專利名稱：通過代謝競爭除去污染性的非人唾液酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請?jiān)谕僖核峄瘜W(xué)、代謝和抗原性的領(lǐng)域中。更特別地，本申請涉及N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)(其為在人中是免疫原性的非人唾液酸)，用于實(shí)驗(yàn)室和人使用的無 Neu5Gc哺乳動(dòng)物產(chǎn)品的生產(chǎn)，和從人體中除去Neu5Gc。
背景 所有的細(xì)胞均被糖鏈的密集和復(fù)雜的陣列所覆蓋。唾液酸(Sias)是典型地出現(xiàn)在這些鏈的最外部單元處的九碳糖家族。由于它們的末端位置，唾液酸對于許多外源的和內(nèi)源的受體(例如流感病毒和內(nèi)源蛋白的涎免凝集素(Siglec)家族)起到結(jié)合位點(diǎn)的作用。因此此類糖是預(yù)防和治療感染的有用的藥物靶點(diǎn)。它們還涉及各種生物的和病理的過程，例如神經(jīng)元可塑性和的癌癥轉(zhuǎn)移。在許多這些情況中，唾液酸的精確結(jié)構(gòu)和其所附著的殘基發(fā)揮關(guān)鍵性的作用。
胞苷一磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸水解酶(CMAH)將唾液酸N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac) 轉(zhuǎn)化為N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)。在非人哺乳動(dòng)物中，Neu5Gc被許多內(nèi)源性結(jié)合蛋白及病原性生物體(例如細(xì)菌和病毒)所識(shí)別。人類不能產(chǎn)生內(nèi)源性的Neu5Gc，因?yàn)槠銫MAH 基因中的進(jìn)化失活突變。
此外，已知Neu5Gc在人中是免疫原性的。該免疫原性被認(rèn)為對在接觸了哺乳動(dòng)物產(chǎn)品(例如源自非人哺乳動(dòng)物或被暴露于非人哺乳動(dòng)物的化妝品、食物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)胞產(chǎn)品、以及治療劑)的人中所觀察到的免疫應(yīng)答起作用。已試圖嘗試使用RNAi抑制 CMAH基因的表達(dá)而通過改變細(xì)胞系來減少所述細(xì)胞系中重組產(chǎn)生的人糖蛋白的Neu5Gc含量。(Chenu S.，等人，Biochim. Biophys. Acta.，1622 (2) 133-144，2003)。
概述 非人唾液酸N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)通過以代謝的方式被分別摻入培養(yǎng)的細(xì)胞和人組織中而污染生物治療產(chǎn)品和人體。在第一種情況中，污染來自培養(yǎng)基中源于動(dòng)物的組分和/或所使用的動(dòng)物細(xì)胞系；而在第二種情況中，污染來自從食物(例如紅肉)中的膳食攝取。本公開的方法除去或減少人受試者、生物治療劑或細(xì)胞系中Neu5Gc的量。所述方法包括以人唾液酸N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)，其衍生物、類似物或前體(例如，N-乙酰甘露糖胺(ManNAc))漫灌系統(tǒng)。所使用的Neu5Ac也可以單體的形式結(jié)合至其他分子，或以多聚體的形式(聚唾液酸)結(jié)合。在這些情況下，所結(jié)合的Neu5Ac將通過細(xì)胞過程被釋放然后以類似于被結(jié)合的形式的方式起作用。Neu5Ac和Neu5Gc都為被CMP-Sia合成酶活化而競爭。因此，通過在Neu5Gc首次進(jìn)入細(xì)胞時(shí)和/或從預(yù)先存在的細(xì)胞分子的分解再循環(huán)時(shí)代謝競爭過Neu5Gc，任何來源的過量的Neu5Ac提供了簡單有效的減少或除去Neu5Gc負(fù)荷的方法。此外，本公開提供用于減少CMAH陽性動(dòng)物細(xì)胞中的Neu5Gc產(chǎn)生的方法，包括用大丸的或濃度遞增的Neu5Ac漫灌系統(tǒng)，其抑制內(nèi)源性Neu5Gc的產(chǎn)生。
本公開提供的方法包括以足夠的量、在足夠的時(shí)期內(nèi)、用有效量或遞增量的N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、其衍生物、類似物或前體培養(yǎng)細(xì)胞系以除去或大量地減少細(xì)胞或細(xì)胞系中的、或由所述細(xì)胞或細(xì)胞系產(chǎn)生的產(chǎn)品中的Neu5Gc。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞系包含用于治療性蛋白生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞系包含hESC、 誘導(dǎo)的干細(xì)胞、胚狀體細(xì)胞或任何其他意在用于人中的治療應(yīng)用或用于生產(chǎn)治療性產(chǎn)品的細(xì)胞。
本公開提供減少生物治療產(chǎn)品中Neu5Gc的量的方法，包括在包含Neu5Ac的培養(yǎng)基中，在用于生產(chǎn)生物治療產(chǎn)品的條件下培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物。
本公開還提供制備用于移植的、含有Neu5Gc的組織的方法，包括將所述組織暴露于缺少Neu5Gc且包含足量的N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)或其前體N-乙酰甘露糖胺 (ManNAc)的培養(yǎng)基。
除去Neu5Gc的方法和組合物可用于人，因?yàn)镹eu5Ac (其衍生物、或類似物、或前體)是可以散布到體內(nèi)各區(qū)室并因此影響體內(nèi)所有細(xì)胞的小分子。因此本公開提供治療感染性疾病或癌癥的方法，包括向受試者施用遞增量的、結(jié)合或游離形式的N-乙酰神經(jīng)氨酸 (Neu5Ac)或其前體N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)，直至Neu5Gc的水平降低或從受試者中被去除。例如，本公開表明暴露于飲用水中的ImM Neu5Ac超過6個(gè)月的小鼠未產(chǎn)生明顯的毒性， 表示所述過程對于在人中長時(shí)間的使用是安全的。
本公開還提供了相比于Neu5Gc的水平，具有升高的Neu5Ac或其前體的食物、飲料或細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述食物、飲料或細(xì)胞培養(yǎng)基包含約0. lmM-20mM 或更多的結(jié)合或游離形式的Neu5Ac。
本公開還提供了在含有Neu5Gc酶途徑的動(dòng)物中減少Neu5Gc產(chǎn)生的方法，所述方法包括對動(dòng)物施用有效量的Neu5Ac，其衍生物、類似物或前體，其中所述有效量減少或除去所述動(dòng)物中Neu5Gc的產(chǎn)生。
在上述所有用于動(dòng)物用途(包括人用途)的方法中，Neu5Ac可以是膳食補(bǔ)充物的形式，可作為包含高水平Neu5Ac的天然膳食產(chǎn)品的一部分，可以是合成的Neu5Ac，可以是單體或多聚體形式的、結(jié)合的或未結(jié)合形式的Neu5Ac。關(guān)于培養(yǎng)方法，可將來自合成或其他生產(chǎn)方法的，結(jié)合、非結(jié)合形式的Neu5Ac加入培養(yǎng)基中。對于施用或膳食消耗而言，Neu5Ac 可以是基本上純化的形式。
本公開的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式的細(xì)節(jié)如所附的附圖和以下的描述中所示。從說明書和附圖以及權(quán)利要求中，本公開的其他特征、目標(biāo)和優(yōu)勢將是顯然的。
附圖簡述

