專利名稱：具有噬菌體內切唾液酸酶活力的重組蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種具有噬菌體內切唾液酸酶活力的重組蛋白，涉及其生產方法且涉及生產中應用的重組表達系統(tǒng)。
噬菌體E是噬菌體PK1A-PK1E家族的成員；這些噬菌體最初被從歐洲的污水中分離出來以幫助大腸桿菌(Escherichia coli)K1感染的臨床鑒定，這種大腸桿菌K1在新生兒腦膜炎的病例中導致很高的致死率。噬菌體E內切唾液酸酶(K1E內切唾液酸酶)被認為是在與宿主細菌的最初結合中起重要作用的酶，這種結合通過專一性地識別和水解K1多糖蛋白復合物的α-2，8相連的聚-N-乙酰神經氨酸(多唾液酸/PSA)糖聚合物來實現(xiàn)。α-2，8-相連的PSA也在其它幾種致病菌中，多種腫瘤細胞及細胞系中表達。在美國專利第4695541號中已經提出，因為K1E內切唾液酸酶具有水解α-2，8-唾液酶(α-2，8-sialosyl)鍵的高度專一性，所以其可以被用來診斷和治療K1腦膜炎，敗血癥或菌血癥。PSA已經在人的腎和神經內分泌組織的癌化中被認為是癌化標志，而且它也增加了一些腫癌的侵襲力和轉移的潛能。
在1993年的細菌學期刊中(J.Bacteriol.，1993，175，P4354-4363)曾經報道過試圖通過源于相關的KIF噬菌體的DNA構建物表達獲得具有酶活力的蛋白，但是并沒有成功。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，具有噬菌體內切唾液酸酶活力的蛋白即專性結合或裂解α-2，8-多唾液酸的蛋白，能夠通過表達從一種DNA構建物獲得，該構建物可源于KIE內切唾液酸酶基因，而且可以克隆到表達加至內切唾液酸酶序列N-端的多肽的表達載體中。
因此，本發(fā)明一方面提供了一種具有噬菌體內切唾液酸酶活性的重組蛋白，它能通過表達從重組載體得到，所述重組載體包括一段編碼噬菌體內切唾液酸酶的DNA序列，該DNA序列與表達加至內切唾液酸酶N-末端的多肽的表達載體的一段DNA序列連接，或者所述蛋白的類似物，這種類似物是所述有內切唾液酸酶活力的蛋白的突變體、功能性的片段或衍生物。
例如，上文所說的突變體可能是一種氨基酸序列中一處或幾處被刪除或替換的蛋白。上文所說功能性片段可以是C-或N-末端縮短的片段或是多肽鏈中的具有內切唾液酸酶活力的片段。上文所說衍生物可能是例如一種藥學上可以接受的與酸例如鹽酸、硫酸、磷酸、焦磷酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、甲磺酸、乳酸、棕櫚酸、酒石酸、抗壞血酸或檸檬酸形成的鹽；或與堿形成的鹽，通常是含氮的堿，例如含氮的鈉鹽，鉀鹽、鎂鹽或銨鹽；或是一種內鹽。
本發(fā)明在另一方面提供了一種包括一段編碼噬菌體內切唾液酸酶的DNA序列的重組載體，該DNA序列與表達加至內切唾液酸酶N-末端的多肽的表達載體的一段DNA序列連接，所述重組載體能在相容宿主細胞中指導所述蛋白表達。
本發(fā)明又一方面提供了生產具有噬菌體E內切唾液酸酶活力的蛋白的方法，這種方法包括在能表達所述蛋白的條件下培養(yǎng)用前述重組載體轉化過的宿主細胞，并分離由此生產出的蛋白。再一方面，本發(fā)明提供了一種用前述重組載體轉化過的宿主細胞。
本發(fā)明的優(yōu)選蛋白是一種可通過表達由前文定義的重組載體獲得的蛋白，其中編碼內切唾液酸酶的DNA序列源于編碼由噬菌體E內切唾液酸酶基因的核苷酸172-1744即下文中定義的SEQ ID NO.1的核苷酸172-1744所編碼的氨基酸殘基的DNA構建物，或是具有內切唾液酸酶活力的所述蛋白的突變體、功能性片斷或衍生物。本發(fā)明特別優(yōu)選的蛋白是一種可通過表達由前文定義的重組載體獲得的蛋白，其中編碼內切唾液酸酶的DNA序列源于編碼由噬菌體E內切唾液酸酶基因的核苷酸1-2436即下文中定義的SEQ ID No.1的核苷酸1-2436所編碼的氨基酸殘基的DNA構建物，或是具有內切唾液酸酶活力的所述蛋白的突變體、功能性片斷或衍生物。
本發(fā)明的蛋白通常是以融合蛋白的形式表達的，所述融合蛋白包括直接或通過一段間隔序列與源于所述表達載體(即用來在適合的宿主細胞中表達該蛋白的載體)的多肽相連的內切唾液酸酶，一種優(yōu)選的該多肽是谷胱甘肽S-轉移酶。當希望該融合蛋白的多肽成分是可分離的時候，如果該融合蛋白不是天然存在可用化學或酶促法專一性切割的區(qū)域的話，就可用常規(guī)方法插入這一區(qū)域。用于融合蛋白的選擇性裂解試劑或裂解酶的實例有V8蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶、因子X、CNBr、肽酶yscα和yscF。
