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具有雙表達(dá)盒的谷氨酰胺合成酶高效表達(dá)載體的制作方法

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具有雙表達(dá)盒的谷氨酰胺合成酶高效表達(dá)載體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種可擴(kuò)增的同時(shí)具有兩個(gè)表達(dá)盒的谷氨酰胺合成酶表達(dá)載體,該表達(dá)載體主要元件由6大部分組成:第一表達(dá)盒元件、第二表達(dá)盒元件、f1復(fù)制子、谷氨酰胺合成酶表達(dá)盒元件、氨芐青霉素β內(nèi)酰胺酶水解表達(dá)盒元件和ColE1復(fù)制子,其中第一表達(dá)盒元件、第二表達(dá)盒元件中采用的是強(qiáng)的增強(qiáng)/啟動(dòng)子CMV立早增強(qiáng)子/啟動(dòng)子;谷氨酰胺合成酶表達(dá)盒元件中采用弱的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子SV40,降低谷氨酰胺合成酶的表達(dá),有利于高表達(dá)克隆的篩選。表達(dá)蛋白編碼基因分別通過(guò)多克隆位點(diǎn)A和多克隆位點(diǎn)B克隆至表達(dá)載體。該載體適于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中同時(shí)高效表達(dá)1-2種蛋白,特別適用于抗體蛋白的表達(dá)。
【專利說(shuō)明】具有雙表達(dá)盒的谷氨酰胺合成酶高效表達(dá)載體

【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥基因工程表達(dá)技術(shù),具體涉及一種用于高表達(dá)細(xì)胞株開(kāi)發(fā)的 載體的構(gòu)建及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 誕生于70年代末的生物制藥因其具有其他藥物無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn),已迅速成為制 藥工業(yè)中一個(gè)引人矚目的領(lǐng)域。生物技術(shù)的主要應(yīng)用領(lǐng)域是我國(guó)改善民生的重要組成部 分,我國(guó)龐大的人口基數(shù)和巨大的藥物消費(fèi)增長(zhǎng)潛力,為我國(guó)生物技術(shù)的發(fā)展提供了比國(guó) 外更為廣闊的市場(chǎng)需求和發(fā)展?jié)摿ΑI镏扑幍膽?yīng)用主要在這幾個(gè)領(lǐng)域:各種腫瘤、自身免 疫性疾病(如紅斑狼瘡、哮喘、多發(fā)性硬化癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等)、糖尿病、心血管疾病等多 發(fā)病、常見(jiàn)病的診斷和治療。近年來(lái),生物制藥全球生物技術(shù)藥物增長(zhǎng)率為15%?33%,遠(yuǎn) 高于年增長(zhǎng)率為7%?10%的傳統(tǒng)制藥業(yè),其總銷售額占藥物市場(chǎng)總額的比例從2000年的 9%上升至2014年的23%。生物技術(shù)藥物2014年銷售總額估計(jì)可達(dá)1690億美元,其中單 抗藥物至少占一半。
[0003] 生物制藥研究與開(kāi)發(fā)的主要環(huán)節(jié)包括:基因的克隆和基因工程菌的構(gòu)造;重組 細(xì)胞獲得和篩選;目的產(chǎn)物的分離純化等技術(shù)環(huán)節(jié)。目前已有多種表達(dá)系統(tǒng)用于生產(chǎn)具 有醫(yī)療價(jià)值的人或動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)藥物,主要的表達(dá)系統(tǒng)有原核表達(dá)系統(tǒng)(大腸桿菌, E. coli)、酵母、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)因哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi) 有蛋白折疊形成正確立體空間構(gòu)象所需要的分子伴侶,表達(dá)的糖基化蛋白藥物在分子結(jié) 構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然蛋白分子,因而越來(lái)越受到重視。