專利名稱：產(chǎn)生多核苷酸分子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有改變特性的多核苷酸分子的方法。
如我們所了解的，生物分子，尤其是生物多聚體，如多核苷酸、多肽、多糖等，不但形成生物體的基礎(chǔ)，而且也日益在整個工業(yè)應(yīng)用中得到使用。新功能性生物分子的尋找、分離和制備、以及它們的工業(yè)應(yīng)用是現(xiàn)代生物技術(shù)的主題。除了偶然發(fā)現(xiàn)自然界中以前未知的、具有所需特性的生物分子外(參考篩選天然物質(zhì))，最近出現(xiàn)了在實驗室中模擬自然進化原則的方法。
除了產(chǎn)生點突變(以堿基交換、缺失和插入的方式)的方法外，對多聚體內(nèi)部的結(jié)構(gòu)域、異源多聚體的亞單位、或者基因簇內(nèi)部的基因變體或基因組內(nèi)部的基因，序列部分的重組實質(zhì)上是用于組合點突變非常成功的策略。同源重組，即來自不同變體對應(yīng)序列部分的組合且保持方向和讀碼框不變，是特別重要的。
在實驗上，重組可以多種方式實現(xiàn)第一，體外通過使用單獨的酶功能、或確定的混合物或序列的酶處理步驟；第二，體內(nèi)通過使用細(xì)胞重組和/或修復(fù)程序。
以前，在工業(yè)上體外方法主要使用基于PCR的方法。這里首先提到的是DNA改組(DNA shuffling)，也稱為secual PCR(WO 95/22625；Stemmer，Nature 370(1994)，389)。在該方法中，序列重疊的隨機基因片段得到產(chǎn)生，并且隨后通過無引物PCR重建而獲得原始長度的產(chǎn)物。因此，在每一PCR循環(huán)中，通過互相引發(fā)，不同來源的片段隨機地和同源地組合成產(chǎn)物分子是可能的。通過調(diào)節(jié)片段長度，DNA改組原則上限制重組事件的頻率是可能的。然而，該方法在實驗上是復(fù)雜的，因為首先必須建立產(chǎn)生核苷酸片段的反應(yīng)條件。Shao等(Nucl.Acids Res.26(1998)，681)已報道另外一種體外制備重組DNA的方法。該方法使用具有隨機序列的引物，該引物可使聚合反應(yīng)在多核苷酸內(nèi)部的隨機位點開始。因此，與DNA改組類似，產(chǎn)生短多核苷酸片段，這些片段可通過互相引發(fā)而重組。使用該方法幾乎不可能控制重組頻率。此外，非特異引物導(dǎo)致相對高的固有錯誤率，這可成為敏感序列部分和/或長基因的問題。作為這些方法的備選，在PCR擴增中，為促進鏈交換，使用改良PCR法進行交錯延伸的方法(WO 98/42728；Zhao等，Nat.Biotechnol.(1998)，258)。通過使用解鏈和退火階段之間非常短階段的聚合溫度，不完全產(chǎn)物可與新模板雜交，并且可進一步延伸。重組頻率可通過預(yù)設(shè)聚合時間和循環(huán)數(shù)而得到調(diào)節(jié)。這里技術(shù)上的限制是需要精確設(shè)定在特定溫度下的非常短的階段。作為這些基于PCR方法的備選，描述了這樣一種方法，該方法可從具有突變的多核苷酸的群體中產(chǎn)生異源雙鏈體，這些異源雙鏈體然后通過將它們導(dǎo)入細(xì)胞后經(jīng)過體內(nèi)隨機修復(fù)，或?qū)⑺鼈兣c細(xì)胞提取物孵育后的體外隨機修復(fù)，依賴起始群體中變體的相對頻率，而導(dǎo)致產(chǎn)生一定比例的重組分子變體(WO 99/29902)。該方法以使用細(xì)胞修復(fù)系統(tǒng)為特征，該系統(tǒng)可特異識別未配對堿基和隨機修復(fù)雙鏈中的任何一條鏈。一方面該方法受限于將多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞的有限效率和修復(fù)過程中缺少的可控性。此外，一個決定性的缺點是在每個修復(fù)步驟，僅有兩個起始分子可互相重組的事實。
本發(fā)明的一個目的是提供制備具有改變特性的多核苷酸的方法，該方法可避免已公知方法的上述缺點，并可允許多核苷酸分子基因型之間的有效重組，從而產(chǎn)生改變的表型。
我們已發(fā)現(xiàn)，該目的可通過提供權(quán)利要求中所述的實施方案而實現(xiàn)。
因此，本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有改變特性的多核苷酸分子的方法，該方法包括進行包括下述步驟的至少一個循環(huán)(a)提供一種雙鏈多核苷酸分子或提供雙鏈多核苷酸分子的群體，其中所述群體中單獨的多核苷酸具有至少一個同源序列部分和至少一個異源序列部分，(b)在所述雙鏈多核苷酸分子中產(chǎn)生單鏈缺口，
