專(zhuān)利名稱(chēng)：一種基于Blocker引物和ARMS引物檢測(cè)基因突變的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測(cè)基因突變的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
基因突變(gene mutation)是由于DNA分子中發(fā)生堿基對(duì)的增添、缺失或改變而引起的基因結(jié)構(gòu)的改變?；蛲蛔兎譃閮煞N，性細(xì)胞突變以及體細(xì)胞突變。性細(xì)胞突變是指發(fā)生在性細(xì)胞的突變，是可遺傳的突變類(lèi)型。除性細(xì)胞外的體細(xì)胞發(fā)生的突變不會(huì)造成后代的遺傳改變，卻可以引起當(dāng)代某些細(xì)胞的遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。絕大部分體細(xì)胞突變無(wú)表型效應(yīng)。體細(xì)胞突變是一種稀有突變，體細(xì)胞突變存在于大量的野生型背景DNA序列中，相對(duì)于野生型背景序列的含量，體細(xì)胞突變含量很少。如腫瘤患者組織和外周血內(nèi)含有少量的腫瘤細(xì)胞DNA，初期出現(xiàn)的細(xì)菌和病毒耐藥情況等。體細(xì)胞突變常與疾病的發(fā)病相關(guān)，可以作為疾病發(fā)病的標(biāo)志物、預(yù)后判斷的主要標(biāo)志以及用藥指導(dǎo)的標(biāo)志物。因此，體細(xì)胞突變的檢測(cè)對(duì)于疾病的診療和預(yù)后評(píng)價(jià)具有重要的意義。肺癌是當(dāng)今世界各國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，并已成為絕大多數(shù)國(guó)家癌癥死亡的主要原因。其中以非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)最常見(jiàn)。目前祀向治療已經(jīng)成為非小細(xì)胞肺癌臨床治療的重要手段。易瑞沙(I ressa/吉非替尼/Gef itinib,阿斯利康)和特羅凱(Tarceva/厄羅替尼/Erlotinib，羅氏制藥)作為表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，是美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于NSCLC靶向治療的主要藥物。但是，臨床試驗(yàn)表明易瑞沙和特羅凱僅對(duì)10-30%的NSCLC病人有顯著療效。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變L858R和19外顯子缺失(E746_A750)與NSCLC靶向治療的療效具有相關(guān)性，絕大多數(shù)攜帶EGFR基因突變L858R和19外顯子缺失(E746_A750)的病人療效顯著。但幾乎所有患者遲早均要發(fā)生EGFR-TKI性耐藥，中位無(wú)進(jìn)展時(shí)間只有6-12個(gè)月。而EGFR-TKI耐藥存在明顯的分子靶標(biāo)，即I790M。EGFR野生型基因序列見(jiàn)Genbank N0.NM_005228.3，T790M突變即該序列中第2369個(gè)堿基C突變?yōu)門(mén)。結(jié)合EGFR基因突變的檢測(cè)信息制定出最為適合NSCLC病人個(gè)體的腫瘤治療方案，為臨床醫(yī)生用藥提供用藥科學(xué)依據(jù)，降低醫(yī)生治療風(fēng)險(xiǎn)以及患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前體細(xì)胞突變的檢測(cè)方法主要有DNA測(cè)序法和突變體富集PCR等技術(shù)方法。DNA測(cè)序法是進(jìn)行突變檢測(cè)的可靠方法，也是使用最多的方法。測(cè)序法對(duì)取材和技術(shù)要求比較高，更重要的是，由于測(cè)序方法本身的限制，靈敏度不高，只能對(duì)含量大于20%的突變基因進(jìn)行檢測(cè)。突變體富集PCR是一種用限制性內(nèi)切酶選擇性消化野生型基因的兩步法PCR，與測(cè)序法相比，由于突變體富集PCR有兩次PCR擴(kuò)增，檢測(cè)突變靈敏性更高，特異性強(qiáng)更強(qiáng)，能從IO4 IO5個(gè)野生型拷貝中檢測(cè)到一個(gè)突變基因。該方法的主要限制因素是，合適限制性內(nèi)切酶的選擇、操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、以及兩次PCR容易污染。探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(amplificationrefractory mutation system, ARMS)ARMS又名等位基因特異PCR(allele specific PCR，AS-PCR)。原理為:利用Taq DNA聚合酶缺少3’ -5’外切酶活性，PCR引物的3’端末位堿基必須與其模板DNA互補(bǔ)才能有效擴(kuò)增的原理，針對(duì)不同的已知突變，設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)囊镆詸z測(cè)出突變基因。該方法的能夠在IO3 IO4個(gè)野生型拷貝中檢測(cè)到一個(gè)突變基因，檢測(cè)靈敏度高。