性，以及商業(yè)使用的品種類型(例如，F(xiàn)1雜合子品種，純系品種等)。培養(yǎng)程序的強化可利用標志物對任何雜交子代進行選擇。還應理解，任何商業(yè)和非商業(yè)的品種均可用于培養(yǎng)程序中。因素例如種子發(fā)芽活力(emergencevigor)，營養(yǎng)勢(vegetativevigor)，應激耐受力，疾病抵抗力，分枝，開花，結(jié)種(seedset)，種子體積，種子密度，直立性(standability)，和脫粒性(threshability)等通常將決定選擇。示例性用途本發(fā)明的核酸分子及其片段可用來從相同物種獲得任何其它核酸分子(可利用來自谷物的核酸分子從谷物獲得其它核酸分子)。這種核酸分子包括編碼蛋白和啟動子的完全編碼序列的核酸分子以及這種分子的側(cè)翼序列。此外，這種核酸分子包含編碼其它同工酶或者基因家族成員的核酸分子。這種分子可通過利用上述核酸分子或其片段來篩選eDNA或基因組文庫輕易獲得。形成這種文庫的方法是本領域已知的。本發(fā)明的核酸分子及其片段也可用來獲得核酸同源物。這種同源物包括植物和其它生物體包括細菌和真菌的核酸分子，包括編碼其它植物物種或其它生物體蛋白同源物的全部或部分的核酸分子，遺傳元件的序列，例如啟動子或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件。這種分子可通過利用上述核酸分子或其片段來篩選獲自這種植物種類的cDNA或基因組文庫輕易獲得。形成這種文庫的方法是本領域已知的。這種同源分子的核苷酸序列與選自SEQIDNO11，12，13，16，17，19，21，23，25，或27或其互補序列的一或多種序列的核苷酸序列不同，這是因為穩(wěn)定雜交不需要完全互補性。本發(fā)明的核酸分子因此還包含這樣的分子，盡管其能夠與所述核酸分子特異性雜交，但缺乏“完全互補性”。與一或多種公開的核酸序列結(jié)合的啟動子序列和其它遺傳元件，包括但不限于轉(zhuǎn)錄調(diào)控側(cè)翼序列，可利用本文公開的核酸序列也可獲得。在一個實施方案中，這種序列通過將本發(fā)明的核酸分子與基因組文庫的成員一同保溫，并回收與這種核酸分子雜交的克隆而獲得。在第二個實施方案中，可用“染色體步行法”的方法，或者反向PCR來獲得這樣的序列(Frohman等.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，858998-9002(1988)；Ohara等.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，865673-5677(1989)；Pang等.，Bioteehniques，221046-1048(1977)；Huang等.，MethodsMol.Biol.，6989-96(1997)；Huang等.，MethodMol.Biol.，67287-294(1997)；Benkel等.，Genet.Anal.，13123-127(1996)；Hartl等.，MethodsMol.Biol.，58293-301(1996))。術語“染色體步行法”指通過連續(xù)雜交步驟延長遺傳圖譜的方法。本發(fā)明的核酸序列還可用于分離以下類型的啟動子細胞增強型，細胞特異型，組織增強型，組織特異型，發(fā)育或環(huán)境調(diào)控的表達模式。從基因組文庫中對這些基因的5’側(cè)接啟動子序列進行分離和功能分析，例如利用基因組篩選方法和PCR技術，可導致有用啟動子和轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的分離。這些方法是本領域熟練技術人員已知的，并在文獻中描述(見，例如Birren等.，GnomeAnalysisAnalyzingDNA，1(1997)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)。利用本發(fā)明的核酸分子獲得的啟動子可被修飾以影響它們的控制特性。這種修飾的實例包括，但不限于增強子序列。這種遺傳元件可用于增強新的和存在的特性的基因表達以改良農(nóng)作物。本發(fā)明的核酸分子的另一子集包括作為標志物的核酸分子。所述標志物可用于分子遺傳學領域的多種常見方法中。這種標志物包括可作為標志物的核酸分子SEQIDNO11，12，13，16，17，19，21，23，25，和27，以及其互補序列和片段，以及可作為標志物的本發(fā)明的其它核酸分子。本發(fā)明的一方面，一或多種本發(fā)明的核酸分子用來測定植物(優(yōu)選canola，棉花，蕓苔，油菜，油菜籽，大豆，海甘藍，芥菜，蓖麻子，花生，芝麻，棉籽，亞麻籽，紅花，油棕，亞麻，或向日葵)中的水平(即，樣品中mRNA的濃度)，或本發(fā)明一或多種分子部分或完全編碼的蛋白的表達模式(即表達的動力學，分解速率，穩(wěn)定性特征等)。多種方法可用于比較兩種或更多種細胞或組織樣品之間的表達。這些方法包括雜交實驗，例如Northern，RNAse保護實驗，和原位雜交?？蛇x地，所述方法包括PCR-型實驗。在優(yōu)選的方法中，所述表達通過將來自兩種或多種樣品的核酸與核酸陣列進行雜交來比較。所述陣列含有多種可疑序列，所述序列已知或可疑存在于樣品的細胞或組織中。本發(fā)明現(xiàn)已總體描述，通過參照以下實施例，將更容易理解，所述實施例僅為示例性而并非意圖限制本發(fā)明。實施例實施例1DGAT2核酸序列的分離以及DGAT活性的確認拉曼被孢霉的培養(yǎng)如Kamisaka，Y.等.，Lipids，28583-587(1993)所述。通過對舊培養(yǎng)物通過Miracloth傳代10-13天，并通過傾倒(hand-wringing)去除多余的液體來收獲細胞。濕的堆積(packed)細胞儲存在-70℃。從拉曼被孢霉純化DGAT2蛋白如下進行。