在本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明蛋白是融合蛋白形式的，它包括與谷胱甘肽S-轉移酶相連的噬菌體E內切唾液酸酶，該融合蛋白的分子量優(yōu)選約為100kDa。
適合于表達本發(fā)明蛋白的DNA構建物即重組DNA分子可以是一種編碼噬菌體內切唾液酸酶的分離DNA片段，例如僅包括編碼區(qū)的DNA片段或由同源或異源DNA序列延伸而成的DNA片段。該構建物可以是一種編碼內切唾液酸酶、克隆入合適的克隆載體的DNA片斷，載體最好是細菌載體例如pBR317，pBR322，pUC18，pSF 2124或特別是Bluescript SK+。這種克隆缺少只分離出內切唾液酸酶開放的閱讀框架所需的限制性酶切位點，可以利用包含所需限制性位點的引物通過聚合酶鏈反應法(PCR)反應來擴增。
編碼噬菌體內切唾液酸酶的DNA片段能從噬菌體E基因組DNA或與其基本同源的合成DNA得到，例如80-100％同源。噬菌體E能夠被純化并可以用傳統(tǒng)的方法抽提全部基因組DNA。抽提后的DNA可以隨后用合適的限制性內切酶例如BgI II，ECoRI，HincII，Hind III，BamHI或者Pst I進行消化。消化產物能應用低熔點瓊脂糖凝膠的制備電泳來富集特定長度的DNA級分，以用來富集編碼本發(fā)明蛋白的DNA片段。
當編碼噬菌體內切唾液酸酶的核苷酸序列或其氨基酸序列已知時，編碼內切唾液酸酶的DNA也可以通過直接產生所需DNA的方法例如傳統(tǒng)的PCR方法或者體外的化學合成方法來制備。
為了表達本發(fā)明的蛋白，DNA構建物被克隆到一個表達一種連在內切唾液酸酶N-末端的多肽的表達載體中，從而產生本發(fā)明的重組載體。表達載體的選擇當然是依據為表達蛋白所選宿主細胞的性質而定。適合的這種表達載體可商購。當一種適合的表達載體是原核表達載體，例如λ噬菌體或細菌質粒時，優(yōu)選在原核宿主中進行表達，更優(yōu)選微生物宿主，特別是大腸桿菌。特殊原核表達載體的例子是pGEX載體例如pGEX-2T(Pharmacia Biotech)，其能夠實現(xiàn)內切唾液酸酶-谷胱甘肽S-轉移酶(GST)融合蛋白的表達；pMAL(New England Biolab)，其能夠實現(xiàn)內切唾液酸酶-麥芽糖結合蛋白融合蛋白的表達；得自Promega的“針尖(pinpoint)”系統(tǒng)，其使表達蛋白生物素化；得自Biometra的“鏈狀標記(strep-tag)”系統(tǒng)，其可以在表達的蛋白上安插鏈霉抗生物素結合蛋白；得自Qiagen的Ni-NTA系統(tǒng)，它給表達蛋白增加6個組氨酸來結合鎳；得自Invitrogen的Xpress系統(tǒng)，其作用原理與Ni-NTA系統(tǒng)相似。
優(yōu)選的表達載體是pGEX載體，其含有一個tac啟動子、一個內部的lacI基因和一種凝血酶或Xa因子識別位點；特別是pGEX-2T載體，其具有如下序列Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Gly lle His Arg AspCTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GGA ATT CAT CGT GAC TGA CTG ACG將DNA構建物克隆至表達載體以得到本發(fā)明的載體，其可以通過傳統(tǒng)的限制和連接技術實現(xiàn)。這樣當DNA構建物包含可以通過PCR擴增而摻入的限制性酶切位點Bam HI和EcoRI時，DNA構建物和表達載體可以同時用Bam HI和EcoRI消化，按照廠商的說明用DNA連接酶進行連接反應。
正象前面提到的那樣，用于表達本發(fā)明蛋白的宿主細胞優(yōu)選是原核細胞，更優(yōu)選微生物細胞，包括細菌細胞例如枯草芽孢桿菌，假單孢菌屬，鏈球菌屬或特別是大腸桿菌的細胞。
轉化宿主細胞可以用適合于那些細胞的傳統(tǒng)技術來進行。因此，大腸桿菌細胞的轉化步驟包括，例如用Ca2+預處理細胞以便允許DNA吸收，以及與重組載體一同孵育。隨后的轉化細胞選擇可這樣實現(xiàn)通過將細胞轉移到一種能將轉化細胞從原代細胞中分離出來的選擇性生長培養(yǎng)基中，或通過對由孵育細胞得到的小量制備DNA樣品的限制性分析。
轉化過的宿主細胞可以通過本領域公知方法在包含以下成份的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種可同化的碳源，例如糖如葡萄糖或乳糖；一種氮源，例如氨基酸、肽、蛋白，或其降解產物例如蛋白胨、銨鹽等；以及一種無機鹽，例如鈉、鉀、鎂或鈣的硫酸鹽、磷酸鹽和/或碳酸鹽。培養(yǎng)基還可含有，例如促進生長的物質，如微量元素，例如鐵、鋅、錳等。