該方法的主要限制因素是，若突變的位點(diǎn)為弱錯(cuò)配堿基序列，該方法的特異性將受到影響?；贐locker技術(shù)來(lái)檢測(cè)突變位點(diǎn)目前也已經(jīng)有相應(yīng)的文獻(xiàn)報(bào)道。Blocker引物是一段與野生型完全匹配互補(bǔ)的核酸序列。目前Blocker引物的使用方法主要是有以下兩種，一種是Blocker引物和擴(kuò)增引物不重疊，Blocker引物位于突變位點(diǎn)區(qū)域,突變引物封閉野生型DNA，而不封閉突變型模板，因此突變型模板擴(kuò)增；另一種是Blocker引物和擴(kuò)增引物有重疊，利用Blocker引物封閉野生型DNA，降低野生型模板DNA的擴(kuò)增。這種方法能夠有效地降低野生型模板的擴(kuò)增，提高野生型背景中突變型DNA模板的檢出能力。但是這種方法也存在一個(gè)問(wèn)題，在Blocker引物封閉的過(guò)程中，Blocker不能有效的區(qū)分突變型模板和野生型模板，盡管有一個(gè)堿基的差別(針對(duì)突變位點(diǎn))，但是在引物的退火溫度下(melting temperature, Tm)Blocker引物還是能夠和突變型的模板接合,或者引物也能夠與野生型模板接合，從而降低了野生型封閉的效率以及突變型的檢測(cè)效率。因此，針對(duì)突變位點(diǎn)提供一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異性高的檢測(cè)方法成為目前臨床上迫切的需要。因此，為了進(jìn)一步提高ARMS+Blocker技術(shù)中Blocker引物的封閉效率，我們?cè)O(shè)計(jì)的Blocker引物的退火溫度要高于ARMS引物的退火溫度。這樣，在Blocker引物的退火溫度下，Blocker引物優(yōu)先與野生型模板結(jié)合，因?yàn)锽locker引物與突變型模板相差一個(gè)堿基，退火溫度也有差異，所以在這個(gè)條件下，Blocker引物優(yōu)先與野生型結(jié)合，而不與突變型結(jié)合，同時(shí)擴(kuò)增引物也不與野生型結(jié)合。在擴(kuò)增引物的退火溫度條件下，擴(kuò)增引物將與突變型模板結(jié)合。通過(guò)上述方法能夠有效降低野生型背景的擴(kuò)增，提高突變型的檢測(cè)效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種基于Blocker引物和ARMS引物檢測(cè)基因突變的方法，本方法整合了 Blocker技術(shù)和ARMS熒光定量PCR技術(shù)。本發(fā)明能夠檢測(cè)的突變類(lèi)型主要包括:點(diǎn)突變、缺失突變和插入突變等。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種基因突變的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明能夠檢測(cè)的突變類(lèi)型主要包括:點(diǎn)突變、缺失突變和插入突變等。因此，根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一種用于基因突變檢測(cè)的Blocker引物，所述Blocker引物為與所檢測(cè)突變區(qū)域的野生型序列完全互補(bǔ)且3’末端進(jìn)行修飾以阻止其延伸的寡核苷酸，其中，所述Blocker引物的退火溫度(Tm值)高于突變檢測(cè)引物的退火溫度(Tm值)。因此，在DNA模板變性雙鏈打開(kāi)之后，在Blocker引物的退火溫度(Tm)下，Blocker引物與野生型模板優(yōu)先結(jié)合從而阻斷突變檢測(cè)引物與野生型模板結(jié)合，然后在突變檢測(cè)引物的退火溫度(Tm)下，突變檢測(cè)引物與突變型模板結(jié)合，通過(guò)PCR反應(yīng)富集擴(kuò)增樣本DNA中待測(cè)基因突變的片段。本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述Blocker引物的長(zhǎng)度為15 35bp。本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述Blocker引物的相關(guān)參數(shù)可為:Tm值65.(TC-85.(TC，GC{t 40.0% -65.0%，引物大小 25± IObp。本發(fā)明中 ，優(yōu)選地，在所述Blocker引物的3’末端進(jìn)行雙脫氧堿基修飾，該末端修飾堿基與所檢測(cè)序列的野生型序列的堿基互補(bǔ)，或者使用其他的化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行修飾如:C3Spacer或磷酸化修飾。本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述Blocker引物在合成過(guò)程中在其序列中直接引入化學(xué)基團(tuán)提高其Tm值，例如，MGB修飾。本發(fā)明中，優(yōu)選地，在所述Blocker引物的5’末端進(jìn)行去磷酸化修飾，以阻止其被Taq聚合酶酶切降解。本發(fā)明中，優(yōu)選地，使所述Blocker引物的退火溫度比突變檢測(cè)引物的退火溫度高5 25°C。更優(yōu)選地，所述Blocker引物的Tm值比所述突變檢測(cè)引物的Tm值高20 25。。。