專利名稱：獲得可溶性克隆表達(dá)的斑馬魚(yú)肌酸激酶蛋白方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種從大腸桿菌中快速、經(jīng)濟(jì)、高效地獲得克隆表達(dá)的可溶性斑馬魚(yú)肌酸激酶蛋白并驗(yàn)證的方法，為獲得融合表達(dá)蛋白研究提供便利，具有廣泛的科研價(jià)值和應(yīng)用前景。
背景技術(shù)：
腸埃希氏菌(E. coli)通常稱為大腸桿菌，是細(xì)菌的一種，由Escherich在1885年發(fā)現(xiàn)。根據(jù)不同的生物學(xué)特性將致病性大腸桿菌分為5類致病性大腸桿菌(EPEC)、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)、腸黏附性大腸桿菌(EAEC)。大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的宿主，遺傳背景清楚，技術(shù)操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)，倍受遺傳工程專家的重視。目前大腸桿菌是應(yīng)用最廣泛，最成功的表達(dá)體系，常做高效表達(dá)的首選體系。肌酸激酶(Creatine Kinase, CK) (ATP -Creatine N-phosphotransferase EC 2. 7. 3. 2)通常存在于動(dòng)物的心臟、肌肉以及腦等組織的細(xì)胞漿和線粒體中，是一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶，它可逆地催化肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷酰基反應(yīng)，可作為研究蛋白質(zhì)折疊的理想模型。肌酸激酶是心肌梗塞和骨骼肌疾病等的臨床診斷方面的一個(gè)重要指標(biāo)。斑馬魚(yú)(zebra fish)，又名藍(lán)條魚(yú)、花條魚(yú)、斑馬擔(dān)尼魚(yú)(Brachydanio rerio)，原產(chǎn)于印度、孟加拉國(guó)。斑馬魚(yú)由于個(gè)體小，養(yǎng)殖花費(fèi)少，能大規(guī)模繁育，其基因與人類87%相似，且具許多優(yōu)點(diǎn)，吸引了眾多研究者的注意。經(jīng)過(guò)30多年的研究應(yīng)用和系統(tǒng)發(fā)展，斑馬魚(yú)的細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)、組織移植技術(shù)、突變技術(shù)、單倍體育種技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因活性抑制技術(shù)等已經(jīng)成熟，且有數(shù)以千計(jì)的斑馬魚(yú)胚胎突變體，是研究胚胎發(fā)育分子機(jī)制的優(yōu)良資源， 有的還可做為人類疾病模型。斑馬魚(yú)已經(jīng)成為最受重視的脊椎動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)模式之一， 在其它學(xué)科上的利用也顯示很大的潛力。目前，常用的破碎大腸桿菌獲得目的蛋白的方法有超聲破碎、玻璃珠破碎等機(jī)械法，干燥法、凍融法等物理法、化學(xué)試劑處理、酶解法等化學(xué)方法。傳統(tǒng)的凍融法是在_20°C以下，而且所適用于動(dòng)物性材料，對(duì)微生物作用較差。傳統(tǒng)的酶解法一個(gè)是濃度的問(wèn)題，濃度一般為300μ g/mL-lmg/ml，濃度太高，容易造成產(chǎn)物抑制作用；此外含量過(guò)高在鎳柱純化時(shí)候容易堵塞柱子，給進(jìn)一步純化帶來(lái)困難。此外，溶菌酶的處理時(shí)間均需要Ih以上，不同的菌種需選擇不同的酶，不適宜大量方便快捷蛋白質(zhì)提取。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種快速、經(jīng)濟(jì)、高效地破碎大腸桿菌獲得可溶性克隆表達(dá)的斑馬魚(yú)肌酸激酶蛋白方法，采用該方法能有效獲得高質(zhì)量且含量高的總蛋白，包括目的蛋白。