(c)從所述單鏈缺口開始進行5’-3’核酸酶降解，同時在所述單鏈缺口的3’端進行5’-3’從頭合成和移動，(d)制備單鏈多核苷酸分子，(e)制備步驟(d)提供的單鏈多核苷酸分子的部分雙鏈多核苷酸分子，(f)從步驟(e)制備的部分雙鏈多核苷酸分子起始進行模板指導(dǎo)的核酸合成，可依次或同時實施步驟(b)和(c)。
因此，本發(fā)明的方法可通過結(jié)合其優(yōu)點而得以區(qū)別，這在以前所述的任一方法都不能實現(xiàn)。上述方法另外的優(yōu)點是其低實驗復(fù)雜性和僅需少量的時間以及也有自動化的可能。
本發(fā)明的方法可通過這樣的事實加以區(qū)別，該事實是同時存在核酸酶降解和核酸合成，即“切口平移”，以避免核酸的過度片段化和可重組核酸的降解。原則上，使用的全部DNA量可用于隨后所述核酸的體外重組。
與以前所述的體外核酸重組的方法相比，這使得增加重組效率成為可能。
優(yōu)選的實施方案包括進行一個以上包括上述步驟(a)-(d)的循環(huán)，即至少2個、優(yōu)選的至少5個、特別優(yōu)選的至少10個、以及非常特別優(yōu)選的至少20個循環(huán)。
因此，本發(fā)明方法的循環(huán)應(yīng)用使得從相關(guān)多核苷酸序列的起始分布制備具有新近組合數(shù)次的序列區(qū)域的多核苷酸成為可能。所述循環(huán)應(yīng)用尤其允許多種不同的異源序列部分互相組合。此外，通過循環(huán)數(shù)可精確控制每一多核苷酸鏈的重組頻率。循環(huán)應(yīng)用也使得以這種方式控制從一個循環(huán)至下一個循環(huán)的重組事件之間的平均間隔時間成為可能。
在進一步優(yōu)選的實施方案中，選擇步驟在本發(fā)明方法的一個、幾個或所有循環(huán)之后進行。所述選擇步驟可能與基因型、或表型、或與多核苷酸的基因型和表型都有關(guān)。
在本文中，多核苷酸的基因型是所述多核苷酸不同單體的序列。表型是多核苷酸分子和多核苷酸編碼的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物的功能和特性的總和。
例如，選擇步驟可以通過與擴增偶聯(lián)(自然)的選擇而實現(xiàn)，通過物理分離而選擇，或通過篩選而選擇(Koltermann和Kettling，Biophys.Chem.66(1999)，159；Kettling等，Current Topics in Microbiol.and Immunol.243(1999)，173；Koltermann，Dissertation，TU Berlin(1998)，Zhao等，Manual of Ind.Microbiol.and Biotechnol.49章，597-604頁，ASM Press，Washington，DC，1999；Reetz，Angew.Chem.113(2001)113，292-320)。本發(fā)明方法的步驟(a)提供一種雙鏈多核苷酸分子或雙鏈多核苷酸的群體。
根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(a)提供的雙鏈多核苷酸分子的群體，可以是包含至少兩種型別的含有至少一種同源序列部分和至少一種異源序列部分的多核苷酸分子的任一雙鏈多核苷酸分子群體。在本文中，術(shù)語“單鏈多核苷酸分子群體”指一定量這樣的多核苷酸分子，這些分子以特異性堿基配對形式發(fā)生的分子間相互作用被阻止或不存在。這里的術(shù)語“多核苷酸”(核酸、寡核苷酸)包含DNA和RNA，多核苷酸是線性的、定向(5’-3’)的單鏈或雙鏈形式的異源多聚體。在雙鏈中，通過特異性堿基配對的相互作用，兩條單鏈彼此結(jié)合。原則上，多核苷酸可以是具有經(jīng)修飾單體的DNA或RNA。一般而言，本方法也可用于同樣構(gòu)建的人工多聚體以及用于DNA-RNA雜交雙鏈。
術(shù)語“同源部分”指兩個或更多多核苷酸分子中相同或互補的部分，即在對應(yīng)位點包含相同的信息。術(shù)語“異源部分”指兩個或更多多核苷酸分子中不相同或不互補的部分，即在對應(yīng)位點包含不同的信息。這里多核苷酸分子的信息(基因型)指多核苷酸分子中不同單體的序列。異源序列區(qū)域的長度至少有一個核苷酸，但實際上可更長。異源序列區(qū)域尤其可以是兩個核苷酸、或三個核苷酸，例如密碼子，以及在長度上優(yōu)選的是5個以上的核苷酸，特別優(yōu)選的是10個以上的核苷酸。原則上，異源區(qū)域的長度沒有上限。然而，優(yōu)選的是，異源區(qū)域應(yīng)不長于10000核苷酸，特別優(yōu)選的不長于5000核苷酸，尤其不長于2000，非常特別優(yōu)選的不長于1000核苷酸。這種相對較長的序列部分可以是，例如，編碼抗體序列的高變區(qū)、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域、基因簇的基因或基因組的區(qū)域。異源區(qū)域優(yōu)選的是其中多核苷酸分子在每個堿基處互不相同的序列區(qū)域。然而，異源區(qū)域也可以是在多核苷酸分子中已出現(xiàn)或已發(fā)生的缺失、重復(fù)、插入、翻轉(zhuǎn)或添加。