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)EGFR基因點(diǎn)突變I790M的Blocker 引物，所述 Blocker 引物的序列為 5’ -TGCAGCTCATCACGCAGCTCATG-3 ’ ddC (SEQ IDNO:1)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)EGFR基因19外顯子缺失(E746_A750缺失突變)的Blocker引物，所述Blocker引物的序列為5’-CAAGGAATTAAGAGAAGCAACATC-3，ddC(SEQ ID NO:9)。根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了一種基于Blocker引物和ARMS引物檢測(cè)基因突變的方法，在包括樣本DNA、Blocker引物、ARMS引物、TaqMan探針、聚合酶及緩沖液的同一反應(yīng)體系中，依次進(jìn)行阻斷富集PCR反應(yīng)和ARMS熒光定量PCR反應(yīng)，該方法包括以下步驟:
I)首先在Blocker引物的退火溫度(Tm)下，Blocker引物與野生型模板優(yōu)先結(jié)合從而阻斷ARMS引物與野生型模板結(jié)合，然后在ARMS引物的退火溫度(Tm)下，ARMS引物與突變型模板結(jié)合，通過(guò)PCR反應(yīng)富集擴(kuò)增樣本DNA中包含待測(cè)基因突變區(qū)域的片段，其中，所述Blocker引物為與所檢測(cè)突變區(qū)域的野生型序列完全互補(bǔ)且3’末端進(jìn)行修飾以阻止其延伸的寡核苷酸，所述ARMS引物3’末端位于突變區(qū)域處，可擴(kuò)增包含待測(cè)基因突變區(qū)域的片段并且與突變型序列一致，其中，所述Blocker引物的退火溫度高于ARMS引物的退火溫度。其中，突變型序列是指點(diǎn)突變、缺失或者插入堿基的核苷酸序列。2)在反應(yīng)I)的基礎(chǔ)上，ARMS引物及5’端FAM標(biāo)記的Taqman探針通過(guò)熒光定量PCR反應(yīng)對(duì)所述突變基因進(jìn)行熒光檢測(cè)。Blocker 引物本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地，所述Blocker引物在突變區(qū)域附近(包含突變區(qū)域)設(shè)計(jì)，且Blocker引物與突變區(qū)域的野生型序列完全互補(bǔ)且3’末端進(jìn)行修飾以阻止其延伸。本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地，所述Blocker引物的長(zhǎng)度為15 35bp。本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地，所述Blocker引物的相關(guān)參數(shù)可為:Tm值65.(TC -85.0°C，GC 值 40.0% -65.0%，引物大小 25± IObp。本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地，在所述Blocker引物的3’末端進(jìn)行雙脫氧堿基修飾，或者使用其他的化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行修飾如:C3Spacer或磷酸化修飾。本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述Blocker引物在合成過(guò)程中在其序列中直接引入化學(xué)基團(tuán)提高其Tm值，例如，MGB修飾。本發(fā)明中，優(yōu)選地，在所述Blocker引物的5’末端進(jìn)行去磷酸化修飾，以阻止其被Taq聚合酶酶切降解。
ARMS 引物本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地，所述ARMS引物可擴(kuò)增一段60_150bp片段的產(chǎn)物，所述ARMS引物的相關(guān)參數(shù)可為:Tm值55.(TC-60.(TC，GC值40.0%-60.0%，引物大小20±5bp。
本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地，所述ARMS引物3’末端堿基與所述突變基因的突變堿基
完全一致。本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地，所述ARMS引物的3’末端可位于突變區(qū)域處，并與突變型基因的突變堿基序列一致。為提高特異性，優(yōu)選地，可在所述ARMS引物的3’末端第2個(gè)、第3個(gè)堿基或第4個(gè)堿基處再引入一個(gè)錯(cuò)配堿基。具體而言，當(dāng)所述突變?yōu)辄c(diǎn)突變時(shí)，ARMS引物的3’末端堿基可為突變位點(diǎn)處堿基；當(dāng)所述突變?yōu)槿笔蛔儠r(shí)，ARMS引物的3’末端堿基可為與缺失堿基相鄰的下一個(gè)堿基；當(dāng)所述突變?yōu)椴迦胪蛔儠r(shí)，ARMS引物的3’末端堿基可為插入堿基。本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地，所述Blocker引物的退火溫度比所述ARMS引物的退火溫度高5 25°C。