圖1顯示在兩個(gè)細(xì)胞系中添加和未添加Neu5Ac時(shí)的Neu5Gc含量圖。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的、 表達(dá)重組可溶的涎免凝集素9-Fc或涎免凝集素13-Fc蛋白的CHO-KI細(xì)胞，在不存在或存在 5mM Neu5Ac (Ac)時(shí)生長。CH0Sig9 細(xì)胞在含有 10% FCS 和 80 μ M MTX 的 MEM alpha 中生長至70%匯合。CH0Sigl3細(xì)胞在含有10% FCS和1. 2mg/ml G418的MEM alpha中生長至70%匯合。首先以PBS沖洗所述細(xì)胞兩次，然后加入含有2%低IgG FCS和5mM Neu5Ac 的Optimem培養(yǎng)基三天，在第三天收集所述培養(yǎng)基(第3天)，加入含有Neu5Ac的新鮮培養(yǎng)基并在兩天后(第5天)收集，再次加入含有Neu5Ac的新鮮培養(yǎng)基并在第7天收集。將各個(gè)收集的培養(yǎng)基離心以去除細(xì)胞碎片，調(diào)節(jié)至5mM Tris-HCl pH 8并以250μ1的蛋白質(zhì)-A瓊脂糖、在4°C下孵育3天以結(jié)合嵌合蛋白。針對各時(shí)間點(diǎn)和細(xì)胞類型，用PBS清洗樹脂，并用0. IM pH3的甘氨酸洗脫。在用IM Tris-HCl pH 8中和至pH7后，使用Millipore Ultrafree-15 30K截止裝置濃縮被洗脫的蛋白質(zhì)。使用Pierce BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒確定蛋白質(zhì)的濃度。將經(jīng)純化的蛋白質(zhì)的等份用2M醋酸在80°C下水解3小時(shí)以釋放唾液酸， 隨后用DMB試劑進(jìn)行衍生化。HPLC分析通過反相色譜法在C18柱上、在等度模式中以85% 的水、8%的乙腈和7%的甲醇在0. 9ml/min下進(jìn)行，且檢測了熒光。獲得了各峰下的面積且確定了相對于Neu5Ac，各樣品中Neu5Gc的百分比。結(jié)果顯示附著于兩種蛋白的Neu5Gc的量均通過Neu5Ac的加入而顯著減少。這提供了減少在CHO細(xì)胞中生產(chǎn)的生物治療產(chǎn)品中的Neu5Gc污染的方法。
圖2A-E顯示減少在積累了來自環(huán)境的Neu5Gc的人細(xì)胞中制備的生物治療產(chǎn)品中的Neu5Gc污染的方法。(A-B)用游離的Neu5Ac飼養(yǎng)人細(xì)胞減少了糖綴合物中預(yù)先存在的Neu5Gc的含量。人細(xì)胞在DME+10% FCS中、在5mM Neu5Gc的存在下生長3天， 以使細(xì)胞負(fù)載Neu5Gc。然后用PBS清洗所述細(xì)胞，將其分入兩種相同的培養(yǎng)物中，一種加入了 5mM Neu5Ac，而另一種沒有。然后如圖所示將細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)天，收獲細(xì)胞，用HPLC分析乙醇可溶的低分子量級(jí)分㈧和乙醇可沉淀的蛋白質(zhì)⑶二者中Neu5Gc和Neu5Ac的含量。所顯示的％ Neu5Gc是相對于總的唾液酸，Neu5Gc的量。可見Neu5Ac在培養(yǎng)基中的存在顯著地加快了 Neu5Gc從細(xì)胞中除去的速度。(C-E)用游離的Neu5Ac飼養(yǎng)CHO細(xì)胞減少了具有內(nèi)源性CMAH的動(dòng)物細(xì)胞系的總細(xì)胞膜和分泌的糖蛋白中的Neu5Gc。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的表達(dá)重組可溶的IgG-Fc融合蛋白的CHO-KI細(xì)胞在不存在或存在5mM Neu5Ac (Ac)時(shí)生長。首先用 PBS清洗細(xì)胞兩次，然后加入含2%低IgG FCS和5mM Neu5Ac的Optimem培養(yǎng)基三天，在第三天收集所述培養(yǎng)基(第3天)，加入含Neu5Ac的新鮮培養(yǎng)基并在2天后(第5天)收集， 再次加入含Neu5Ac的新鮮培養(yǎng)基并在第7天收集。將各個(gè)收集的培養(yǎng)基離心以去除細(xì)胞碎片，調(diào)節(jié)至5mM Tris-HCl pH 8。用蛋白質(zhì)-A瓊脂糖純化融合蛋白。(C)將經(jīng)純化的蛋白質(zhì)的等份用2M醋酸在80°C下水解3小時(shí)以釋放唾液酸，隨后用DMB試劑進(jìn)行衍生化并使之經(jīng)受HPLC分析。獲得了各峰下的面積且確定了相對于Neu5Ac，各樣品中Neu5Gc的百分比?？梢奛eu5Gc的含量相對于對照明顯減少。(D)制備來自相同的CHO細(xì)胞的總細(xì)胞膜并用于DMB-HPLC分析。再次可見Neu5Gc的含量相對于對照明顯減少。(E)通過SDSPAGE分離來自上述實(shí)驗(yàn)的CHO膜蛋白并將其轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。通過用親和純化的多克隆雞抗-Neu5Gc抗體孵育而檢測Neu5Gc的表達(dá)?？梢奛eu5Gc-表達(dá)在蛋白質(zhì)方面相對于對照明顯減少。
圖3顯示來自喂食了含有大量糖苷連接的Neu5Ac的食物的4名人受試者的尿中 Neu5Ac的含量?？梢娫诰o接著攝食富含Neu5Ac的食物的時(shí)間段中尿的Neu5Ac含量顯著增加。類似于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，預(yù)期此方法會(huì)以Neu5Ac漫灌人體。反復(fù)應(yīng)用該方法將最終從人體中除去 Neu5Gc。
發(fā)明詳述 在本申請和所附的權(quán)利要求中所用的單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)指示物，除非語境清楚地表明另外的情況。因此，例如，引用“Neu5Gc”包括數(shù)種此類分子和引用 “Neu5Ac”包括引用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的一種或多種Neu5Ac，等等。
此外，除非陳述了其他情況，使用“或”意味著“和/或”。類似地，“包含 (comprise) ”、“包含(comprises) ”、“包含(comprising) ”、“包括(include) ”、“包括 (includes) ”和“包括(including) ”可互換而不意在是限制性的。
此外將理解當(dāng)各種實(shí)施方式的描述使用術(shù)語“包含”時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解在一些特定的情況下，可使用語言“基本上由…組成”或“由…組成”來備選地描述實(shí)施方式。
除非另外限定，本申請中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本公開所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員所通常理解的具有相同的含義。盡管與本申請中描述的方法和材料類似或等同的方法和材料可被用于實(shí)施所公開的方法和組合物，示例性的方法，設(shè)備和材料被描述于本申請中。
上面和貫穿全文所討論的出版物僅為其在本申請遞交日之前的公開而被提供。本申請中沒有任何內(nèi)容將被解釋為承認(rèn)發(fā)明人不能因?yàn)樵谙裙_而有權(quán)先于此類公開。
唾液酸(Sia)是酸性九碳糖家族的通用名稱，通常被發(fā)現(xiàn)作為脊椎動(dòng)物細(xì)胞多糖包被上和分泌的糖蛋白上聚糖鏈的最外部的單元。它們在所有脊椎動(dòng)物細(xì)胞上的位置和廣泛存在允許其涉及下列過程，例如配體-受體相互作用，細(xì)胞-細(xì)胞識(shí)別，細(xì)胞-病原體結(jié)合，炎性過程，免疫應(yīng)答和腫瘤轉(zhuǎn)移。
已知自然中有多于50種唾液酸。大部分經(jīng)由稱為N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)的唾液酸的生物合成修飾而衍生。將單個(gè)氧原子加至Neu5Ac的N-乙?；鶊F(tuán)產(chǎn)生很常見的、 稱為N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)的變化。迄今研究的大部分靈長類細(xì)胞類型的表面由這兩種主要的唾液酸占優(yōu)勢。