培養(yǎng)可用本領域公知的各種方法進行。選擇培養(yǎng)條件，例如溫度、培養(yǎng)基pH和發(fā)酵時間，以得到本發(fā)明蛋白的最大表達水平。這樣，大腸桿菌菌株最好在約20℃-40℃、優(yōu)選約37℃，pH值為4-8、優(yōu)選約7的條件下有氧條件下由深層液體培養(yǎng)法進行培養(yǎng)，培養(yǎng)中進行攪拌或振蕩，培養(yǎng)約4-30小時，最好到本發(fā)明蛋白的產量達到最高時為止。
表達出的蛋白能通過常規(guī)方法從象大腸桿菌細胞這樣的微生物細胞中或細胞培養(yǎng)物上清液中抽提出來，所述方法例如包括裂解細胞，象離子交換層折、疏水或大小排阻層析這樣的層析法，例如用硫酸銨或酸，制備電泳例如十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)或等電聚焦，等等。象本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案中那樣，當表達蛋白是一種內切唾液酸酶-谷胱甘肽S-轉移酶融合蛋白時，可以如Smith和Johnson所述將蛋白通過結合谷胱甘肽的珠子而純化，見(1988)Gene，67，31-40。裂解純化的融合蛋白能夠用凝血酶而實現(xiàn)，例如按Pharmacia Biotech即pGEX-2T表達載體的產商的說明來進行。
本發(fā)明也提供了一種藥物組合物，它包含本發(fā)明的蛋白或其藥物學上可接受的鹽作為活性成分，選擇地含有生理上可接受的載體，載體例如可以是賦形劑，稀釋劑或藥物組合物中的其它常規(guī)輔助劑。
本發(fā)明的蛋白可用于醫(yī)學中的診斷或治療，特別是用于人體，包括多種的疾病，特別是腦膜炎，和以在腫瘤細胞表面表達多唾液酸為特征的癌，例如Wilm′s腎瘤、小細胞肺癌，神經母細胞瘤，髓樣甲狀腺癌，尿道癌，神經外胚層癌，畸胎癌，橫紋肌肉瘤，嗜鉻細胞瘤，Ewing肉瘤，胰島腺癌、乳腺癌和腦垂體癌。這種蛋白可用于抑制腫瘤轉移，例如手術后的腫瘤轉移。這些蛋白還可用于診斷或治療由大腸桿菌KI所導致的其它病癥，例如膿毒病和尿路感染，或其它在細胞表面表達多唾液酸的細菌引起的癥狀。
這樣，本發(fā)明也提供了治療下列病癥的方法由在其細胞表面表達多唾液酸的細菌引起的病癥、以在腫瘤細胞表面表達多唾液酸為特征的癌癥、或腫瘤轉移，該方法包括給需要這種治療的溫血動物施用本發(fā)明的蛋白或類似物。
本發(fā)明的藥物組合物，特別是用于以上適應癥的組合物，可以通過非腸道方式給藥，例如靜脈給藥、皮內給藥，皮下給藥、肌內給藥。劑量主要取決于給藥的方法及治療的目的。具體劑量及給藥方法可依據對不同病例的具體判斷來決定。通常，注射給藥時，本發(fā)明蛋白的治療有效量是約0.005-約0.1mg/kg體重。
除了活性成份之外，本發(fā)明的可注射藥物組合物可包含一種緩沖劑，例如磷酸緩沖劑，氯化鈉，甘露醇或山梨醇以調節(jié)等滲性，以及一種有抗菌活性的防腐劑，例如對羥基苯甲酸的甲酯或乙酯。
本發(fā)明的蛋白，鑒于其酶活性，也可以用于分析糖蛋白，例如檢測及測序修飾寡糖殘基的糖蛋白，因為這種蛋白可以從糖蛋白中選擇性地除去特定的糖殘基。
本發(fā)明由下列實施例來闡述，這些實施例涉及特別優(yōu)選的實施方案。
實施例1制備包含噬菌體E內切唾液酸酶開放閱讀框架的DNA構建物除了另有指明，所有用到的方法都如Sambrook等所述，MolecularCloninga Laboratory Mannual，2nd Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(1989)。
簡并寡核苷酸探針參照大腸桿菌密碼子使用表(Holm(1986)Nuc.AcidsRes.14，3075-3087)設計，用一種自動Applied Biosystems PCR-MAT model391 DNA合成儀制備，并采用T4多核苷酸激酶用[r32p]ATP(AmershamInternational Plc.，Amersham，Bucks，U.K.)標記5′末端。放射性標記的寡核苷酸探針與噬菌體E DNA的限制性酶的消化物雜交，瓊脂糖凝膠中進行電泳，然后轉移到Hybond-N尼龍膜上(Amersham InternationalPlc.)。與探針雜交的噬菌體E DNA片段由放射自顯影來證實，由NA級的瓊脂糖凝膠(Pharmacia Biosystems Ltd，Milton Keynes，Bucks，U.K.)