更優(yōu)選地，所述Blocker引物的退火溫度比所述ARMS引物的退火溫度高20 25°C。探針在ARMS引物擴(kuò)增片段內(nèi)設(shè)計(jì)探針，所述探針的相關(guān)參數(shù)為:Tm值68.(TC-70.(TC，GC值40.0% -70.0%,對(duì)探針進(jìn)行5’端FAM標(biāo)記，3’端標(biāo)記相應(yīng)的淬滅熒光基團(tuán)TAMAR或者 BHQ。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種EGFR基因點(diǎn)突變I790M的一步檢測(cè)方法，其特征在于，所述 Blocker 引物的序列為 5’ -TGCAGCTCATCACGCAGCTCATG-3 ’ ddC (SEQ IDNO:1)，所述上游 ARMS 引物的序列為:5，-CACCGTGCAGCTCATTAT-3，(SEQ ID NO:2)，下游引物的序列為:5’ -CACACACCAGITGAGCAGGTACT-3’ (SEQ ID NO:3);所述 Taqman 探針的序列為:5’-CCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGT-3’ (SEQ ID NO:4)。優(yōu)選地，反應(yīng)條件為:1)95°C 5 分鐘；95°C 15 秒、80°C 20 秒、60°C 30 秒、72°C 20 秒，共 5 個(gè)循環(huán)；2)95°C 15 秒、80°C 20 秒、60 0C 45秒(收集熒光)，共40個(gè)循環(huán)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種EGFR基因19外顯子缺失(E746_A750缺失突變)的一步檢測(cè)方法，其特征在于，所述Blocker引物的序列為:5’ -CAAGGAATTAAGAGAAGCAACATC-3’ ddC(SEQ ID NO:9),上游 ARMS 引物的序列為:5’ -AATTCCCGTCGCTATCAAAAC-3’ (SEQ ID NO: 10)，下游弓I 物的序列為:5’-ACCCCCACACAGCMAGC-3’(SEQ ID NO:11)，所述Taqman 探針的序列為:5’_CCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTG-3’ (SEQ ID NO:12)。優(yōu)選地，反應(yīng)條件為:1)95°C 5 分鐘；95°C 15秒、80°C 20 秒、60°C 30 秒、72°C 20 秒，共 5 個(gè)循環(huán)；2)95°C 15 秒、80°C 20 秒、60°C 45 秒(收集熒光)，共40個(gè)循環(huán)。 根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了一種基因突變的檢測(cè)試劑盒，包括=Blocker引物、ARMS引物以及5’端FAM標(biāo)記的Taqman探針，其中，所述Blocker引物為與所檢測(cè)突變區(qū)域的野生型序列完全互補(bǔ)且3’末端進(jìn)行修飾以阻止其延伸的寡核苷酸，所述ARMS引物3’末端位于突變區(qū)域處，可擴(kuò)增包含待測(cè)基因突變區(qū)域的片段并且與突變型序列一致，其中，所述Blocker引物的退火溫度高于ARMS引物的退火溫度。其中，突變型序列是指點(diǎn)突變、缺失或者插入堿基的核苷酸序列。
Blocker 引物本發(fā)明的試劑盒中，優(yōu)選地，所述Blocker引物在突變區(qū)域附近(包含突變區(qū)域)設(shè)計(jì)，且blocker引物與突變區(qū)域的野生型序列完全互補(bǔ)且3’末端進(jìn)行修飾以阻止其延伸。本發(fā)明的試劑盒中，優(yōu)選地，所述Blocker引物的長(zhǎng)度為15 35bp。本發(fā)明的試劑盒中，優(yōu)選地，所述Blocker引物的相關(guān)參數(shù)可為:Tm值65.(TC -85.0°C，GC 值 40.0% -65.0%，引物大小 25± IObp。本發(fā)明的試劑盒中，優(yōu)選地，在所述Blocker引物的3 ’末端進(jìn)行雙脫氧堿基修飾。本發(fā)明試劑盒中，優(yōu)選地，所述Blocker引物在合成過(guò)程中在其序列中直接引入化學(xué)基團(tuán)提高其Tm值，例如，MGB修飾。本發(fā)明的試劑盒中，優(yōu)選地，在所述Blocker引物的5’末端進(jìn)行去磷酸化修飾，以阻止其被Taq聚合酶酶切降解。ARMS 引物本發(fā)明的試劑盒中，優(yōu)選地，所述ARMS引物可擴(kuò)增一段60_150bp片段的產(chǎn)物，所述ARMS引物的相關(guān)參數(shù)可為:Tm值55.(TC -60.(TC，GC值40.0% -60.0%，引物大小20±5bp。本發(fā)明的試劑盒·中，優(yōu)選地，所述ARMS引物的3’末端位于突變區(qū)域處，并與突變型基因序列一致。為提高特異性，可在所述ARMS引物的3’末端第2、或第3個(gè)堿基或第4個(gè)堿基處再引入一個(gè)錯(cuò)配堿基。具體而言，當(dāng)所述突變?yōu)辄c(diǎn)突變時(shí)，ARMS引物的3’末端堿基可為突變位點(diǎn)處堿基；當(dāng)所述突變?yōu)槿笔蛔儠r(shí)，ARMS引物的3’末端堿基可為與缺失堿基相鄰的下一個(gè)堿基；當(dāng)所述突變?yōu)椴迦胪蛔儠r(shí)，ARMS引物的3’末端堿基可為插入堿基。