為了使唾液酸(Sia)分子附著至糖綴合物，必須通過轉(zhuǎn)化為糖核苷酸衍生物胞苷一磷酸唾液酸(CMP-Sia)而先將所述唾液酸(Sia)活化。唾液酸在核中被轉(zhuǎn)換為CMP_Sias， 然后其從核中返回至細(xì)胞溶膠，以便被轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體中。CMP-Sias作為高能量供體用于使Sias在到細(xì)胞表面的途中附著至新合成的糖綴合物。Neu5Ac到Neu5Gc的生物合成轉(zhuǎn)化發(fā)生在所述糖核苷酸水平，其中CMP-Neu5Ac水解酶(CMAH)催化氧原子到CMP-Neu5Ac的轉(zhuǎn)移,產(chǎn)生CMP-Neu5Gc。然后CMP_Neu5Gc可被轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體中并以與CMP_Neu5Ac相同的方式被用來將Neu5Gc加至新合成的糖綴合物。這兩種核苷酸糖似乎被高爾基CMP-Sia 轉(zhuǎn)運(yùn)子和轉(zhuǎn)運(yùn)Sia殘基到細(xì)胞表面和被分泌的糖綴合物的哺乳動(dòng)物唾液酸轉(zhuǎn)移酶可互換地使用。在溶酶體降解過程中從糖綴合物中釋放的Neu5Ac或Neu5Gc分子還可以通過特定的轉(zhuǎn)運(yùn)子被輸出回胞質(zhì)區(qū)室中。在那里，所述分子可用于作為底物而用來轉(zhuǎn)化為其各自的 CMP-Sia形式。Neu5Gc可被“再循環(huán)”而用于在高爾基唾液酸化(sialation)反應(yīng)中重復(fù)使用。
非人唾液酸N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)通過被代謝地?fù)饺肱囵B(yǎng)細(xì)胞和人組織中而污染生物治療產(chǎn)品和人體。在前一種情況中，污染來自培養(yǎng)基中源于動(dòng)物的組分和/或所使用的動(dòng)物細(xì)胞系，在第二種情況中，污染來自膳食攝取。防止所述Neu5Gc摻入是非常困難的，因?yàn)閷τ谂囵B(yǎng)基或膳食所需的處理程度是可觀的。
Neu5Gc也許是非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最廣泛地表達(dá)的唾液酸。盡管人類在產(chǎn)生Neu5Gc方面是遺傳缺陷性的，少量的Neu5Gc存在于人細(xì)胞中。通過人志愿者研究，以及通過觀察到游離的Neu5Gc通過未知機(jī)理被代謝地?fù)饺肱囵B(yǎng)的人細(xì)胞中，提示了膳食起源。 研究顯示Neu5Gc的摻入可能主要源于膳食來源(Tangvoranuntakul，P.等人Natl. Acad. Sci. (USA)(2003) 100 :12045-12050)。
例如，來自例如牛肉、豬肉和羊肉來源的紅肉特別富含Neu5Gc且可能是人膳食中 Neu5Gc的主要來源。此外，奶制品含有Neu5Gc，雖然在比紅肉低一些的水平上。
此外，由遺傳工程哺乳動(dòng)物細(xì)胞或異源或異種細(xì)胞(例如移植物)生產(chǎn)的生物治療產(chǎn)品可包含Neu5Gc。Neu5Gc在培養(yǎng)于動(dòng)物產(chǎn)品中用于人治療劑的人細(xì)胞中的存在也是潛在的抗原性來源。更特別地，當(dāng)人細(xì)胞被培養(yǎng)于來自動(dòng)物的血清中時(shí)，其可攝取和摻入 Neu5Gc，如果此類細(xì)胞被用于治療(例如移植源于人胚胎干細(xì)胞的移植物)就潛在地引起免疫排斥。例如由經(jīng)轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)產(chǎn)生的生物治療劑可直接地或通過培養(yǎng)物產(chǎn)生含有Neu5Gc的材料。從此類培養(yǎng)物中去除Neu5Gc是重要的。
已表明游離Neu5Gc的攝取發(fā)生在各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織中，例如分泌細(xì)胞，癌細(xì)胞和血管。某些非網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的(即不依賴于受體的)胞吞途徑的抑制劑減少Neu5Gc 的積累。以人突變細(xì)胞進(jìn)行的研究顯示游離Neu5Gc的代謝性摻入需要溶酶體的唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)子。來自異源糖綴合物的糖苷連接的Neu5Gc的摻入(與暴露于膳食Neu5Gc的人腸上皮有關(guān))需要轉(zhuǎn)運(yùn)子和可能用以釋放游離Neu5Gc的溶酶體唾液酸酶。因此，外源的Neu5Gc 經(jīng)由胞飲/胞吞途徑到達(dá)溶酶體，并以游離的形式被輸出到胞質(zhì)溶膠中，可用于活化作用和轉(zhuǎn)移至糖綴合物。相反地，N-羥乙酰甘露糖胺(ManNGc)顯然通過被動(dòng)擴(kuò)散低效地橫過質(zhì)膜并可用于在胞質(zhì)溶膠中向Neu5Gc的轉(zhuǎn)化。
大多數(shù)正常健康人具有一定量的循環(huán)的抗Neu5Gc抗體，可能因?yàn)橄铝惺聦?shí)大多數(shù)人攝食源于含高水平Neu5Gc的非人哺乳動(dòng)物的食物來源或其他材料。例如，可能以 Neu5Gc接種受試者的材料包括異種(即非人)來源的生物材料(例如來自培養(yǎng)方法，如干細(xì)胞培養(yǎng)，生物反應(yīng)器系統(tǒng)等)以及植入/移植材料。由于攝取和Neu5Gc在從暴露于含有 Neu5Gc的產(chǎn)品的人細(xì)胞發(fā)育而來的任何組織的表面上的表達(dá)，此類材料可引起降低治療成功的免疫應(yīng)答。這一問題也可影響重組可溶性生物治療產(chǎn)品。
盡管Neu5Gc是大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中主要的唾液酸，其長期被認(rèn)為在健康人組織中是不存在的(Traving, C，等人，Cell. Mol. Life. Sci. 54 :1330-1349,1998) 的確， 人在遺傳上不能合成Neu5Gc，由于人CMAH基因中的外顯子缺失/移碼突變(Varki，Α.， Yearb. Phys. Anthropo 1. 44 :54-69, 2002 ；Chou, H. H.，等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 11751-11756，1998 ；和 Irie, Α.等人 J. Biol. Chem. 273 :15866-15871,1998)。已估計(jì)此突變發(fā)生在類人系中-2. 5至3百萬年前(Chou，H. H.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 11736-11741,2002)。
盡管不存在任何已知的在人中合成Neu5Gc的備選途徑，各個(gè)小組已使用了抗體研究Neu5Gc在人腫瘤中、特別是在各種癌中的表達(dá)。(Hirabayashy，Y.等人，Jpn. J. Cancer Res. 78 :251-260,1987 ；Miyoshi, I.等人，Mol. Immunol. 23 :631-638,1986 ；Marquina, G.等人，Cancer Res. 56 :5165-5171,1996 ；Carr, Α.等人，Hybridoma 19 :241-247,2000 ； Devine,P. L.，等人，Cancer Res. 51 :5826-5836,1991 ；Kawachi S.等人，Int. Arch. Allergy App 1. Immunol. 85 :381-383,1988 ；禾口 Higashi，H.等人，Jpn. J. Cancer Res. 79 :952 :956,1998)。近期的研究重新探索了這些發(fā)現(xiàn)，證實(shí)了 Neu5Gc在人癌癥中表達(dá)的先前報(bào)道并且將發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展至正常人組織，包括在正常人的上皮和內(nèi)皮細(xì)胞中檢測到少量的Neu5Gc。確定性的證實(shí)來自通過HPLC和質(zhì)譜分析利用熒光衍生形式的Neu5Gc從所述組織中釋放和純化唾液酸(Tangvoranuntakal，P.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 :12045-12050, 2003)。已顯示外源添加的游離Neu5Gc在體外被摻入所培養(yǎng)的人癌細(xì)胞中。此外，人志愿者中Neu5Gc的口服研究提供下述證據(jù)在人組織中發(fā)現(xiàn)的Neu5Gc可源自膳食來源 (Tangvoranuntakal, P.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USAlOO 12045-12050，2003)，特別是來自紅肉和奶產(chǎn)品。