來純化，并用T4 DNA連接酶(NEB Inc.)連接在Bluescript SK+(Strategene Inc.，La Jolla，CA，USA)上用Bluescript SK+轉化大腸桿菌Epicurian SURE細胞(Strategene Inc.)，是按照采用Bio-Rad GenePulser和Pluse Controller的電穿孔法(Dower等(1988)，Nucleic AcidsRes.16，6127-6145)進行的，利用電泳的方法或者用熱激法在42℃下進行60秒鐘來轉化高效大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞(Promega Inc.Madison，WI，USA)。用重組質粒轉化的克隆通過下述方法來鑒定在2TY/氨芐青霉素瓊脂平板上生長并應用50mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基(indoyl)-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)和0.1M異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的混合物來以藍-白色篩選克隆。雙鏈DNA的測序用得自UnitedStates Biochemical Corporation，Cleveland，OH，USA的SequenaseVersion 2.0測序試劑盒和一個SA型測序儀(得自BRL Life TechnologiesInc.，Gaithersburg，MD，U.S.A.)來進行。測序可以通過嵌套缺失技術或通過由British Biotechnology Products Ltd，Abingdon U.K.或上述方法制備的合成寡核苷酸引物來獲得更大的方便。
簡并寡核苷酸引物即引物1[5′- TAC(T)CAC(T)CAGGGT(G)GAC(T)GTG(T)GCG(C)CC-3′]得自具有最長的非多義氨基酸序列的KIE內切唾液酸酶的溴化氰片段；且是用得自溴化氰片段的部分氨基酸序列設計的五個探針中簡并性最小的一個。噬菌體E基因組DNA一個長達1.9kb的BgIII限制性消化片段通過采用32P-放射性標記的探針1的Southern印跡分析鑒定為有能力編碼內切唾液酸酶。BgIII和BamHI內切酶產生帶相同序列的粘性突出末端，這使得1.9kb BgIII片段能與Bluescript SK+克隆載體(Promega INc.)的BamHI位點連接。來自于用上面得到的重組載體轉化過的一個克隆(克隆1)的質粒小量制備DNA產生一DNA序列，該DNA序列編碼一種推斷的蛋白序列，該蛋白序列含有一段與設計引物1用的CNBr片斷的序列相同的序列。
探針2[5′-GATCTTGGTCTAATCCCT-3′]，是一個非簡并性的寡核苷酸18體，它是利用克隆1的5′端處的序列合成的。這個探針鑒定了噬菌體E基因組DNA的兩個SinI消化片段中的一個，其能做為約等于3.3kb的單線DNA。已經證實這個片段編碼克隆1的5′末端上游的DNA序列，方法是用SinI消化克隆1插入DNA。消化物結果顯示，在克隆1插入DNA中至少有三個SinI位點，其中最大的一個片段是1.1kb。因為噬菌體E DNA的限制性分析表明在整個基因組中只有2個BgIII位點，凝膠純化的SinI片段用BgIII消化，這個包含探針2識別序列和BgIII位點的片斷產生出2.1kb和1.1bk兩個片段。將該2.1kb SinI×BgIII消化片段克隆入Bluescript SK+中，方法是連接BgIII末端與BamHI末端，隨后用T4 DNA聚合酶的Klenow片斷填平末端，再連接所得平端在一起來環(huán)化質粒。所得克隆(克隆2)被發(fā)現(xiàn)包含一個開放閱讀框架，通過與約76kDa的酶亞基N-端氨基酸序列比較知道該框架編碼KIE內切唾液酸酶的N-端。得到克隆1和2在5′與3′方向上的重迭序列，開放閱讀框架的位置由編碼優(yōu)選性和堿基位置優(yōu)選性分析確定(Staden等，(1982)Nuc.Acids Res.10，141-156和Staden(1990)Meth.Enzymol.183，163-180)。
重組質粒DNA由克隆2純化，通過裂解唯一的EcoRI位點而線性化，帶5′帽子的RNA用SP6RNA聚合酶和mCAP mRNA加帽試劑盒(Stratagene Inc.)進行轉錄。按廠商的說明(Promega Inc)利用0.1μg RNA轉錄物、20μCi[35S]甲硫氨酸及兔網織紅細胞裂解物體系進行體外翻譯反應(25μl)。確信SP6RNA聚合酶和體外翻譯系統(tǒng)是起作用的是通過同時進行的陽性對照獲得的。所述對照質粒是一種線性的SV64-羧肽酶E構建物，它帶有上游SP6啟動子區(qū)(Fricker等，(1989)，Mol.Endocrinol.3，667-673)。