從70-75g濕的堆積細胞中分離脂質(zhì)體(lipidbody)。在使用前，在冰上解凍細胞并重懸于200mL的緩沖液D(10mM磷酸鉀(pH7.0)，1MKCl，0.5M蔗糖，1mMEDTA)中。將細胞破壞器(Bead-Beater，BiospecProducts，Bartlesville，OK)調(diào)到“勻漿”、45-90秒，在其中用等體積的0.5mm玻璃珠溶解樣品。含有玻璃珠的細胞漿在500xg離心，去除上清，并用另外的5mL緩沖液D洗滌沉淀。離心后，組合兩次離心后的上清組合。將其分到6只超離心管(25×89mm)，并向每管中加入5mL緩沖液E(10mM磷酸鉀，pH7.0，1MKCl，和0.3M蔗糖)。在100,00×g、4℃離心所述樣品3小時。組合漂浮在覆蓋層上的脂質(zhì)體部分，并在50mL的緩沖液F(10mM磷酸鉀(pH7.0)，75mMKCl，0.5M蔗糖和1.5％TritonX-100)中溶解。不溶物通過超速離心(90,000×g，1.8小時)去除。棄去懸浮的脂質(zhì)層，并且保留含有溶解部分(TritonX-100提取物)上清用于柱純化。DGAT活性測定為14C三酰甘油從[1-14C]油酰-CoA和未標記的二油酰-DAG的產(chǎn)生。對于不溶的樣品，反應混合物(0.1mL)由以下物質(zhì)組成酶提取物，3.67μM的[1-14C]油酰-CoA，和1.5mM1，2-181二酰甘油，所述反應混合物位于含有10mM磷酸鉀(pH7.0)，100-150mMKCI，和0.1％Tritonx-100(w/v)的緩沖液中。實驗混合物在25℃保溫5分鐘，并通過加入1.5mL的庚烷∶異丙醇∶0.5MH2S04(10∶40∶1，v/v/v)來終止反應。對于溶解的樣品，1，2-181DAG降低到0.5mM，TritonX-100增加到0.2％，并包含300μML-α-磷脂酸。所述L-α-磷脂酸在用清潔劑溶解后需要恢復活性，如Kamiska等.，J.Biochem.，119520-523(1996)所述，但使用的是300μM磷脂酸而不是500μM。這導致活性被極大刺激。溶解以后，產(chǎn)物形成有賴于加入外源性DAG。在這些條件下，所述反應速率在10分鐘的時間內(nèi)是線性的。實驗終止后，放射標記的甘油磷脂通過加入0.1mL的1MNaHCO3和1mL的庚烷(含有15納摩爾/mL的三油酸甘油酯作為載體)來分離。渦旋攪拌所述混合物，并將上層有機相轉(zhuǎn)移到新的玻璃容器中。有機提取物用1mL的1MNaCl反萃取。取出40％的終有機相，進行液閃計數(shù)，并在氮氣條件下蒸發(fā)剩余的有機相直到干燥。殘余物重懸于庚烷中，并在具有預附著加樣區(qū)的硅膠-G(Analtech#31011，Newark，Delaware)上進行TLC。TLC板在庚烷∶二乙醚∶乙酸(50∶50∶1，v/v/v)中處理，然后進行干燥并通過放射圖像分析儀(AMBIS3000，AMBIS，Inc.，SanDiego，California)進行掃描，以確定摻入TAG的放射活性部分。，暴露于碘蒸氣以后，通過未標記三油酸甘油酯載體和[14C]TAG的共遷移測定TLC板上的TAG活性。TritonX-100提取物中DGAT活性通過在Yellow86-瓊脂糖柱(2.5cm×6.4cm)上進行染料結(jié)合層析進一步純化，所述柱用緩沖液G(10mM磷酸鉀(pH7.0)，0.1％(w/v)TritonX-100，10％(w/v)甘油)中的75mMKCl平衡。所述柱用5倍體積的平衡緩沖液以2mL每分鐘進行洗滌，隨后活性用緩沖液G中的500mMKCl得以洗脫。DGAT活性在純化的這一階段對凍融是穩(wěn)定的，因此洗脫部分馬上測定，并將活性部分儲存在-70℃。為保持最大活性，隨后進行層析并在同一天測定級分。組合Yellow86-瓊脂糖純化活性的四個制備物，并通過超濾(YM-30膜，Amicon，Beverly，MA)濃縮12倍。所述活性通過羥磷灰石層析在1.0cm×25.5em的柱上進一步純化，所述柱用緩沖液G中的500mMKCl平衡。所述柱用40mL的平衡緩沖液洗滌，隨后用平衡緩沖液中的100mM磷酸二鉀梯度洗滌結(jié)合的蛋白。收集來自含有DGAT活性的流經(jīng)物的級分，并在緩沖液G中以1∶3.3稀釋，以將KCl濃度從500降低到150mM。稀釋的樣品加樣于用含150mMKCl的緩沖液G平衡的肝素柱CL-6B(0.55×4.7cm)。所述柱用5倍體積的平衡緩沖液以0.5mL/分洗滌，并在10mL150-500mMKCl的線性梯度中隨后用10mL緩沖液G中的500mMKCl以0.25mL/分洗脫結(jié)合的蛋白。收集1.1mL的級分。從肝素柱上洗脫下兩個活性峰值(fnx22和fxn28)。蛋白純化方案的總結(jié)見表1。從300g拉曼被孢霉細胞漿中分離的脂質(zhì)小體級分用于制備。Mr-DGAT2A(肝素fxn28)和Mr-DGAT2B(肝素fxn22)的回收值在最后的層析步驟中分別報道。表1.DGAT2的純化方案聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳(10-13％)根據(jù)Laemmli，Nature，227680-227685(1970)的方法，以及Delepelaire，Proc.Nat.Acad.Sci.，76115-115(1979)所述的修飾進行。溶解的凝膠含有10-13％的丙烯酰胺保存液的線性梯度，所述保存液用0-10％蔗糖線性梯度穩(wěn)定。蛋白的顯示可通過根據(jù)Blum等.，Electrophoresis，893-99(1987)的方法進行銀染色，或者利用考馬斯藍(0.1％考馬斯藍R-250，50％甲醇(v/v)，10％乙酸(v/v))。多條蛋白帶(36.5kD，36kD，35kD，和34kD)與活性的首次峰值(fxn22)相關。34kD的帶在所有層析步驟中均不與DGAT活性相關，因此將其去除(即數(shù)據(jù)未顯示)。