已將Neu5Gc與細(xì)胞增生性病癥、癌癥、組織排異和炎癥相關(guān)聯(lián)(“Neu5Gc關(guān)聯(lián)性病癥”)。因?yàn)镹eu5Gc是非人動(dòng)物產(chǎn)品膳食組分，組織移植物、生物治療劑和基于細(xì)胞的療法遞送所述非人Neu5Gc產(chǎn)品到人體，在那里抗體可反應(yīng)并引起炎癥、組織排異等。
相應(yīng)地，從人或人消耗的產(chǎn)品中去除或減少Neu5Gc可被用于減少免疫應(yīng)答和疾病發(fā)展。本公開提供用于從人受試者中去除或減少、從動(dòng)物或動(dòng)物產(chǎn)品中去除或減少、從膳食消耗品中去除或減少、和從治療劑中去除或減少所存在的Neu5Gc的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法可與減少動(dòng)物或人對Neu5Gc的攝取的方法相結(jié)合。
本公開表明可通過用人唾液酸N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、其衍生物、類似物或前體(例如ManNAc)漫灌系統(tǒng)而除去或大幅減少所摻入的Neu5Gc。所述方法可代謝地與之前摻入的Neu5Gc競爭或減少或除去包含CMAH基因的生物體或細(xì)胞中的Neu5Gc。本公開的方法可被用于當(dāng)Neu5Gc首次進(jìn)入細(xì)胞時(shí)或從預(yù)先存在的細(xì)胞分子的分解再循環(huán)時(shí)去除或減少Neu5Gc。所述方法可被用于任何哺乳動(dòng)物系統(tǒng)或生物體包括人細(xì)胞和人。例如，已顯示 Neu5Ac在長期暴露后對小鼠是無毒性的，相應(yīng)地這一方法可用于培養(yǎng)中的細(xì)胞和用于完整的哺乳動(dòng)物體(例如人受試者)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本公開提供生產(chǎn)無Neu5Gc的生物治療劑、細(xì)胞產(chǎn)品、細(xì)胞培養(yǎng)物及由此而得的產(chǎn)品的方法，包括用N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)，Neu5Ac前體N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)或合適的Neu5Ac或ManNAc的衍生物漫灌(例如沖洗(flushing) /驅(qū)逐 (chasing))細(xì)胞、培養(yǎng)物或受試者。Neu5AC、ManNAC或其衍生物的量包含當(dāng)Neu5Gc首次進(jìn)入細(xì)胞時(shí)和/或從預(yù)先存在的細(xì)胞分子的分解中再循環(huán)時(shí)足以代謝地競爭過Neu5Gc的量。 因此，本公開的方法和組合物可用于去除或減少受試者、細(xì)胞或動(dòng)物中所存在的Neu5Gc，或可用于通過競爭性置換防止Neu5Gc的攝取或合成。
如本申請中所使用的，Neu5Ac組合物通常指含有N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、 Neu5Ac前體N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或Neu5Ac或ManNac的衍生物的組合物。N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、Neu5Ac前體N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或Neu5Ac或ManNac的衍生物可源自天然來源或可通過標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法被合成或可通過重組或酶促過程被生成。所使用的Neu5Ac也可以單體的形式結(jié)合至其他分子，或者以多聚體的形式(聚唾液酸)結(jié)合。在這些情況下，結(jié)合的Neu5Ac將通過細(xì)胞過程被釋放且然后以類似于被結(jié)合的形式的方式起作用。
本公開表明可通過用N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、其前體N-乙酰甘露糖胺 (ManNAc)、或其衍生物，包括單體和多聚體形式的Neu5Ac漫灌細(xì)胞、培養(yǎng)物或受試者來去除或大幅減少所述細(xì)胞中的Neu5Gc。Neu5Ac、ManNAc或其衍生物的量包含當(dāng)Neu5Gc首次進(jìn)入細(xì)胞和/或從預(yù)先存在的細(xì)胞分子的分解中再循環(huán)時(shí)足以代謝地除去Neu5Gc的量。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法被用于替換受試者的細(xì)胞中先前摻入的Neu5Gc。而在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法被用于減少含有功能性CMAH基因的細(xì)胞或生物體中Neu5Gc的合成。
用Neu5Ac“漫灌”細(xì)胞或受試者意指提供在Neu5Ac方面高而含很少或不含可檢測到的Neu5Gc (例如，至少99% -100%無Neu5Gc)的組合物。把所述過程認(rèn)為是從細(xì)胞或生物體中沖洗或驅(qū)逐Neu5Gc可能是有幫助的。用于漫灌細(xì)胞或受試者的Neu5Ac的量是足以減少和除去Neu5Gc而對受試者或細(xì)胞無毒性的量。所述量將取決于生物體的大小、重量、 類型，培養(yǎng)條件，受試者或細(xì)胞中Neu5Gc的量，細(xì)胞或生物體是否具有功能性CMAH基因或同源體等等而變化。使用本領(lǐng)域中的技術(shù)可容易地確定所述量。用于漫灌受試者系統(tǒng)或培養(yǎng)系統(tǒng)的Neu5Ac可以是天然存在的Neu5Ac(以游離形式或糖苷連接的形式)或純合成的 Neu5Ac或其組合。來自膳食制備物的Neu5Ac的來源是已知的，其包括例如燕窩湯。合成 Neu5Ac或其衍生物的方法在本領(lǐng)域中已知。
在一個(gè)實(shí)施方式中，在產(chǎn)生所期望的產(chǎn)品的條件下生長和擴(kuò)增或培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物。培養(yǎng)條件可包括無Neu5Gc的培養(yǎng)基或包含N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、N_乙酰甘露糖胺(ManNAc)或其衍生物或類似物的無Neu5Gc的培養(yǎng)基，所述N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、 N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)或其衍生物或類似物的量足以除去細(xì)胞中預(yù)先存在的Neu5Gc或減少Neu5Gc的產(chǎn)生。例如，目前用于生產(chǎn)生物治療產(chǎn)品的一些細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)已經(jīng)含有和產(chǎn)生Neu5Gc和/或從培養(yǎng)基中獲得Neu5Gc。在一些實(shí)施方式中，以有效量或遞增量的Neu5Ac和/或其前體或衍生物或其類似物培養(yǎng)產(chǎn)生目的生物治療產(chǎn)品的細(xì)胞系以從培養(yǎng)物中去除Neu5Gc。如圖2E中所表明的，通過所述遞增量的Neu5Ac、其衍生物、類似物或前體，CHO細(xì)胞膜糖蛋白中存在的Neu5Gc大大減少。類似地，純化的由CHO細(xì)胞分泌的產(chǎn)品上Neu5Gc的量穩(wěn)定地減少直至不可檢測到(圖1)。因此，本公開提供這樣的方法和組合物，其通過將Neu5Ac加入培養(yǎng)基，可用于從已建立的動(dòng)物細(xì)胞系中已產(chǎn)生的所存在的生物治療產(chǎn)品中除去Neu5Gc。
此外，本公開的方法可有效地減少具有完整CMAH基因的生物體或源自所述生物體的細(xì)胞中的Neu5Gc的量。除不具有完整CMAH基因的人細(xì)胞中所運(yùn)行的代謝競爭機(jī)制之外，所述方法引起具有完整CMAH基因的細(xì)胞中Neu5Gc的產(chǎn)生。
