專利名稱：植物生長發(fā)育相關(guān)蛋白abp7及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與植物生長發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)及其編碼基因與應(yīng)用，特別涉及一種來源于玉米的與植物生長發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)ABP7及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
玉米是分布最廣泛的糧食作物之一，產(chǎn)量居世界糧食作物的首位。中國的玉米產(chǎn)量僅次于美國居世界第二位。近年來，我國玉米的主要用途是用于生產(chǎn)配合飼料和工業(yè)原料，并且這種需求正在快速增長。據(jù)預測，2020年我國對玉米的需求將達到2. 14億噸，如果仍然按照目前的生產(chǎn)水平發(fā)展，屆時國內(nèi)的玉米生產(chǎn)能力只能達到I. 63億噸，有5100萬噸的缺口。鑒于以上情況，在土地資源有限的前提下，發(fā)展玉米生產(chǎn)，培育具有優(yōu)良性狀的玉米新品種成為我國糧食產(chǎn)業(yè)的主要任務(wù)之一。植物的生長發(fā)育和形態(tài)建成是一個十分復雜的過程，其歸根結(jié)底是由基因控制的，是基因的選擇性表達及大分子的修飾和更新的過程。以下僅舉幾個例子說明基因?qū)χ参锷L發(fā)育的調(diào)節(jié)作用一、植物側(cè)根的形成和發(fā)育相關(guān)基因植物側(cè)根的形成被大量的基因所調(diào)控，其中，ALF4基因編碼一種未知功能的蛋白， 這種蛋白被認為可以使中柱鞘細胞有能力進行側(cè)根的起始；slr突變體有正常的主根而沒有側(cè)根，SLR基因編碼IAA14 ( 一種轉(zhuǎn)錄抑制蛋白)，它在側(cè)根起始方面具有特殊作用。近年的研究表明，兩類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白生長素反應(yīng)因子(ARF)和Aux/IAA在生長素控制的植物側(cè)根發(fā)育中起著重要的作用。生長素促進Aux/IAA蛋白與SCFtiki復合體之間的相互作用，從而促進Aux/IAA的泛素化和降解，這樣就讓ARF在生長素誘導的轉(zhuǎn)錄中起作用。NAC基因家族中的新成員NACl能受生長素的誘導，可調(diào)節(jié)生長素信號轉(zhuǎn)導而促進側(cè)根的發(fā)育。NACl 是一個轉(zhuǎn)錄激活因子，由一個N末端保守的NAC區(qū)域和C末端激活區(qū)域組成，NAC區(qū)域能與 DNA結(jié)合。NACl能激活兩個下游的生長素反應(yīng)基因(DB和AIR3)的表達。轉(zhuǎn)基因植物(表達反義NACl cDNA)表現(xiàn)為側(cè)根形成減少，而且TIRl誘導的側(cè)根發(fā)育能被反義NACl cDNA 的表達所阻斷，NACl的超表達能恢復生長素反應(yīng)突變體tirl的側(cè)根形成，表明NAC I在 TIRl的下游起作用。目前的研究表明，二十余種基因調(diào)控側(cè)根的發(fā)育，其中包括ABAl、ABII、ABI4、 ABI5、ALF、AUXl、AXRl、AXR4等，但是人們目前對植物調(diào)控這些基因的機制仍不十分清楚。二、控制花分生組織的基因現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有一小群基因?qū)ǖ姆稚M織的發(fā)生是必須的。當它們突變后，莖或類莖的結(jié)構(gòu)將取代花的結(jié)構(gòu)。目前已知有5個基因Ify (leafy)、apl (apetalal)、 ap2 (apetala2)、cal (cauliflower)和 ufo (unusual floral organs)。這五個基因中，以 Ify作用最強、表達最早。弱的Ify等位基因的突變能把最底層的花分生組織完全轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄐ蛑l；強的Ify等位基因則可以產(chǎn)生異常的花，花被類葉的苞片包裹。稍后表達的是apl 基因，apl突變體的特征是僅個別的基底花轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄐ蛑l，而且不象正常枝條那樣包被在葉腋之中；上部的花轉(zhuǎn)變?yōu)樾』ù兀瑪?shù)朵花簇生于小柄之上。值得注意的是Ify和apl雙突變體的花分生組織無論在基底部還是在上部都完全轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄐ蛑l。cal基因的作用似乎與apl類似。例如，cal與弱的apl的雙突變體類似于一個強的apl突變體，而cal與強的apl則類似于一個更強的apl突變現(xiàn)象。ap2對花分生組織的決定作用不如以上三個基因那么清楚。弱的、異質(zhì)的等位基因ap2_l類似于一個強的apl等位基因；它們與Ify間的作用方式相似。三、細胞壁的生長相關(guān)基因細胞壁的生長是通過細胞壁松弛和細胞壁組分的填充和結(jié)構(gòu)的修飾改變來完成的。細胞壁的松弛對細胞壁的生長是很必要的，其中木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖基化酶(Xyloglucan endotransglycosylase,XET或XTH)和擴展蛋白(Expansin)兩種酶起著關(guān)鍵的作用。XET 在植物體內(nèi)屬于一個多基因家族(擬南芥中超過22個)，有催化轉(zhuǎn)糖基化與水解的作用，目前的研究表明，XET可以通過水解細胞壁的組成成分，通過作用于與纖維素微纖絲相連的木葡聚糖而重新調(diào)整纖維素微纖絲的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而達到促進細胞生長的作用。