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種獲得可溶性克隆表達(dá)的斑馬魚(yú)肌酸激酶蛋白方法，依次包括以下步驟1)、在導(dǎo)入ckmt2基因的大腸桿菌的菌液中加入IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)至 IPTG的終濃度0. 9 1. ImM ；220rpm、36. 5 37. 5°C培養(yǎng)搖床振蕩繼續(xù)培養(yǎng)4. 5 5. 5小時(shí)；所述菌液的OD6tltlnm 為 0. 4 0. 6 ；OD是optical density (光密度)的縮寫，表示被檢測(cè)物吸收掉的光密度， nanodrop儀器檢測(cè)；2)、將步驟1)的所得菌液先于IlOOOg 13000g離心9 llmin，棄上清，所得的沉淀中先加入PBS重懸，重懸后再加入溶菌酶，使溶菌酶的終濃度為180 220 μ g/mL ；3)、先將上述步驟的所得物于36. 5 37. 5°C處理8 12min，然后于液氮中冰凍 38 42秒；再于室溫中自然解凍至液態(tài)；4)、重復(fù)上述步驟3) 2次；5)、將步驟4)的所得物先于IlOOOg 13000g離心9 llmin，取上清，所述上清
中含有可溶性的斑馬魚(yú)肌酸激酶融合蛋白。作為本發(fā)明的獲得可溶性克隆表達(dá)的斑馬魚(yú)肌酸激酶蛋白方法的改進(jìn)步驟1)為在導(dǎo)入ckmt2基因的大腸桿菌的菌液加入IPTG至IPTG的終濃度ImM; 220rpm、37°C培養(yǎng)搖床振蕩繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)；步驟2)為使溶菌酶的終濃度為200 μ g/mL ；步驟幻為先將上述步驟的所得物于37°C處理lOmin，然后于液氮中冰凍40秒； 再于室溫中自然解凍至液態(tài)。在步驟2)中，每Iml的步驟1)的所得菌液配用80 120 μ L的PBS (即PBS緩沖液)。采用本發(fā)明的方法破碎大腸桿菌后，通過(guò)離心、加熱等預(yù)處理方法，從而獲得蛋白，并進(jìn)行驗(yàn)證。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法得出以下結(jié)論，證明了加溶菌酶處理后液氮反復(fù)凍融具有良好的效果，操作簡(jiǎn)便，可大規(guī)模使用，獲得克隆表達(dá)的肌酸激酶蛋白。本發(fā)明的有益效果(1)本發(fā)明優(yōu)化得到一系列高效的破碎大腸桿菌的方法，解決了超聲波破碎體積小的問(wèn)題；同時(shí)操作起來(lái)方便快速，比純粹的反復(fù)凍融效果佳，此外更溶于獲得目的蛋白。(2)通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)破碎后的細(xì)胞總蛋白，該方法獲得的目的蛋白，溶于上清，可能是活性蛋白，減少包涵體蛋白變性復(fù)性過(guò)程的損失，為直接純化、活性的檢測(cè)等進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)材料。(3)采用加溶菌酶處理后液氮反復(fù)凍融方法破碎大腸桿菌，獲得總蛋白方法，使用量較少的酶，相比傳統(tǒng)的酶的方法經(jīng)濟(jì)，且可用于大規(guī)模的生產(chǎn)， 此外在處理后液氮環(huán)境下反復(fù)凍融，操作簡(jiǎn)單，快速，能夠短時(shí)間處理大批量的樣本，在節(jié)省成本和時(shí)間的同時(shí)獲得目的蛋白。綜上所述，本發(fā)明所建立的快速、經(jīng)濟(jì)、高效破碎大腸桿菌獲得目的蛋白并通過(guò) SDS-PAGE驗(yàn)證的方法，數(shù)據(jù)可靠，具有廣泛的科研價(jià)值和應(yīng)用前景。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。