專利名稱：增強(qiáng)植物提取物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)抑制植物提取物內(nèi)源蛋白質(zhì)成分的降解來(lái)增強(qiáng)植物提取物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法。該方法使用植物的遺傳改變減少蛋白酶介導(dǎo)的內(nèi)源蛋白質(zhì)的降解。
背景技術(shù)：
植物是公認(rèn)的營(yíng)養(yǎng)成分的優(yōu)秀來(lái)源，用于人類健康和動(dòng)物飼料。提高用于動(dòng)物飼料的植物飼料作物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法已有文獻(xiàn)記載并且一些方法在下面的段落中描述。
提高飼料植物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的一種方法是優(yōu)化它們的氨基酸平衡。這可以通過(guò)向這些植物中導(dǎo)入編碼高甲硫氨酸含量的蛋白質(zhì)的基因，該基因由強(qiáng)組成型啟動(dòng)子或者葉子啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。為了顯著改變豆類飼料的氨基酸平衡，外源蛋白質(zhì)應(yīng)該含有約15-25％的S-氨基酸，并且組成總?cè)~蛋白的5-10％。為了實(shí)現(xiàn)這些水平的蛋白質(zhì)積累，必須確保該基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的最大水平和該蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。
大多數(shù)關(guān)于營(yíng)養(yǎng)提高的共同努力集中于種子蛋白質(zhì)。因?yàn)橛衩缀推渌阮愖魑锊蝗菀邹D(zhuǎn)化，針對(duì)種子蛋白質(zhì)修飾的大多數(shù)工作包括試驗(yàn)轉(zhuǎn)基因煙草中被修飾的谷醇溶蛋白的穩(wěn)定性。還分析了轉(zhuǎn)基因煙草和矮牽?；ǚN子中含有賴氨酸的α玉米醇溶蛋白的合成(Williamson等，1988)。發(fā)現(xiàn)正常的和被修飾的蛋白質(zhì)都具有非常短的半衰期。
增加植物中特定氨基酸庫(kù)的一種方法是導(dǎo)入編碼植物中氨基酸生物合成途徑中關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶的細(xì)菌基因。一種編碼天冬氨酸激酶的細(xì)菌基因?qū)τ谫嚢彼岷吞K氨酸的反饋抑制脫敏化，該細(xì)菌基因被融合到β云扁豆蛋白基因啟動(dòng)子并導(dǎo)入到煙草中。轉(zhuǎn)基因煙草的種子顯示出游離蘇氨酸和甲硫氨酸的增加的水平(Galili，1995，Plant Cell.7899-906)。
盡管已經(jīng)開發(fā)了提高植物中氨基酸含量的方法，但是對(duì)飼料作物蛋白質(zhì)質(zhì)量的提高進(jìn)行了很少的努力。例如，Schoeder等，(199，Aust.J.PlantPhysiol.18495-505)向苜蓿中導(dǎo)入雞卵清蛋白基因(cDNA)，其被CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。然而，該轉(zhuǎn)基因苜蓿植物葉子中顯示出非常低的蛋白質(zhì)積累水平(0.005％)。還沒有確定可以解釋轉(zhuǎn)基因苜蓿葉子中該蛋白質(zhì)的如此低豐度的原因，但是該觀察表明在植物中導(dǎo)入外源高價(jià)值蛋白可能因?yàn)榈退奖磉_(dá)而不一定是提高植物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的適當(dāng)方法。
植物提取物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值部分依賴于其內(nèi)源蛋白質(zhì)的質(zhì)量。對(duì)于植物中產(chǎn)生的重組蛋白，穩(wěn)定內(nèi)源蛋白的產(chǎn)率與它們?cè)谥参镏蟹e累過(guò)程中和在植物提取物的加工過(guò)程中的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性密切相關(guān)。
有價(jià)值的蛋白質(zhì)生產(chǎn)的低產(chǎn)率的一個(gè)原因是可以降解蛋白質(zhì)的內(nèi)源性蛋白酶的蛋白水解活性。已知植物細(xì)胞具有一些特異性差的蛋白酶。在微酸性pH范圍內(nèi)具活性的葉子液泡蛋白酶尤其可顯著地改變?cè)S多蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性并減少植物提取物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
實(shí)際上，在從植物生產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)性提取物時(shí)兩個(gè)關(guān)鍵步驟中植物蛋白酶可以降解內(nèi)源性蛋白質(zhì)。降解可以1)植物內(nèi)發(fā)生，在蛋白質(zhì)積累過(guò)程中，和2)植物外發(fā)生，在植物提取物加工過(guò)程中細(xì)胞破碎的時(shí)候。后者可能具有主要的重要性，因?yàn)樵谠摬襟E中，細(xì)胞破碎從植物的所有部分和細(xì)胞隔室釋放一群蛋白酶。從植物葉子產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)性提取物的基本過(guò)程通常以碎裂植物生物量和將所得漿液壓縮產(chǎn)生綠色汁液開始。綠色汁液通常含有包括蛋白酶的各種蛋白質(zhì)和綠色色素物質(zhì)。如果在含有高水平的蛋白質(zhì)的植物加工中和之后這些水平相對(duì)較低，那么該加工是沒有用的。本發(fā)明集中于防止植物提取物加工過(guò)程中細(xì)胞破碎時(shí)發(fā)生植物外蛋白質(zhì)水解。
對(duì)于植物蛋白酶和它們的抑制劑之間的相互作用知之甚少，然而，沒有可獲得的含有低蛋白質(zhì)水解表型的植物品系?？朔参镏械鞍踪|(zhì)水解問(wèn)題的一個(gè)實(shí)際方法是使用適宜的導(dǎo)向信號(hào)將重組蛋白質(zhì)靶向細(xì)胞器和因此它們?cè)谔囟ǖ膩喖?xì)胞隔室中積累。因?yàn)樵摬呗孕枰揎椬畛醯牡鞍踪|(zhì)序列，所以其不適用于內(nèi)源性蛋白。
降低植物提取物中蛋白質(zhì)水解水平的另一方法是切割后“冷卻”(冰凍)植物材料。收獲時(shí)存在內(nèi)源性蛋白質(zhì)水解的相當(dāng)大的危險(xiǎn)(Michaud和Asselin，1995，J.ChromatographyA698263-279)。在苜蓿沉淀的收獲和制備過(guò)程中，例如，植物細(xì)胞被破碎然后將各種化合物釋放到介質(zhì)中，這些化合物包括蛋白酶，其可以改變內(nèi)源性有價(jià)值蛋白質(zhì)的完整性。