擴展蛋白是目前已知的唯一能在體外引起細胞壁擴展的蛋白質(zhì)。它們廣泛存在于所有有花植物的組織中，例如擬南芥中含有26個a-擴展蛋白和5個￠-擴展蛋白。擴展蛋白受環(huán)境和激素信號的調(diào)節(jié)，在這些基因的啟動子區(qū)域中有激素調(diào)節(jié)元件，旱脅迫誘導植物根系伸長，同時也促進了擴展蛋白的mRNA含量與蛋白含量的升高。同時，擴展蛋白基因的表達具有一定的時空特異性，不同的擴展蛋白在植物發(fā)育的不同階段表達；果實成熟階段擴展蛋白基因大量表達；擴展蛋白可以使熱滅活的細胞壁松弛，恢復其酸生長與延伸性；能破壞纖維素與幾種交聯(lián)聚糖之間的氫鍵，導致植物細胞壁延伸。綜上所述，植物特定的基因在激素、代謝物及環(huán)境因素的相互作用下，依時間和空間順序表達出特定的產(chǎn)物，這些產(chǎn)物或者直接構(gòu)成分化的組織或器官，或者充當開啟其它基因表達的信號分子，或者作為酶催化產(chǎn)生有特定生理功能的組織或器官特異的物質(zhì)，由此可以看出，影響植物生長發(fā)育的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是極其復雜的。因此，新的發(fā)育調(diào)節(jié)基因的發(fā)現(xiàn)對了解植物發(fā)育機理和利用其人工改良農(nóng)作物的品種資源是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與植物生長發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)及其編碼基因。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，命名為ABP7，來源于玉米(Zea mays L.)，為下述I)或2) 的蛋白質(zhì)I)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將I)所限定的蛋白質(zhì)的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和 /或缺失和/或添加，且與植物生長發(fā)育相關(guān)的由I)衍生的蛋白質(zhì)。編碼所述ABP7蛋白的基因(ABP7)也屬于本發(fā)明的保護范圍。編碼所述ABP7蛋白的ABP7基因為如下3)_6)中任一所述的基因3)編碼序列是序列表中序列I第124-1185位核苷酸序列的基因；4)核苷酸序列為序列表中序列I的基因；5)在嚴格條件下與3)或4)的基因雜交，且編碼上述ABP7蛋白的基因；6)與3)或4)或5)所限定的基因具有90%以上的同源性，且編碼上述ABP7蛋白的基因。其中，序列I由1584個核苷酸組成，第124-1185位為ABP7基因的編碼序列，編碼序列表中序列2所示蛋白質(zhì)。序列2由353個氨基酸組成。含有上述ABP7基因的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組表達載體可為在質(zhì)粒pBI121中插入上述ABP7基因，得到的表達所述 ABP7基因的重組質(zhì)粒(pBI121-ABP7-Full)。在本發(fā)明的一個實施例中，所述ABP7基因具體插入到了質(zhì)粒PBI121的酶切位點Sma I和EcoICRI之間，得到表達所述ABP7基因的重組質(zhì)粒 pBI121-ABP7-Full。所述表達盒由能夠啟動所述ABP7基因表達的啟動子，ABP7基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列組成。所述重組菌具體可為攜帶有所述ABP7基因的農(nóng)桿菌，如攜帶有所述ABP7基因的 GV3101。所述ABP7蛋白，或所述ABP7基因，或上述重組表達載體、表達盒或重組菌在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育，和/或植物產(chǎn)量中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述植物生長發(fā)育體現(xiàn)在如下a) -e)中至少一個a)葉片面積；b)開花時間；c)種子萌發(fā)時間；d)初生根長度；e)衰老速度；所述葉片面積為土中生長4周的成熟苗的最大的兩片蓮座葉的面積，在本發(fā)明的一個實施例中，所述葉片面積具體采用Image J軟件測得。所述開花時間為從種子萌發(fā)到開花所用的時間。所述種子萌發(fā)時間為從播種到胚根長至Icm所用時間。所述衰老速度可從葉片表型(顏色)，以及葉綠素含量上體現(xiàn)葉片失綠，葉綠素(葉綠素a和/或葉綠素 b)含量下降為植物衰老的標志。所述植物產(chǎn)量體現(xiàn)在如下f)_h)中至少一個f)種子體積；g)種莢長度；h)種子的千粒重。所述種子的千粒重為1000粒同一株系種子的重量。在本發(fā)明的實施例中，所述植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)具體體現(xiàn)在葉片面積增大、開花時間縮短、種子萌發(fā)時間縮短、初生根伸長、衰老速度加快；所述植物產(chǎn)量的調(diào)節(jié)具體體現(xiàn)在種子體積增大、種莢變長、種子的千粒重增加。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育生長發(fā)育加速和/或產(chǎn)量提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。該方法包括如下步驟將所述ABP7基因?qū)肽康闹参镏校玫奖磉_生長發(fā)育速度快于所述目的植物，和/或產(chǎn)量高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。所述生長發(fā)育體現(xiàn)在如下a) -e)中至少一個
