一種運用重組唾液酸酶轉(zhuǎn)化多唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂制備單唾液四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種運用重組唾液酸酶轉(zhuǎn)化多唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂制備單唾液四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的方法，包括以下步驟：1)提供一種游離的重組唾液酸酶，所述重組唾液酸酶是由SEQ?ID?NO:1所示的堿基序列編碼的蛋白；以及2)將步驟1)中的重組唾液酸酶與多唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂混合，以將所述多唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(GLS)轉(zhuǎn)化為單唾液四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)。本發(fā)明首次通過全合成唾液酸酶的全長基因，在大腸桿菌中成功實現(xiàn)了唾液酸酶的可溶性表達(dá)，該重組唾液酸酶比活高，制備成本低，并且該方法通過采用透析原位分離產(chǎn)物唾液酸可進(jìn)一步解除唾液酸的抑制作用，促進(jìn)反應(yīng)向產(chǎn)物方向進(jìn)行，從而將高濃度的GLS完全轉(zhuǎn)化為GM1。
【專利說明】一種運用重組唾液酸酶轉(zhuǎn)化多唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂制備單唾 液四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶法轉(zhuǎn)化制備單唾液四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂領(lǐng)域，更具體地涉及一種運用 重組唾液酸酶轉(zhuǎn)化多唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂制備單唾液四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)節(jié)苷脂是含唾液酸的鞘糖脂。1942年Klenk首先在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)找到這類 化合物，故名神經(jīng)節(jié)苷脂。神經(jīng)節(jié)苷脂由神經(jīng)酰胺、寡糖和唾液酸組成。神經(jīng)節(jié)苷脂所含 的寡糖是一種特異的以β-糖苷鍵連接的四糖。四糖按半乳糖（Gal)、N-乙酰半乳糖胺 (N-GalNAC)、半乳糖及葡萄糖（Glu)順序連接，最后通過葡萄糖殘基與神經(jīng)酰胺（Cer)相 連。神經(jīng)節(jié)苷脂的唾液酸殘基均連接于寡糖的半乳糖基上，其數(shù)目從無（無唾液酸神經(jīng)節(jié) 苷脂）到四個或更多不等。目前已從腦組織中分離出30多種神經(jīng)節(jié)苷脂，其命名通常采用 Svennerholm法，主要內(nèi)容包括：（1):用大寫"G"表示神經(jīng)節(jié)苷脂；（2)用A、M、D、T、Q、P、H、 S分別表示含0-7個唾液酸；(3)用（5-糖基數(shù)）之差表示含相同唾液酸但不同糖基數(shù)的神 經(jīng)節(jié)苷脂；（4)用a、b、c表示唾液酸的連接部位。
[0003] 下圖舉例說明一個神經(jīng)節(jié)苷脂縮寫名稱中各部分含義。
[0004]

【權(quán)利要求】
1. 一種運用重組唾液酸酶轉(zhuǎn)化多唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂制備單唾液四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的 方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 提供一種游離的重組唾液酸酶，所述重組唾液酸酶是由SEQ ID NO: 1所示的乳酪短 桿菌唾液酸酶喊基序列編碼的蛋白；以及 2) 將步驟1)中的重組唾液酸酶與多唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂混合，以將所述多唾液酸神經(jīng) 節(jié)苷脂轉(zhuǎn)化為單唾液四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂是以神經(jīng)節(jié)苷 脂混合物形式提供。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述重組唾液酸酶是通過將SEQ ID NO: 1 所示的乳酪短桿菌唾液酸酶堿基序列連接載體并在大腸桿菌中進(jìn)行可溶性表達(dá)獲得的蛋 白。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2)進(jìn)一步包括采用膜透析的方 法去除反應(yīng)產(chǎn)物唾液酸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述膜透析的截留分子量為 10000-50000kDa。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述透析液是50mM的pH5. 5的醋酸鈉緩 沖液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)的溫度控制在30?40°C。
【文檔編號】C12P19/44GK104195200SQ201410441305
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月1日
【發(fā)明者】王學(xué)東, 龍輝, 魏東芝 申請人:華東理工大學(xué)