該降解問(wèn)題也可以通過(guò)將低分子量蛋白酶抑制劑包含在提取緩沖液中來(lái)解決(Michaud，1998，Anal.Chimica Acta372173-185)。然而，盡管該策略在小規(guī)模生產(chǎn)水平中有用，但是其不適于工業(yè)規(guī)模，也不適于食品和飼料市場(chǎng)，其中蛋白質(zhì)被大量生產(chǎn)。
從現(xiàn)有技術(shù)中知道植物中重組蛋白酶抑制劑的表達(dá)可負(fù)面地影響轉(zhuǎn)基因植物的正常發(fā)育，因?yàn)榈鞍酌竻⑴c各種代謝事件。在現(xiàn)有技術(shù)中還知道重組蛋白酶抑制劑可以被插入到植物中以改變植物的代謝從而得到期望的農(nóng)藝學(xué)特征。此外，在文獻(xiàn)中還建議植物中外源蛋白酶抑制劑的積累可以受到內(nèi)源性蛋白酶的蛋白水解活性的危害。抑制劑還可以在植物中大量積累，但是在提取時(shí)可被內(nèi)源性蛋白酶降解，如以前對(duì)OC-1半胱氨酸蛋白酶抑制劑所陳述的(Michaud等，2000，in Michaud Ed.，Austin TX，pp.195-200)。
考慮到植物是對(duì)內(nèi)源性蛋白酶的蛋白水解高度敏感的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的優(yōu)秀來(lái)源，非常期望開發(fā)在食物生產(chǎn)過(guò)程中保存植物和植物提取物的蛋白質(zhì)含量，并且不改變植物的正常新陳代謝或發(fā)育的有效方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供增加植物或其部分的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而不顯著改變植物或其部分的自然生理的方法，該方法包括使用植物或植物提取物的植物細(xì)胞被破碎時(shí)從植物或植物提取物釋放的抑制劑中和對(duì)至少一種內(nèi)源性蛋白的至少一種植物蛋白水解降解的活性或作用。該部分可以是所述植物的提取物或濃縮物?？梢岳斫飧鶕?jù)需要中和可以是部分或全部的。
在提取物或濃縮物制備過(guò)程中所述植物或植物部分的加工過(guò)程中，或者在該植物或植物部分的吞咽或消化過(guò)程中，所述植物細(xì)胞被破壞。
此外，可以通過(guò)遺傳改變植物導(dǎo)致完全或部分抑制細(xì)胞破碎發(fā)生時(shí)特定地與內(nèi)源性蛋白降解相關(guān)的至少一種蛋白水解反應(yīng)，得到對(duì)蛋白水解降解的中和。
植物蛋白酶不是在植物的生長(zhǎng)過(guò)程中被抑制以便保持該植物生長(zhǎng)過(guò)程中所述植物蛋白酶的活性和該植物的自然生理。
本發(fā)明的方法允許在人或動(dòng)物中吞咽或消化過(guò)程中內(nèi)源性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性增加預(yù)定的時(shí)間。例如，被動(dòng)物吞咽或消化的植物部分的降解和細(xì)胞破碎僅當(dāng)該部分到達(dá)胃或者腸時(shí)才可以完成，以便將具有更高營(yíng)養(yǎng)效果的完整蛋白質(zhì)或肽傳遞到該系統(tǒng)。
可以實(shí)施該方法以中和蛋白酶，所述蛋白酶選自半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶和多特異性的廣譜蛋白酶。
優(yōu)選地，通過(guò)遺傳學(xué)方法用含有可操作地與一種因子或肽連接的啟動(dòng)子的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物，該因子或肽導(dǎo)致細(xì)胞被裂解或破壞時(shí)蛋白水解降解的中和條件。例如，該中和因子可以連接到前導(dǎo)肽、信號(hào)肽或錨定肽或者將蛋白酶抑制劑導(dǎo)向或者錨定到細(xì)胞部分或者胞外隔室的蛋白質(zhì)，從而保護(hù)內(nèi)源性蛋白在植物提取物的加工過(guò)程中免受植物蛋白酶的活性影響。可以選擇細(xì)胞部分或胞外隔室以便在植物提取物的加工過(guò)程中細(xì)胞破碎時(shí)但不是在植物生長(zhǎng)過(guò)程中保護(hù)內(nèi)源蛋白免受植物蛋白酶的活性，以便在植物生長(zhǎng)過(guò)程中保持植物蛋白酶的活性。例如，細(xì)胞部分可以是選自線粒體、葉綠體、存儲(chǔ)液泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞溶膠的細(xì)胞器。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，可以使用蛋白酶抑制劑實(shí)施該方法，所述蛋白酶抑制劑選自抗體或其片段、有意義mRNA或反義mRNA、轉(zhuǎn)錄抑制劑或其調(diào)節(jié)劑、翻譯抑制劑或其調(diào)節(jié)劑、前導(dǎo)肽或信號(hào)肽抑制劑、蛋白酶活性的代謝獲得抑制劑、蛋白酶特異性蛋白酶，和導(dǎo)致所述蛋白酶分離到細(xì)胞器或細(xì)胞隔室的親和肽蛋白酶。表達(dá)盒可以包括表達(dá)載體，其中編碼序列被組成型、兩極的或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)節(jié)。表達(dá)載體也可以含有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其是組織特異性啟動(dòng)子、時(shí)間特異性啟動(dòng)子或傷口誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
優(yōu)選地，本發(fā)明方法在其上實(shí)施的植物或植物細(xì)胞來(lái)自苜?；蝰R鈴薯。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供在植物、植物組織、植物部分、植物細(xì)胞或植物提取物的加工過(guò)程中細(xì)胞破碎時(shí)通過(guò)防止內(nèi)源蛋白降解增加植物提取物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種方法，其中在細(xì)胞被破碎、裂解、吞咽或消化時(shí)通過(guò)中和蛋白酶介導(dǎo)的所述內(nèi)源蛋白的蛋白水解在植物或植物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)源蛋白降解的抑制。