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a)葉片面積；b)開花時間；c)種子萌發(fā)時間；d)初生根長度；e)衰老時間；所述葉片面積為土中生長4周的成熟苗的最大兩片蓮座葉的面積，在本發(fā)明的一個實施例中，所述葉片面積具體采用Image J軟件測得。所述開花時間為從種子萌發(fā)到開花所用的時間。所述種子萌發(fā)時間為從播種到胚根長至Icm所用時間。所述衰老速度可從葉片表型(顏色)，以及葉綠素含量上體現(xiàn)葉片失綠，葉綠素(葉綠素a和/或葉綠素b) 含量下降為植物衰老的標志。所述產(chǎn)量體現(xiàn)在如下f)_h)中至少一個f)種子體積；g)種莢長度；h)種子的千粒重。所述種子的千粒重為1000粒同一株系種子的重量。所述植物為擬南芥，如Columbia型擬南芥。實驗證明，本發(fā)明所提供的ABP7蛋白能夠加速植物生長發(fā)育，提高植物產(chǎn)量，具體體現(xiàn)在葉片面積增大、開花時間縮短、種子萌發(fā)時間縮短、初生根伸長、種子體積增大、 種莢變長、種子的千粒重增加。


圖I為ABP7轉(zhuǎn)基因擬南芥不同純系的生長表型及其表達量差異。其中，A為ABP7 轉(zhuǎn)基因擬南芥不同純系的生長表型為ABP7轉(zhuǎn)基因擬南芥不同純系中ABP7基因的表達量。A和B中，I均表示對照系(轉(zhuǎn)入pBI 121空載體的擬南芥)；2均表示ABP7轉(zhuǎn)基因系 2-2 ；3均表示ABP7轉(zhuǎn)基因系4-8 ；4均表示ABP7轉(zhuǎn)基因系6_9。圖2為種子相關(guān)表型測量結(jié)果。其中，A為顯微鏡下的種子；B為種子千粒重的統(tǒng)計結(jié)果；C為種莢長度比較結(jié)果；D為種莢長度統(tǒng)計結(jié)果。A-D中，I均表示對照系(轉(zhuǎn)入 PBI121空載體的擬南芥)；2均表示ABP7轉(zhuǎn)基因系2-2 ;3均表示ABP7轉(zhuǎn)基因系4_8 ;4均表示ABP7轉(zhuǎn)基因系6-9。圖3為葉面積測量結(jié)果。其中，A為葉片寬度；B為葉片長度；C為葉片面積。圖4為花期表型結(jié)果。其中，A為開花時間的表型體現(xiàn)；B為自萌發(fā)到開花時間統(tǒng)計結(jié)果；C為開花時的蓮座葉數(shù)目統(tǒng)計結(jié)果。A-C中，I均表示對照系(轉(zhuǎn)入pBI121空載體的擬南芥)；2均表示ABP7轉(zhuǎn)基因系2-2 ；3均表示ABP7轉(zhuǎn)基因系4_8 ；4均表示ABP7轉(zhuǎn)基因系6_9。圖5為衰老速度比較。其中，A為衰老速度的表型體現(xiàn)；B為葉綠素a和葉綠素b含量的測定結(jié)果。A和B中，I均表示對照系(轉(zhuǎn)入PBI121空載體的擬南芥)；2均表示ABP7 轉(zhuǎn)基因系2-2 ；3均表示ABP7轉(zhuǎn)基因系4-8 ；4均表示ABP7轉(zhuǎn)基因系6_9。A中1_4，從左側(cè)至右側(cè)均為新葉至成熟葉片。圖6為種子萌發(fā)時間。其中，橫坐標數(shù)值表示時間(單位h)。
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圖7為初生根伸長結(jié)果。其中，A為初生根伸長的表型體現(xiàn)；B為初生根根長統(tǒng)計結(jié)果。A和B中，I均表示對照系(轉(zhuǎn)入PBI121空載體的擬南芥)；2均表示ABP7轉(zhuǎn)基因系 2-2 ；3均表示ABP7轉(zhuǎn)基因系4-8 ；4均表示ABP7轉(zhuǎn)基因系6_9。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、ABP7基因的獲得玉米材料選用玉米自交系齊319 (利用外源種質(zhì)選育優(yōu)良玉米自交系及強優(yōu)勢雜交種的實踐與思考，《山東農(nóng)業(yè)科學》，葉金才，03 :11-13，2000，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所獲得。)授粉后17天(17dpp)的幼胚。菌種大腸桿菌E. coli DH5 a，DH10B、JM109 及酵母菌株 yWAM2 (Leu_His_Trp_) (Sikorski R. S. and Hieter P. ,A System of Shuttle Vectors and Yeast Host Strains Designed for Efficient Manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics，1989，vol. 122 :19_27，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所獲得)載體pBluescriptII SK+(美國 STRATAGENE 公司，產(chǎn)品目錄號 212205)、 pRS315HIS(Wang M. M. and Reed R. R. , Molecular cloning of the olfactory neuronal transcription factor Olf-I by genetic selection in yeast. Nature 364(6433)， 121-126，1993，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所獲得)及pPC86 (S. T. Cooper and I. M. Hanson, A screen for proteins that interact with PAX6 :C_terminal mutations disrupt interaction with H0MER3，DNCLl and TRIMlI，BMC Genetics 2005，6 :43，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所獲得)工具酶和修飾酶各種限制性內(nèi)切酶和修飾酶購自Promega公司，New England Biolab公司和Gibco公司?