如本申請中所使用的，術(shù)語“培養(yǎng)基(medium) ”或“培養(yǎng)基(media) ”指任何用于生長和收獲細(xì)胞的培養(yǎng)基和/或所述細(xì)胞所表達(dá)和/或分泌的產(chǎn)品。所述“培養(yǎng)基(medium)，， 或“培養(yǎng)基(media) ”包括但不限于可支持或含有任何宿主細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)容物的液體、固體、 半固體或剛性支持，其中所述宿主細(xì)胞以舉例的方式包括，細(xì)菌宿主細(xì)胞，酵母宿主細(xì)胞， 昆蟲宿主細(xì)胞，植物宿主細(xì)胞，真核宿主細(xì)胞，哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，CHO細(xì)胞，原核宿主細(xì)胞， 大腸桿菌(E.coli)或假單胞菌宿主細(xì)胞。所述“培養(yǎng)基(medium) ”或“培養(yǎng)基(media) ”包括但不限于宿主細(xì)胞已生長于其中、多肽已被分泌于其中的培養(yǎng)基，包括增殖步驟之前或之后的培養(yǎng)基。所述“培養(yǎng)基(medium)”或“培養(yǎng)基(media) ”還包括但不限于含有宿主細(xì)胞裂解物(例如，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的多肽，及裂解或破壞宿主細(xì)胞以釋放所述多肽)的緩沖液或試齊LU 在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞或細(xì)胞系在第一培養(yǎng)基中生長、被清洗然后生長在無 Neu5Gc且含有Neu5Ac的第二培養(yǎng)基中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基包含Neu5Ac，所述Neu5Ac的濃度至少是所述培養(yǎng)基中Neu5Gc濃度的1倍、2倍、3倍或更高。
人胚胎干細(xì)胞(hESCs)可潛在地生成所有身體細(xì)胞類型，使其成為用于細(xì)胞和組織替換療法的極佳候選者。典型地在鼠類飼養(yǎng)層上用源于動(dòng)物的“血清替換物”培養(yǎng)hESCs。 這兩者都是非人唾液酸Neu5Gc的來源，很多人具有針對所述非人唾液酸Neu5Gc的循環(huán)抗體。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，hESC和衍生的胚狀體都代謝地?fù)饺腼@著量的Neu5Gc (Martin，Μ. J.， Muotri,A. ,Gage,F.,禾口Varki,A. ,Human embryonic stem cells express an immunogenic non-human sialic acid. Nat Med. 11 :2沘_232，2005)。使用本公開的方法，通過在沒有 Neu5Gc或有檢測不到的Neu5Gc、以及有效量的Neu5Ac (例如，足夠的或遞增的Neu5Ac濃度)以替換細(xì)胞中Neu5Gc的條件下培養(yǎng)hESC、誘導(dǎo)的干細(xì)胞或胚狀體或由其衍生的細(xì)胞， 可降低或除去Neu5Gc的水平。所述培養(yǎng)基將包含約0. ImM至20mM或更多的Neu5Ac。所述方法可包括在通過將培養(yǎng)基或其組分暴露于抗Neu5Gc抗體而已排除Neu5Gc的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞或使用制備自或源自缺乏功能性CMAH多肽/基因的轉(zhuǎn)基因生物體的血清或培養(yǎng)基。
本公開的各種組合物和方法中所用的血清或細(xì)胞可源自CMAH轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。例如， 干細(xì)胞培養(yǎng)中所用的飼養(yǎng)層細(xì)胞可源自CMAH敲除轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本公開的方法可與所述 CMAH敲除細(xì)胞或血清制備物結(jié)合使用以進(jìn)一步從培養(yǎng)系統(tǒng)中“沖洗”任何在分離、傳代等過程中可能已被摻入的Neu5Gc。CMAH轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可在CMAH基因中具有敲除或具有突變的 CMAH基因。所述CMAH轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生無Neu5Gc的產(chǎn)品或相比于野生型動(dòng)物具有減少的 Neu5Gc負(fù)荷的產(chǎn)品。在另一個(gè)實(shí)施方式中，血清替換物現(xiàn)在可用于培養(yǎng)完全缺乏動(dòng)物產(chǎn)品的細(xì)胞和組織。
可使用許多普通的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。典型的傳代、無血清培養(yǎng)基、含血清培養(yǎng)基、低溫保存及相關(guān)的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。培養(yǎng)的方法將取決于生物體和/或細(xì)胞類型及其生長要求。在多數(shù)情況下，hESCs被培養(yǎng)于動(dòng)物飼養(yǎng)層上，最常見的是小鼠成纖維細(xì)胞。然而， 由于在本申請的別處所討論的原因，這些飼養(yǎng)層作為不希望的Neu5Gc的另外的來源，所述不希望的Neu5Gc然后可被摻入被培養(yǎng)的細(xì)胞中。相應(yīng)地，在將為過于謹(jǐn)慎的嘗試中，可能希望通過與使用人飼養(yǎng)層一起在培養(yǎng)基中使用人血清、以有效濃度的Neu5Ac培養(yǎng)所述細(xì)胞以替換或競爭過先前摻入的Neu5Gc或減少Neu5Gc的生產(chǎn)，以進(jìn)一步去除任何Neu5Gc的來源。培養(yǎng)條件可包括約0. ImM至20mM或更多的Neu5Ac。
正如在本申請中所用的，術(shù)語“缺乏Neu5Gc”或“無Neu5Gc”意指Neu5Gc與總唾液酸的比率小于5%，并甚至小于或是檢測不到的。例如，通過在親和柱中利用抗Neu5Gc 抗體可利用Neu5Gc的免疫原性，以去除產(chǎn)品中存在的任何Neu5Gc。備選地，各種人細(xì)胞、組織、胚狀體、神經(jīng)系細(xì)胞、癌細(xì)胞、皮膚細(xì)胞和器官(在此統(tǒng)稱為“細(xì)胞”)可用Neu5Ac培養(yǎng)且保存在Neu5Ac-環(huán)境中足夠長以使它們不含Neu5Gc。如以上文所討論的，任何存在于培養(yǎng)物或儲(chǔ)存培養(yǎng)基中的Neu5Gc可被摻入細(xì)胞中，因此除去Neu5Gc，且使用有效量的Neu5Ac 可從所述細(xì)胞中除去Neu5Gc。
除hESCs外，其它在本公開范圍內(nèi)的細(xì)胞類型包括，例如，胰島細(xì)胞、內(nèi)皮、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、心臟細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。然而，最顯著地，還未完全分化的祖細(xì)胞和多潛能細(xì)胞作為用于涉及細(xì)胞植入的治療處理的潛在來源對科學(xué)研究有很大的用處。此外，本申請中所描述的方法可在避免傳遞抗Neu5Gc抗體或摻入另外的Neu5Gc的條件下被用于在移植前保存人器官。
本公開的方法可與其他防止Neu5Gc的摻入的試劑聯(lián)合使用。在一個(gè)實(shí)施方式中， 本公開表明了將本公開的方法應(yīng)用于人細(xì)胞系或小鼠細(xì)胞系。用含有遞增量的人唾液酸 Neu5Ac的培養(yǎng)基“驅(qū)逐”或“沖洗”所述細(xì)胞。當(dāng)向培養(yǎng)基中加入Neu5Ac時(shí)，細(xì)胞中Neu5Gc 的水平降低得更快，在約5mM時(shí)所述效果達(dá)到峰值。因此，Neu5Ac可在約ImM至大于15mM 的范圍內(nèi)被使用(例如 l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14、15mM 或更多)。