本主題發(fā)明還涉及能夠表達(dá)高水平穩(wěn)定蛋白質(zhì)的植物和植物組織，該穩(wěn)定蛋白質(zhì)例如但不限于，作為植物細(xì)胞中的蛋白體被局部化。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種方法，其中蛋白水解的中和包括遺傳改變蛋白酶的功能性能，所述蛋白酶包括苜蓿和馬鈴薯蛋白酶。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供細(xì)胞破碎時(shí)保持植物內(nèi)源蛋白產(chǎn)率的植物或植物細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將認(rèn)識(shí)到，當(dāng)植物被例如，碾磨，或者在植物提取物或植物濃縮物的制備過(guò)程中時(shí)可以發(fā)生細(xì)胞破碎。當(dāng)植物或植物細(xì)胞在食用過(guò)程中被咀嚼或吞咽時(shí)也會(huì)發(fā)生細(xì)胞破碎。這通過(guò)抑制蛋白酶介導(dǎo)的所述內(nèi)源蛋白質(zhì)的蛋白水解進(jìn)行。優(yōu)選地，植物包括Medicagosativa(苜蓿)和馬鈴薯。
為了本發(fā)明的目的，定義下面的術(shù)語(yǔ)。
術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源蛋白質(zhì)”包括植物或植物細(xì)胞天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”或“啟動(dòng)子區(qū)”或“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列”指通常在編碼區(qū)的上游(5’)發(fā)現(xiàn)的DNA序列，其通過(guò)提供RNA聚合酶識(shí)別位點(diǎn)和/或在正確位點(diǎn)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄必需的其他因子控制信使RNA(mRNA)的產(chǎn)生而控制編碼序列的表達(dá)。如此處所預(yù)期的，啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)包括通過(guò)連接到各種調(diào)節(jié)序列、隨機(jī)或受控誘變，和加入或復(fù)制增強(qiáng)子序列衍生的各種啟動(dòng)子。此處公開的啟動(dòng)子區(qū)，和其生物學(xué)功能等價(jià)物負(fù)責(zé)當(dāng)基因序列作為適當(dāng)?shù)闹亟M載體導(dǎo)入宿主時(shí)驅(qū)動(dòng)基因序列在它們的控制下轉(zhuǎn)錄，如通過(guò)其產(chǎn)生mRNA的能力所證明的。
如此處所用的表達(dá)“植物細(xì)胞”或“植物部分”旨在表示或包括小植株、原生質(zhì)體、愈傷組織、根、塊莖、繁殖體、種子、幼苗、花粉、任何其他植物組織。
術(shù)語(yǔ)“蛋白酶”旨在表示將多肽直接或間接降解成更小的肽、片段或氨基酸，或者導(dǎo)致目的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性損失的形式的酶。
附圖簡(jiǎn)述

圖1闡明了粗提物中，pH 4.5和pH 7.5時(shí)內(nèi)源性蛋白酶降解苜蓿(A)或馬鈴薯(B)葉蛋白的時(shí)程。
圖2闡明了通過(guò)通常濃度的絲氨酸型PIs(A)或半胱氨酸型PIs(B)抑制苜蓿(品種Saranak)葉子蛋白酶對(duì)核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶-Bodipy-FL的降解。
圖3闡明了通過(guò)通常濃度的絲氨酸型PIs(A)或天冬氨酸和半胱氨酸型PIs(B)抑制馬鈴薯(品種Kennebec)葉子蛋白酶對(duì)核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶-Bodipy-FL的降解。
圖4闡明了在表達(dá)低(+)、高(++)或非常高(+++)水平的cdi mRNA的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物中測(cè)量的rubiscase活性。
實(shí)施本發(fā)明的方式本發(fā)明提供了通過(guò)在將要用于動(dòng)物飼料加工或者用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)和藥物的植物中表達(dá)蛋白酶抑制劑增加植物提取物的內(nèi)源蛋白質(zhì)含量的方法。
本發(fā)明提出了通過(guò)以遺傳學(xué)方法導(dǎo)入所選蛋白酶抑制劑以防止內(nèi)源植物蛋白質(zhì)的蛋白水解以提高飼料作物蛋白質(zhì)的新方法。
此外，本發(fā)明涉及生產(chǎn)植物品系的方法，該植物品系通過(guò)遺傳學(xué)方法改變以在植物提取物的加工過(guò)程中細(xì)胞破碎時(shí)抑制至少一種蛋白酶以保持目標(biāo)內(nèi)源蛋白的完整性。
在本發(fā)明的一個(gè)方面中，選擇特異表達(dá)和處理蛋白酶抑制劑的策略以不負(fù)面影響轉(zhuǎn)基因植物的代謝或發(fā)育。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶抑制劑可以靶向到與所靶向蛋白酶的天然定位不同的亞細(xì)胞隔室，以便保持植物生長(zhǎng)中該蛋白酶的重要活性，和在植物提取物加工過(guò)程中細(xì)胞破碎時(shí)促進(jìn)內(nèi)源蛋白的保護(hù)。
也可以通過(guò)抑制目標(biāo)植物中蛋白酶的產(chǎn)生或合成來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
備選地，通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或翻譯機(jī)制以防止蛋白酶得到其活性或活性潛能，可以進(jìn)行植物或植物組織中蛋白酶活性的抑制。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇特異表達(dá)和靶向蛋白酶抑制劑的策略以不明顯影響或保持植物的代謝和發(fā)育。這里應(yīng)該理解在細(xì)胞裂解時(shí)抑制蛋白酶對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的活性或作用的條件中植物或植物細(xì)胞的正常生理優(yōu)選不受影響。例如，但不限于，被基因修飾導(dǎo)致其中的蛋白酶抑制的植物將以與未修飾植物相同的速度生長(zhǎng)。另一方面，蛋白質(zhì)合成也不受導(dǎo)致植物或植物細(xì)胞中該蛋白酶抑制的條件的影響。
根據(jù)本發(fā)明，提供了植物細(xì)胞被破碎或裂解時(shí)，將提供導(dǎo)致蛋白酶的作用或活性被部分或完全抑制的條件的方法。優(yōu)選地，該方法利用了蛋白酶抑制劑，并使用序列遺傳改造植物或植物細(xì)胞，以保護(hù)這些植物或植物細(xì)胞中產(chǎn)生的內(nèi)源蛋白免于蛋白酶的活性。抑制根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶活性的另一條件是抑制劑直接結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)以避免蛋白酶接近切割位點(diǎn)，例如，直接結(jié)合蛋白酶以阻礙其作用或活性。