第二峰值(fxn28)具有較高的比活性(表2)，并含有SDS-PAGE的36kD的主要蛋白帶。純化鑒定了三種蛋白(36.5kD，36kD，和35kD)作為潛在的DGAT候選物。從36kD肽產(chǎn)生的氨基酸序列設計的簡并性引物以有義和反義方向構(gòu)建。這些引物以不同的組合用于擴增從拉曼被孢霉總RNA產(chǎn)生的cDNA。從濕的堆積細胞復制總RNA基本如Jones等.，ThePlantCell，7359-371(1995)所述。利用MarathoncDNA擴增試劑盒(BDBiosciencesClontech，Inc.PaloAlto，California)從RNA合成cDNA。50μL的擴增混合物由模板，聚合酶鏈反應緩沖液，各200-300ng的引物，2.5mMdNTP，和1單位AmpliTaqGold聚合酶(PerkinElmer，Norwalk，CT)組成。擴增程序包括在95℃保持一個10分鐘，并進行變性(94℃，30秒)，退火(62℃，10秒，10％rampto50℃，15秒)，和引物延伸(72℃，2分)的循環(huán)30次。反應產(chǎn)物在0.7％的瓊脂糖凝膠上分離，切下，并根據(jù)QIAPREPDNA提取手冊(Qiagen，SantaClara，California)純化。純化的產(chǎn)物克隆入pCR2.1TOPO載體(Invitrogen，Carlsbad，California)，并利用DNA測序分析。通過并非用于設計引物的Edman降解所得肽序列與PCR產(chǎn)物的推定氨基酸序列之間的比較用來確認片段。利用對這些片段特異的引物進行RACE反應(MarathoncDNA擴增試劑盒)以產(chǎn)生克隆入pCR2.1-TOPO載體的1312個堿基對(bp)長的cDNA。該閱讀框架的最5′ATG密碼子位于第76個堿基對，以允許長度為355個氨基酸的多肽的翻譯(圖1，MrDGAT2A)。Genbank搜索顯示這些多肽與已知的DGAT1或任何其它?；D(zhuǎn)移酶不是序列相關的，但所述多肽是以前沒有提到的真核細胞主要門的基因家族成員，尤其是真菌，植物，動物和基本真核生物。商品BAC-to-BAC桿狀病毒表達系統(tǒng)(LifeTechnologies，Inc.，Gaithersburg，MD)用于在培養(yǎng)的昆蟲(sf9)細胞中表達拉曼被孢霉DGAT2A和DGAT2B的全長蛋白。全長DGAT2開放閱讀框架采用含有5’末端限制性位點的引物(對于有義引物為NotI和SpeI，對反義引物為PstD，通過PCR進行擴增。PCR產(chǎn)物克隆入pCR2.1TOPO載體，并對其進行測序以證實構(gòu)建體的可信性。pCR2.1-TOPO載體中的全長cDNA用NotI和PstI消化，并克隆入pFASTBAC1載體(LifeTechnologies，Inc.)的NotI和PstI限制性位點。所述桿狀病毒表達系統(tǒng)可用來表達全長cDNA以測定DGAT活性，所述cDNA編碼SEQIDNO18，20，22，24，26，和28中所述的多肽。昆蟲細胞(1×10細胞/mL)以0.05-0.1的感染復數(shù)(MOI)感染，并在27℃感染5天后通過離心收集。沉淀的細胞重懸于緩沖液H(100mMTricine-NaOH，pH7.8，10％甘油，100mMNaCI)中，并通過超生處理裂解(2×10秒)。細胞壁和其它碎片可通過離心沉淀并丟棄。通過對上清部分進行離心(100,000×g，1小時)收獲膜，并將沉淀重懸于緩沖液H中用于酶測定。昆蟲細胞膜中的DGAT活性測定為14C三酰甘油從[1-14C]油酰-CoA和未標記的二油酰-DAG中的產(chǎn)生。反應混合物(0.1mL)組成如下分離的膜，3.5μM[1-14C]油酰-CoA，21.5μM油酰-CoA和200μM1，2-181二酰甘油，所述混合物在含有25-30mMTricine(pH7.8)，50-60mMNaCl，和0.06％CHAPS(w/v)的緩沖液中。實驗混合物在25℃保溫5-10分鐘，并通過加入1.5mL庚烷∶異丙醇∶0.5MH2SO4(10∶40∶1，v/v/v)終止反應。如上述對樣品進行處理。就蛋白和時間而言，所述實驗是線性的。相對于未轉(zhuǎn)化的sf9細胞而言，拉曼被孢霉的DGAT2A(94-倍)和DGAT2B蛋白(37-倍)的DGAT活性明顯升高(表2)。表2還研究了表達的拉曼被孢霉DGAT2A和DGAT2B基因的酶特性。在4.0到11.0的pH范圍內(nèi)研究了pH對DGAT活性的影響。對于兩種酶的最佳pH據(jù)觀察為6.8。兩種多肽的pH方面沒有差異。在兩種多肽對溫度的反應性中觀察到差異。對DGAT2A而言，最佳溫度是37℃，而DGAT2B不顯示最佳溫度。實施例2粗糙脈孢霉DGAT2核酸序列的分離以及DGAT活性的確定以下方案用于獲得對應粗糙脈孢霉DGAT2蛋白(NcDGAT2)的整個編碼區(qū)。利用Tri-試劑(Sigma，St.Louis，MO)根據(jù)生產(chǎn)商說明，從粗糙脈孢霉配對型A(FungalGeneticsStockCenter，KansasCity，Kansas)菌絲體分離RNA。第一鏈cDNA合成利用SMARTcDNA擴增試劑盒(Clontech，California)實現(xiàn)?；诤痛植诿}孢霉基因組序列的序列比較，基因特異性引物被設計為擴增所述NcDGAT2序列的全長編碼區(qū)。導入其它限制性位點以便于克隆(HindIII和RsrII)，所用引物為SEQIDNO7和SEQIDNO8(圖3)。PCR產(chǎn)物根據(jù)生產(chǎn)商的方案(Invitrogen)克隆如質(zhì)粒pCR2.1，產(chǎn)生質(zhì)粒pMON69834。進行雙鏈DNA測序以證實序列(SEQIDNO13)。