目前用于生產(chǎn)生物治療產(chǎn)品的細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)可能已經(jīng)含有和產(chǎn)生Neu5Gc 和/或從培養(yǎng)基中獲得Neu5Gc。本公開的方法通過可被一般性地描述為Neu5Gc再循環(huán)或 Neu5Gc生產(chǎn)中的代謝競爭的過程而從生物治療產(chǎn)品中減少或去除Neu5Gc。所述方法可區(qū)別于競爭性“攝取”過程，在競爭性“攝取”過程中，Neu5Gc的攝取被Neu5Ac競爭性地取代了。然而，本公開的方法替換了先前摻入的Neu5Gc和/或Neu5Gc的合成(對于包含功能性的CMAH基因或同系物的細(xì)胞而言)。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞系已經(jīng)在產(chǎn)生目的生物治療產(chǎn)品，然后以遞增量的人唾液酸Neu5Ac和其類似物或衍生物和/或其前體培養(yǎng)所述細(xì)胞系以去除或減少Neu5Gc。所述Neu5Ac、衍生物、類似物、或前體替換(代謝地競爭)先前被摻入細(xì)胞培養(yǎng)物中的Neu5Gc。隨著時(shí)間，Neu5Gc被從培養(yǎng)物中替換或除去。典型地，與未接受任何Neu5Ac的相同培養(yǎng)物相比，所述過程以可檢測的量減少了 Neu5Gc。在某些情況下，所述減少可以是1、2、3、4、5倍或更多。
本公開的方法還提供了治療人的Neu5Gc關(guān)聯(lián)性病癥的方法或防止此類病癥發(fā)生的方法。所述方法包括以大丸劑、多次遞送或穩(wěn)定遞增遞送的方式向受試者配量施用 (dosing)(通過膳食消耗或醫(yī)療干預(yù))Neu5Ac。所述方法將Neu5Ac作為Neu5Gc的代謝競爭劑遞送，其幫助從身體中去除Neu5Gc。典型地，可通過尿樣品、組織樣品、血液、血清或血漿取樣監(jiān)控Neu5Ac和Neu5Gc的量。
所述方法包括以有效減少Neu5Gc含量的量向受試者施用包含合成的或天然存在的游離或結(jié)合的Neu5AC、Neu5AC類似物、Neu5Ac衍生物、前體或它們的任意組合的組合物。 合成Neu5Ac的方法是本領(lǐng)域中已知的。可通過酶促反應(yīng)、通過重組生物體和通過標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)反應(yīng)獲得Neu5Ac。某些食物和細(xì)菌多糖也含有大量的Neu5Ac。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，在個(gè)體被置于Neu5Gc缺乏性膳食約三天后(以清理胃腸道和除去任何新的Neu5Gc來源)測試人尿的Neu5Gc含量。在這一階段后，將M小時(shí)的尿收集物用于確定尿中Neu5Gc的基線水平(例如，從體內(nèi)的各種細(xì)胞類型排出并最終在尿中)。進(jìn)行所述測量或多個(gè)該測量之后，然后給予所述個(gè)體大劑量的或遞增的更大劑量的 Neu5Ac(例如，源自天然來源)。所述Neu5Ac處理的重復(fù)循環(huán)可最終引起身體Neu5Gc負(fù)荷的逐漸減少。
可通過任何途徑(例如，靜脈內(nèi)的、口服的、腹膜內(nèi)地等等)施用Neu5Ac。此外，本公開的方法可利用另外的膳食方法，包括但不限于，(i)無Neu5Gc食物的膳食，(ii)低量 Neu5Gc食物的膳食，(iii)高Neu5Ac食物的膳食，或者(i)或(ii)與(iii)的任意組合。 所述組合物和方法對從受試者中除去已摻入的Neu5Gc是有用的。換言之，所述組合物將所存在的Neu5Gc從細(xì)胞系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)對象中“沖洗”掉。盡管不希望被特定的理論所約束，當(dāng)已經(jīng)被摻入受試者或細(xì)胞系統(tǒng)的Neu5Gc被再循環(huán)時(shí)，本公開的方法和組合物所提供的過量Neu5Ac替換Neu5Gc。這和在最初接觸時(shí)與Neu5Gc的摻入競爭的方法相反。然而，將認(rèn)識(shí)到，除了去除先前摻入的Neu5Gc之外，所述方法可用于防止從膳食或細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中攝取 Neu5Gc。
為防止進(jìn)一步從食物來源將Neu5Gc攝取到體內(nèi)，含有Neu5Ac或ManNAc的片劑或飲料可與已知含有Neu5Gc的餐食或與包含減少的或無Neu5Gc的食物/飲料的餐食一同被提供。也可以使用某些已知富含唾液酸的食物。
在一個(gè)實(shí)施方式中，向呈現(xiàn)出Neu5Gc關(guān)聯(lián)性病癥的受試者或被懷疑患有Neu5Gc 關(guān)聯(lián)性病癥的受試者施用Neu5Ac組合物，將所述受試者置于Neu5Ac膳食、向所述受試者施用Neu5Ac組合物并將其置于低或無Neu5Gc膳食、或?qū)⑺鍪茉囌咧糜贜eu5Ac膳食和低或無Neu5Gc膳食。由于Neu5Gc在受試者中被代謝替換，將會(huì)有Neu5Gc含量的減少，例如在尿中。
以下實(shí)施例意在闡釋而非限制本公開。雖然它們是典型的可能被使用的，其他本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的程序可備選地被使用。
實(shí)施例 用中國倉鼠卵巢(CHO-Kl)細(xì)胞和分離自CMAH基因敲除小鼠的自發(fā)性腫瘤的上皮細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。但是，由于非人細(xì)胞經(jīng)常具有大量內(nèi)源性的Neu5Gc，在人細(xì)胞中的結(jié)果更顯
-frh-
者O 游離的Neu5Ac和Neu5Gc通過相同的途徑被攝取和摻入。Neu5Ac和Neu5Gc可由細(xì)胞從外源性來源攝取并被摻入內(nèi)源性糖綴合物中。Neu5Gc和Neu5Ac被基本上所有導(dǎo)致其最終被摻入糖綴合物中的步驟可互換地使用。
通過在Caco-2和人正常成纖維細(xì)胞中進(jìn)行競爭實(shí)驗(yàn)，確定了 Neu5Gc和Neu5Ac是經(jīng)由相同的途徑被攝取和摻入的。所述兩個(gè)細(xì)胞系都給出了類似的結(jié)果。用3mM Neu5Gc, 在培養(yǎng)基中缺少或存在(3mM或15mM)Neu5AC時(shí)飼養(yǎng)3天。兩種分子都使用相同的途徑進(jìn)入人細(xì)胞并可用于代謝摻入。所述途徑中的各種酶和轉(zhuǎn)運(yùn)子在對Neu5Gc和Neu5Ac的利用方面當(dāng)然可能有小的差異。
用游離的Neu5Ac飼養(yǎng)人細(xì)胞可加速總細(xì)胞膜和分泌的糖蛋白中預(yù)負(fù)載的Neu5Gc 的除去。由于發(fā)生Neu5Gc從外源性來源的轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取，本公開提供了用于減少所述攝取或從細(xì)胞或受試者中除去所存在的Neu5Gc的方法和組合物。如之前所述，在人細(xì)胞系中生產(chǎn)的生物治療產(chǎn)品可被從培養(yǎng)基中所用的源自動(dòng)物的材料中摻入的Neu5Gc污染。此外，讓所有的生物制藥都從目前用于生產(chǎn)的、已很好建立且經(jīng)FDA批準(zhǔn)的細(xì)胞系(如CH0，BHK，鼠骨髓瘤)進(jìn)行轉(zhuǎn)變，是非常困難的。