圖1為直接液氮環(huán)境下反復(fù)凍融和加了溶菌酶反復(fù)凍融的上清和沉淀SDS-PAGE 分析圖的一部分；圖2為直接液氮環(huán)境下反復(fù)凍融和加了溶菌酶反復(fù)凍融的上清和沉淀SDS-PAGE 分析圖的另一部分；圖1和圖2中7到12為液氮反復(fù)凍融三次，不加溶菌酶的上清，15和16分別是其7和10的沉淀。1到6為液氮反復(fù)凍融三次，溶菌酶終濃度為200 μ g/mL的上清，13和14為其2和5 的沉淀?？煽闯黾佑腿芫斧@得蛋白含量明顯多于沒(méi)有加的，此外作者實(shí)驗(yàn)克隆表達(dá)的蛋白在47KD左右(m表示maker，第一條帶(最下面為第一條帶)為最小，分子量為14. 4KD， 第五條帶為45KD)，加有溶菌酶的在沉淀和上清都有，沒(méi)有加的都在沉淀里面，其上清蛋白基本沒(méi)有。圖3超聲波破碎后上清和沉淀圖；圖3中1、3為沉淀，2、4為上清，可見(jiàn)目的蛋白，但是只適合在小體積應(yīng)用(m表示 maker，第一條帶為最小，分子量為14. 4KD，第五條帶為45KD)。圖4為直接加溶菌酶處理后是SDS-PAGE檢測(cè)圖；圖4中6和8為處理后上清，7和9為沉淀?？梢?jiàn)上清中并沒(méi)有目的條帶，而沉淀處理后更難以分清，可見(jiàn)單獨(dú)處理的效過(guò)并不佳。(m表示maker，第一條帶為上圖中maker 的五條帶，大小為45KD)；圖中的1為空白孔道，2到3為重復(fù)實(shí)驗(yàn)上清，4、5為沉淀。可見(jiàn)沉淀處理結(jié)果處理并不理想，沉淀電泳時(shí)更是陳現(xiàn)模糊狀態(tài)，破碎效果不佳。因此，在此處理下，上清中并沒(méi)有目的條帶，沉淀電泳結(jié)果顯示破碎處理效果并不佳。圖5為west-blot檢測(cè)克隆的蛋白，同全魚(yú)提取的作為對(duì)照(如圖中1_6所示，為全魚(yú)提取的蛋白做west-blot檢測(cè)，共提取6條魚(yú)做的重復(fù)，顯示條帶為肌酸激酶蛋白)， 7-9為純化后蛋白，驗(yàn)證克隆表達(dá)的為目的所需蛋白，因克隆表達(dá)純化需要，克隆蛋白上有組氨酸標(biāo)簽，比全魚(yú)提取大十幾KD。(m為maker，圖上第4條帶大小為40KD，第5條帶為 55KD)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中使用的均為以構(gòu)建好的表達(dá)菌種樣本。實(shí)驗(yàn)試劑均為常用的分子生物學(xué)試劑，主要有IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)、溶菌酶，聚丙烯酰胺等常用試劑均購(gòu)于上海生工公司。純化鎳柱購(gòu)自北京中科院過(guò)程研究所， 一抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，二抗購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。實(shí)施前處理操作(依次進(jìn)行以下步驟)(1)提取斑馬魚(yú)totalRNA，根據(jù)下述設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增斑馬魚(yú)ckmt2基因，引物的兩端加入合適的雙酶切酶切位點(diǎn)，對(duì)擴(kuò)增后片段和質(zhì)粒PETjSa同時(shí)進(jìn)行雙酶切、割膠回收等操作后16°C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5 α感受態(tài)，在含kana終濃度為50 μ g/ml的固體LB培養(yǎng)基上涂板挑斑驗(yàn)證，提取質(zhì)粒送上海生工測(cè)序，測(cè)序驗(yàn)證后進(jìn)行第二次轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21感受態(tài)，在含kana終濃度為50 μ g/ml的固體LB培養(yǎng)基上涂板挑斑驗(yàn)證，同樣提取質(zhì)粒送上海生工測(cè)序，比對(duì)結(jié)果后對(duì)已驗(yàn)證的菌種，在含有終濃度為50μ g/ml kana (卡那霉素)的LB固體培養(yǎng)基上劃線涂板，37°C過(guò)夜。