包含全部克隆1插入片段的1892bp的一個噬菌體E DNA片段被用ECoRI和XbaI從克隆1中切除。它被定向克隆到用同樣的限制酶切過的載體pGEM-IIz(Promega Inc.)中，這樣就在克隆1的3′端安插一個Sacl位點。一個707bp的Sacl/AvrII片段被從新構建物中切除。這個707bp的片段編碼預計的內切唾液酸酶的C-端114個氨基酸和KIE DNA的3′非翻譯區(qū)。這個片段與克隆2的Sacl/AvrII消化物的3253bp產物連接。這樣產生的質粒(克隆3)僅包含原先在Bluescript SK+載體中克隆出來的KIE DNA的5′及3′末端區(qū)，實際上缺少這樣一種DNA序列的中央2975bp所述DNA序列包括編碼預計的內切唾液酸酶開放閱讀框架的序列。一個來自于整個KIEDNA的AvrII消化產物的2975bp片段被連接到AvrII消化的克隆3中。在Bluescript SK+中得到的構建物(克隆4)包含原先編碼于克隆1和2中的全長內切唾液酸酶基因；該基因用Sequenase2.0測序試劑盒(USBCorp)測序。其具有SEQ.ID.NO1中所示的序列。
實施例2制備表達噬菌體E內切唾液酸酶用的重組質?？寺?即如實施例1所述制備的一種包含全部內切唾液酸酶開放閱讀框架的DNA構建物，應用PCR反應使其內切唾液酸酶開放閱讀框架擴增，所用引物為5′-CCGGGGATCCATGATTCAAAGACTAGGTTCTTCATTA-3′和3′-CGTTAGACGACGTGCGGTCTTGTGTATCTTAAGACAC-5′，分別在開放閱讀框架的5′和3′端摻入了BamHI限制性位點和EcoRI限制性位點。
該2483bp的PCR產物用以下方法洗滌先用苯酚(用2-氨基-2-羥甲基丙-1，3-二醇平衡至pH8.0)和24∶1的氯仿∶異戊醇混合物的等體積混合物提取，然后只用氯仿∶異戊醇混合物，隨之用乙醇沉淀并在TE緩沖液中重懸浮(10mM 2-氨基-2-羥甲基丙-1，3-二醇鹽酸化物，1mM EDTA，pH8.0)。洗滌后的PCR產物及pGEX-2T表達載體(PharmaciaBiotech)用BamHI和ECoRI同時消化，通過瓊脂糖凝膠電泳和Qiaex抽提(Quiagen Corp.)來純化。切割后的PCR產物和表達載體按廠商的說明用T4 DNA連接酶(New England Biolabs)連接，以形成一個重組載體，利用USB Sequenase2.0對該載體進行測序，通過兩個克隆位點證明已保留了正確的閱讀框架。
實施例3轉化和表達采用Bio-Rad電穿孔器，將實施例2的連接產物用于轉化電感受態(tài)大腸桿菌MC 1061細胞。轉化的細胞通過限制性分析由該細胞得到的小量制備的DNA來選擇。
培養(yǎng)轉化過的細胞以表達融合蛋白，方法是在OD600已達0.3時添加IPTG至終濃度為0.5mM；然后在37℃、250rpm振蕩下讓細胞再生長4小時。如Smith和Johnson(1988)Gene 67，31-40中所述，通過與谷胱甘肽小珠的結合從培養(yǎng)基中純化表達出的融合蛋白。
細菌培養(yǎng)物的樣品和純化融合蛋白級分的樣品經SDS-PAGE、電泳法轉移至硝化纖維素膜上、洗滌并按Sambrook等的方法(1989，同上)與抗內切唾液酸酶多克隆抗血清雜交。檢測免疫反應性帶，方法是通過將綴合的第二抗體與堿性磷酸酶結合以及與(a)氮藍四唑氯在二甲基甲酰胺和水的70∶30混合物中的50mg/ml溶液和(b)5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸二鈉鹽在水中的50mg/ml溶液這兩種溶液的反應。
用Horgan的TBA分析法(Horgan(1981)，Clin.Chim.Acta 116，409-41 5)測定N-乙酰神經氨酸(NANA)通過純化的融合蛋白級分從多唾液酸中的釋放。測定表明，NANA的釋放速率與融合蛋白濃度成正比。當該融合蛋白僅被谷胱甘肽S-轉移酶蛋白替代時，觀察不到NANA的釋放。