專利名稱：一種高效發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的方法，特別是一種利用誘導(dǎo)物低溫控制策略誘導(dǎo)提高重Coli BL21(DE3)發(fā)酵生產(chǎn)pro-TGase (谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原)的方法。
背景技術(shù)：
谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(TransglutaminaseEC 2. 3. 2. 13 全稱 R-glutaminyl-p印tide amine- y -glutayle-transferase簡稱TGase)，又稱轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或谷胺酰胺酰-肽 Y-谷氨酰胺?；D(zhuǎn)移酶，具有多種催化功能。它能夠通過催化蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)形成ε-(Y-谷氨?；?賴氨酸共價(jià)鍵，引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)、分子間發(fā)生交聯(lián)、蛋白質(zhì)和氨基酸之間的連接以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺基的水解。TCase具有的獨(dú)特催化功能，使其在許多領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。目前該酶廣泛用于食品工業(yè)，大量的研究報(bào)道來自TCase改善各類食品蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值，應(yīng)用范圍包括肉制品、水產(chǎn)品、乳制品、植物蛋白制品、可食性包裝等。通過TCase對食品蛋白的作用機(jī)理的研究，人們發(fā)現(xiàn)TCase催化蛋白交聯(lián)表現(xiàn)出一定的底物特異性。對底物蛋白進(jìn)行一定的變性處理(如化學(xué)改性、加熱、蛋白酶處理或物理方法)，可使Tfese更易接近底物，顯著提高酶的催化活性目前，國內(nèi)有關(guān)TGase的研究主要集中在鏈霉菌TGase的生產(chǎn)方面，包括篩選野生型產(chǎn)生菌、構(gòu)建基因工程菌及產(chǎn)酶條件研究和酶的應(yīng)用等方面。國內(nèi)除了泰興一鳴精細(xì)化工有限公司有較為成熟的產(chǎn)品外，其他還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。中科院微生物研究所、華南理工大學(xué)及本研究室相繼開展了 TCase重組菌的構(gòu)建研究。但是對TCase基因工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵過程優(yōu)化仍處于起步階段。Escherichia Coli作為外源基因表達(dá)的宿主，遺傳背景清楚，技術(shù)操作簡單，培養(yǎng)條件簡單，大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)，倍受遺傳工程專家的重視。目前 Escherichia Coli是應(yīng)用最廣泛，最成功的表達(dá)體系，常做高效表達(dá)的首選體系。在前期研究中，本研究室在分離篩選得到一株TCase高產(chǎn)菌株Sti^ptomyces hygroscopicus的基礎(chǔ)上,擴(kuò)增出編碼pro-TGase的基因，并成功表達(dá)Coli BL21(DE3)中。此菌株通過搖瓶初步發(fā)酵優(yōu)化后在體外加入蛋白酶活化后酶活最高可達(dá)5U/mL，如何提高酶的產(chǎn)量是一個(gè)長期困擾我們的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種高效發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的方法， 以解決谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原分泌量低的技術(shù)問題。本發(fā)明技術(shù)方案為以含有pET22b (+) -proTGase重組質(zhì)粒的Escherichia Coli BL21(DE3)為生產(chǎn)菌株(The pro-region of Streptomyces hygroscopicus transglutaminase affects its secretionby Escherichia coli, FEMS Microbiology Letters, 2011,324,98-105)，從甘油管中接50 μ L菌液于50mL LB中，過夜8-10h培養(yǎng)后將 IOOmL的種子接入3L全自動(dòng)發(fā)酵罐，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，培養(yǎng)溫度37°C，通氣量為lvvm。當(dāng)菌體濃度OD6tltl = 8時(shí)，開始加入0. 4mM的IPTG并降溫至20°C培養(yǎng)誘導(dǎo)pro-TGase的表達(dá)。所述改良TB培養(yǎng)基成分為(g/L):蛋白胨12，酵母膏24，甘油4-12g/L，17mmol/ LKH2P04,72mmol/L K2HP04，其中優(yōu)選TB培養(yǎng)基中，甘油濃度為8g/L。谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶活測定方法pro-TGase 的活化活化蛋白酶(dispase，12mg/mL) :0. 