備選地，可以在改變蛋白酶自身的專一性或者細(xì)胞裂解過(guò)程中導(dǎo)致蛋白酶對(duì)目標(biāo)營(yíng)養(yǎng)蛋白的專一性改變的條件下進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶抑制。該蛋白酶的專一性改變將優(yōu)選地不影響其在植物或植物細(xì)胞中天然存在的活性。
根據(jù)本發(fā)明，提供了通過(guò)增強(qiáng)植物或植物提取物蛋白質(zhì)含量提高它們的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法。更具體地，通過(guò)防止植物蛋白酶催化的內(nèi)源蛋白的降解提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是提供增加植物的飼料質(zhì)量的方法，該方法包括將植物或植物組織用編碼至少一種蛋白酶抑制劑，或者在細(xì)胞被破碎或裂解時(shí)將導(dǎo)致中和蛋白酶的作用或活性的條件的蛋白酶的多核苷酸分子轉(zhuǎn)化。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了增加植物或植物細(xì)胞中內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)蛋白的回收產(chǎn)率的方法，該方法包括得到表達(dá)一種或多種抑制劑的植物或植物細(xì)胞的步驟，該抑制劑靶向參與內(nèi)源蛋白質(zhì)降解的內(nèi)源植物蛋白酶。
廣義上，該方法可由以下各項(xiàng)組成a)靶向特定亞細(xì)胞隔室中的蛋白酶抑制劑或b)將兩種蛋白酶抑制劑靶向到分開的亞細(xì)胞隔室中或c)靶向相同亞細(xì)胞隔室中的兩種蛋白酶抑制劑。兩種以上的蛋白酶抑制劑也可以在一種或幾種亞細(xì)胞隔室中表達(dá)。亞細(xì)胞隔室可選自細(xì)胞溶膠、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞外隔室、線粒體、葉綠體、質(zhì)外體和存儲(chǔ)液泡。
蛋白酶抑制劑的靶向策略的選擇是關(guān)鍵的，因?yàn)槠淇赏ㄟ^(guò)改變內(nèi)源蛋白酶的重要功能顯著影響轉(zhuǎn)基因植物的代謝或發(fā)育。例如，豌豆球蛋白(vicillin)，其是通過(guò)使用保留信號(hào)在苜蓿細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中表達(dá)的液泡蛋白(Wandelt等，1992，Plant J.2181-192)。
在現(xiàn)有技術(shù)中描述了將外源蛋白質(zhì)靶向線粒體和葉綠體的其他實(shí)例以及植物中外源蛋白的液泡靶向的實(shí)例(Di Sansebastiano等，1998，Plant J.15449-457)。
從蛋白質(zhì)除去靶向肽可導(dǎo)致胞液蛋白，增加到外源蛋白質(zhì)的分泌肽將促進(jìn)該蛋白質(zhì)的分泌。外源蛋白質(zhì)的天然分泌肽可通過(guò)植物分泌機(jī)器正確地加工。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，使用植物或植物細(xì)胞可以進(jìn)行本發(fā)明，該植物或植物細(xì)胞含有編碼可操作地連接到啟動(dòng)子的抑制劑的DNA序列并且該序列任選含有靶向肽融合，該靶向肽將抑制劑定位于植物或植物細(xì)胞的特定亞細(xì)胞或細(xì)胞外隔室中。
備選地，可以在通過(guò)兩種分離的植物的雜交(cross-over)得到的植物或植物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)，這兩種植物都含有可操作地連接到特定啟動(dòng)子的特定蛋白酶抑制劑并且該蛋白酶抑制劑任選地含有特定靶向肽的融合以將該抑制劑定位于植物或植物細(xì)胞的特定亞細(xì)胞或細(xì)胞外隔室中。
編碼強(qiáng)蛋白酶抑制劑的基因可導(dǎo)入植物的基因組中以減少植物中蛋白水解活性，這對(duì)于用于動(dòng)物飼料的植物內(nèi)源蛋白質(zhì)含量的增加是理想的?？梢栽谲俎；蝰R鈴薯中重組產(chǎn)生的蛋白酶抑制劑的實(shí)例包括但不限于抑制植物的半胱氨酸蛋白酶的植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑OC1、OCII和TMC-8和抑制植物的絲氨酸蛋白酶的人絲氨酸蛋白酶抑制劑α-1-抗-胰凝乳蛋白酶(AACT)?？梢栽隈R鈴薯植株中表達(dá)的蛋白酶抑制劑的一個(gè)實(shí)例是抑制植物天冬氨酸蛋白酶的天冬氨酸型蛋白酶抑制劑(CD-I)。
本發(fā)明也可以使用其他類型的蛋白酶抑制劑，它們可選自但不限于，對(duì)蛋白酶或蛋白酶前肽特異的抗體或抗體片段。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，可以在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生阻止蛋白酶正?；钚缘膶?duì)該蛋白酶特異的抗體或其片段。該抑制方法依賴于抗體結(jié)合其植物細(xì)胞中抗原的能力。所以，需要該植物能夠產(chǎn)生抗體或其片段，并且這可以通過(guò)用產(chǎn)生完全的和活性抗體所需的一種或多種轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化該植物實(shí)現(xiàn)。在轉(zhuǎn)基因植物中可以表達(dá)不同抗體，這些抗體包括免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)、單鏈抗體片段(ScFv)、片段抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Fab)，和重鏈可變結(jié)構(gòu)域。
在本發(fā)明另一方面，抗體或其片段可以靶向到與被靶向蛋白的天然定位不同的亞細(xì)胞隔室以便在植物的生長(zhǎng)過(guò)程中保存該蛋白酶的重要活性，并在提取和植物食物生產(chǎn)時(shí)促進(jìn)對(duì)內(nèi)源蛋白的保護(hù)。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，通過(guò)產(chǎn)生基因修飾的植物或植物細(xì)胞部分或完全防止蛋白水解。在植物收獲、植物儲(chǔ)存，或甚至人或動(dòng)物的吞咽或消化的整個(gè)過(guò)程中，在基因修飾的植物或產(chǎn)生的植物細(xì)胞中可特別允許蛋白質(zhì)降解受蛋白酶抑制。
如此處所闡明的，為了實(shí)施本發(fā)明方法，植物可以被基因修飾以表達(dá)至少一種重組蛋白酶抑制劑，該抑制劑基本上針對(duì)絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，兩種蛋白酶抑制劑基因可以共同插入到植物基因組中、與此處描述的相同或不同的亞細(xì)胞隔室中。