哺乳動(dòng)物細(xì) 胞表達(dá)體系主要由宿主細(xì)胞和表達(dá)載體兩部分組成。表達(dá)細(xì)胞以中國(guó)卵巢癌細(xì)胞(CH0)表 達(dá)體系最具代表性。蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的過(guò)程是重組表達(dá)載體與宿主細(xì)胞之間相互 作用的一個(gè)復(fù)雜過(guò)程,包括5個(gè)相對(duì)獨(dú)立的環(huán)節(jié):重組表達(dá)載體在宿主細(xì)胞染色體上的定 位,主要指整合位點(diǎn)和基因拷貝數(shù);蛋白mRNA的轉(zhuǎn)錄,包括轉(zhuǎn)錄效率和穩(wěn)定性;蛋白藥物基 因的翻譯;蛋白藥物的翻譯后加工、組裝;蛋白藥物的分泌等。
[0004] 表達(dá)載體系統(tǒng)是獲得高效表達(dá)細(xì)胞株的關(guān)鍵,在確定宿主細(xì)胞后,蛋白藥物的表 達(dá)量很大程度上由其表達(dá)載體的各表達(dá)調(diào)控元件及組成方式?jīng)Q定。一般來(lái)講,表達(dá)載體包 括以下幾種基本元件:骨架序列、選擇性標(biāo)志基因、表達(dá)盒以及一些調(diào)控序列。根據(jù)基因拷 貝數(shù)是否擴(kuò)增,表達(dá)載體可分為2類:可擴(kuò)增和不可擴(kuò)增表達(dá)的載體系統(tǒng)。可擴(kuò)增載體系統(tǒng) 具有特殊的選擇標(biāo)志基因在外加的選擇壓力下實(shí)現(xiàn)宿主細(xì)胞染色體上的基因拷貝數(shù)的擴(kuò) 增,并可以連帶兩側(cè)的序列一同擴(kuò)增,從而提高目的蛋白基因在宿主細(xì)胞染色體上的基因 拷貝數(shù)。不可擴(kuò)增的表達(dá)載體系統(tǒng)則在選擇壓力下不具備基因拷貝數(shù)的擴(kuò)增。雖然目的基 因低拷貝的載體也能達(dá)到較高水平的蛋白表達(dá)量,但若使用可擴(kuò)增表達(dá)載體可轉(zhuǎn)錄出更多 的目的蛋白的mRNA,更易獲得目的蛋白的高效表達(dá)。實(shí)現(xiàn)蛋白藥物產(chǎn)業(yè)化絕大多數(shù)采用可 擴(kuò)增表達(dá)載體。
[0005] 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)中,常用的可擴(kuò)增選擇標(biāo)志基因最常用的基因篩 選擴(kuò)增系統(tǒng)有二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)系統(tǒng)和谷氨酰胺合 成酶(glutamine synthetase, GS)系統(tǒng)。二氫葉酸還原酶能夠被葉酸類似物氨甲碟呤 (methotrexate,MTX)所抑制,含有的目的基因及與之相連的DHFR基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 CHO DHFR-細(xì)胞,利用濃度不斷提高的MTX選擇出抗MTX的高表達(dá)細(xì)胞系,DHFR基因及與 之相連的目的基因一起擴(kuò)增500-2000倍,從而使目的基因表達(dá)水平提高數(shù)百倍。谷氨酰 胺合成酶(glutamine synthetase, GS)系統(tǒng)是近年來(lái)新發(fā)展的一種基因篩選擴(kuò)增系統(tǒng)。 谷氨酰胺合成酶在ATP水解提供能量時(shí),利用細(xì)胞內(nèi)的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺,在缺乏 外加谷氨酰胺的培養(yǎng)條件下,加入谷氨酰胺合成酶的抑制劑蛋氨酸磺酰胺(methionine sulphoximine,MSX),可使GS基因及與之相連的目的基因擴(kuò)增,達(dá)到提高目的基因表達(dá)水 平的目的。