本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述Blocker引物的退火溫度比所述ARMS引物的退火溫度高5 25°C。更優(yōu)選地，所述Blocker引物的退火溫度比所述ARMS引物的退火溫度高20 25。。。Mt在ARMS引物擴(kuò)增片段內(nèi)設(shè)計(jì)探針，所述探針的相關(guān)參數(shù)為:Tm值68.(TC-70.(TC，GC值40.0% -70.0%,對(duì)探針進(jìn)行5’端FAM標(biāo)記，3’端標(biāo)記相應(yīng)的淬滅熒光基團(tuán)TAMAR或者 BHQ。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種EGFR基因點(diǎn)突變I790M的一步檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述 Blocker 引物的序列為 5’-TGCAGCTCATCACGCAGCTCATG-3’ ddC (SEQ IDNO:1)，所述上游 ARMS 引物的序列為:5，-CACCGTGCAGCTCATTAT-3，(SEQ ID NO:2)，下游引物的序列為:5’ -CACACACCAGITGAGCAGGTACT-3’ (SEQ ID NO:3);所述 Taqman 探針的序列為:5’ -CCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGT-3’ (SEQ ID NO:4)。優(yōu)選地，反應(yīng)條件為:1)95°C 5分鐘；95°C 15 秒、80°C 20 秒、60°C 30 秒、72°C 20 秒，共 5 個(gè)循環(huán)；2)95°C 15 秒、80°C 20 秒、60 0C 45秒(收集熒光)，共40個(gè)循環(huán)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種EGFR基因19外顯子缺失(E746A750缺失突變)的一步檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述Blocker引物的序列為:5’ -CAAGGAATTAAGAGAAGCAACATC-3’ ddC (SEQ ID NO:9),上游 ARMS 引物的序列為:5’ -AATTCCCGTCGCTATCAAAAC-3’ (SEQ ID NO:10)，下游弓I 物的序列為:5’ -ACCCCCACACAGCAAAGC-3’ (SEQ ID NO:11)，所述 Taqman 探針的序列為:5’ -CCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTG-3’ (SEQ ID NO:12)。優(yōu)選地，反應(yīng)條件為:1)95°C 5 分鐘；95°C 15秒、80°C 20 秒、60°C 30 秒、72°C 20 秒，共 5 個(gè)循環(huán)；2)95°C 15 秒、80°C 20 秒、60°C 45 秒(收集熒光)，共40個(gè)循環(huán)。本文所用術(shù)語(yǔ)“突變型序列”是指點(diǎn)突變、缺失或者插入堿基的核苷酸序列。本文所用術(shù)語(yǔ)“突變區(qū)域”是指突變位點(diǎn)、序列缺失或者序列插入位點(diǎn)。本文所用術(shù)語(yǔ)“一致”是指與檢測(cè)的突變區(qū)域的核苷酸序列相同或者互補(bǔ)，在本文具體實(shí)施方式
中所列是與檢測(cè)的突變區(qū)域的核苷酸序列相同的情況。本發(fā)明中，根據(jù)退火溫度來(lái)設(shè)計(jì)相應(yīng)的blocker引物,在blocker的退火溫度下，Blocker引物與野生型模板結(jié)合，阻斷野生型的擴(kuò)增，同時(shí)使用ARMS技術(shù)來(lái)降低野生型背景的擴(kuò)增。本發(fā)明通過(guò)將Blocker富集技術(shù)以及ARMS熒光定量PCR技術(shù)整合在一個(gè)反應(yīng)體系中，一步即可實(shí)現(xiàn)對(duì)突變基因的富集和鑒定，減少了操作步驟，提高了檢測(cè)靈敏度和特異性。


圖1顯示1790位點(diǎn)野生型質(zhì)粒在加入Blocker引物和未加入Blocker引物的情況下的擴(kuò)增曲線。A:1790位點(diǎn)野生型質(zhì)粒IO7個(gè)拷貝/iil背景下未加入Blocker引物，B:1790位點(diǎn)野生型質(zhì)粒IO7個(gè)拷貝/iil背景下加入Blocker引物。圖2顯示1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒在未加入Blocker引物的情況下的擴(kuò)增曲線。A:1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒IO4個(gè)拷貝/iU，B:1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒IO3個(gè)拷貝/iU，C:1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒IO2個(gè)拷貝/ yl，D:1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒10個(gè)拷貝/ ill。 