根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(a)提供的雙鏈多核苷酸分子，根據(jù)本發(fā)明，具有至少一個同源和至少一個異源序列區(qū)域。然而，優(yōu)選的是，它們具有多個同源和異源部分。原則上，同源區(qū)和異源部分的數(shù)量沒有上限。
上述雙鏈多核苷酸分子中的異源部分在每一種情況下被同源部分間斷。在本文中，同源部分的長度優(yōu)選的至少5個，優(yōu)選的至少10個，以及特別優(yōu)選的至少20個核苷酸。然而，如異源部分類似，同源部分實際上可以更長，并且它們的長度原則上沒有上限。優(yōu)選的是，它們不長于50000核苷酸，優(yōu)選的不長于20000核苷酸，特別優(yōu)選的不長于10000核苷酸，以及非常特別優(yōu)選的不長于1000核苷酸。
通過熟練工作人員所公知的方法，雙鏈多核苷酸分子可根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(a)提供。這些包括，例如物理、化學(xué)、生物化學(xué)和生物方法。這些包括合成和制備方法，如，例如寡核苷酸的化學(xué)合成、通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)合成核酸、制備質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、BACs(細(xì)菌人工染色體)、YACs(酵母人工染色體)或染色體DNA。
在本發(fā)明方法特別優(yōu)選的實施方案中，具有同源和異源部分的雙鏈多核苷酸的群體通過使用來自于準(zhǔn)種突變體的相關(guān)多核苷酸序列而提供。這里的術(shù)語“相關(guān)”涉及存在同源和異源區(qū)的多核苷酸。準(zhǔn)種指互相關(guān)聯(lián)的分子變體(突變體)的動態(tài)群體，通過易錯復(fù)制可產(chǎn)生分子變體?？娠@示的是，根據(jù)準(zhǔn)種原則，選擇的對象不是野生型(準(zhǔn)種的質(zhì)心)，而是整個分布。隨著改變的選擇條件，根據(jù)它們的適合度值，這種突變體分布已經(jīng)包含有益變體，因此不需首先通過隨后的隨機突變而產(chǎn)生。在選擇參數(shù)接連改變的情況下，進化的產(chǎn)生類似于所述準(zhǔn)種沿著特定的值悄悄地定向漂移。WO 92/18645描述了準(zhǔn)種的制備和進化生物技術(shù)原則的應(yīng)用。
如果基于分子變體的易錯復(fù)制，可產(chǎn)生準(zhǔn)種。當(dāng)使用多核苷酸時，復(fù)制可優(yōu)選在復(fù)制酶的幫助下進行，所述復(fù)制酶即模板控制的多核苷酸分子合成的聚合酶。錯誤的引入，即分子信息的變化，可僅通過固有易錯拷貝過程、或通過特異增加聚合酶錯誤的其它過程(例如特異性不平衡地添加單體、添加堿基類似物、易錯PCR、具有極高錯誤率的聚合酶)、通過多核苷酸合成后的化學(xué)修飾、通過至少部分使用單體混合物和/或核苷酸類似物進行多核苷酸的完全合成、以及通過上述方法的組合而實現(xiàn)。優(yōu)選使用準(zhǔn)種突變體的分布，其中上述準(zhǔn)種的每個突變體的目標(biāo)分子功能的表型特性與野生型相比已經(jīng)得到提高。術(shù)語“多核苷酸分子的表型”指多核苷酸分子和多核苷酸編碼的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物的功能和特性的總和。
此外，可使用不同來源的序列，尤其是來源于不同物種的基因家族的多核苷酸序列、在體內(nèi)以特別高的錯誤率復(fù)制的多核苷酸序列(例如通過病毒、通過具有突變基因的細(xì)菌、通過紫外線照射下的細(xì)菌)、或在體外以特別高的錯誤率復(fù)制的多核苷酸序列(例如通過Qβ復(fù)制酶反應(yīng)、易錯PCR的方法)、合成后已通過化學(xué)試劑引入突變或以它們具有同源和異源區(qū)的方式化學(xué)合成的多核苷酸序列、或通過上述方法的組合產(chǎn)生的多核苷酸序列。原則上，本發(fā)明方法所使用的多核苷酸可以是任一多核苷酸，尤其是DNA或RNA分子。