可以使用不同策略改造植物。例如，可以通過(guò)，非限制地，將蛋白酶抑制劑編碼基因插入到植物的基因組中進(jìn)行工程化。
此外，本發(fā)明可以通過(guò)使用組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制蛋白酶抑制劑的表達(dá)進(jìn)行。例如，通過(guò)收獲前加入誘導(dǎo)劑可以僅在收獲時(shí)誘導(dǎo)抑制劑的表達(dá)。表達(dá)一種或幾種蛋白酶抑制劑的植物可以與表達(dá)一種或多種蛋白酶抑制劑的植物雜交。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提出了使用各種啟動(dòng)子控制蛋白酶抑制劑的表達(dá)。可以用于所提出的方法中的啟動(dòng)子為，但不限于組成型的、誘導(dǎo)型的、病毒的、合成的、發(fā)育-特異的、組織-特異的、時(shí)間上被調(diào)節(jié)的、空間上被調(diào)節(jié)的，和空間-時(shí)間上被調(diào)節(jié)的。
可用于實(shí)施本發(fā)明的啟動(dòng)子可以應(yīng)答外源誘導(dǎo)劑的存在或不存在而被誘導(dǎo)，從而能夠在與蛋白質(zhì)相同的時(shí)間表達(dá)抑制劑，從而在整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中減少了所述蛋白質(zhì)被植物蛋白酶降解。可以根據(jù)本發(fā)明使用的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可選自，但不限于傷口-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、營(yíng)養(yǎng)-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、冷-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。例如，但不限制，本發(fā)明誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以包括來(lái)自Medicacosativa(苜蓿)基因組的亞硝酸鹽還原酶啟動(dòng)子(WO 01/25454)。也可以使用重金屬-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如35S CaMV-驅(qū)動(dòng)的啟動(dòng)子，已知存在Cd2+時(shí)該啟動(dòng)子控制煙草中β-葡糖醛酸糖苷酶的表達(dá)(Brandle等，1993，Genome36255-260)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的另一個(gè)實(shí)例是低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其天然地控制擬南芥(Arabidopsis thaliana)的cor15a基因的表達(dá)(Dordrecht，1994，PlantMol.Biol.24701-713)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，設(shè)計(jì)表達(dá)載體，其將被插入到植物或植物細(xì)胞中以抑制蛋白酶活性，該表達(dá)載體可以含有編碼兩種蛋白酶抑制劑的兩條DNA序列。這兩條DNA序列通?？梢酝ㄟ^(guò)唯一的兩極啟動(dòng)子可操作地連接。
根據(jù)本發(fā)明，可以使用不同轉(zhuǎn)化方法將蛋白酶抑制劑基因插入各種植物的基因組中。這包括微粒轟擊、組織電穿孔、微注射、使用聚乙二醇(PEG)將DNA直接轉(zhuǎn)移到原生質(zhì)體中和碳化硅“晶須(whisker)”方法。所有這些方法都可以從現(xiàn)有技術(shù)中知道。
本發(fā)明范圍中預(yù)期的植物包括飼料作物植物，包括，例如，苜蓿、三葉草、玉米青貯、高梁和其他豆科作物，這些植物被轉(zhuǎn)化而表達(dá)本發(fā)明的蛋白。
本發(fā)明范圍內(nèi)還預(yù)期的為用于人或動(dòng)物消費(fèi)的植物，它們已經(jīng)被轉(zhuǎn)化而表達(dá)蛋白質(zhì)或RNA，所述蛋白質(zhì)或RNA增強(qiáng)植物的蛋白質(zhì)質(zhì)量以提高營(yíng)養(yǎng)。
可用于實(shí)施本發(fā)明的一種植物是苜蓿Medicago sativa。苜蓿被認(rèn)為是世界上最重要的種植性飼料作物并且由于其廣泛生長(zhǎng)而被稱為“飼料作物皇后”，具有維生素和礦物質(zhì)的完美平衡，高產(chǎn)，是生物氮固定的優(yōu)秀來(lái)源，并且其作為良好的蜜蜂花蜜來(lái)源。已經(jīng)針對(duì)飼料質(zhì)量和植物性能對(duì)苜蓿育種多年。
通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明可以適當(dāng)?shù)乇３志哂懈郀I(yíng)養(yǎng)價(jià)值的飼料植物、植物組織或植物提取物的不同蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和完整性。例如，但不限制，核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶是賦予植物適當(dāng)?shù)母郀I(yíng)養(yǎng)價(jià)值的蛋白質(zhì)之一。
實(shí)施例通過(guò)參考下面的實(shí)施例將更容易理解本發(fā)明，這些實(shí)施例用于闡明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1馬鈴薯和苜蓿葉子提取物中蛋白質(zhì)的降解和保護(hù)為了建立鑒定植物提取物中靶蛋白酶和選擇有效抗這些蛋白酶的抑制劑的基本原理，使用植物中最豐富的蛋白質(zhì)核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶)作為底物監(jiān)測(cè)苜蓿和馬鈴薯葉組織中蛋白水解活性。