圖3顯示1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒在加入Blocker引物的情況下的擴(kuò)增曲線。A:T790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒IO4個(gè)拷貝/ Ul，B:1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒IO3個(gè)拷貝/iU，C:1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒IO2個(gè)拷貝/ yl，D:1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒10個(gè)拷貝/ ill。圖4顯示1790位點(diǎn)突變型質(zhì)?；旌显贗O7個(gè)拷貝/ iU野生型背景質(zhì)粒在加入Blocker引物條件擴(kuò)增曲線。A:1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒IO4個(gè)拷貝/yl，B:1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒IO3個(gè)拷貝/ Ul，C:1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒IO2個(gè)拷貝/ Ul，D:1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒10個(gè)拷貝/u I。 圖5顯示1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒混合在IO7個(gè)拷貝/ U I野生型背景質(zhì)粒在未加入Blocker條件擴(kuò)增曲線。A:1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒IO4個(gè)拷貝/yl，B:1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒IO3個(gè)拷貝/ Ul，C:1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒IO2個(gè)拷貝/iil，D:1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒10個(gè)拷貝/u I。圖6顯示19缺失位點(diǎn)野生型質(zhì)粒在加入Blocker引物和未加入Blocker引物的情況下的擴(kuò)增曲線。A:19缺失位點(diǎn)野生型質(zhì)粒IO7個(gè)拷貝/iU背景下未加入Blocker引物，B:19缺失位點(diǎn)野生型質(zhì)粒IO7個(gè)拷貝/ Ul背景下加入Blocker引物。圖7顯示19缺失突變型質(zhì)粒在未加入Blocker引物的情況下的擴(kuò)增曲線。A:19缺失突變型質(zhì)粒IO4個(gè)拷貝/ Ul，B: 19缺失突變型質(zhì)粒IO3個(gè)拷貝/yl，C: 19缺失突變型質(zhì)粒IO2個(gè)拷貝/yl，D:19缺失突變型質(zhì)粒10個(gè)拷貝/yl。
圖8顯示19缺失變型質(zhì)粒在加入Blocker引物的情況下的擴(kuò)增曲線。A:19缺失突變型質(zhì)粒IO4個(gè)拷貝/ Ul，B: 19缺失突變型質(zhì)粒IO3個(gè)拷貝/yl，C: 19缺失突變型質(zhì)粒IO2個(gè)拷貝/ yl，D:19缺失突變型質(zhì)粒10個(gè)拷貝/ Pi。圖9顯示19缺失突變型質(zhì)?；旌显贗O7個(gè)拷貝/iU野生型背景質(zhì)粒在加入Blocker引物條件擴(kuò)增曲線。A:1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒IO4個(gè)拷貝/yl，B: 1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒IO3個(gè)拷貝/iU，C:1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒IO2個(gè)拷貝/iU，D:1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒10個(gè)拷貝/u 1圖10顯示19缺失突變型質(zhì)粒混合在IO7個(gè)拷貝/ Ul野生型背景質(zhì)粒在未加入Blocker條件擴(kuò)增曲線。A:1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒IO4個(gè)拷貝/yl，B:1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒IO3個(gè)拷貝/ Ul，C:1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒IO2個(gè)拷貝/iil，D:1790位點(diǎn)突變型質(zhì)粒10個(gè)拷貝/U I。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例實(shí)施例1EGFR基因點(diǎn)突變I790M的突變阻斷富集ARMS熒光定量PCR —步檢測(cè)方法1.