293-T人腎細(xì)胞在補(bǔ)充了 10% FCS的DME上生長。使用PBS中的20mMEDTA使細(xì)胞從培養(yǎng)板上升起并允許其生長至50%匯合。此時(shí)，一式兩份地向培養(yǎng)物中加入經(jīng)緩沖的IOOmM Neu5Gc，最終的濃度為5mM，且令細(xì)胞在此經(jīng)補(bǔ)充的培養(yǎng)基中生長3天。在這一 Neu5Gc脈沖結(jié)束時(shí)，用PBS中的20mM EDTA使細(xì)胞再次升起、沉淀細(xì)胞、用PBS洗滌一次以去除任何過量的Neu5Gc，然后懸浮于30ml生長培養(yǎng)基中。向5個(gè)P-100培養(yǎng)皿的每一個(gè)中加入5ml此細(xì)胞懸浮液。通過沉淀所述細(xì)胞而立即收獲所述細(xì)胞懸浮液的最后等份(時(shí)間 “0”)，用PBS洗滌一次，隨后將所述細(xì)胞懸浮于Iml PBS中并轉(zhuǎn)移至1. 5ml微量離心管中。 再次沉淀所述細(xì)胞并將其冷凍直至收集了所有的時(shí)間點(diǎn)。向另外5個(gè)用于“Neu5Ac驅(qū)逐” 的板的每一個(gè)中加入經(jīng)緩沖的IOOmM Neu5Ac，將等量的培養(yǎng)基加入“負(fù)驅(qū)逐”樣品中。在第1、2、3、4和5天，通過將細(xì)胞刮至培養(yǎng)基中、經(jīng)沉淀而收集、用PBS洗滌一次、轉(zhuǎn)移到1. 5ml 微量離心管中、沉淀并冷凍細(xì)胞粒狀沉淀而收獲細(xì)胞。在5天的驅(qū)逐結(jié)束時(shí)，在300 μ 1冰冷的20mM KP04 pH 7中、用Fisher超聲波儀、使用3_20秒的猝發(fā)使所有收集的細(xì)胞沉淀均質(zhì)化。通過加入700 μ 1100%的冰冷乙醇(最終為70%乙醇)并在_20°C孵育過夜而沉淀糖綴合物結(jié)合的唾液酸。使樣品在20000Xg下旋轉(zhuǎn)15min，將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的管中并在真空離心蒸發(fā)濃縮器上使其干燥。用超聲處理將所沉淀的糖綴合物和經(jīng)干燥的乙醇上清物各自懸浮于100 μ 1 20mM ΚΡ04ρΗ 7中。通過用2M醋酸(最終)的酸水解和在80°C孵育3小時(shí)，從所述兩級(jí)分中釋放唾液酸。使樣品通過Microcon-10過濾器并用DMB試劑使濾過物衍生化，用于通過HPLC分析唾液酸。
除了省略了 Neu5Gc脈沖且在蛋白質(zhì)-A瓊脂糖珠上捕獲所分泌的糖蛋白外，對于在培養(yǎng)基中穩(wěn)定表達(dá)涎免凝集素-Fc蛋白的CHO細(xì)胞采用類似的方法。除了通過離心沉淀總細(xì)胞膜外，細(xì)胞也被類似地處理。通過酸水解、DMB衍生化和HPLC確定分泌的蛋白和細(xì)胞膜中唾液酸的含量。還用雞抗Neu5Gc IgY、通過蛋白質(zhì)印跡法研究細(xì)胞膜。
因?yàn)榧?xì)胞中的Neu5Gc在溶酶體中“再循環(huán)”并被再用于新合成糖綴合物，本公開提供了減少所述再循環(huán)并因此從細(xì)胞中除去Neu5Gc的方法。本公開表明培養(yǎng)基中游離的 Neu5Ac被細(xì)胞攝取并與預(yù)先存在的Neu5Gc競爭，防止后者的再循環(huán)。另外，過量的Neu5Ac 將競爭掉Neu5Gc自培養(yǎng)基的任何進(jìn)一步摻入。為了研究這一可能性，我們用Neu5Gc預(yù)負(fù)載人細(xì)胞，然后用存在或缺少5mM Neu5Ac的培養(yǎng)基進(jìn)行驅(qū)逐。如圖2A和2B所示， Neu5Ac在培養(yǎng)基中的存在確實(shí)引起乙醇可沉淀的(糖苷結(jié)合的)Neu5Gc從細(xì)胞以及從分泌的糖蛋白中更快的清除。因此，向培養(yǎng)基中加入Neu5Ac是除去或減少人細(xì)胞的Neu5Gc污染的簡單且非毒性的方式。
大多數(shù)重組生物治療糖蛋白目前在非人細(xì)胞中生產(chǎn)，其中最普遍的是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。已知在CHO細(xì)胞中生產(chǎn)的生物治療糖蛋白攜帶少量的Neu5Gc。因此，本公開表明了減少Neu5Gc在培養(yǎng)的CHO細(xì)胞中積累的方法。如圖2C-E所示，對于膜糖蛋白和分泌的重組蛋白而言，這確實(shí)都是成功的。鑒于CHO細(xì)胞已經(jīng)表達(dá)其自身的內(nèi)源性Cmah 酶，這些數(shù)據(jù)提示除競爭過再循環(huán)的Neu5Gc外，涉及了新的機(jī)制。不論那種機(jī)制可能是什么，本方法顯示甚至在非人Cmah-陽性細(xì)胞系中也可實(shí)現(xiàn)重組糖蛋白的Neu5Gc含量的減少。
在商業(yè)上，可以所需的量獲得純化學(xué)合成的Neu5Ac。但是，研究可使用源自食物來源的 Neu5Ac。
作為治療人類的前序，用lmg/ml Neu5Ac在小鼠的飲用水中飼喂正常的WT小鼠18 周。通過觀察或全部血細(xì)胞計(jì)數(shù)和血液化學(xué)分析，這些小鼠不顯示任何毒性跡象，最終的尸體剖檢顯示無組織學(xué)異常。
人志愿者從可食用的燕窩(EBN)(流行的中國美味，典型地作為湯被食用并常常被稱為“東方的魚子醬”)攝食結(jié)合的Neu5Ac。EBN源自棲息在越南、泰國、印度尼西亞和菲律賓海岸區(qū)域的白巢金絲燕(Aerodramus fuciphogus)的唾液。EBN是膳食Neu5Ac的理想來源因?yàn)樗呛蟹浅８逳eu5Ac含量(9%w/w)的天然食物產(chǎn)品。此外，它作為中國菜肴和傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的一部分已經(jīng)超過1000年。對于制備用于攝食的結(jié)合的Neu5Ac，依照了典型的傳統(tǒng)湯食譜，其中將燕窩在水中浸泡過夜然后在新鮮的水中煮沸并加入肉湯和/或糖調(diào)味。對于制備用于攝食的游離的Neu5Ac，如上制湯，加入醋以溫和地酸化肉湯并促進(jìn)Neu5Ac的釋放。醋從食品商店購買。所述提取類似于制備甜的和酸的湯。每個(gè)個(gè)體攝食的游離或結(jié)合的Neu5Ac的量是l_3g，類似于^Ν湯的典型份量(參見,例如,www. chinesefood-recipes. com) ο 含有Neu5Ac的樣品被直至10個(gè)正常人志愿者攝食，所述人志愿者已避免了含有 Neu5Gc的產(chǎn)品3天并在所述研究的早晨僅食用了水果或蔬菜汁(無唾液酸)。避免固體食物是重要的因?yàn)槌錆M的胃會(huì)顯著延遲樣品進(jìn)入腸中和所測分子的攝取。攝食測試樣品后， 在下面6小時(shí)中受試者以約％il/Kg/小時(shí)僅飲用水果或蔬菜汁。從攝食前M小時(shí)開始收集所有的尿并繼續(xù)收集至攝食后48小時(shí)(3個(gè)集合U4小時(shí)=共72小時(shí))。在用鹽水徹底清洗口腔且在一片石蠟?zāi)ど暇捉?分鐘后，在攝食后0、6和M和48小時(shí)收集唾液樣品。在 0,3,24小時(shí)時(shí)收集血液樣品(約30ml或約2湯匙)，共約90ml或6湯匙。針對游離的和結(jié)合的Neu5Ac和Neu5Gc、以及N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)和N-羥乙酰甘露糖胺(ManNGc) (這些唾液酸的直接降解產(chǎn)物)分析所有的樣品。使樣品等份通過具有3000道爾頓的分子量截止值的Microcon過濾器。對于結(jié)合的唾液酸，滲余物被酸水解然后再次通過類似的 Microcon-3過濾器。然后用Dowex陰離子交換柱純化游離的唾液酸，并將這些陰離子性的糖從將含有ManNAc和ManNGc的中性糖級(jí)分中分離。后者通過使用丙酮酸鹽裂解酶、在加入過剩的丙酮酸鈉以驅(qū)動(dòng)反應(yīng)的條件下被酶促轉(zhuǎn)化回為唾液酸。用DMB (1，2-二氨基-4，5， 亞甲基-二氧基苯)試劑使唾液酸衍生化，從而在高壓液相色譜分離之后通過熒光檢測它們。通過質(zhì)譜直接分析目的峰，用于證實(shí)化學(xué)組成。為了定量的目的，使用了其他類似分子的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，在分析前將其加入尿樣品中。
在攝食前收集的尿提供了關(guān)于受試者尿的Neu5Ac和Neu5Gc排泄的基線水平的信息。在隨后的M小時(shí)的收集中，由于對所攝食的食物材料的腸吸收，觀察到了 Neu5Ac排出的增加，在第3天的M小時(shí)收集中回歸到基線。血液樣品收集的目的主要是確保在血液和生化參數(shù)方面沒有顯著的變化。注意在中國人群中，這些將不是對于特殊情況下的食用而言非常不尋常的量。由于各受試者是其自己的對照，問題是在重復(fù)處理之后，尿的Neu5Gc 排泄隨著時(shí)間是否顯著減少。沒有在先的數(shù)據(jù)可能預(yù)測基于性別或種族，結(jié)果是否會(huì)有差異。因此起初的志愿參與者是研究者自己，代表來自歐洲，南印度和墨西哥的女性和男性 (年齡范圍31-56)。所有所述志愿參與者目前都有良好的健康沒有主要的醫(yī)療問題。在研究前的72小時(shí)和在研究中的72小時(shí)避免所有非必要藥物、含Neu5Gc的食物和任何不尋常的食物。