圖1闡明了苜蓿(A)和馬鈴薯(B)葉子提取物中內(nèi)源蛋白質(zhì)的命運(yùn)，表明在低pH提取后它們有限的穩(wěn)定性。葉樣品(來(lái)自頂點(diǎn)的第一到第四片葉子)在液氮中研磨。在10mM β-巰基乙醇的存在下在50mM Tris-HCl(pH7.5)或0.1M檸檬酸鹽-磷酸鹽(pH 4.5)中提取蛋白質(zhì)(1∶3 w/v)?？扇苄缘鞍踪|(zhì)提取物在4℃攪拌10分鐘，并以18000g離心10分鐘?；厥丈锨逡翰⒂肂radford’s方法(Bradford，1976，Anal Biochem.72248-254)確定蛋白質(zhì)濃度。將Tris-HCl緩沖液中的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)到1mg/ml的終濃度，而檸檬酸鹽-磷酸鹽中的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)到0.5mg/ml的終濃度。通過(guò)25℃溫育提取物進(jìn)行蛋白水解分析。反應(yīng)開始后在不同時(shí)間吸取70μl等分試樣，立即與30μl變性電泳緩沖液(200mM Tris-HCl pH 8.8，10％(v/v)β-巰基乙醇，2％(w/v)SDS，10％(v/v)甘油)混合，并在95℃加熱5分鐘。然后將7μg變性蛋白加到標(biāo)準(zhǔn)10％SDS-PAGE凝膠上并通過(guò)考馬斯染色。圖1表明僅僅幾小時(shí)后，例如，大的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的52kDa亞單位(箭頭)的顯著部分在pH 4.0和pH 7.5下被內(nèi)源蛋白酶降解。
為了監(jiān)控診斷性PIs和植物重組PIs對(duì)馬鈴薯葉子和苜蓿提取物的蛋白酶活性的影響，通過(guò)熒光分析法確定針對(duì)核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的總蛋白酶活性(稱為rubiscase活性)，使用偶聯(lián)琥珀酰酯熒光團(tuán)，BodipyFL，SE(Molecular Probes，OR，USA)的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶作為底物。按照供應(yīng)商的使用說(shuō)明進(jìn)行核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶與BodipyFL，SE的偶聯(lián)。植物組織在液氮中磨碎并在含有2mM MgCl2，1mM DTT和1％(w/v)PVPP的100mM Hepes(pH 7.5)緩沖液中提取(1∶3 w/v)。可溶的提取物在4℃以12000rpm離心15分鐘。除去上清液并將其在用由50mMHepes(pH 7.5)(中性反應(yīng)緩沖液)或0.15M乙酸鉀(pH 5.5)(酸性反應(yīng)緩沖液)組成的反應(yīng)緩沖液預(yù)平衡的Sephadex G-25柱上透析。將50μl植物提取物在20℃下與5μL反應(yīng)緩沖液(對(duì)照)、5μL DMSO、5μL甲醇、5μlSBTI(1mg/ml)、5μL BBTI(1mg/ml)、5μL抑肽酶(1mM)、5μLα-1抗胰蛋白酶(1mg/ml)、5μLα-1抗胰凝乳蛋白酶(1mg/ml)、5μL抑凝乳蛋白酶素(6mM)、5μL TPCK(20mg/ml)、5μL TLCK(20mg/ml)、5μLPMC8、5μL E-64(100mM)、5μL抑胃肽(1mM)、5μL GST-CCII或5μL GST-CDI預(yù)溫育20分鐘。所有診斷性PIs都獲自Sigma-Aldrich(St-Louis，USA)。GST-CDI和GST-CCII作為重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌(Escherichia coli)中表達(dá)并在親和谷胱甘肽柱上純化(Brunelle等，1999，Arch.Insect Biochem.Physiol.4288-98)。在30℃用核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶-Bodipy-FL作為底物進(jìn)行熒光測(cè)定分析。將2μg核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶-Bodipy-FL加入到反應(yīng)緩沖液中并用中性(用DMSO、甲醇、SBTI、BBTI、抑肽酶、抗胰蛋白酶、抗胰凝乳蛋白酶、抑凝乳蛋白酶素、PMSF、TPCK、TLCK分析)或酸性(用PMC8、E-64、抑胃肽、GST-CCII、GST-CDI分析)反應(yīng)緩沖液使體積達(dá)到100μl。使用Fluostar Polastar Galaxy熒光計(jì)(BMG LabTechnologies)在5000秒內(nèi)測(cè)量熒光強(qiáng)度100次，激發(fā)和發(fā)射濾光器分別為485nm和520nm。蛋白酶活性(以每秒熒光單位表達(dá))相應(yīng)于發(fā)射曲線的斜率。如在圖2(苜蓿)和3(馬鈴薯)中所示的，當(dāng)加入診斷性蛋白酶抑制劑時(shí)苜蓿和馬鈴薯葉子蛋白酶對(duì)核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的水解被顯著延遲，指出一些蛋白酶組可作為如下策略開發(fā)的有趣目標(biāo)，這些策略旨在通過(guò)抑制植物內(nèi)源蛋白酶保護(hù)內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)性蛋白完整性。這些數(shù)據(jù)還表明一種蛋白酶(或者蛋白酶組)的抑制足夠保護(hù)粗提物中的蛋白質(zhì)的顯著部分，盡管介質(zhì)中存在其他(不敏感的)蛋白酶。胰凝乳蛋白酶的抑制劑(TPCK，抑凝乳蛋白酶素，α1-抗胰凝乳蛋白酶)、胰蛋白酶抑制劑(TLCK，α1-抗胰蛋白酶)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑(CCII)和天冬氨酸蛋白酶抑制劑(抑胃肽)尤其顯示出有趣的保護(hù)效果，導(dǎo)致rubiscase活性率減少約15-40％。
實(shí)施例II馬鈴薯中組織蛋白酶D蛋白酶的異位表達(dá)對(duì)內(nèi)源蛋白(例如核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶)穩(wěn)定性的影響為了評(píng)定植物中重組蛋白酶抑制劑的異位表達(dá)對(duì)提取時(shí)內(nèi)源蛋白酶活性的影響(ex vitro)，將來(lái)自馬鈴薯的一種組織蛋白酶D抑制劑—馬鈴薯CDI(Werner等1993，Plant Physiol.1031473)整合到表達(dá)載體中并穩(wěn)定表達(dá)到馬鈴薯(品種Kennebec)中表達(dá)，馬鈴薯CDI處于花椰菜花葉病毒35S(CaMV 35S)啟動(dòng)子(CD系)的控制下。編碼馬鈴薯CDI的DNA序列從表達(dá)載體pGEX-3X/CDI(Brunelle等1999，Arch.Insect Biochem.Physiol.4288-98)通過(guò)BamHI和EcoRI消化分離，并亞克隆到商業(yè)載體pCambia 2300(CAMBIA，Canberra，澳大利亞)的BamHI和EcoRI克隆位點(diǎn)之間。CaMV35S啟動(dòng)子從商業(yè)性質(zhì)粒pBI-121(Clontech，Palo Alto，CA)使用BamHI/SalI處理分離，然后連接到含有cdi轉(zhuǎn)基因的pCambia構(gòu)建體的BamHI和SalI克隆位點(diǎn)之間。