引物和探針設(shè)計(jì)I) Blocke r 引物設(shè)計(jì)在突變位點(diǎn)附近(包含突變位點(diǎn))設(shè)計(jì)引物，3’末端進(jìn)行雙脫氧堿基修飾，以阻止其延伸并提高其退火溫度。相關(guān)參數(shù)為:Tm值63.(TC -80.(TC，GC值40.0% -65.0%，引物大小 25 ± IObp。所設(shè)計(jì)的Blocker引物序列如下:Blocker 引物:5，-TGCAGCTCATCACGCAGCTCATG-3，ddC (SEQ ID NO:1)2) ARMS引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)可擴(kuò)增一段60_150bp片段的引物，相關(guān)參數(shù)為:1'111值55.01: -60.0°C，GC值40.0% -60.0%，引物大小20±3bp。上游ARMS引物的3’末端位于突變位點(diǎn)處，并與突變型基因相一致，為提高特異性，在其3’末端第3個(gè)堿基處再引入一個(gè)錯(cuò)配堿基，所設(shè)計(jì)的ARMS引物序列如下:上游ARMS 引物:5’ -CACCGTGCAGCTCATTAT-3，(SEQ ID NO:2)下游引物:5’-CACACACCAGITGAGCAGGTACT-3’ (SEQ ID NO:3)3)探針設(shè)計(jì)在ARMS引物擴(kuò)增片段內(nèi)設(shè)計(jì)探針，相關(guān)參數(shù)為:1'111值68.01: -70.0 °C, GC值40.0% -70.0%,對(duì)探針進(jìn)行5’端FAM標(biāo)記，其序列如下:探針:5，-CCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGT-3，(SEQID NO:4)實(shí)施例1中的Blocker引物，ARMS引物，引物和探針均由上海生物工程有限公司制備。2.待檢測(cè)樣品制備:
野生型質(zhì)粒構(gòu)建:分別使用含有1790位點(diǎn)的上游引物序列I (5’-1TCACAGCCCTGCGTAAAC-3’ (SEQ ID NO:5))和下游引物序列 I (5’-1TTCCACATGCAGATGGGAC-3，(SEQ ID NO:6))以人基因組為模板PCR擴(kuò)增(PCR反應(yīng)條件:1)95°C 5分鐘；95°C 15秒、55°C 30秒、72°C 20秒，共35個(gè)循環(huán)；72°C 10分鐘)后，將產(chǎn)物克隆至Takara公司pMD19載體，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后將樣本提取后備用。反應(yīng)體系如表I所示。表I
權(quán)利要求
1.一種基于Blocker引物和ARMS引物檢測(cè)基因突變的方法，在包括樣本DNA、Blocker弓丨物、ARMS引物、TaqMan探針、聚合酶及緩沖液的同一反應(yīng)體系中，依次進(jìn)行阻斷富集PCR反應(yīng)和ARMS熒光定量PCR反應(yīng)，該方法包括以下步驟 1)首先在Blocker引物的退火溫度下，Blocker引物與野生型模板優(yōu)先結(jié)合從而阻斷ARMS引物與野生型模板結(jié)合，然后在ARMS引物的退火溫度下，ARMS引物與突變型模板結(jié)合，通過(guò)PCR反應(yīng)富集擴(kuò)增樣本DNA中包含待測(cè)基因突變區(qū)域的片段，其中，所述Blocker引物為與所檢測(cè)突變區(qū)域的野生型序列完全互補(bǔ)且3’末端進(jìn)行修飾以阻止其延伸的寡核苷酸，所述ARMS引物的3’末端位于突變區(qū)域處，可擴(kuò)增包含待測(cè)基因突變區(qū)域的片段并且與突變型序列一致，其中，所述Blocker引物的退火溫度高于ARMS引物的退火溫度； 2)在反應(yīng)I)的基礎(chǔ)上，ARMS引物及5’端FAM標(biāo)記的Taqman探針通過(guò)熒光定量PCR反應(yīng)對(duì)所述突變基因進(jìn)行熒光檢測(cè)。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，優(yōu)選地，所述Blocker引物的長(zhǎng)度為15 35bp;優(yōu)選地，在所述Blocker引物的3’末端進(jìn)行雙脫氧堿基修飾；優(yōu)選地，在所述Blocker引物的5’末端進(jìn)行去磷酸化修飾，以阻止其被Taq聚合酶酶切降解；和/或，優(yōu)選地，在所述ARMS引物的3’末端第2個(gè)、第3個(gè)堿基或第4個(gè)堿基處再引入一個(gè)錯(cuò)配堿基。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，使所述Blocker引物的退火溫度比所述ARMS引物的退火溫度高5 25°C ;優(yōu)選地，所述Blocker引物的退火溫度比所述ARMS引物的退火溫度高20 25°C。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述基因突變?yōu)镋GFR基因點(diǎn)突變I790M，其中，所述 Blocker 引物的序列為 5’ -TGCAGCTCATCACGCAGCTCATG-3’ ddC (SEQ ID NO :1)，所述上游ARMS 引物的序列為:5，-CACCGTGCAGCTCATTAT-3’ (SEQ ID NO :2)，下游引物的序列為:5，-CACACACCAGITGAGCAGGTACT-3’(SEQ ID NO 3);所述Taqman探針的序列為5’_CCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGT-3’ (SEQ ID NO :4)。