序列表(1)SEQ.ID.NO1的信息(i)序列特征(A)長度2436個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(ii)分子類型DNA(基因組的)(iv)來源(A)生物體噬菌體E(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置1..2436(D)其它信息/產品＝“噬菌體E內切唾液酸酶的編碼區(qū)”(xi)序列描述SEQ ID NO1M I O R L G S S L V K F K S K I A G A I W R N L D D K L T E V V S L K D T G A KATGATTCAAAGACTA GGTTCTTCATTAGTT AAATTCAAGAGTAAA ATACCAGGTGCAATC TGGCGTAACTTGGAT GACAAGCTCACCGAG GTTGTATCGCTTAAA GATTTTGGAGCCAAA 120G D G K T N D O D A V N A A M A S G K R I D G A G A T Y K V S S L P D M E R F YGGTCATGGTAAGACA AACGACCAAGATGCA GTAAATGCAGCGATG GCTTCAGGTAAGAGA ATTGACGGTGCTGGT GCTACTTACAAAGTA TCATCTTTACCTGAT ATGGAGCGATTCTAT 240N T R F V W E R L A G O P L Y Y V S K GF I N G E L Y K I T D N P Y Y N A W P OAACACCCGCTTCGTA TGGGAACGTTTAGCA GGTCAACCTCTTTAC TATGTGAGTAAAGGT TTTATCAATGGTGAA CTCTATAAAATCACG GATAACCCTTATTAC AATGCTTGGCCTCAA 360D K A F V T E N V I Y A P Y H G S D R H G V S R L H V S W V K S G D O G Q T W SGACAAAGCGTTTGTA TATGAGAACGTGATA TATGCACCTTACATG GGTAGCGACCGTCAT GGTGTTAGTCGTCTG CATGTATCATGGGTT AAGTCTGGTGACGAT GGTCAAACATGGTCT 480T P E W L T D M H P D Y P T V N Y H C M S M G V C R N H L T A M I C T R T L A KACTCCAGAGTGGTTA ACTGATATGCATCCA GATTACCCTACAGTG AACTATCATTGTATG AGTATGGGTGTATGT CGCAACCGTCTGTT TGCCATGATTGAAACA CGTACTTTAGCCAAG 600N E L T N C A L W D R P M S R S L H L T G G I T K A A N Q R Y A T I H V P D H GAACGAACTAACCAAT TGTCCATTGTGGGAT GGCCCTATGTCTCGT AGTCTGGATCTTACT GGTGGTATCACTAAG GCTGCAAATCAGAGA TATGCAACAATCCAT GTACCTGATCACGGA 120L F V G D F V N F S N S A V T G V S G D M K V A T V I D K D N F T V L T P N O OCTCTTCGTTGGTGAT TTTGTTAACTTCCCT AACTCTGGGGTAACA GGTGTATCTGGTGAT ATGAAGGCTGCAACA GTAATAGATAAGGAC AACTTCACGGTTCTT ACACCTAACCAGCAG 8A0T S D L N N A G K N W H M G T S T H K S P W H K T D L G L I P R V T E V H S F AACTTCAGATTTGAAT AACGCTGGAAAGAAT TGGCACATGGGTACT TCTTTCCATAAGTGT CCGTGGGGTAAGACA GATCTTGGTCTAATC CCTCGTGTCACAGAG GTGCATAGCTTTGCT 960T I O N N G F V M G Y H Q G D V A P R E V G L F Y F F Q A F N S P S N Y V R R QACTATTGATAACAAT GGCTTTGTTATGGGC TATCATCAAGGTGAT GTAGCTCCACGAGAA GTTGGGCTTTTCTAC TTCCCTGATGCTTTC AATAGCCCATCTAAT TATGTTCGTCGTCAG 1080I P S E Y E F D A A E P C I K Y Y D G V L Y L I T R G T R G D R L G