CKMT2Forward primer (弓 |物)CCGGATCCATGTTCAGTCGAGTGTCKMT2Reserve primer (弓 |物)ATTTGCGGCCGCTTTCTTGAACTGGGAC加的雙酶切位點(diǎn)為Bam HI Not I。(2)、IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，依次進(jìn)行以下步驟①、從平板中挑取1環(huán)單菌落加入5mL含有50 μ g/ml kana的LB液體培養(yǎng)基中。②、放入37°C培養(yǎng)搖床振蕩培養(yǎng)，220rpm培養(yǎng)過(guò)至OD6tltlnm為0. 5 (0D是optical density (光密度)的縮寫，表示被檢測(cè)物吸收掉的光密度，nanodrop儀器檢測(cè))。③、取50 μ L培養(yǎng)液(上述步驟②所得)加入5mL含有50 μ g/ml kana的LB培養(yǎng)基中。④、放入37°C培養(yǎng)搖床振蕩培養(yǎng)，220rpm培養(yǎng)至OD6tltlnm為0. 5 (約2 3小時(shí))。 得處理菌液。實(shí)施例1、一種快速、經(jīng)濟(jì)、高效地破碎大腸桿菌獲得可溶性克隆表達(dá)的斑馬魚(yú)肌酸激酶蛋白方法，進(jìn)行以下步驟1)、取上述處理菌液2. 5ml加入IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)至IPTG的終濃度 ImM ；220rpm、37°C培養(yǎng)搖床振蕩繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)，收集菌液。2)、取步驟1)所得的菌液lml，12000g離心lOmin，棄上清，所得的沉淀中加入 100 μ L PBS重懸，重懸后加入溶菌酶，使溶菌酶的終濃度為200 μ g/mL ；3)、先將上述步驟的所得物于37°C處理lOmin，然后于液氮中冰凍40秒；在室溫中自然解凍至液態(tài)；4)、重復(fù)上述步驟3) 2次；5)、如上處理后，對(duì)步驟4)的所得物12000g離心5min，從而使樣品上清和沉淀分開(kāi)，吸取上清至新的離心管，沉淀中再加入IOOyL PBS重懸。分別加入2 X SDS-PAGE Loading buffer 100 μ L，混勻，沸水中煮 lOmin，后 12000rpm 離心 SDS-PAGE 檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果為如圖1和圖2中的1到6和13、14所示，1到6為上清，13、14為沉淀，可見(jiàn)在上清中出現(xiàn)高比例的目的蛋白。實(shí)施例2、一種破碎大腸桿菌獲得可溶性克隆表達(dá)的斑馬魚(yú)肌酸激酶蛋白方法，將實(shí)施例1中步驟幻的預(yù)處理改成以下內(nèi)容不加溶菌酶，其余同實(shí)施例1。結(jié)果如圖1和圖2的7-12，以及15、16，7_12為上清，15、16為沉淀，可見(jiàn)蛋白基本在沉淀中出現(xiàn)。對(duì)照例、一種破碎大腸桿菌獲得可溶性克隆表達(dá)的斑馬魚(yú)肌酸激酶蛋白方法，將步驟幻的預(yù)處理改成以下內(nèi)容將菌液超聲波破碎15min，采用寧波新芝kientz-II D超聲波破碎儀，功率950W，工作k后間歇3s，共處理15min ；其余同實(shí)施例1。結(jié)果如圖3，沉淀中基本沒(méi)有目的蛋白，在上清中目的蛋白含量較多，此方法結(jié)果能取得同樣的效果，且時(shí)間較短，且操作簡(jiǎn)單，同時(shí)可大面積的操作。實(shí)施例3、一種破碎大腸桿菌獲得可溶性克隆表達(dá)的斑馬魚(yú)肌酸激酶蛋白方法，取消步驟i)的離心，即，在步驟1)所得的菌液中直接加溶菌酶至終濃度為200 μ g/mL,然后進(jìn)行步驟3)。結(jié)果如圖4，6和8為處理后上清，7和9為沉淀?？