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述基因突變?yōu)镋GFR基因19外顯子缺失E746_A750 缺失突變，其中，所述 Blocker 引物的序列為5’-CAAGGAATTAAGAGAAGCAACATC-3’ddC(SEQ ID NO :9)，上游 ARMS 引物的序列為5’-AATTCCCGTCGCTATCAAAAC-3’(SEQ ID NO :10)，下游引物的序列為5’-ACCCCCACACAGCAAAGC-3’(SEQ ID NO :11)，所述Taqman探針的序列為5’ -CCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTG-3’ (SEQ ID NO: 12)。
6.一種基因突變的檢測(cè)試劑盒，包括BloCker引物、ARMS引物以及5’端FAM標(biāo)記的Taqman探針，其中，所述Blocker引物為與所檢測(cè)突變區(qū)域的野生型序列完全互補(bǔ)且3’末端進(jìn)行修飾以阻止其延伸的寡核苷酸，所述ARMS引物的3’末端位于突變區(qū)域處，可擴(kuò)增包含待測(cè)基因突變區(qū)域的片段并且與突變型序列一致，其中，所述Blocker引物的退火溫度高于ARMS引物的退火溫度。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中，優(yōu)選地，所述Blocker引物的長(zhǎng)度為15 35bp；優(yōu)選地，在所述Blocker引物的3’末端進(jìn)行雙脫氧堿基修飾；優(yōu)選地,在所述Blocker引物的5’末端進(jìn)行去磷酸化修飾，以阻止其被Taq聚合酶酶切降解；和/或，優(yōu)選地，在所述ARMS引物的3’末端第2個(gè)、第3個(gè)堿基或第4個(gè)堿基處再引入一個(gè)錯(cuò)配堿基。
8.如權(quán)利要求6或7所述的試劑盒,其中，使所述Blocker引物的退火溫度比所述ARMS引物的退火溫度高5 25°C ;優(yōu)選地，所述Blocker引物的退火溫度比所述ARMS引物的退火溫度高20 25°C。
9.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中，所述基因突變?yōu)镋GFR基因點(diǎn)突變I790M，其中，所述 Blocker 引物的序列為 5’ -TGCAGCTCATCACGCAGCTCATG-3’ ddC (SEQ ID NO :1)，所述上游ARMS引物的序列為:5，-CACCGTGCAGCTCATTAT-3’ (SEQ ID NO :2)，下游引物的序列為5’-CACACACCAGITGAGCAGGTACT-3’(SEQ ID NO 3);所述 Taqman 探針的序列為5’_CCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGT-3’ (SEQ ID NO :4)。
10.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中，所述基因突變?yōu)镋GFR基因19外顯子缺失E746_A750 缺失突變，其中，所述 Blocker 引物的序列為5’-CAAGGAATTAAGAGAAGCAACATC-3’ ddC (SEQ ID NO :9)，上游 ARMS 引物的序列為:5’-AATTCCCGTCGCTATCAAAAC_3’(SEQ ID NO :10)，下游引物的序列為5’-ACCCCCACACAGCAAAGC-3’(SEQ ID NO :11)，所述Taqman探針的序列為5’ -CCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTG-3’ (SEQ ID NO: 12)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基于Blocker引物和ARMS引物檢測(cè)基因突變的方法和試劑盒。本發(fā)明中，根據(jù)退火溫度來(lái)設(shè)計(jì)相應(yīng)的blocker引物，在blocker的退火溫度下，Blocker引物與野生型模板結(jié)合，阻斷野生型的擴(kuò)增，同時(shí)使用ARMS技術(shù)來(lái)降低野生型背景的擴(kuò)增。本發(fā)明通過(guò)將Blocker富集技術(shù)以及ARMS熒光定量PCR技術(shù)整合在一個(gè)反應(yīng)體系中，一步即可實(shí)現(xiàn)對(duì)突變基因的富集和鑒定，減少了操作步驟，提高了檢測(cè)靈敏度和特異性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103255201SQ20121003566
公開(kāi)日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2012年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月16日
發(fā)明者陳唯軍, 劉利成, 趙金銀, 馮華華, 吳偉力, 王鵬志, 劉琦, 徐磊 申請(qǐng)人:北京宏微特斯生物科技有限公司