還通過(guò)整合無(wú)啟動(dòng)子的cdi轉(zhuǎn)基因設(shè)計(jì)了表達(dá)選擇標(biāo)記新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTii)但是無(wú)CDI的轉(zhuǎn)基因?qū)φ?SPCD系)。馬鈴薯的Axenically生長(zhǎng)的小植株(Solanum tuberosum L.品種Kennebec)用作基因轉(zhuǎn)化的來(lái)源材料。小植株在補(bǔ)加0.8％(w/v)瓊脂(Difco，Detroit，MI)和3％(w/v)蔗糖的MS增殖培養(yǎng)基(Murashige和Skoog 1962，Physiol.Plant15473-497)上保持，該培養(yǎng)基被置于22℃，光強(qiáng)度為60μmol.m-2.s-1的組織培養(yǎng)室中，通過(guò)冷熒光燈提供16小時(shí)/天的光周期。直徑約10mm的葉盤用如Wenzler等(1989，Plant Sci.6379-85)描述的細(xì)菌載體根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，只是用頭孢噻肟代替羧芐青霉素作為根癌農(nóng)桿菌生長(zhǎng)對(duì)照。將再生的根轉(zhuǎn)移到含有卡那霉素和頭孢噻肟的選擇培養(yǎng)基上，用于根再生和小植株繁殖。為了馴化，將小植株生長(zhǎng)室中14天，處于24℃/21℃白天/黑夜溫度周期、12-h L:D光周期、200μmol m-2.s-1光強(qiáng)度和60％的相對(duì)濕度下，之后轉(zhuǎn)移到標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)條件下的溫室中。根據(jù)Edwards等(1991，Nuc.Acids Res.191349)，使用從約30cm馬鈴薯植株的第4、5和6片葉子(從頂端)提取的DNA，通過(guò)PCR證實(shí)卡那霉素抗性植株中nptii(標(biāo)記)轉(zhuǎn)基因的整合。如Logemann等(1987，AnalBiochem.16316-20)所描述的，使用從nptii轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的第4、5和6片葉子提取的總RNA，通過(guò)RT-PCR和northern印跡監(jiān)控轉(zhuǎn)基因品系中cdi轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
為了監(jiān)控馬鈴薯中CDI的異位表達(dá)對(duì)內(nèi)源蛋白酶活性的影響，使用核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶-Bodipy-FL作為底物(見上面)，通過(guò)熒光測(cè)定法確定抗核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的總蛋白酶活性。在0.15M乙酸鉀(pH5.5)(1∶3 w/v)中從對(duì)照(SPCD品系)或表達(dá)cdi(CD品系)的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的葉子(從頂端的第四片葉子)提取可溶性蛋白質(zhì)。將50μl可溶蛋白質(zhì)提取物在30℃存在20mM L-半胱氨酸下與2μg核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶-Bodipy(100μl提取緩沖液中)溫育。如圖4中所示，與對(duì)照相比，從表達(dá)高水平重組cdi mRNA的轉(zhuǎn)基因品系(例如，克隆21A)提取的葉蛋白對(duì)核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶-Bodipy-FL的降解被顯著降低(Fisher′s LSD檢驗(yàn)(p＜0.05)。更精確地，與沒有CDI的轉(zhuǎn)基因?qū)φ?SP4、SP7和SP12)相比，在分析條件下rubiscase活性的抑制率達(dá)到約40％，清楚地表明CDI-表達(dá)品系的抗核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶降低的“蛋白水解能力”。
將CDI隔離到馬鈴薯葉細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中不顯著影響轉(zhuǎn)基因體(transgenics)的生長(zhǎng)和發(fā)育，表明假定的目標(biāo)天冬氨酸蛋白酶在體內(nèi)不被抑制劑顯著地或者負(fù)影響。另一方面，圖4中給出的數(shù)據(jù)表明在收獲、勻漿和/或提取步驟中，馬鈴薯重組CDI可以快速抑制內(nèi)源蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的水解，導(dǎo)致大部分葉蛋白核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的顯著保護(hù)。
實(shí)施例III苜蓿中通過(guò)蛋白酶抑制劑的異位表達(dá)保護(hù)內(nèi)源蛋白質(zhì)如上所描述的，苜蓿葉細(xì)胞含有大量特異性差的蛋白酶，它們?cè)谔崛∵^(guò)程中釋放到介質(zhì)中。類似地，Wandelt和同事(1992，Plant J.2181-192)證明蠶豆球蛋白——蠶豆(Vicia faba)的一種液泡種子儲(chǔ)存蛋白質(zhì)——當(dāng)指導(dǎo)其通常積累于液泡中的肽信號(hào)線路受損時(shí)，在苜蓿葉細(xì)胞中大量積累，清楚地表明該植物的液泡蛋白酶對(duì)葉子中表達(dá)的異源蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性的潛在負(fù)影響。現(xiàn)在通常認(rèn)為植物葉細(xì)胞中非特異性蛋白水解活性的一個(gè)重要來(lái)源在酸性到弱酸性pH范圍內(nèi)有活性的蛋白酶的原因，這些蛋白酶通常屬于蛋白水解酶的半胱氨酸和天冬氨酸類(Callis，1995，Plant Cell7845-857)。從我們上面給出的數(shù)據(jù)可明顯發(fā)現(xiàn)不同類型的蛋白酶——例如抑凝乳蛋白酶素-敏感蛋白酶——也可以對(duì)有用的內(nèi)源蛋白質(zhì)具有重要影響(見圖2)。由于通常在細(xì)胞隔室而不是細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)特異性差的蛋白酶，所以具有抗這些蛋白酶活性的PIs(例如α1-抗凝乳蛋白酶和CCII)可以在葉細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)隔室中表達(dá)而不在體內(nèi)負(fù)面地干擾植物蛋白酶，但是然后在回收過(guò)程中細(xì)胞破碎后易于抗這些相同的酶。
實(shí)踐中，可以使用的策略包括開發(fā)表達(dá)適當(dāng)PI的飼料植物(例如苜蓿)的轉(zhuǎn)基因品系，然后使用該品系產(chǎn)生收獲后，通過(guò)保護(hù)內(nèi)源蛋白質(zhì)免受內(nèi)源蛋白酶的影響而保存更高蛋白質(zhì)含量的動(dòng)物飼料。
盡管結(jié)合其特定實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)該理解本發(fā)明能夠進(jìn)一步修改并且該申請(qǐng)旨在覆蓋通常按照本發(fā)明的原理對(duì)本發(fā)明的任何變化、應(yīng)用，和改變，這些變化、應(yīng)用和改變包括在本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的公知或習(xí)慣實(shí)踐內(nèi)可以得到的與本公開的背離，和可以應(yīng)用于此前提出的基本特征，并且如在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)給出的。
權(quán)利要求
1.增加植物或其部分的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值且包括不顯著改變所述植物或其部分的自然生理的方法，該方法包括用植物細(xì)胞被破碎時(shí)從所述植物或植物提取物釋放的抑制劑中和至少一種植物蛋白水解降解對(duì)至少一種內(nèi)源蛋白質(zhì)的活性或作用。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述部分是所述植物的提取物或濃縮物。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述中和是部分或完全的。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述植物細(xì)胞在提取物或濃縮物的制備過(guò)程中所述植物或植物部分的加工過(guò)程中，或者所述植物或植物部分的吞咽或消化過(guò)程中被破碎。
5.權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)遺傳改變所述植物而導(dǎo)致當(dāng)細(xì)胞破碎發(fā)生時(shí)完全或部分抑制至少一種特異參與內(nèi)源蛋白質(zhì)降解的蛋白水解反應(yīng)的條件來(lái)獲得所述蛋白水解降解的中和。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述蛋白水解反應(yīng)通過(guò)蛋白酶進(jìn)行。
7.權(quán)利要求6的方法，其中在所述植物或植物提取物的所述加工過(guò)程中所述細(xì)胞破碎發(fā)生時(shí)而不是在所述植物的生長(zhǎng)過(guò)程中所述植物蛋白酶被抑制，以便保持生長(zhǎng)過(guò)程中所述植物蛋白酶的活性和該植物的自然生理。
8.權(quán)利要求1的方法，該方法將在人或動(dòng)物的吞咽或消化過(guò)程中所述內(nèi)源蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性增加預(yù)定的時(shí)間。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述中和在選自以下各項(xiàng)的蛋白酶上進(jìn)行半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶，和多特異性的廣譜蛋白酶。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述植物用含有與一種因子或肽可操作地連接的啟動(dòng)子的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化，所述因子或肽導(dǎo)致所述蛋白水解降解的中和。
11.權(quán)利要求10的方法，其包括將所述因子連接到前導(dǎo)肽、信號(hào)肽或錨定肽或?qū)⑺龅鞍酌敢种苿?dǎo)向或者錨定到細(xì)胞部分或者胞外隔室的蛋白質(zhì)，從而保護(hù)所述內(nèi)源性蛋白在所述植物提取物的加工過(guò)程中免受植物蛋白酶的活性影響。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述因子是蛋白酶抑制劑。
13.權(quán)利要求11的方法，其中選擇所述細(xì)胞部分或細(xì)胞外隔室以在所述植物提取物加工過(guò)程中細(xì)胞破碎時(shí)但不是該植物的生長(zhǎng)過(guò)程中保護(hù)所述內(nèi)源蛋白免受植物蛋白酶的活性影響，以便在該植物的生長(zhǎng)過(guò)程中保持所述植物蛋白酶的活性。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述細(xì)胞部分是選自線粒體、葉綠體、儲(chǔ)存液泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞溶膠的細(xì)胞器。
15.權(quán)利要求12的方法，其中所述蛋白酶抑制劑選自由以下各項(xiàng)組成的組抗體或其片段、有意義mRNA或反義mRNA、轉(zhuǎn)錄抑制劑或其調(diào)節(jié)劑、翻譯抑制劑或其調(diào)節(jié)劑、前導(dǎo)肽或信號(hào)肽抑制劑、蛋白酶活性的代謝獲得抑制劑、蛋白酶特異性蛋白酶，和導(dǎo)致所述蛋白酶分離到細(xì)胞器或細(xì)胞隔室的親和肽蛋白酶。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述植物是苜?；蝰R鈴薯。
17.權(quán)利要求10的方法，其中所述表達(dá)盒含有表達(dá)載體，其中編碼序列被組成型、兩極的或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)節(jié)。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是組織-特異性啟動(dòng)子、時(shí)間-特異性啟動(dòng)子或傷口誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
全文摘要
本發(fā)明涉及增加從植物細(xì)胞或植物回收的內(nèi)源蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性的方法。通過(guò)中和粗提物中的蛋白水解，尤其通過(guò)使用表達(dá)重組蛋白酶抑制劑或者活性改變的特定目標(biāo)蛋白酶的通過(guò)遺傳學(xué)改變的植物細(xì)胞或植物進(jìn)行內(nèi)源蛋白質(zhì)的內(nèi)源蛋白完整性的保持。
文檔編號(hào)C12N9/50GK1671849SQ03818266
公開日2005年9月21日 申請(qǐng)日期2003年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月29日
發(fā)明者D·米肖, D·里瓦拉, R·安格諾, S·特雷龐尼, L-P·韋齊納, F·布呂內(nèi)勒 申請(qǐng)人:拉瓦勒大學(xué)