S S L H R SATACCATCTGAGTAT GAACCAGATCCGGCA GAGCCATGCATCAAG TACTATGACCGTGTA TTATACCTTATCACT CGTGGTACTCGTGGC GACCGACTAGGAAGC TCTCTGCATCGTAGT 1200R O I G Q T W E S L R F P H N V H H T T L P F A K V G D D L I M F G S E R A E NAGAGATATAGGTCAG ACTTGGGAGTCACTA ACATTTCCACATAAT GTGCATCATACTACT TTACCGTTTGCTAAG GTAGGAGATGACCTT ATTATGTTTGGTTGA CAACGTGCAGAAAAT 1120E H E A G A P D D H Y K A S Y A R T I Y A R L N V N V N N A D D I E M V N I T DGAATGGGAAGCAGCT GCACCAGATGATCGT TACAAGGTATCTTAT CCTCCTAGCTTTCAT GCACGATTGAATGTA AACAATTGGAATGCA GATGATATTGAATGG GTTAACATGACAGAC 1440O I Y O G D I V N S S V G V G S V V V K S I Y Y I Y I F G G E N H F N P M T Y GCAAAICTATCAGGGT GACACCGTGAACTCT AGTGTAGGCGTAGGT TCTGCTGTAGTTAAA GACAGCTTCATlIAC TATATCTTTGGTGGT GAAAACCATTTGAAC CCAATGAGTTATGGT 1560D N K D K D F I K G H G H P I D I Y I Y K M U I A N D N R V S R K F Y Y G A T PGACAACAAAGACAAA GACCTATTTAAAGGT CATGGACACCCTATT CATATATACTGCTAT AAGATGCAGATTGCA AATGACAATCGTGTA TCTCGTAAGTTTACA TATGGTGCAACTCCA 1680G O A I P T F M G T D G I R N I P A F L Y F S O N T V T E O T K V G H L T L A AGGTCAAGCTATACCT ACTTTCATGGGGACT GATGGAATACGAAAT ATCCCTGCACCTTTG TATTTCTCAGATAAC ATTGTTACAGAGGAT ACTAAAGTTGGACAC TTAACACTTAAAGCA 1800S T S A N I M S E M O M E G E Y G F I G K S V P K D K P T G O R L I I C G G E GAGCACAAGTGCGAAT ATACGATTCGAAATG CAGATGGAAGGTGAG TATGGCTTTATTGGG AAGTCTGTTGCAAAG GACAAACCAACAGGT CAACGTTTGATTATT TGTGGTGGAGAAGGG 1920T S S S S A Q I T L H G S N S S N A K R I T Y N N G N E H L F Q G A P I M P A VACTTCATCATCTTCA GGTGCATAGATAACT TTGCACGGTTCTAAT TCAAGTAATGCTAAG CGTATCACTTATAAC GGAAACGAGCACCTA TTCCAAGGTGCACCA ATCATGCCTGCTGTA 2040D N O I A A G G P S N R F T T I Y L G S D F V T T S P D A D K Y G I S S I N T KGATAACCAGTTTGCT GCGGTGGACTTACTT AACCGATTTACTACC ATTTACTTAGGCAGT GACCTTGTTATAACT TCAGATTGTGACCAC AAGTACGGTATCTCT AGTATTAATAGCAAG 2160V L K A W S R V G I K O Y G L N S E A E R N L D S I H F G V L A Q D I V A A F EGTGTTAAAGGCTTGG AGGTAGGGTTGTTTT AAACAGTATGGCTCG AATAGTGAAGCGAAG AGGAACCTTGATAGG ATACACTTCGGTGTC TTGGCTCAGGATATT GTAGCTGCTTTTGAA 2280A L G L D A I K Y G I V S F F E G H Y G V H Y S E V L I L E A A Y T R H R L D KGCTGAAGGGTTGGAT GCCATCAAGTATGGA ATTGTGTCCTTCGAA GAAGGTAGGTATGGT GTGAGATATAGTGAA GTTCTAATCCTAGAG GCTGCCTATACTCGC CATCGTCTTGATAAA 2400L E E M T A T N K I S *TTAGAGGAGATGTAT GCCACTAATAAAATC AGTTAA 243權利要求