梢?jiàn)上清中并沒(méi)有目的條帶，而沉淀處理后更難以分清，可見(jiàn)單獨(dú)處理的效過(guò)并不佳。實(shí)驗(yàn)=SDS-PAGE檢測(cè)不同處理方法獲得的蛋白，粗略比較上述四種方法獲得的總蛋白含量和目的蛋白含量。鎳柱純化后用west-blot檢測(cè)。本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種新的從大腸桿菌中快速、經(jīng)濟(jì)、高效地獲得克隆表達(dá)的可溶性斑馬魚(yú)肌酸激酶蛋白，操作起來(lái)簡(jiǎn)便，并不需要特別的儀器，對(duì)所有的實(shí)例圖進(jìn)行分析， bandscan5. 0 (條帶分析軟件)分析可溶性蛋白在總蛋白中的含量，發(fā)現(xiàn)能獲得25%以上的可溶性蛋白，達(dá)到了并且超過(guò)了常規(guī)的超聲波儀器破碎的效果，同時(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了其他處理。 但超聲波儀器昂貴且破碎往往只適應(yīng)于小體積操作，本發(fā)明能大體積操作且價(jià)格便宜，結(jié)果適合其他實(shí)驗(yàn)繼續(xù)操作。具體如表1所示。表 權(quán)利要求
1.獲得可溶性克隆表達(dá)的斑馬魚(yú)肌酸激酶蛋白方法，其特征是依次包括以下步驟1)、在導(dǎo)入ckmt2基因的大腸桿菌的菌液中加入IPTG至IPTG的終濃度為0.9 1.ImM ； 220rpm、36. 5 37. 5°C培養(yǎng)搖床振蕩繼續(xù)培養(yǎng)4. 5 5. 5小時(shí)；所述菌液的OD6tltlnm為0. 4 0. 6 ；2)、將步驟1)的所得菌液先于IlOOOg 13000g離心9 llmin，棄上清，所得的沉淀中先加入PBS重懸，重懸后再加入溶菌酶，使溶菌酶的終濃度為180 220 μ g/mL ；3)、先將上述步驟的所得物于36.5 37. 5°C處理8 12min，然后于液氮中冰凍38 42秒；再于室溫中自然解凍至液態(tài)；4)、重復(fù)上述步驟；3)2次；5)、將步驟4)的所得物先于IlOOOg 13000g離心9 llmin，取上清，所述上清中含有可溶性的斑馬魚(yú)肌酸激酶融合蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲得可溶性克隆表達(dá)的斑馬魚(yú)肌酸激酶蛋白方法，其特征是所述步驟1)為在導(dǎo)入ckmt2基因的大腸桿菌的菌液加入IPTG至IPTG的終濃度ImM; 220rpm、37°C培養(yǎng)搖床振蕩繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)；所述步驟2、為使溶菌酶的終濃度為200 μ g/mL ；所述步驟幻為先將上述步驟的所得物于37°C處理lOmin，然后于液氮中冰凍40秒； 再于室溫中自然解凍至液態(tài)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種獲得可溶性克隆表達(dá)的斑馬魚(yú)肌酸激酶蛋白方法，依次包括以下步驟1)、在導(dǎo)入ckmt2基因的大腸桿菌的菌液中加入IPTG至IPTG的終濃度為0.9～1.1mM；搖床培養(yǎng)；菌液的OD600nm為0.4～0.6；2)、將步驟1)的所得菌液先離心，棄上清，所得的沉淀中先加入PBS重懸，重懸后再加入溶菌酶，使溶菌酶的終濃度為180～220μg/mL；3)、先將上述步驟的所得物于36.5～37.5℃處理8～12min，然后于液氮中冰凍38～42秒；再于室溫中自然解凍至液態(tài)；4)、重復(fù)上述步驟3)2次；5)、將步驟4)的所得物先離心，取上清，上清中含有可溶性的斑馬魚(yú)肌酸激酶融合蛋白。
文檔編號(hào)C12N9/12GK102533690SQ201210035220
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月16日
發(fā)明者丁先鋒, 趙鐵軍, 郭江峰, 馬琴琴, 黃涵年 申請(qǐng)人:浙江理工大學(xué)