；瘜W試劑酵母培養(yǎng)用試劑均購自Sigma公司和Oxford公司；其它化學藥品均為國產(chǎn)分析純。試劑盒質(zhì)粒DNA 提取用 Promega 公司的 Wizard Minipreps DNA Purification System 和 Wizard Maxipreps DNA Purification System ;回收 DNA 用鼎國公司的 DNA 片段快速純化/回收試劑盒；RNA提取用Promega公司的RNAgents Total RNA Isolation System kit 和 PolyATtract mRNA Isolation System ;文庫構(gòu)建用 GibcoBRL 公司的 SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning kit。引物合成由北京賽百盛生物工程公司和上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。測序由上海博亞生物技術(shù)有限公司完成。以下為玉米ABP7基因的獲得過程I、玉米總RNA的提取和mRNA的分離玉米總RNA的提取和mRNA的分離分別按Promega公司的RNAgents Total RNA Isolation System kit 和 PolyATtract mRNA Isolation System 進行。取玉米自交系齊 319 的 17dpp 幼胚 lg，提取總 RNA2. 834mg，共分離出 mRNA43. 7u g。2、玉米幼胚17dpp cDNA文庫的構(gòu)建
按GibcoBRL 公司的 SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning kit進行。取出5iig 17dpp的mRNA用于cDNA文庫構(gòu)建,反轉(zhuǎn)錄引物用 Not I adapter :5’ -pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCC(T)15-3’，雙鏈合成后加Sal I adapter :5，-TCGACCCACGCGTCCG-3，；3， -GGGTGCGCAGGCp-5，；再用Not I酶切，構(gòu)建到經(jīng)Sal I和Not I酶切純化后的pPC86 (Trp+)載體上。轉(zhuǎn)化E. coli. DH10B，得到庫容量為5. 2X IO6Cfu的cDNA文庫。3、cDNA文庫的擴增配2XLB 培養(yǎng)基 4L(Bacto_ 胰蛋白胨 20g/L，Bacto-酵母膏 10g/L，NaCl 10g/L, SeaPrep瓊脂糖3g/L，pH 7. 0)，121°C滅菌30min后，37°C溫育2小時；加入氨芐青霉素至終濃度200mg/L ;加入上述步驟2所得的cDNA文庫中至濃度為106cfu/L ;混勻后，分裝20 30mL到50mL的培養(yǎng)管中；冰浴I小時;30°C培養(yǎng)40小時；8000rpm離心IOmin,收集菌體； 棄上清，加入200mL 2XLB (含甘油12. 5%)懸浮細胞，分裝成IOmL—份于-70°C保存?zhèn)溆谩?、4mer ABRE誘餌載體的構(gòu)建合成引物ABRE (+) 5 ' -GAAGTCCACGTGGAGGTGG-3 '和 ABRE (-) 5' -TCCCACCTCCACGTGGACT-3'，各取 20 u l(lu g/u I) ABRE (+)和 ABRE (-)，混勻，加 4 y I 濃度為3M的NaOAc和100 U I的無水乙醇，_20°C，30分鐘后12000rpm離心，沉淀DNA，70% 乙醇洗一次，干燥，加6. 5iU無菌水，I Ul的IOX的T4多核苷酸激酶緩沖液，退火條件是 88°C，2min ；65°C，IOmin ；37°C, IOmin ；25°C, 5min ;力口 I. 5 y I 20mM 的 ATP 和 I y I T4 多核苷酸激酶，37°C反應(yīng)2小時，加苯酚-氯仿和氯仿各抽提一次，用無水乙醇沉淀DNA。再加2iil的10X連接酶緩沖液，I 連接酶(5units/iil)，17iil無菌水，16°C連接過夜， 用2%的瓊脂糖電泳，分離大小約為80bp的DNA片段，克隆到pBluescript II SK+載體上 (經(jīng)Spe I酶切，補平)，測序，獲得pA4質(zhì)粒。pRS315His (Leu+)載體及 pA4 質(zhì)粒均用 BamHI、Xba I 雙切后純化，把 4mer ABRE 克隆到pRS315HIS，得到誘餌載體pRSA4 (Leu+)質(zhì)粒。5、玉米幼胚17dpp cDNA文庫的篩選制備酵母菌株yWAM2 (LeiTHi sTrpl感受態(tài)細胞，把步驟4所得的誘館載體 pRSA4 (Leu+)轉(zhuǎn)化到酵母菌株 yWAM2 (LeiTHislrpD 中，轉(zhuǎn)化方法參照 Two Hybrid System TRAFO Protocol進行。獲得含有pRSA4的酵母菌株yA4 (His_，Trp_)。用所得的含有誘餌載體pRSA4的yA4酵母對步驟3的cDNA文庫進行篩選，轉(zhuǎn)化方法同上，將轉(zhuǎn)化細胞涂到Hi s_選擇培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)3 5天。待酵母長出(進行文庫篩選時，轉(zhuǎn)入的cDNA文庫中含有目的cDNA克隆(pPC86-ABP7)，其編碼蛋白(ABP7)與pRSA4上的ABRE結(jié)合導致下游報告基因HIS3表達，因此目的酵母克隆可在His_選擇培養(yǎng)基上長出)后，提酵母質(zhì)粒(候選目的 cDNA 克隆 pPC86_ABP7),提取方法參照 Method I Quick Plasmid DNA Preparations from Yeast (Christine Guthrie 1991)。將酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 E. Coli DH5a,從中提取質(zhì)粒， 酶切分析，測序可知所獲得的陽性克隆的DNA序列，再對序列進行分析，從而獲得陽性克隆 PPC86-ABP7。測序表明，ABP7基因的序列如序列表中序列I所示，其中第124-1185位為編碼區(qū)序列，編碼得到序列表中序列2所示蛋白質(zhì)(ABP7蛋白)。實施例2、轉(zhuǎn)ABP7基因擬南芥生長發(fā)育表型分析