GS較DHFR系統(tǒng)有明顯的優(yōu)越性:該系統(tǒng)不需要基因缺陷型的CH0細(xì)胞株作為宿 主細(xì)胞,使該系統(tǒng)較DHFR系統(tǒng)更具有通用性;CH0細(xì)胞較易于培養(yǎng),更強(qiáng)壯;在轉(zhuǎn)染、篩選和 工程細(xì)胞馴化中的優(yōu)越性更為突出,篩選得到高表達(dá)量工程細(xì)胞株的概率高、周期短。二氫 葉酸還原酶系統(tǒng)為逐漸提高M(jìn)TX的濃度需要多輪篩選,GS系統(tǒng)僅需一輪篩選就可得到高表 達(dá)細(xì)胞株;GS系統(tǒng)大規(guī)模發(fā)酵時(shí)培養(yǎng)基中無(wú)需添加谷氨酰胺,可利用細(xì)胞內(nèi)的氨和谷氨酸 合成谷氨酰胺,避免谷氨酰胺分解造成培養(yǎng)體系中氨濃度過(guò)高,造成對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的損傷,降 低了工藝控制的難度。因此,GS表達(dá)系統(tǒng)在構(gòu)建一種適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞,尤其是CH0細(xì) 胞的高效表達(dá)載體在工業(yè)生產(chǎn)中意義重大。
[0006] 同時(shí)對(duì)兩個(gè)感興趣的基因進(jìn)行表達(dá)的系統(tǒng)常見(jiàn)的有Clontech的pIRES系統(tǒng)和 Lonza公司的pEE系統(tǒng)(比如,ρΕΕ6· 4載體和ρΕΕ12· 4載體)。pIRES是在兩個(gè)感興趣的基 因間插入一個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site, IRES),轉(zhuǎn)錄出的一 條成熟mRNA可同時(shí)翻譯出兩條蛋白序列。該系統(tǒng)的特點(diǎn)或缺點(diǎn)是第2條蛋白表達(dá)水平較 第1條蛋白的要低很多。pIRES系統(tǒng)的缺點(diǎn)是所表達(dá)的兩蛋白表達(dá)水平差異較大,不適于表 達(dá)水平均一性的兩種蛋白,更為重要的是pIRES系統(tǒng)為ΝΕ0篩選系統(tǒng),為不可擴(kuò)增表達(dá)的載 體系統(tǒng),不適于蛋白的高效表達(dá)。PEE系統(tǒng)構(gòu)建比較繁瑣,完成一個(gè)同時(shí)表達(dá)兩種蛋白的表 達(dá)體系需3個(gè)步驟:將兩目標(biāo)蛋白編碼基因分別構(gòu)建到ρΕΕ6. 4載體和ρΕΕ12. 4載體中,然 后通過(guò)雙酶切(Notl和BamHI或Notl和Sail)的方法將兩個(gè)獨(dú)立的表達(dá)載體構(gòu)建成一個(gè) 可擴(kuò)增的谷氨酰胺合成酶表達(dá)載體。PEE表達(dá)系統(tǒng)目前已廣泛用于科研和產(chǎn)業(yè)化方面。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為克服pIRES系統(tǒng)和pEE系統(tǒng)的各自缺點(diǎn),本發(fā)明構(gòu)建的P327. 7表達(dá)載體系統(tǒng)不 僅是一種可擴(kuò)增表達(dá)的載體系統(tǒng)(GS表達(dá)系統(tǒng)),適用于蛋白的高效表達(dá),而且操作簡(jiǎn)便, 所要表達(dá)的兩種蛋白編碼基因分別構(gòu)建至第一表達(dá)盒和第二表達(dá)盒即可完成表達(dá)兩種蛋 白表達(dá)載體的構(gòu)建。
[0008] 本發(fā)明涉及一種可擴(kuò)增的同時(shí)具有兩個(gè)表達(dá)盒的谷氨酰胺合成酶p327. 7表達(dá)載 體,該表達(dá)載體主要元件由6大部分組成:第一表達(dá)盒元件、第二表達(dá)盒元件、Π 復(fù)制子、谷 氨酰胺合成酶表達(dá)盒元件、氨芐青霉素 β內(nèi)酰胺酶水解表達(dá)盒元件和ColEl復(fù)制子,其中 第一表達(dá)盒元件、第二表達(dá)盒元件中采用的是強(qiáng)的增強(qiáng)/啟動(dòng)子CMV立早增強(qiáng)子/啟動(dòng)子, 有利于目標(biāo)蛋白的表達(dá);表達(dá)蛋白編碼基因分別通過(guò)多克隆位點(diǎn)A和多克隆位點(diǎn)B克隆至 表達(dá)載體;谷氨酰胺合成酶表達(dá)盒元件中采用弱的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子SV40,降低谷氨酰胺合 成酶的表達(dá),有利于高表達(dá)克隆的篩選。