本發(fā)明方法的步驟(b)所需要的單鏈缺口原則上可通過任一方法產(chǎn)生，這些方法可導(dǎo)致雙鏈多核苷酸分子的多核苷酸鏈中2個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。上述方法可以是物理的或化學(xué)的方法(例如超聲處理、部分的酯水解作用)。
酶方法尤其適用于步驟(b)。
適用于這種情況的酶的實例是核酸酶。
在本發(fā)明方法優(yōu)選的實施方案中，單鏈缺口通過序列特異的切口酶引入。
上述切口酶的實例是來自于蝕幾丁芽孢桿菌(Bacillus chitinosporus)的V.BchI、來自于嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)的N.BstNBI、來自于嗜熱脂肪芽孢桿菌的N.BstSEI、來自于綠藻(Chlorella)NC64A株的N.CviPII、來自于綠藻NC64A株的N.CviQXI、來自于大腸桿菌(E.Eoli)的V.EcoDem、來自于副流感嗜血桿菌(Haemophilusparainfluenzae)的V.HpaII、來自于氣生菌落諾卡氏菌(Nocardiaaerocolonigenes)的V.Neal和來自于水稻黃單胞菌(Xanthomonas oryzae)的V.XorII。
在進一步優(yōu)選的實施方案中，可通過非序列特異的切口酶在上述雙鏈多核苷酸分子中引入單鏈缺口。在本文中，可使用，例如以Mg2+作為輔因子的小牛胰腺DNase I(Kunitz，J.Genetic Physiology 33(1950)，349；Kunitz，J.Genetic Physiology 33(1950)，363、以及Melgac和Goldthwaite，J.Biolog.Chem.243(1968)，4409)。
依據(jù)使用的酶選擇步驟(c)中的反應(yīng)條件。
在優(yōu)選的實施方案中，步驟(c)在可導(dǎo)致增加從頭合成錯誤率的條件下進行。
可依據(jù)欲產(chǎn)生的目標(biāo)變體選擇上述從頭合成的錯誤率。典型的錯誤率是0.1×10-3-10×10-3，即0.01-1％的錯誤(在10000堿基的DNA部分中，改變了1-10個堿基)。
進行步驟(c)是特別有益的，該步驟具有錯誤率1×10-3-5×10-3，即0.1-0.5％的錯誤，即在1000堿基的DNA部分中，改變了1-5個堿基。
DNA聚合酶I的錯誤率是9×10-6(Kunkel等.(1984)J.Biol.Chem.2591539-1545)。因此，當(dāng)使用DNA聚合酶I時，錯誤率的增加就是錯誤率超過9×10-6。
原則上，從頭合成的錯誤率可以增加，例如通過使用突變的DNA聚合酶或通過選擇步驟(c)中適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件。
在優(yōu)選的實施方案中，從頭合成的錯誤率可通過使用具有降低或無校正活性的聚合酶而得到增加。
在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案中，從頭合成的錯誤率可通過將不同濃度的核苷酸作為起始物質(zhì)而得到增加。在本文中，每種或幾種核苷酸的濃度相對于其它核苷酸可得到改變。與其它核苷酸相比，優(yōu)選的是亞化學(xué)計量的一種核苷酸，尤其是dATP。適當(dāng)濃度的實例是dGTP、dCTP和dTTP都是200μM，ATP是20-50μM。
與其它核苷酸相比，優(yōu)選的是亞化學(xué)計量的兩種核苷酸，尤其是dATP和dGTP。適當(dāng)濃度的實例是dCTP和dTTP都是200μM，dATP和dGTP都是40μM。
在本發(fā)明方法進一步的實施方案中，從頭合成的錯誤率可通過添加核苷酸類似物而得到增加。提到的核苷酸類似物是三磷酸脫氧肌苷、7-脫氮脫氧鳥苷三磷酸和脫氧核糖核苷α-硫代三磷酸。特別優(yōu)選的是使用三磷酸脫氧肌苷。
在本發(fā)明方法進一步的實施方案中，從頭合成的錯誤率可通過改變鹽濃度而得到增加。適用于這種情況的實例是將Mg2+離子濃度增加至1.5mM以上。也適用的是添加Mn2+離子，例如濃度為0.1-1mM，尤其是0.2-0.5mM。
在本發(fā)明方法進一步的實施方案中，從頭合成的錯誤率可通過添加添加劑而得到增加。適合的添加劑是任何可增加錯誤率的物質(zhì)，提到的實例是二甲基亞砜、聚乙二醇和甘油。特別優(yōu)選的是按下述濃度添加上述添加劑DMSO 2-10％、PEG 5-15％、甘油＞0-30％，優(yōu)選的是5-20％。