YEB液體培養(yǎng)基5g胰蛋白胨，Ig酵母提取物，5g蔗糖，0. 5g MgS04，用IM NaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 2-7. 5，定容于IL的去離子水中，121°C高壓滅菌15min。YEB固體培養(yǎng)基在每升YEB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂15g，121°C高壓濕熱滅菌 15min。1/2MS 培養(yǎng)基:1. 65g NH4NO3,1. 9g KNO3,0. 37g MgSO4 7H20，0. 17g KH2PO4,0. 44g CaCl2 2H20,5ml (200 X)有機元素，5ml (200 X)微量元素，5ml (200 X)鐵鹽，20g 蔗糖，2L 定容至；用IM的KOH調(diào)pH至5. 7-5. 8，加入瓊脂糖至終濃度0. 8% (w/v) ;121°C高壓滅菌 20mino一、重組表達載體pBI121-ABP7_Full的構(gòu)建以實施例I的陽性克隆pPC86-ABP7中的ABP7基因(序列I)為模板，以ABP7-FW I :5’ -cggatatcgtcgctttcccccaaatcc—3，(劃線部分序列為EcoR V酶切識別位點)和 ABP7-RVI :5’ -cagttaacacttggactttcgtcatc-3’ 為上下游引物(劃線部分序列為 Hpa I 酶切識別位點)，進行PCR擴增。用Sma I和EcoICRI雙酶切pBI 121載體(北京天恩澤基因科技有限公司，產(chǎn)品目錄號111010-2)，并回收大片段。將上述PCR擴增得到的產(chǎn)物經(jīng)EcoR V 和Hpa I雙酶切后與PBI121載體酶切回收的大片段按照3 I連接，16°C過夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a中，得到的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、測序，鑒定正確的克隆命名為pBI121-ABP7-Full。二、農(nóng)桿菌介導的擬南芥基因轉(zhuǎn)化I、重組表達載體pBI121-ABP7_Full熱激轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌將凍存的農(nóng)桿菌GV3101 (Biovector Science Lab, Inc.，產(chǎn)品目錄號 Biovector-822)感受態(tài)細胞置于冰上融化，200 GV3101感受態(tài)細胞中加入約10 yl的 DNA(步驟一構(gòu)建的重組表達載體pBI121-ABP7-Full);冰浴5min ;液氮凍5min ;37°C水浴中5-10min ;加入800 u I SOC液體培養(yǎng)基，28°C，200rpm培養(yǎng)2_4h ;將菌液涂于含有相應(yīng)抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)2天。從長出的農(nóng)桿菌菌落中提取質(zhì)粒DNA，用引物 ABP7-FW1和ABP7-RV1進行PCR鑒定。將鑒定正確(PCR產(chǎn)物大小約為1581bp)，表明轉(zhuǎn)入重組表達載體pBI121-ABP7-Full的農(nóng)桿菌命名為GV3101/pBI121-ABP7-Full。同時設(shè)置轉(zhuǎn)入PBI121空載體的農(nóng)桿菌對照，將其命名為GV3101/pBI121。2、擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化(I)遺傳轉(zhuǎn)化用擬南芥的培養(yǎng)消毒的擬南芥Columbia型種子播于1/2MS平板上，4°C冰箱春化4°C處理3天，放置于培養(yǎng)箱(120 u mo I photons hTY1，22 °C，光照16小時；18°C，暗8小時)中培養(yǎng)約7-10天，移至土中。當初生薹長出后從根部剪去初生薹，使其抽出大量的次生薹，當開花較多時可用于轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化前一天澆飽和水一次。(2)擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化挑 GV3101/pBI121-ABP7-Full (或 GV3101/pBI121)單菌落，接種于 5ml 的 YEP 液體培養(yǎng)基(kan 50mg/L, Rif50mg/L)中，28°C，250rpm 培養(yǎng)約 19h ； 將活化的菌液按I : 200的比例轉(zhuǎn)接入含200ml YEP培養(yǎng)基(kan 50mg/L,Rif 50mg/L)的 500ml錐形瓶中，28°C 200rpm繼續(xù)培養(yǎng)約14h ;測量0D600值，0D600 = I. 5 3. 0時即可； 4°C,5000rpm,離心IOmin,收集菌體,棄上清；加入2倍體積10%鹿糖(含0. 02% Silwet L-77，美國GE公司，產(chǎn)品目錄號SL77080596)，將菌體充分懸??；轉(zhuǎn)化前剪去擬南芥中已經(jīng)長出的小果莢，將菌液倒置于大培養(yǎng)皿中，將花浸泡其中約40s后取出，用吸水紙將殘余菌液吸去，將浸染后的擬南芥倒置避光培養(yǎng)24h后正常培養(yǎng)，收集種子(Ttl代)。