為便于測(cè)序在多克隆位點(diǎn)A和多克隆位點(diǎn)B的5' 端和3'端分別設(shè)計(jì)了 T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子和T3 RNA聚合酶啟動(dòng)子序列。該載體適于在 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中同時(shí)高效表達(dá)1-2種蛋白,特別適用于抗體的表達(dá)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009] 圖1 :ρ327· 7表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖
[0010] 圖2 :ΒΥ01抗體非還原SDS-PAGE電泳
[0011] 圖3 :ΒΥ01抗體還原SDS-PAGE電泳

【具體實(shí)施方式】
[0012] 實(shí)施例1、ρ327. 7表達(dá)載體全基因合成及功能元件
[0013] 委托上海捷瑞生物工程有限公司全合成ρ327. 7表達(dá)載體全基因,8066bp,其載體 結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示,序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0014] 一、第一表達(dá)盒元件
[0015] 1、CMV 立早增強(qiáng)子(l-659bp),如 SEQ ID N0 :2 所示。
[0016] 2、CMV 啟動(dòng)子(669-750bp),如 SEQ ID N0 :3 所示。
[0017] 3、I7 RNA 聚合酶啟動(dòng)子(l〇67_l〇85bp)
[0018] TAATACGACTCACTATAGG
[0019] 4、多克隆位點(diǎn) A(1091-1125) :XhoI-EcoRI-MluI,
[0020] CTCGAGTCTTGATAGCACCTATTGAATTCACGCGT
[0021] 5、SV40 多聚 A 信號(hào) l(1150-1353bp),如 SEQ ID NO :4 所示。
[0022] 二、第二表達(dá)盒元件
[0023] 1、CMV 立早增強(qiáng)子 2 (1664-2322bp),如 SEQ ID NO :5 所示。
[0024] 2、CMV 立早啟動(dòng)子 2 (2325-2405bp),如 SEQ ID NO :6 所示。
[0025] 3、多克隆位點(diǎn) B(3374-3402bp) :XbaI-BglII-SalI,
[0026] TCTAGACTTAGGCAGATCTCTGCGTCGAC
[0027] 4、T3 RNA 聚合酶啟動(dòng)子 3(3430-3451bp),
[0028] GTTAATGCTTCGAGCAGACATG
[0029] 5、SV40 多聚 A 信號(hào) 2 (3462-3682),如 SEQ ID NO :7 所示。
[0030] 三、fi 復(fù)制子(3777-4232),如 SEQ ID NO :8 所示。
[0031] 四、谷氨酰胺合成酶表達(dá)盒
[0032] 1、SV40 增強(qiáng)啟動(dòng)子(4296-4701bp),如 SEQ ID N0 :9 所示。
[0033] 2、谷氨酰胺合成酶結(jié)構(gòu)基因(4730-5851bp),如SEQ ID N0:10所示。
[0034] a.起始密碼子(4730_4732bp)
[0035] b.終止密碼子 TAA (5849-585 lbp)
[0036] c.谷氨酰胺合成酶表達(dá)基因
[0037] 五、氨芐青霉素 β內(nèi)酰胺酶水解基因(6374-7234bp)如SEQ ID N0 :11所示。
[0038] a.起始密碼子 ATG (6374-6376)
[0039] b.終止密碼子 TAA (7232-7234)
[0040] c.氨芐青霉素 β內(nèi)酰胺酶水解基因
[0041] 六、ColEl 復(fù)制子(7389-8009bp),如 SEQ ID Ν0 :12 所示。
[0042] 實(shí)施例2、抗Her2/neu人源化抗體BY01表達(dá)載體構(gòu)建