為在昆蟲細胞中利用桿狀病毒表達系統(tǒng)來表達NcDGAT2蛋白，pMON69834的RsrII-HindIII片段克隆入RsrII-HindIII消化的質(zhì)粒pFASTBAC1(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)。產(chǎn)生的質(zhì)粒pMON69839被轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH10BAC，并利用BAC-to-BAC桿狀病毒表達系統(tǒng)(Gibco-BRL)根據(jù)生產(chǎn)商說明表達所述蛋白，但重組病毒的收獲是在轉(zhuǎn)染后5天進行的。轉(zhuǎn)染混合物上清用于產(chǎn)生病毒株，所述病毒株用來感染實驗所用的Sf9細胞。DGAT活性測定為14C三酰甘油從[1-14C]油酰-CoA和未標記的二油酰-DAG中的產(chǎn)生。反應混合物(0.1mL)組成如下分離的膜3.5μM[1-14C]油酰-CoA，21.5μM油酰-CoA和200μM1，2-181二酰甘油，所述混合物位于含有25-30mMTricine(pH7.8)，50-60mMNaCl，和0.06％CHAPS(w/v)的緩沖液中。實驗混合物在實驗混合物在25℃保溫5-10分鐘，并通過加入1.5mL庚烷∶異丙醇∶0.5MH2SO4(10∶40∶1，v/v/v)終止反應。如實施例1中所述對樣品進行處理。與未轉(zhuǎn)化(sf9)細胞中的活性相比，在質(zhì)粒pMON6983轉(zhuǎn)化的細胞中DGAT活性增加了6倍。為在植物中表達NcDGAT2序列，從pMON69834中通過PCR擴增所述基因，以利用引物寡DB#19911(SEQIDNO9)和寡DB#19912(SEQIDNO10)導入NotI和Sse83871克隆位點(圖3)。PCR產(chǎn)物用NotI-Sse8387I消化，并將1071bp的片段與來自pMON67164的NotI-Sse8387I-消化的載體連接以形成pMON68762。在該質(zhì)粒中，所述基因在napin啟動子的控制下。質(zhì)粒pMON68762被導入根癌土壤桿菌ABI菌株，并利用所述菌株如Martinell等.，美國專利6,384,301所述轉(zhuǎn)化大豆。實施例3制備并轉(zhuǎn)化再合成的DGAT2基因從以下物質(zhì)構(gòu)建密碼子利用表來自大豆的8種高表達種子特異性蛋白即伴大豆球蛋白(GenBankAccession&num；AB008678，AB008679，AB008680)，大豆球蛋白(AB003680，AB004062)，和球蛋白(D16107，U59425)，以及來自carola的14種高表達的種子特異性蛋白即cuciferin，(GenBankAccession#167133，167135，17800，17804，17810，21117)，和napin(AA349403，167176，167178，167174，167154，17836，17834，17832)。MrDGAT2B和ScDGAT2氨基酸序列(分別為SEQIDNO4和SEQIDNO6)，以及上述密碼子利用表，被送到BlueHeronBiotechnologyInc.，(Bothell，WA)，其隨后利用適當?shù)乃惴óa(chǎn)生最終的密碼子優(yōu)化核苷酸序列，所述序列形成RNA二級結(jié)構(gòu)的自由能最低。MrDGAT2B的密碼子優(yōu)化序列通過BlueHeronBiotechnology，Inc.合成，并命名為MrDGAT2B.nno(SEQIDNO11)。ScDGAT2的密碼子優(yōu)化序列通過MidlandCertifiedReagentCompany(Midland，TX)合成，并命名為ScDGAT2.nno(SEQIDNO16)。對包含位于大腸桿菌表達載體中的MrDGAT2B.nno的質(zhì)粒pMON70924進行測序，以確定BlueHeronBiotechnology報道的序列。質(zhì)粒DNA用XhoI消化，并進行填充以產(chǎn)生平末端，并隨后用Sse83871消化。1068bp片段和平端/Sse8387I-消化的載體pMON70918連接以形成pMON70925。在該質(zhì)粒中，所述基因在napin啟動子控制下。對含有ScDGAT2.nno的質(zhì)粒pMON70917進行測序，以證實MidlandCertifiedReagentCompany報道的DNA。質(zhì)粒DNA用NotI-Sse8387I消化，并且對1269bp片段進行凝膠純化。所述片段與NotI-Sse8387I-消化的pMON70918連接以形成pMON70920。在該質(zhì)粒中，所述基因在napin啟動子的控制下。利用類似的技術將ScDGAT2.nno克隆入另一表達載體中，使得所述基因在USP88啟動子(pMON70923)的控制下表達。質(zhì)粒pMON70925，pMON70923，和pMON70920被導入根癌土壤桿菌ABI菌株，每種菌株都用來轉(zhuǎn)染大豆，如Martinell等.，美國專利6,384,301所述。類似地，將NcDGAT2氨基酸序列(SEQIDNO14)和上述密碼子使用表送到BlueHeronBiotechnology，Inc.，在那里產(chǎn)生了密碼子優(yōu)化核苷酸序列，所述序列形成RNA二級結(jié)構(gòu)的自由能最低。NcDGAT2的密碼子優(yōu)化序列通過BlueHeronTechnology合成，并命名為NcDGAT2.nno(SEQIDNO12)。對再合成的NcDGAT2.nno進行測序，以證實BlueHeronBiotechnology所報道的DNA。質(zhì)粒DNA用NotI-Sse8387I消化，并用凝膠純化片段。所述片段與NotI-Sse8387I消化的pMON67164連接以產(chǎn)生一種質(zhì)粒，所述質(zhì)粒的基因在napin啟動子的控制下。