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三、轉(zhuǎn)基因擬南芥生長發(fā)育表型分析I、轉(zhuǎn)基因擬南芥植株抗性的篩選和PCR檢測將收集到的Ttl代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子滅菌處理后，播種在1/2MS培養(yǎng)基上(含kan 50mg/L)，4°C春化3天，放置于培養(yǎng)箱(22°C，光照16小時；18°C，暗8小時)中培養(yǎng)，約7天后在Kan抗性培養(yǎng)板上出現(xiàn)黃化苗和綠苗，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為Kan抗性，呈正常綠色，非轉(zhuǎn)基因植株呈黃色。將綠苗移至1/2MS培養(yǎng)板上5天恢復生長后，轉(zhuǎn)移至土中。當轉(zhuǎn)移至土中的苗長至10-12片葉子時按照如下方法提取葉片提取基因組DNA: I)取I片葉子，置于1.5ml離心管中，加入適量液氮，用預冷的玻璃研磨棒將葉片研磨成粉末，加入 700 ill 的 DNA 提取液(IOOmM NaCl ； IOOmM Tris-HCl, pH8. 5 ；50mM EDTA ； I % SDS)，60°C 水浴 30min。2)加入 200 酚氯仿(I 1)，充分混勻。3) 4°C，12000rpm 離心IOmin。4)吸上清600 U I至一個新離心管中，加入600 U I異丙醇，混勻充分，_20°C沉淀 15-20min。5) 4°C，12000rpm 離心 15min。6)棄上清，75% 乙醇洗滌 DNA，加入 30 超純水 (內(nèi)含無DNA酶的20 ii g/ml的胰RNA酶)重新溶解DNA沉淀，37°C保溫30min去除RNA后， 得到轉(zhuǎn)基因擬南芥的基因組DNA，_20°C保存?zhèn)溆?。以上述制備的轉(zhuǎn)基因擬南芥的基因組DNA為模板，利用引物ABP7_Fw3 5' -GAACCGCCCAAGGACTAC-3 '，ABP7-Rv3:5' -TCCGCTTGGTCACAGAATG-3 '進行 PCR 鑒定 PCR 擴增條件94°C 5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 40s，30 個循環(huán)；72°C 5min。將鑒定的陽性(目的片段約370bp)植株保留即為T1代轉(zhuǎn)基因植株，下一代繼續(xù)單株收種為T2代種子， T2代轉(zhuǎn)基因植株繼續(xù)用Kan篩選，出現(xiàn)黃苗綠苗=I 3的T2株系單株收種，T3代植株全部表現(xiàn)卡那霉素抗性的T2代單株為純合植株。通過三代抗性(Kan)和PCR篩選，最終獲得三個不同ABP7轉(zhuǎn)基因擬南芥純系，分別命名為2_2、4_8和6_9。2、轉(zhuǎn)基因擬南芥不同純系的生長表型及ABP7基因表達量差異將上述步驟I獲得的三個不同ABP7轉(zhuǎn)基因擬南芥純系(2-2、4_8和6_9)的種子， 以及對照系(轉(zhuǎn)入PBI121空載體的擬南芥)種子分別播種于1/2MS平板，4°C春化三天，于光照培養(yǎng)箱中生長約7天長至兩片真葉時，移至含有1/2MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中生長兩周后，移至土中，約4周后觀察其生長表型(如圖I中A所示)，之后取整株，液氮冷凍，貯存于_80°C冰箱中。參照實施例I中玉米總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA的方法提取轉(zhuǎn)基因擬南芥的總RNA并進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。以Actin2作為內(nèi)參基因，使用引物Actin2-Fwl 5 ' -CCAACAGAGAGAAGATGACT-3 '；和 Actin2_Rvl 5 ' -ATGTCTCTTACAATTTCCCG-3 '均一化模板；PCR 體系如下10XPCR 緩沖液 1，cDNA I u 1,2. 5mM dNTP 2u I, IOu I Actin2-Fwl0. 5 u 1,10 u lActin2-Rvl 0.5u I, Taq SI (2.5U/y I)0. 5y 1，ddH20 補至 20 u I0 PCR 反應(yīng)條件94°C 5min ；94°C 30s, 60°C 25s，72°C 30s，28 個循環(huán)；72°C IOmin0 根據(jù)用Actin2引物獲得的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果調(diào)整模板cDNA的用量；用ABP7基因內(nèi)部引物 ABP7-Fw3 5' -GAACCGCCCAAGGACTAC-3'，ABP7-Rv3 5' -TCCGCTTGGTCACAGAATG-3'擴增 cDNA模板，分析不同ABP7過表達擬南芥株系中ABP7基因的表達水平。圖I為三個不同ABP7轉(zhuǎn)基因擬南芥純系，即2-2、4-8和6-9和轉(zhuǎn)入pBI121空載體的擬南芥的生長表型(圖I中A所示，其中轉(zhuǎn)入pBI121空載體的擬南芥的生長表型與未經(jīng)轉(zhuǎn)基因的擬南芥表型一致)，以及ABP7基因的表達量(圖I中B所示)。這一結(jié)果顯示， 其中2-2和4-8兩個系A(chǔ)BP7基因的表達量相似，6-9的表達相對較弱，而它們的生長表型強弱與ABP7基因表達量的多少呈現(xiàn)一致性。