在進一步的實施方案中，從頭合成的錯誤率可通過改變反應(yīng)溫度而得到增加，尤其是升高溫度。
為增加錯誤率而提到的所有方法也可以互相組合實施，例如Mn2+離子濃度增加時核苷酸過量。
在優(yōu)選的實施方案中，步驟(b)和(c)同時得到進行。
根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(d)，單鏈多核苷酸分子的制備可通過使用熟練工作人員所公知的方法而得到實現(xiàn)。這些方法包括，例如物理的、化學(xué)的、生物化學(xué)的和生物的方法。這里列出的實例是通過將溫度加熱至退火溫度以上而解開多核苷酸的雙鏈(Newton，PCR，Spektrum AkademischerVerlag(1994)；Lazurkin，Biopolymers 9(1970)，1253-1306)、通過添加變性劑(例如尿素或去污劑)而將多核苷酸的雙鏈變性、添加可將雙鏈多核苷酸轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂湺嗪塑账岬拿福缤ㄟ^核酸酶外切降解將雙鏈DNA轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂淒NA。
步驟(d)提供的單鏈多核苷酸分子的部分雙鏈多核苷酸分子的制備，根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(e)，可使用熟練工作人員所公知的方法而得到實現(xiàn)，并且可通過互補單鏈多核苷酸分子同源部分的雜交而優(yōu)選地得到實現(xiàn)。
產(chǎn)生雙鏈多核苷酸的雜交使用熟練工作人員所公知的方法進行，尤其是，例如可通過結(jié)合單鏈和設(shè)定反應(yīng)條件而實現(xiàn)，這可通過，如，例如降低溫度和/或鹽濃度而促進互補多核苷酸的退火。
從步驟(e)制備的部分雙鏈多核苷酸分子開始，模板指導(dǎo)的核酸合成在本發(fā)明方法的步驟(f)中實現(xiàn)。
這里的術(shù)語“模板指導(dǎo)的核酸合成”指在對應(yīng)模板鏈信息的基礎(chǔ)上，通過現(xiàn)存單鏈的延伸而合成多核苷酸。
熟練的工作人員熟于進行這種模板指導(dǎo)的聚合反應(yīng)，例如Sambrook(Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))中所描述的。
具有模板控制的多核苷酸聚合活性和可合成多核苷酸鏈的任一酶可以用于聚合酶反應(yīng)。大量來自多種生物體、并具有不同功能的聚合酶已經(jīng)得到分離和描述。在DNA依賴的DNA聚合酶、RNA依賴的DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)、DNA依賴的RNA聚合酶和RNA依賴的RNA聚合酶(復(fù)制酶)之間，關(guān)于模板和合成的多核苷酸類型存在差別。關(guān)于溫度穩(wěn)定性，在非熱穩(wěn)定(37℃)和熱穩(wěn)定(75-95℃)的聚合酶之間存在差別。此外，聚合酶就存在的5’-3’和3’-5’核酸外切酶活性而言也是不同的。最重要的聚合酶是DNA依賴的DNA聚合酶。
尤其是，可使用具有最適溫度大約為37℃的DNA聚合酶。這些聚合酶包括，例如大腸桿菌DNA聚合酶I、噬菌體T7的T7 DNA聚合酶和噬菌體T4的T4 DNA聚合酶，每一種在商業(yè)上均有大量的制造商例如USB、RocheMolecular Biochemicals、Stratagene、NEB或Quantum Biotechnologies出售。大腸桿菌DNA聚合酶I(全酶)具有5’-3’聚合酶活性、3’-5’校正的核酸外切酶活性以及5’-3’核酸外切酶活性。通過切口平移方法(Rigby等(J.Mol.Biol.113(1977))，237-251)，該酶用于體外DNA標(biāo)記。與全酶相反，大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段，如T7 DNA聚合酶和T4 DNA聚合酶一樣，沒有5’核酸外切酶活性。因此，這些酶用于“填平反應(yīng)”或合成長鏈(Young等(Biochemistry 31(1992)，8675-8690)，Lehman(Methods Enzymol.29(1974)，46-53))。最后，大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段的3’-5’-exo(-)變體也缺乏3’核酸外切酶活性。該酶常用于根據(jù)Sanger(Sanger(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74(1977)，5463-5467))的DNA測序。除這些酶外，存在大量更多具有不同特性的37℃ DNA聚合酶，這些酶可在本發(fā)明方法中使用。