在植物宿主的基因組中構(gòu)建一種載體來獲得所述序列的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄和翻譯來實現(xiàn)表型改變，所述載體表達SEQIDNO17，19，21，和23中所述的序列。轉(zhuǎn)基因大豆植物可通過土壤桿菌-介導的轉(zhuǎn)化，如Martinell等.，美國專利6,384,301所述獲得。實施例4DGAT2在植物中的表達再合成的拉曼被孢霉DGAT2A基因，MrDGAT2A.nno，(SEQIDNO15)在大豆7S啟動子序列的控制下在大豆中表達(pCGN8832)。通過微粒攻擊轉(zhuǎn)化植物，并對集中的，發(fā)育的R1種子進行酶分析。與未轉(zhuǎn)化的植物相比，多種植物顯示DGAT活性明顯升高(5-20倍，StudentstTest，α＝0.05)，如表3所示。表3植物中的DGAT活性如下測定。發(fā)育的胚在液氮中利用研缽和杵磨碎。部分樣品用Tricine緩沖液(100mMTricine，pH7.5，280mMNaCl，10％甘油)溶解，并利用Bradford試劑(Sambrook等.，MolecularCloning，ALaboratoryManual，2ndEd.，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NewYork，1989)測定蛋白濃度。將樣品稀釋到1mg/ml，并將10μl用于實驗。DGAT活性測定為14C三酰甘油從[1-14C]油酰-CoA和未標記的二油酰-DAG中的產(chǎn)生。反應混合物(0.1mL)組成如下蛋白勻漿，3.5μM[1-14C]油酰-CoA，10μM油酰-CoA和1.5mM1，2-181二酰甘油，所述混合物位于含有25-30mMTricine(pH7.8)，50-60mMNaCl，和0.06％CHAPS(w/v)的緩沖液中。實驗混合物在25℃保溫5-10分鐘，并通過加入1.5mL庚烷∶異丙醇∶0.5MH2SO4(10∶40∶1，v/v/v)終止反應。如實施例1中所述對樣品進行處理。表達MrDGAT2A.nno基因的植物R1種子進入第二代(R2)。油和蛋白水平通過對成熟R2種子進行近紅外(Near-Infra-Red)(NIR)分析測定。測定從單獨植物收集的集中種子樣品的NIR譜，并根據(jù)回歸分析利用標準曲線計算油水平，所述標準曲線是在加速溶劑提取后，對具有各種油重量水平的大豆種子進行分析產(chǎn)生的(BetterSolutioiisforFoodandBeverageAnalysis，2′2dEdition，DionexCorporation，Sunnyvale，California(1997))。與不含有轉(zhuǎn)基因(nulls)的種子的油均值相比，MrDGAT2A.nno的純合種子的油均值增長了1.7％，該值具有統(tǒng)計學顯著意義(StudentsT檢驗，α＝0.05)。蛋白數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學評估顯示所述均值之間沒有差異(StudentsT檢驗，α＝0.05)。為在植物中，在napin啟動子的控制下表達再合成MrDGAT2A序列，將NotI-Sse8387I片段與NotI-Sse8387I-消化的雙元載體pMON67164連接以產(chǎn)生質(zhì)粒pMON70904。質(zhì)粒pMON70904被導入根癌土壤桿菌ABI菌株，其隨后用于轉(zhuǎn)染大豆。從R0植物收獲發(fā)育的R1種子并測定其DGAT活性?；钚陨叩倪x定量的事件前進一代(R2種子)。成熟第二代種子的油和蛋白水平通過近紅外信號(NearInfraredTransmittance)(NIT)光譜法測定，其中測定從單個植物采集的集中種子樣品的NIT譜，并基于回歸分析利用標準曲線計算油和蛋白水平，所述標準曲線通過分析具有各種油或蛋白水平的大豆種子產(chǎn)生，所述油或蛋白的重量水平例如分別通過以下加速溶劑提取或元素(％N)分析測定。與不含有轉(zhuǎn)基因(nulls)的種子的油均值相比，MrDGAT2A.nno的純合種子的油均值增長了2.6％，該值具有統(tǒng)計學顯著意義(StudentsT檢驗，α＝0.05)。蛋白數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學評估顯示所述均值之間沒有差異(StudentsT檢驗，α＝0.05)。實施例5從多重啟動子表達DGAT2在拉曼被孢霉中鑒定了兩種顯示DGAT2活性的蛋白(MrDGAT2A和MrDGAT2B)。為構(gòu)建能夠表達兩種DGAT基因的質(zhì)粒，將兩個基因克隆入相同的質(zhì)粒中的單一t-DNA上。質(zhì)粒pMON70927含有7Sa′啟動子控制下的MrDGAT2A.nno(SEQIDNO15)和napin啟動子控制下的MrDGAT2B.nno(SEQIDNO11)。所述克隆如下用EcoRV消化pMON70900，其含有7Sa′啟動子控制下的MrDGAT2A.nno，，并填補以產(chǎn)生平末端。隨后用NotI切割DNA，并用凝膠純化7Sa′MrDGAT2A.nno片段。所述片段與平末端/NotI-消化的植物表達載體pMON63689連接以形成pMON70912。為獲得MrDGAT2B.nno，用XhoI和EcoRI消化pMON70924，并填滿末端以產(chǎn)生1017bp長的平端/平端片段。所述片段利用凝膠純化，并隨后與平端/平端pCGN7770(含napin啟動子和3′UTR的大腸桿菌表達載體)連接以形成pMON70926。含有位于napin表達盒中的MrDGAT2B.nno的質(zhì)粒用NotI消化，并將所述片段與NotI-消化的pMON70912如上述連接，以形成pMON70927。