86mg dispase溶于500 μ L標(biāo)準(zhǔn)活化緩沖液 (50mMTris-HCl,300mM NaCl, 2mM CaCl2, ImM GSH, pH 7.0)?；罨^程將 4uL 活化蛋白酶添加至 IOOuL pro-TGase 溶液中，37°C溫育 2h?；罨?pro-TGase 時(shí)，13，000r/min 離心5min，取上清液即可進(jìn)行活化過程?；罨麅?nèi)pro-TGase時(shí)，取50D_樣品離心，沉淀用 500μ L50mmol/L Tris-HCl pH 8. 0 重懸。超聲破碎后，13，000r/min 離心 5min，取上清液進(jìn)行活化。比色法測定酶活參照程力碩士學(xué)位論文(吸水鏈霉菌產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的發(fā)酵條件優(yōu)化D)].無錫江南大學(xué)生物工程學(xué)院，2007.)。殘余甘油濃度測定見參照(張永生等，克拉維酸發(fā)酵液中碳源——甘油含量的比色法測定，天津科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2006, 21 (1) :14-17)采用本發(fā)明提供的方法，在添加IPTG低溫誘導(dǎo)策略在3L罐上發(fā)酵達(dá)到較高水平， 比原來發(fā)酵提高了約100%，具有很好的應(yīng)用前景。


圖1不同誘導(dǎo)0D_下對應(yīng)的菌體生長以及產(chǎn)酶變化圖2不同初始甘油濃度下對應(yīng)的菌體生長，產(chǎn)酶變化及殘余甘油濃度圖3初始甘油濃度為8g/L時(shí)對應(yīng)的發(fā)酵過程中菌體生長，產(chǎn)酶變化以及殘余甘油濃度
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 對數(shù)生長期控制溫度為37°C，當(dāng)菌體生長至0D_分別為4，6，8，10時(shí)降溫至20°C 添加終濃度為0. 4mM的IPTG以促進(jìn)pro-TCase高效表達(dá)。直至發(fā)酵結(jié)束，得到誘導(dǎo)0D_ = 8時(shí)酶活最高為6. 22U/mL,生產(chǎn)強(qiáng)度為0. 16U/mL/h(圖1)。實(shí)施例2:改變初始甘油濃度分別為4g/L，8g/L和12g/L，在OD6tltl = 8時(shí)誘導(dǎo)。培養(yǎng)條件同例 1，直至發(fā)酵結(jié)束(圖2)。初始甘油濃度為8g/L時(shí)酶活最高為9. 92U/mL，生產(chǎn)強(qiáng)度為021U/ mL/h，較之前的生產(chǎn)強(qiáng)度提高了 31. 25% (圖3)。
權(quán)利要求
1.一種高效發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原的方法，其特征在于以含有 pET22b(+)-proTGase重組質(zhì)粒的hcherichia Coli BL21(DE3)為生產(chǎn)菌株，活化后制備種子液，接種入3L改良TB培養(yǎng)基，采用全自動(dòng)發(fā)酵罐發(fā)酵，控制攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，培養(yǎng)溫度 37°C，通氣量為Ivvm ；當(dāng)菌體濃度達(dá)到0D_ = 8，時(shí)降溫至20°C同時(shí)并添加終濃度為0. 4mM 的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于改良TB培養(yǎng)基成分為(g/L)蛋白胨12，酵母膏 24，甘油 4-12g/L，17mmol/L KH2P04, 72mmol/L K2HP04。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述TB培養(yǎng)基中，甘油濃度為8g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種添加IPTG、低溫策略誘導(dǎo)提高重組Escherichia Coli(大腸桿菌)BL21(DE3)發(fā)酵生產(chǎn)pro-TGase(谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原)的方法。本發(fā)明采用分泌性表達(dá)載體pET22b重組Escherichia Coli BL21(DE3)為發(fā)酵菌株，初始生長階段控制溫度為37℃，當(dāng)菌體生長至一定菌體濃度時(shí)進(jìn)行降溫誘導(dǎo)，添加終濃度為0.4mM的IPTG，降溫至20℃，誘導(dǎo)pro-TGase的表達(dá)。通過在發(fā)酵過程中降低誘導(dǎo)階段溫度，最終實(shí)現(xiàn)了提高pro-TGase產(chǎn)量的目標(biāo)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能有效地提高pro-TGase的產(chǎn)量及生產(chǎn)強(qiáng)度，并減少發(fā)酵液中雜蛋白的含量，提高了下游提取時(shí)的效率，增加了產(chǎn)品純度，并且減少了能耗，有利于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/19GK102559628SQ20121003533
公開日2012年7月11日 申請日期2012年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月16日
發(fā)明者劉松, 堵國成, 張東旭, 張娟, 陳堅(jiān), 陳康康, 馬建龍 申請人:江南大學(xué)