最常見和熱穩(wěn)定的DNA聚合酶是來自于水生棲熱菌(Thermusaquaticus)的Taq DNA聚合酶，該酶最適溫度為75℃，在95℃十分穩(wěn)定，該酶在商業(yè)上可得到。Taq DNA聚合酶是高度持續(xù)性的5’-3’DNA聚合酶，該酶沒有3’-5’核酸外切酶活性。它常用于標(biāo)準(zhǔn)PCR、測序反應(yīng)和誘變PCR(Cadwell und Joyce(PCR Methods Appl.3(1994)，136-140，Agrogoni和Kaminski(Methods Mol.Biol.23(1993)，109-114))。來自于嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)HB8的Tth DNA聚合酶和來自于黃色棲熱菌(Thermus flavas)的Tfl DNA聚合酶具有類似的特性。然而，在鎂離子存在下(Cusi等(Biotechniques 17(1994)，1034-1036))，Tth DNA聚合酶又具有內(nèi)在的逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性。此外，許多具有3’、但沒有5’核酸外切酶活性的熱穩(wěn)定DNA聚合酶商業(yè)上有售伍斯氏火球菌(Pyrococcus woesei)的Pwo DNA聚合酶、Thermococcus litoralix的Tli、Vent和DeepVent DNA聚合酶、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的Pfx和Pfu DNA聚合酶、普遍棲熱菌(Thermus ubiquitous)的Tub DNA聚合酶、海棲熱袍菌(Thermotoga maritime)的Tma和UlTma DNA聚合酶(Newton和Graham，PCR，Spektrum Akad.Verlag Heidelberg(1994)，1))。使用缺乏3’校正核酸外切酶活性的聚合酶是為了擴增錯誤盡可能少的PCR產(chǎn)物。最后，5’-3’和3’-5’核酸外切酶活性都缺乏的DNA聚合酶，以Taq DNA聚合酶、Vent-(exo-)DNA聚合酶和Tsp DNA聚合酶的Stoffel片段的形式可以得到。在RNA依賴的DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)中，最常見的酶包括鳥類成髓細(xì)胞白血病病毒的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、莫洛尼鼠白血病病毒的M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶和人免疫缺陷病毒的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶，許多廠商也出售這些酶，例如NEB、LifeTechnologies、Quantum Biotechnologies。如HIV逆轉(zhuǎn)錄酶一樣，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶具有相關(guān)的RNase H活性，這一活性在M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶中顯著降低。M-MuLV和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶都缺乏3’-5’核酸外切酶活性。
在DNA依賴的RNA聚合酶中，最常見的酶包括大腸桿菌RNA聚合酶、來自于噬菌體SP6感染的鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella thyphimurium)LT2的SP6 RNA聚合酶、來自于噬菌體T3的T3 RNA聚合酶和來自于噬菌體T7的T7 RNA聚合酶。
在本發(fā)明方法優(yōu)選的實施方案中，本方法步驟(f)中的模板鏈?zhǔn)荄NA分子，并且DNA依賴的DNA聚合酶用于模板指導(dǎo)的單鏈合成。