將pMON70927導入根癌土壤桿菌ABI菌株，所述質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大豆，如Martinell等.，美國專利6,384,301所述。其它DGAT2基因，包括但不限于MrDGAT2A(SEQIDNO1)，MrDGAT2B(SEQIDNO3)，ScDAGT2(SEQIDNO5)，NcDGAT2(SEQIDNO13)，NcDGAT2.nno(SEQIDNO12)，和ScDGAT2.nno(SEQIDNO16)以類似的方式進行成對(pairs)或雙重(duplicate)克隆。所用啟動子在時間和/或強度方面控制表達。實施例6谷物胚芽(germ)中MrDGAT2的表達制備表達載體以改造谷物中再合成的拉曼被孢霉DGAT2A(SEQIDNO15)基因靶向胚芽的表達。具體地，包含在1076堿基對Notl/Sse8387I片段中的全長MrDGAT2A.nno基因(SEQIDNO15)被克隆入pMON72021的Bspl20I/Sse8387I位點，所述位點恰好位于玉米L3油質(zhì)蛋白啟動子3′，然后通過稻肌動蛋白內(nèi)含子和球蛋白13′UTR以產(chǎn)生pMON68654(圖6)。構(gòu)建體pMON68654通過根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化成原種玉米(elitemaizeline)LH59。該轉(zhuǎn)化導致的事件顯示油增加。序列表<110>Lardizabal，KathrynDBennett，KristenAWagner，NicholasW<120>二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶核酸序列及相關產(chǎn)物<130>REN00-192PRO3<150>60/399,427<151>2002-07-31<160>34<170>PatentInversion3.2<210>1<211>1068<212>DNA<213>拉曼被孢霉(Mortierellaramanniana)<400>1atggccagcaaggatcaacatttacagcagaaggtcaagcatacgctagaagctatccca60tcccctcgctatgctccattgcgagtgccattaagacggagattacaaacattggcagtt120ttattatggtgttccatgatgtcaatatgcatgttcatattcttctttttatgctccatt180cctgttctcctttggttccccattatcctttatttgacctggatcttggtgtgggataag240gcgccagagaacggtggaagacctattcgctggctgcggaatgctgcttggtggaagctg300tttgcagggtattttcccgcacatgtcatcaaggaagccgatttagatccatccaagaac360tacatctttggttatcacccccatggaatcatatccatgggctcgttctgtacttttagt420accaatgctactggctttgatgacttgttcccaggcatccggccatcgcttttgacatta480acatctaattttaatatcccactttatcgtgattatttgatggcgtgcggactttgctcc540gtctccaaaacatcctgtcaaaatattttaaccaaaggtggtccgggccgttccattgcc600attgtcgtgggaggtgcttccgagtctctcaatgctagacccggtgtcatggaccttgtg660ttgaagagacgctttggttttatcaagattgctgttcaaaccggtgcaagtctagtgccc720actatcagttttggtgaaaatgagctgtacgaacagattgaaagcaatgaaaactcaaag780ttgcatagatggcaaaagaagattcaacatgcccttggttttactatgccgctctttcat840ggacgcggtgtattcaattatgactttggtttgctcccccatcgccatcctatctacacg900attgttggaaagcccatccccgtccctagcatcaagtatggacagacaaaggatgagatt960ataagagaactacatgactcgtacatgcatgccgtgcaggatctctatgatcgttacaag1020gatatctatgcaaaggatcgggtaaaagaactagaattcgtcgaatag1068<210>2<211>355<212>PRT<213>拉曼被孢霉(Mortierellaramanniana)<400>2MetAlaSerLysAspGlnHisLeuGlnGlnLysValLysHisThrLeu151015GluAlaIleProSerProArgTyrAlaProLeuArgValProLeuArg202530ArgArgLeuGlnThrLeuAlaValLeuLeuTrpCysSerMetMetSer354045IleCysMetPheIlePhePhePheLeuCysSerIleProValLeuLeu505560TrpPheProIleIleLeuTyrLeuThrTrpIleLeuValTrpAspLys65707580AlaProGluAsnGlyGlyArgProIleArgTrpLeuArgAsnAlaAla859095TrpTrpLysLeuPheAlaGlyTyrPheProAlaHisValIleLysGlu100105110AlaAspLeuAspProSerLysAsnTyrIlePheGlyTyrHisProHis115120125GlyIleIleSerMetGlySerPheCysThrPheSerThrAsnAlaThr130135140GlyPheAspAspLeuPheProGlyIleArgProSerLeuLeuThrLeu145150155160ThrSerAsnPheAsnIleProLeuTyrArgAspTyrLeuMetAlaCys165170175GlyLeuCysSerValSerLysThrSerCysGlnAsnIleLeuThrLys180185190GlyGlyProGlyArgSerIleAlaIleValValGlyGlyAlaSerGlu195200205SerLeuAsnAlaArgProGlyValMetAspLeuValLeuLysArgArg210215220PheGlyPheIleLysIleAlaValGlnThrGlyAlaSerLeuValPro225230235240ThrIleSerPheGlyGluAsnGluLeuTyrGluGlnIleGluSerAsn245250255GluAsnSerLysLeuHisArgTrpGlnLysLysIleGlnHisAlaLeu260265270GlyPheThrMetProLeuPheHisGlyArgGlyValPheAsnTyrAsp275280285PheGlyLeuLeuProHisArgHisProIleTyrThrIleValGlyLys290295300ProIleProValProSerIleLysTyrGlyGlnThrLysAspGluIle305310315320IleArgGluLeuHisAspSerTyrMetHisAlaValGlnAspLeuTy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5200205ThrTyrLysThrValSerThrGlyProArgTyrIlePheGlyTyrHis210215220ProHisGlyValIleSerMetGlyGlyValGlyLeuPheAlaThrAsn225230235240SerLeuArgAsnGluProTyrThrProPheLeuLysPheLeuLysPro245250255PhePheHisAspSerSerLysGlyGluArgLeuPheProGlyLeuGly260265270AsnIlePheLeuLeuThrIleThrThrGlnPheAlaIleProPheTyr275280285ArgAspTyrLeuMetGlyLeuGlyValThrSerAlaSerAlaLysAsn290295300IleArgSerLeuIleSerAsnGlyAspAsnSerValCysIleValVal305310315320GlyGlyAlaGluGluSerLeuLeuAsnAsnMetValAlaLysHisAla325330335ArgValGlyTyrGlyTyrLysGluAsnGlnAspIleAsnGlySerAsp340345350AlaGluAspAspGlnProGluGluGluGluGlnGlnGlnGlnGlnGln355360365ProAsnGlySerValGluValAspLysLysThrThrLysGluValGly370375380GluLysThrSerSerGlnProSerLysArgGluValLysLeuIleLeu385390395400AsnLysArgLysGlyPheValLysLeuAlaIleGluLeuGlyAsnVal405410415AlaLeuValProThrPheAlaPheGlyGluAlaAspValTyrArgLeu420425430ValGlnProSerProThrSerMetMetTyrLysPheGlnLysTrpMet435440445LysGlyIlePheLeuPheThrIleProLeuPheSerAlaArgGlyVal450455460PheIleTyrAspTyrGlyLeuLeuProPheArgAsnProIleAsnIle465470475480CysValGlyLysProIleTyrIleProAlaGlyAlaLeuGlnGluTyr485490495LysGlnGlnHisProGluGluPheThrGluGluGluThrLysProPro500505510MetLysLysSerGlySerPheThrAspIlePheLysMetAsnGlyGlu515520525ThrProLysValSerThrIleLysThrLysIleProProAlaLeuLeu530535540AspLysTyrHisLysLeuTyrValAspGluLeuArgAsnValTyrGlu545550555560GluAsnLysHisLysPheGlyTyrGlyAspValGluPheSerIleVal565570575Glu<210>32<211>314<212>PRT<213>擬南芥(Arabidopsisthaliana)<400>32MetGlyGlySerArgGluPheArgAlaGluGluHisSerAsnGlnPhe151015HisSerIleIleAlaMetAlaIleTrpLeuGlyAlaIleHisPheAsn202530ValAlaLeuValLeuCysSerLeuIlePheLeuProProSerLeuSer354045LeuMetValLeuGlyLeuLeuSerLeuPheIlePheIleProIleAsp505560HisArgSerLysTyrGlyArgLysLeuAlaArgTyrIleCysLysHis65707580AlaCysAsnTyrPheProValSerLeuTyrValGluAspTyrGluAla859095PheGlnProAsnArgAlaTyrValPheGlyTyrGluProHisSerVal100105110LeuProIleGlyValValAlaLeuCysAspLeuThrGlyPheMetPro115120125IleProAsnIleLysValLeuAlaSerSerAlaIlePheTyrThrPro130135140PheLeuArgHisIleTrpThrTrpLeuGlyLeuThrAlaAlaSerArg145150155160LysAsnPheThrSerLeuLeuAspSerGlyTyrSerCysValLeuVal165170175ProGlyGlyValGlnGluThrPheHisMetGlnHisAspAlaGluAsn180185190ValPheLeuSerArgArgArgGlyPheValArgIleAlaMetGluGln195200205GlySerProLeuValProValPheCysPheGlyGlnAlaArgValTyr210215220LysTrpTrpLysProAspCysAspLeuTyrLeuLysLeuSerArgAla225230235240IleArgPheThrProIleCysPheTrpGlyValPheGlySerProLeu245250255ProCysArgGlnProMetHisValValValGlyLysProIleGluVal260265270ThrLysThrLeuGluProThrAspGluGluIleAlaLysPheHisGly275280285GlnTyrValGluAlaLeuArgAspLeuPheGluArgHisLysSerArg290295300ValGlyTyrAspLeuGluLeuLysIleLeu305310<210>33<211>14<212>PRT<213>人工的<220><223>Xaa是任何氨基酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(12)<223>Xaa是任何氨基酸<400>33AlaTyrValPheGlyTyrGluProHisSerValXaaProIle1510<210>34<211>7<212>PRT<213>人工的<220><223>肽<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(7)<223>Xaa是任何氨基酸<400>34PheXaaXaaProXaaTyrArg1權(quán)利要求1.分離的核酸分子，其包含編碼與選自SEQIDNO14，18，20，22，或24之一具有至少約50％同一性的多肽的核酸序列。2.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述多肽選自SEQIDNO14，18，20，22，或24。3.分離的核酸分子，其包含與選自SEQIDNO11，12，13，16，17，19，21，或23之一具有至少75％同一性的核酸序列。4.權(quán)利要求3的分離的核酸序列，其中所述核酸序列選自SEQIDNO11，12，13，16，17，19，21，或23。5.DNA構(gòu)建體，其包含含有在植物細胞中起作用的異源啟動子的表達盒，所述啟動子可操作地連接于權(quán)利要求1或權(quán)利要求3的核酸分子。6.權(quán)利要求5的DNA構(gòu)建體，還包含第二表達盒，其中所述第二表達盒包含在植物細胞中起作用的第二異源啟動子，所述啟動子可操作地連接于編碼二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的多肽的核酸。7.包含權(quán)利要求5的DNA構(gòu)建體的植物或種子。8.權(quán)利要求7的植物或種子，其中所述植物或種子選自玉米，大豆，canola，油菜，棉花，芝麻，亞麻，花生，向日葵，紅花，橄欖，或油棕。9.權(quán)利要求7的植物或種子，其中所述植物或種子被加工。10.權(quán)利要求9的植物或種子，其中所述植物或種子用于產(chǎn)生選自下組的產(chǎn)品飼料，食品，油或蛋白質(zhì)。11.包含權(quán)利要求6的DNA構(gòu)建體的植物或種子。12.權(quán)利要求11的植物或種子，其中所述植物或種子選自玉米，大豆，canola，油菜，棉花，芝麻，亞麻，花生，向日葵，紅花，橄欖，或油棕。13.權(quán)利要求11的植物或種子，其中所述植物或種子被加工。14.權(quán)利要求13的植物或種子，其中所述植物或種子用于產(chǎn)生選自飼料，食品，油或蛋白質(zhì)的產(chǎn)品。15.產(chǎn)生植物的方法，包括以下步驟(A)用權(quán)利要求5或6的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞；和，(B)將所述植物細胞再生成可育植物，其中與遺傳背景相似但缺乏所述DNA構(gòu)建體的植物的種子相比，所述可育植物具有改良的油。16.權(quán)利要求15的方法，其中與遺傳背景相似但缺乏所述DNA構(gòu)建體的植物的種子相比，所述植物提供具有增加油產(chǎn)量的種子。17.分離的多核苷酸，其編碼具有至少一種選自AYVFGYEPHSVXPI(SEQID33)或FXXPXYR(SEQIDNO34)的氨基酸基序的多肽。18.權(quán)利要求17的分離的多核苷酸，其中所述多肽具有二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性。全文摘要本發(fā)明涉及多肽及其相關核酸序列，以及在遺傳工程應用中純化，獲得，和使用這些分子的方法。更具體地，本發(fā)明涉及與三酰甘油在植物和真菌中的產(chǎn)生有關的多肽。文檔編號C12N9/10GK1671850SQ03818346公開日2005年9月21日申請日期2003年7月31日優(yōu)先權(quán)日2002年7月31日發(fā)明者凱瑟琳·D·拉迪扎貝爾,克里斯滕·A·貝內(nèi)特,尼古拉斯·W·瓦格納申請人:孟山都技術公司