[0043] 委托上海捷瑞生物工程有限公司合成抗Herf/neu人源化抗體L鏈編碼基因,如 SEQ ID N0:13所示。經(jīng)XhoI和EcoRI雙酶切克隆至p327.7 表達(dá)載體,命名為p327.7/L:
[0044] 其中下劃線部分分別為Xhol和EcoRI的酶切位點(diǎn),|ATG |和[ΤΑΑ |分別為起始和 終止密碼子。
[0045] 同樣委托上海捷瑞生物工程有限公司合成抗Herf/neu人源化抗體Η鏈編碼基 因,如SEQ ID Ν0:14所示。在經(jīng)Xbal-和Sail雙酶切克隆至p327. 7/L表達(dá)載體,命名為 p327. 7/HER2表達(dá)載體。
[0046] 其中下劃線部分分別為Xbal和Sail的酶切位點(diǎn),^和ffAX丨分別為起始和 終止密碼子
[0047] 實(shí)施例2、抗Her2/neu人源化BY01抗體高表達(dá)細(xì)胞株的篩選
[0048] 1、CH0-K1 (中科院上海細(xì)胞庫(kù))細(xì)胞在10% D-FBS,4mM谷氨酰胺的DMEM/ F12(InVitr〇gen產(chǎn)品)中適應(yīng)并貼壁生長(zhǎng);胰酶消化后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度,加入96孔細(xì)胞培 養(yǎng)板中,細(xì)胞數(shù)大約為1.5X104/孔;24小時(shí)后,按Lipofectin 2000操作說(shuō)明轉(zhuǎn)染96孔 板。用無(wú)血清無(wú)抗生素的頂DM培養(yǎng)基洗2次,每次加入頂DM 100 μ 1/孔。取質(zhì)粒與頂DM 培養(yǎng)基混均,取Lipofectin 2000⑶與頂DM培養(yǎng)基混均。靜置5分鐘后,將Lipofectin 2000⑶和質(zhì)粒混勻。室溫靜置15分鐘后,按每孔50 μ 1加入已含50 μ 1/孔頂DM的96孔 板中。5小時(shí)后,換成完全培養(yǎng)基(10%透析血清,lXHT,4mM谷氨酰胺的⑶OptiCHO)。轉(zhuǎn) 染48小時(shí)后刮取96孔板生長(zhǎng)細(xì)胞,收集培養(yǎng)物;1000轉(zhuǎn)/分,5分鐘離心;按2 X 104/孔 鋪板,并置含25以1^-蛋氨酸砜亞胺(1-]^1:11;[011;[116 8111;1;'(?;[111;[116,1^乂)但不含谷氨酰胺的 10%D-FBS⑶OptiCHO培養(yǎng)基中培養(yǎng);每5天更換一次新鮮培養(yǎng)基;形成克隆后,取50μ1 樣品雙抗體夾心法ELISA方法半定量檢測(cè)培養(yǎng)液中蛋白含量,初步篩選出蛋白表達(dá)量相對(duì) 較高克??;蛋白表達(dá)量相對(duì)較高克隆轉(zhuǎn)入24孔板中懸浮培養(yǎng),培養(yǎng)基換為不含D-FBS的CD OptiCHO培養(yǎng)基(MSX50 μ M/ml)。數(shù)天后,同樣采用ELISA方法檢測(cè)24孔板中的相對(duì)蛋白 表達(dá)量。進(jìn)一步經(jīng)6孔板、75cm2培養(yǎng)瓶和250ml搖瓶懸浮培養(yǎng)。結(jié)合ELISA半定量結(jié)果和 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),篩選表達(dá)量較高、生長(zhǎng)均勻者進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)制成穩(wěn)定細(xì)胞。
[0049] 實(shí)施例3、人源化BY01抗體的表達(dá)和初步純化
[0050] 將高表達(dá)人源化抗體BY01細(xì)胞置無(wú)血清的⑶OptiCHO中培養(yǎng),一定時(shí)間后收 集培養(yǎng)上清。用 ρΗ7· 4 的 PBS 溶液平衡 HiTrapMabSelectSuRe lml 柱(GE Healthcare Life Sciences產(chǎn)品,Cat. No :11-0034-93) 10個(gè)床體積,流速為0. 5ml/min ;培養(yǎng)上清液用 0. 45 μ m濾膜過(guò)濾上樣,流速為0. 5ml/min。用pH7. 4的PBS溶液再洗5-10個(gè)床體積,流速 為0. 5ml/min ;用100mM檸檬酸緩沖液(pH3. 6)洗脫,流速為0. 5ml/min,收集洗脫峰。
[0051] 經(jīng)ELISA和蛋白A-HPLC檢測(cè)抗體在上清中的表達(dá)量為600mg/L。