在特別優(yōu)選的實施方案中，這里使用的是非熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，特別優(yōu)選的是具有5’-3’和3’-5’核酸外切酶活性的酶，例如大腸桿菌聚合酶I。
作為備選，也可使用具有3’-5’核酸外切酶活性、但沒有5’-3’核酸外切酶活性的非熱穩(wěn)定DNA聚合酶，例如大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段、噬菌體T7的T7 DNA聚合酶或噬菌體T4的T4 DNA聚合酶。
此外，也可使用既沒有3’-5’核酸外切酶活性、也沒有5’-3’核酸外切酶活性的非熱穩(wěn)定DNA聚合酶，例如大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段的3’-5’-exo(-)變體。
另外，特別優(yōu)選的實施方案使用熱穩(wěn)定聚合酶(例如Taq聚合酶、Pwo聚合酶)，這些酶同時具有5’-3’和3’-5’核酸外切酶活性，或具有5’核酸外切酶活性、但沒有3’核酸外切酶活性，例如水生棲熱菌的Taq DNA聚合酶、嗜熱棲熱菌HB8的Tth DNA聚合酶或黃色棲熱菌的Tfl DNA聚合酶。
作為備選，熱穩(wěn)定DNA聚合酶可具有3’-5’、但沒有5’-3’核酸外切酶活性，如，例如來自于伍斯氏火球菌的VentR DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶、來自于Thermococcus litoralis的DeepVentR DNA聚合酶或Tli DNA聚合酶、來自于激烈火球菌的Pfu DNA聚合酶或Pfx DNA聚合酶、或來自于海棲熱袍菌的Tma DNA聚合酶或UITma DNA聚合酶。
進一步地也可使用沒有3’-5’和5’-3’核酸外切酶活性的熱穩(wěn)定聚合酶，例如來自于水生棲熱菌的Taq DNA聚合酶的Stoffel片段、來自于Thermococcus litoralis的Tsp DNA聚合酶或者VentR DNA聚合酶或DeepVentR DNA聚合酶的exo(-)變體。
如果使用熱穩(wěn)定聚合酶，聚合酶反應(yīng)優(yōu)選緊接步驟(e)后，不需進行中間的純化或進一步的樣品處理。
在本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選實施方案中，以本發(fā)明方法的步驟(f)進行模板指導(dǎo)的單鏈合成中的模板鏈?zhǔn)荝NA分子。在這種情況下，模板指導(dǎo)的單鏈合成使用RNA依賴的DNA聚合酶，優(yōu)選來自于鳥類成髓細(xì)胞白血病病毒的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、來自于人免疫缺陷病毒的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶、或來自于莫洛尼鼠白血病病毒的M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶。進一步優(yōu)選使用熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶，非常特別的是來自于嗜熱棲熱菌的Tth DNA聚合酶，該酶具有內(nèi)在的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。
實施例1除非在其它地方有所說明，實驗根據(jù)Current Protocols in MolecularBiology進行。
I.提供起始物質(zhì)4種脂肪酶變體作為起始物質(zhì)pBP2035編碼的LipA H86W、pBP2008編碼的LipA S87T、pBP2006編碼的LipA F142W、pBP2007編碼的LipAL167A。
1.下述質(zhì)粒的質(zhì)粒制備物
2.用限制性內(nèi)切酶HindIII和SacI切割質(zhì)粒。
3.使用GFX試劑盒(Pharmacia)，通過凝膠提取分離插入片段。
4.在水中重懸DNA片段。
5.將DNA濃度調(diào)整至～250ng/μl。
II.單鏈缺口的產(chǎn)生和從頭合成1.使用切口平移試劑盒(Roche，目錄號976776)，用于插入片段56-20、98-10、124-9和198-1-3進行切口平移的4個獨立反應(yīng)混合物。
1)酶混合物50％(v/v)甘油中的DNA聚合酶和DNAseI。
2.將混合物在15℃孵育90分鐘。
3.通過加入5μl 0.5M EDTA，pH8.8而終止反應(yīng)。
4.沉淀、洗滌、干燥，并將混合物重懸于20μl水中。