在一組實(shí)驗(yàn)中，四名人受試者攝食在可食用的燕窩湯中的結(jié)合的約3G Neu5Ac。所有受試者都有良好的健康且沒有主要的醫(yī)療問題。如圖3所示，尿收集(其是有意隨機(jī)的， 不計(jì)時(shí)的)顯示在攝食后10-30小時(shí)期間，尿排泄中的Neu5Ac增加。更晚的時(shí)間點(diǎn)顯示在第二天回歸到基線。沒有觀察到不利的效果。在反復(fù)處理后，我們期待看到尿中基線Neu5Gc 的量下降。
已描述了本發(fā)明的許多實(shí)施方式。然而，將會(huì)理解的是可以不偏離本發(fā)明的精神和范圍而進(jìn)行各種修飾。相應(yīng)地，其他的實(shí)施方式在下述權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種方法，其包括用有效量或遞增量的游離或糖苷結(jié)合的N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺 (ManNAc)、或其類似物或衍生物培養(yǎng)包含Neu5Gc的細(xì)胞系，培養(yǎng)足夠的時(shí)間段以去除或大幅減少細(xì)胞、細(xì)胞系或由所述細(xì)胞或細(xì)胞系產(chǎn)生的產(chǎn)品中存在的Neu5Gc。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞系包括用于治療性蛋白生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞系包括hESC、誘導(dǎo)的干細(xì)胞或胚狀體細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述用游離或糖苷結(jié)合的N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、N_乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或其類似物或衍生物的培養(yǎng)，在以含有Neu5Gc的培養(yǎng)基組分進(jìn)行的起初培養(yǎng)之后進(jìn)行。
5.減少生物治療產(chǎn)品中Neu5Gc的量的方法，包括在用于生產(chǎn)生物治療產(chǎn)品的條件下、在包含有效量或遞增量的游離或糖苷結(jié)合的 N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、N_乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或其類似物或衍生物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含Neu5Gc的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述細(xì)胞系包括用于治療性蛋白生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述細(xì)胞系包括hESC、誘導(dǎo)的干細(xì)胞或胚狀體細(xì)胞。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述用游離或糖苷結(jié)合的N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或其類似物或衍生物的培養(yǎng)，在以含有Neu5Gc的培養(yǎng)基組分進(jìn)行的起初培養(yǎng)之后進(jìn)行。
9.制備用于移植的組織的方法，包括使所述組織暴露于缺乏Neu5Gc、且包含有效量或遞增量的游離或糖苷結(jié)合的N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或其類似物或衍生物的培養(yǎng)基。
10.治療炎性疾病或癌癥的方法，包括向包含Neu5Gc的受試者施用有效量或遞增量的游離或糖苷結(jié)合的N-乙酰神經(jīng)氨酸 (Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或其類似物或衍生物，直至Neu5Gc的水平降低或從受試者中被去除。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述疾病或癌癥與Neu5Gc或抗Neu5Gc抗體相關(guān)聯(lián)。
12.相比于Neu5Gc的水平，具有升高的游離或糖苷結(jié)合的N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、 N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或其類似物或衍生物的食物、飲料或細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品，用于治療Neu5Gc關(guān)聯(lián)性疾病或病癥，或用于減少受試者體內(nèi)Neu5Gc的含量。
13.權(quán)利要求12的食物、飲料或細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含約0.ImM至20mM或更多的游離或糖苷結(jié)合的N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、N_乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或其類似物或衍生物。
14.治療患有Neu5Gc關(guān)聯(lián)性疾病或病癥的受試者的方法，包括減少或除去Neu5Gc的膳食消耗和施用有效量或遞增量的游離或糖苷結(jié)合的N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或其類似物或衍生物，以從受試者中去除預(yù)先存在的Neu5Gc。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述游離或糖苷結(jié)合的N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或其類似物或衍生物來自膳食來源。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述游離或糖苷結(jié)合的N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或其類似物或衍生物來自合成的來源。
17.從生物治療產(chǎn)品或用于生產(chǎn)生物治療產(chǎn)品的細(xì)胞系中除去Neu5Gc的方法，包括在包含有效量或遞增量的游離或糖苷結(jié)合的N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺 (ManNAc)、或其類似物或衍生物的無Neu5Gc培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞，以從所述細(xì)胞系中去除先前摻入的Neu5Gc。
18.在包含Neu5Gc酶促途徑的動(dòng)物中減少Neu5Gc生產(chǎn)的方法，所述方法包括向所述動(dòng)物施用有效量的Neu5Ac、衍生物、類似物、或前體，其中所述有效量減少或除去所述動(dòng)物中 Neu5Gc的產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明提供了減少或除去細(xì)胞培養(yǎng)物或人受試者中的Neu5Gc的方法。所述方法包括用糖苷連接形式的或游離形式的人唾液酸N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)或其前體N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)漫灌系統(tǒng)，其量足以在Neu5Gc首次進(jìn)入細(xì)胞或從預(yù)先存在的細(xì)胞分子的分解再循環(huán)時(shí)代謝競爭過Neu5Gc。此外，甚至在某些能夠產(chǎn)生Neu5Gc的動(dòng)物細(xì)胞中，Neu5Ac的供給引起Neu5Gc表達(dá)的減少。
文檔編號(hào)A61P31/00GK102197131SQ200980141681
公開日2011年9月21日 申請日期2009年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月9日
發(fā)明者A·瓦基, S·迪爾茲, R·泰勒 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)