[0052] 純化人源化抗體BY01非還原SDS-PAGE電泳和還原SDS-PAGE電泳見(jiàn)圖1和圖2, 非還原電泳免疫融合蛋白表觀分子量大約220kDa ;還原SDS-PAGE電泳重鏈約50kDa,輕鏈 約25kDa,人源化抗體BY01理論分子量約150kDa,實(shí)測(cè)值均與理論預(yù)期一致。
【權(quán)利要求】
1. 一種具有雙表達(dá)盒的谷氨酰胺合成酶表達(dá)載體,該載體包括兩個(gè)表達(dá)盒,分別為第 一表達(dá)盒元件和第二表達(dá)盒元件,該載體被命名為P327. 7。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有雙表達(dá)盒的谷氨酰胺合成酶表達(dá)載體,該載體還包 含如下4種元件:Π 復(fù)制子、谷氨酰胺合成酶表達(dá)盒元件、氨芐青霉素 β內(nèi)酰胺酶水解表 達(dá)盒元件和ColEl復(fù)制子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種具有雙表達(dá)盒的谷氨酰胺合成酶表達(dá)載體,所述的 第一表達(dá)盒元件、第二表達(dá)盒元件中采用的是強(qiáng)的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子;表達(dá)蛋白編碼基因分 別通過(guò)多克隆位點(diǎn)A和多克隆位點(diǎn)B克隆至表達(dá)載體;谷氨酰胺合成酶表達(dá)盒元件中采用 弱的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子;在多克隆位點(diǎn)A和多克隆位點(diǎn)B的5'端和3'端分別設(shè)計(jì)了 T7 RNA 聚合酶啟動(dòng)子和T3 RNA聚合酶啟動(dòng)子序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種具有雙表達(dá)盒的谷氨酰胺合成酶表達(dá)載體,所述的多 克隆位點(diǎn)A具有Xhol、EcoRI和Mlul等3個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn);所述的多克隆位點(diǎn)B具有 XbaI、BglII和Sail等3個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種具有雙表達(dá)盒的谷氨酰胺合成酶表達(dá)載體,所述的 強(qiáng)的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子是CMV立早增強(qiáng)子/啟動(dòng)子,其序列如SEQ ID N0:2,3,5,6所示; 所述的弱的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子是SV40,其序列如SEQ ID N0:9所示;所述的T7 RNA聚 合酶啟動(dòng)子的序列為T(mén)AATACGACTCACTATAGG ;所述的T3 RNA聚合酶啟動(dòng)子的序列為 GTTAATGCTTCGAGCAGACATG 〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有雙表達(dá)盒的谷氨酰胺合成酶表達(dá)載體的構(gòu)建方法,其特 征在于,所述的表達(dá)載體是通過(guò)全基因合成方法構(gòu)建的。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的表達(dá)載體用于時(shí)高效表達(dá)1-2種蛋白的用途。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的表達(dá)載體用于抗體的表達(dá)中的用途。
【文檔編號(hào)】C12N15/52GK104195173SQ201410441296
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月2日
【發(fā)明者】胡品良, 白潔, 洪偉東, 鄒敬, 宋凌云, 楊澤榮 申請(qǐng)人:北京比洋生物技術(shù)有限公司
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