3、轉(zhuǎn)基因擬南芥植株生長發(fā)育表型觀察與統(tǒng)計(一)將同一時期的上述步驟I獲得的三個不同ABP7轉(zhuǎn)基因擬南芥純系(2-2、4_8和 6-9)的種子，以及對照系(轉(zhuǎn)入pBI121空載體的擬南芥)種子分別播種于1/2MS平板，春化(4°C)三天，于光照培養(yǎng)箱中生長約7天長至兩片真葉時，移至含有1/2MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中生長兩周后，轉(zhuǎn)入土中生長至成熟。從以下幾個方面進行生長發(fā)育表型的觀察與統(tǒng)計(I)種子相關(guān)表型測量統(tǒng)計千粒重和種莢長度，對比轉(zhuǎn)基因系(2-2、4_8和6-9) 和對照系(轉(zhuǎn)入PBI121空載體的擬南芥，以及未轉(zhuǎn)基因的擬南芥)。具體的，待三個轉(zhuǎn)基因株系(2-2、4-8和6-9)和對照系的擬南芥植株種子成熟后，分別收獲種莢，一方面，測量種莢長度，另一方面分別收集種子，測量1000粒種子的重量。測量種莢長度設(shè)三次重復，每次重復每個株系的擬南芥選擇10株，每株上采集最長的5個種莢，測量結(jié)果取三次重復實驗的平均值。測量種子千粒重也設(shè)三次重復，每次重復每個株系的擬南芥選擇20株，收集所有種子，混勻后每個株系隨機選取1000粒進行測重，測量結(jié)果取三次重復實驗的平均值。(2)葉面積測量將土中生長至4周的成熟苗照相，使用Image J軟件測量最大的兩片蓮座葉長度和寬度以及面積，對比轉(zhuǎn)基因系(2-2、4-8和6-9)和對照系(轉(zhuǎn)入pBI121 空載體的擬南芥，以及未轉(zhuǎn)基因的擬南芥)。實驗設(shè)二次重復，每次重復每個株系的擬南芥選擇30株，測量結(jié)果取三次重復實驗的平均值。(3)開花時間一是統(tǒng)計植株開花時的蓮座葉片數(shù)目，二是統(tǒng)計從種子萌發(fā)到植株開花所用的時間。對比轉(zhuǎn)基因系(2-2、4-8和6-9)和對照系(轉(zhuǎn)入pBI121空載體的擬南芥，以及未轉(zhuǎn)基因的擬南芥)。實驗設(shè)三次重復，每次重復每個株系的擬南芥選擇20株， 測量結(jié)果取三次重復實驗的平均值。(4)植株衰老之葉綠素測量植物衰老時最明顯的變化就是由于葉綠素合成能力下降，葉片失綠，光合下降，逐漸使植物失去活力。而葉綠素a、葉綠素b是最重要的兩種葉綠素，它們的含量可以作為植物衰老的標志之一。摘取土中生長至6周的成熟苗的葉片(約 50mg),置于液氮搗碎,然后用80%丙酮抽提約4小時至葉片全部漂白，12000rpm離心5min, 吸上清，于分光光度計上分別讀取663nm，和647nm處的吸光值。葉綠素a和葉綠素b含量分別由下列公式求得葉綠素a = 12. 25 A663-2. 79A645 ;葉綠素b = 21. 50A645_5. IOA6630對比轉(zhuǎn)基因系(2-2、4-8和6-9)和對照系(轉(zhuǎn)入PBI121空載體的擬南芥，以及未轉(zhuǎn)基因的擬南芥)。實驗設(shè)三次重復，每次重復每個株系的擬南芥選擇5株，測量結(jié)果取三次重復實驗的平均值。種子相關(guān)表型的結(jié)果如圖2所示與對照系相比，轉(zhuǎn)基因系(2-2、4_8和6-9)的種子體積增大(圖2中A)，種莢變長(圖2中C和D)，種子千粒重顯著提高(圖2中B)，且 ABP7表達量高的轉(zhuǎn)基因系(2-2和4-8)的粒重顯著高于表達量低(6_9)的；對種莢長度的統(tǒng)計結(jié)果也顯示相同的趨勢(轉(zhuǎn)入PBI121空載體的擬南芥與未轉(zhuǎn)基因的擬南芥在種子相關(guān)表型上基本一致)。該結(jié)果說明ABP7基因過表達顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的種子粒重和種莢長度。
葉片表型的結(jié)果如圖3所示無論是葉片長度、寬度還是葉面積，轉(zhuǎn)基因系(2-2、 4~8和6_9)植株與對照系植株相比都要明顯變大，其中2-2和4_8的葉面積幾乎是對照系的兩倍之多(轉(zhuǎn)入PBI121空載體的擬南芥與未轉(zhuǎn)基因的擬南芥在葉片表型上基本一致)。 以上結(jié)果說明ABP7能夠增大轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的葉片面積。花期表型結(jié)果如圖4所示轉(zhuǎn)基因系(2-2、4_8和6-9)植株開花提前，且與對照系相比速度快的很多，特別是表達較強的2-2和4-8系在開花時的蓮座葉數(shù)目約為對照系的 60-70% (轉(zhuǎn)入PBI121空載體的擬南芥與未轉(zhuǎn)基因的擬南芥在花期表型上基本一致)。以上結(jié)果說明ABP7能夠縮短轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的開花時間。植株衰老之葉綠素測量的結(jié)果如圖5中B所示在轉(zhuǎn)基因系(2-2、4-8和6_9)植株中的葉綠素含量嚴重下降，特別是2-2和4-8兩個系，只有大約0. 15mg/g鮮重，而對照系大約含有0.4mg/g。同時，觀察轉(zhuǎn)基因系(2-2、4-8和6-9)和對照系在衰老時期葉片的變化，發(fā)現(xiàn)正常生長的轉(zhuǎn)基因系(2-2、4-8和6-9)的新葉和成熟葉片均有不同程度的失綠現(xiàn)象，而在底部的老葉差異則較大，轉(zhuǎn)基因系2-2和4-8的老葉幾乎全部失綠，對照系則幾乎無太大影響(圖5中A)(轉(zhuǎn)入pBI121空載體的擬南芥與未轉(zhuǎn)基因的擬南芥在葉綠素測量的結(jié)果上基本一致)。以上結(jié)果說明ABP7對轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的衰老起到了促進作用。