III.無引物PCR使用富含GC的PCR系統(tǒng)(Roche，目錄號2140306)對反應(yīng)混合物進行PCR。
2)穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶和Tgo DNA聚合酶。
PCR條件
IV.有引物PCR使用富含GC的PCR系統(tǒng)(Roche，目錄號2140306)對反應(yīng)混合物進行PCR
*引物MAT16＝5’-GATCGACGTAAGCTTTAACGATGGAGAT-3’*引物MAT19＝5’-CATCGGGCGAGCTCCCAGCCCGCCGCG-3’PCR條件
V.片段的克隆和分析1.20μl步驟4中的PCR產(chǎn)物用HindIII和SacI切割。
2.沉淀、洗滌、干燥和用20μl水重懸混合物。
3.使用GFX試劑盒(Pharmacia)純化切割片段。
4.將片段與預(yù)先用HindIII和SacI切割的載體pBSIIKS(Stratagene)連接。
5.將連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue。
6.具有插入片段的29個克隆的序列分析。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生具有改變特性的多核苷酸分子的方法，其包括進行至少一個包括下述步驟的循環(huán)(a)提供一種雙鏈多核苷酸分子或提供雙鏈多核苷酸分子的群體，其中所述群體中單獨的多核苷酸具有至少一個同源序列部分和至少一個異源序列部分，(b)在所述雙鏈多核苷酸分子中產(chǎn)生單鏈缺口，(c)從所述單鏈缺口開始進行5’-3’核酸酶降解，同時在所述單鏈缺口的3’端進行5’-3’從頭合成和移動，(d)制備單鏈多核苷酸分子，(e)制備步驟(d)提供的單鏈多核苷酸分子的部分雙鏈多核苷酸分子，(f)從步驟(e)制備的部分雙鏈多核苷酸分子起始進行模板指導(dǎo)的核酸合成，可依次或同時實施步驟(b)和(c)。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中進行一個以上包括步驟(a)-(f)的循環(huán)。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中選擇步驟在一個、幾個或所有循環(huán)之后進行，所述選擇步驟與多核苷酸的基因型、或與其表型、或與其基因型和表型都有關(guān)。
4.權(quán)利要求1-3中任意一項所述的方法，其中序列特異的切口酶在步驟(b)中引入所述單鏈缺口。
5.權(quán)利要求1-3中任意一項所述的方法，其中非序列特異的切口酶在步驟(b)中引入所述單鏈缺口。
6.權(quán)利要求1-5中任意一項所述的方法，其中DNA聚合酶I在步驟(c)中使用。
7.權(quán)利要求1-6中任意一項所述的方法，其中通過選擇適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件，所述從頭合成的錯誤率在步驟(c)中是增加的。
8.權(quán)利要求1-6中任意一項所述的方法，其中通過過量的一種或多種核苷三磷酸，所述從頭合成的錯誤率是增加的。
9.權(quán)利要求1-6中任意一項所述的方法，其中通過使用一種或多種核苷酸類似物，所述從頭合成的錯誤率是增加的。
10.權(quán)利要求1-6中任意一項所述的方法，其中通過改變鹽濃度，所述從頭合成的錯誤率是增加的。
11.權(quán)利要求1-6中任意一項所述的方法，其中通過具有降低或無校正活性的聚合酶，所述從頭合成的錯誤率是增加的。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有改變特性的多核苷酸分子的方法，該方法包括進行包括下述步驟的至少一個循環(huán)(a)提供一種雙鏈多核苷酸分子或提供雙鏈多核苷酸分子的群體，其中所述群體中單獨的多核苷酸具有至少一個同源序列部分和至少一個異源序列部分，(b)在所述雙鏈多核苷酸分子中產(chǎn)生單鏈缺口，(c)從所述單鏈缺口開始進行5’－3’核酸酶降解，同時在所述單鏈缺口的3’端進行5’－3’從頭合成和移動，(d)制備單鏈多核苷酸分子，(e)制備步驟(d)提供的單鏈多核苷酸分子的部分雙鏈多核苷酸分子，(f)從步驟(e)制備的部分雙鏈多核苷酸分子起始進行模板指導(dǎo)的核酸合成，可依次或同時實施步驟(b)和(c)。
文檔編號C12N15/10GK1656221SQ03811927
公開日2005年8月17日 申請日期2003年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月24日
發(fā)明者M·馬圖舍克, B·豪爾 申請人:巴斯福股份公司