1.一種具有噬菌體內切唾液酸酶活性的重組蛋白，它能通過表達從重組載體得到，所述重組載體包括一段編碼噬菌體內切唾液酸酶的DNA序列，該DNA序列與表達加至內切唾液酸酶N-末端的多肽的表達載體的一段DNA序列連接，或者所述蛋白的類似物，這種類似物是所述有內切唾液酸酶活力的蛋白的突變體、功能性片段或衍生物。
2.權利要求1的蛋白或類似物，其中編碼內切唾液酸酶的DNA序列源于一種編碼由SEQ.ID.NO.1的核苷酸172-1744所編碼的氨基酸殘基的DNA構建物。
3.權利要求1的蛋白或類似物，其中編碼內切唾液酸酶的DNA序列源于一種編碼由SEQ.ID.NO.1的核苷酸1-2436所編碼的氨基酸的DNA構建物。
4.權利要求1、2或3的蛋白，其是一種融合蛋白，它包括直接或通過一段間隔序列與源于表達載體的多肽相連的內切唾液酸酶，或者所述蛋白的類似物，這種類似物是所述蛋白的突變體、功能性片段或衍生物。
5.權利要求4的蛋白或類似物，其中的多肽是谷胱甘肽S-轉移酶。
6.權利要求1-5中的任意一項的蛋白或類似物，其中編碼內切唾液酸酶的DNA序列源于包括編碼內切唾液酸酶、克隆到細菌克隆載體中的DNA片段的DNA構建物。
7.權利要求6的蛋白或類似物，其中的DNA片段源于噬菌體E基因組DNA或一種與其基本同源的合成DNA。
8.權利要求6或7的蛋白或類似物，其中DNA構建物用含有限制性酶切位點的引物通過聚合酶鏈式反應來擴增。
9.一種包括一段編碼噬菌體內切唾液酸酶的DNA序列的重組載體，該DNA序列與表達加至內切唾液酸酶N-末端的多肽的表達載體的一段DNA序列連接，所述重組載體能在相容宿主細胞中指導所述蛋白表達。
10.權利要求9的重組載體，其中所述編碼DNA序列是權利要求6到8任一項的DNA構建物。
11.權利要求9或10的重組載體，其中表達載體是一個原核表達載體。
12.權利要求9到11中任一項的重組載體，其中表達載體是pGEX載體。
13.權利要求9-12中任一項的重組載體，其中表達載體是pGEX-2T。
14.生產權利要求1-8中任一項的蛋白的方法，它包括在能表達所述蛋白的條件下培養(yǎng)用權利要求9-13中任一項的重組載體轉化過的宿主細胞，并分離由此生產出的蛋白。
15.權利要求14的方法，其中宿主細胞是一種微生物細胞。
16.權利要求14的方法，其中宿主細胞是大腸桿菌細胞。
17.用權利要求9-13中任一項的重組載體轉化過的宿主細胞。
18.權利要求17的宿主細胞，其是一種轉化過的微生物細胞。
19.權利要求17的宿主細胞，其是一種轉化過的大腸桿菌細胞。
20.一種藥物組合物，它包括權利要求1-8中任一項的蛋白或類似物，或其藥學上可接受的鹽，可選擇性地含有生理上可接受的載體。
21.權利要求1到8中任一項的蛋白或類似物用于診斷或治療一種疾病。
22.權利要求1-8中任一項的蛋白或類似物在制備用于診斷或治療下列疾病的藥物中的應用腦膜炎或者由大腸桿菌KI或其它在其細胞表面表達多唾液酸的細菌引起的疾病，以在腫瘤細胞表面表達多唾液酸為特征的癌癥，或腫瘤轉移。
23.權利要求1-8中任一項的蛋白或類似物在糖蛋白分析中的應用。
24.一種治療由在其細胞表面上表達多唾液酸的細菌引起的病癥、以在腫瘤細胞表面表達多唾液酸為特征的癌癥、或腫瘤轉移的方法，該方法包括給需要這種治療的溫血動物施用權利要求1的蛋白或類似物。
全文摘要
一種具有噬菌體內切唾液酸酶活性的重組蛋白,它能通過表達從重組載體得到,所述重組載體包括一段編碼噬菌體內切唾液酸酶的DNA序列,該DNA序列與表達加至內切唾液酸酶N－末端的多肽的表達載體的一段DNA序列連接,或者所述蛋白的類似物,這種類似物是所述有內切唾液酸酶活力的蛋白的突變體、功能性的片段或衍生物。
文檔編號A61P31/04GK1191572SQ9619523
公開日1998年8月26日 申請日期1996年7月1日 優(yōu)先權日1995年7月5日
發(fā)明者P·W·泰勒, J·P·魯齊奧, J·M·布倫特 申請人:安多齊莫有限公司, 劍橋大學技術服務有限公司