4、轉(zhuǎn)基因擬南芥植株生長發(fā)育表型觀察與統(tǒng)計(二)_種子萌發(fā)實驗將同一時期的上述步驟I獲得的三個不同ABP7轉(zhuǎn)基因擬南芥純系(2-2、4_8和 6-9)的種子(每個系80粒)，以及對照系(轉(zhuǎn)入PBI121空載體的擬南芥，以及未轉(zhuǎn)基因的擬南芥)種子(80粒)分三次重復，播種于1/2MS固體培養(yǎng)基上，先置于4°C春化3天，放于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。光照培養(yǎng)箱中生長，每隔十二小時統(tǒng)計一次，以胚根出現(xiàn)Imm為標準計算萌發(fā)率。結(jié)果如圖6所示，ABP7轉(zhuǎn)基因擬南芥純系種子的萌發(fā)速度要比對照系(轉(zhuǎn)入 PBI121空載體的擬南芥)種子的萌發(fā)速度快，表達較強的2-2和4-8在36小時已經(jīng)達到 100%，而對照系只有80% (轉(zhuǎn)入pBI121空載體的擬南芥與未轉(zhuǎn)基因的擬南芥在種子萌發(fā)的速度上基本一致)。5、轉(zhuǎn)基因擬南芥植株生長發(fā)育表型觀察與統(tǒng)計(三)_初生根伸長實驗將同一時期的上述步驟I獲得的三個不同ABP7轉(zhuǎn)基因擬南芥純系(2-2、4_8和
6-9)的種子，以及對照系(轉(zhuǎn)入PBI121空載體的擬南芥，以及未轉(zhuǎn)基因的擬南芥)種子播種于1/2MS培養(yǎng)基，春化3天，光照培養(yǎng)箱中生長至子葉剛剛萌動，10天后測量主根長度。 每次實驗每個系至少30株，實驗設(shè)三次重復。結(jié)果如圖7所示，ABP7轉(zhuǎn)基因擬南芥純系植株的初生根長度要比對照系稍長一些 (轉(zhuǎn)入PBI121空載體的擬南芥與未轉(zhuǎn)基因的擬南芥在初生根長度上基本一致)。
權(quán)利要求
1.蛋白質(zhì)，為下述I)或2):.1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；.2)將I)所限定的蛋白質(zhì)的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且與植物生長發(fā)育相關(guān)的由I)衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因為如下3)-6)中任一所述的基因.3)編碼序列是序列表中序列I第124-1185位核苷酸序列的基因；.4)核苷酸序列為序列表中序列I的基因；.5)在嚴格條件下與3)或4)的基因雜交，且編碼權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的基因；.6)與3)或4)或5)所限定的基因具有90%以上的同源性，且編碼權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的基因。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
5.權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)，或權(quán)利要求2或3所述基因，或權(quán)利要求4所述的重組表達載體、表達盒或重組菌在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育，和/或植物產(chǎn)量中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物生長發(fā)育體現(xiàn)在如下a)-e)中至少一個a)葉片面積；b)開花時間；c)種子萌發(fā)時間；d)初生根長度；e)衰老時間；所述植物產(chǎn)量體現(xiàn)在如下f)_h)中至少一個f)種子體積；g)種莢長度；h)種子的千粒重。
7.一種培育生長發(fā)育加速和/或產(chǎn)量提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟將權(quán)利要求2或3所述的基因?qū)肽康闹参镏?，得到生長發(fā)育速度快于所述目的植物，和/或產(chǎn)量高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述生長發(fā)育體現(xiàn)在如下a)-e)中至少一個a)葉片面積；b)開花時間；c)種子萌發(fā)時間；d)初生根長度；e)衰老時間；所述產(chǎn)量體現(xiàn)在如下f)_h)中至少一個f)種子體積；g)種莢長度；h)種子的千粒重。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述應(yīng)用，或權(quán)利要求7或8所述方法，其特征在于所述植物為擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與植物生長發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)為下述1)或2)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將1)所限定的蛋白質(zhì)的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且與植物生長發(fā)育相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。實驗證明，本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)能夠加速植物生長發(fā)育，提高植物產(chǎn)量，具體體現(xiàn)在葉片面積變大、開花時間縮短、種子萌發(fā)時間縮短、初生根伸長、種子體積增大、種莢變長、種子的千粒重增加。
文檔編號C12N1/21GK102584971SQ201210036350
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月17日
發(fā)明者溫洪濤, 王磊, 范云六, 趙軍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所