專利名稱：新型羰基還原酶及其編碼基因、以及利用它們制備光學(xué)活性醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有還原含羰基化合物，使其轉(zhuǎn)變成光學(xué)活性醇類的活性的肽，該光學(xué)活性醇類是作為醫(yī)藥、農(nóng)藥等中間原料在產(chǎn)業(yè)上有用的化合物。本發(fā)明還涉及編碼上述肽的DNA、將該DNA整合到載體而得到的重組DNA、包含該重組DNA的轉(zhuǎn)化體。另外，本發(fā)明還涉及利用上述轉(zhuǎn)化體、該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物或該轉(zhuǎn)化體的處理物制備光學(xué)活性醇的方法。
背景技術(shù)：
作為(E)-7-[2-環(huán)丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羥基庚-6-烯酸酯類的化學(xué)制備方法，已知有例如專利文獻(xiàn)1中如下所示的制備流程 另外，專利文獻(xiàn)2中也報(bào)道了用光學(xué)活性Schiff堿的制備方法。
專利文獻(xiàn)3中報(bào)道了用(R)-3-叔-丁基二甲基甲硅烷氧基-6-二甲氧基氧膦基-5-氧代己酸甲酯在極低溫度下制備的方法。
另一方面，作為更廉價(jià)且副產(chǎn)物少的制備方法，考慮將用微生物細(xì)胞和/或該細(xì)胞處理物從含羰基化合物進(jìn)行立體選擇性還原，生成光學(xué)活性醇的方法用于制備上述化合物的方法，作為應(yīng)用羰基的側(cè)鏈有喹啉骨架的化合物的方法，非專利文獻(xiàn)1中記載了應(yīng)用微桿菌(Microbacterium campoquemadoensis)MB5614株進(jìn)行以下反應(yīng)。

另外，非專利文獻(xiàn)2中記載了用面包酵母進(jìn)行以下反應(yīng)。
但是，對(duì)于象(E)-7-[2-環(huán)丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二氧代-庚-6-烯酸酯這樣，羰基的α位存在烯烴且羰基連續(xù)存在的化合物，還不知道用微生物進(jìn)行立體選擇性還原的例子。
<非專利文獻(xiàn)1>
Appl microbiol Biotechnol(1998)49p.709-717<非專利文獻(xiàn)2>
Bioorg Med Chem Lett，vol8，p1403-(1998)<專利文獻(xiàn)1>
特開平1-279866號(hào)公報(bào)<專利文獻(xiàn)2>
特開平8-92217號(hào)公報(bào)<專利文獻(xiàn)3>
特開平8-127585號(hào)公報(bào)發(fā)明內(nèi)容因此，希望開發(fā)出工業(yè)上能廉價(jià)制備(3R，5S)-(E)-7-[2-環(huán)丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羥基庚-6-烯酸酯類的新型制備方法。
為了解決上述課題，本發(fā)明者們對(duì)(3R，5S)-(E)-7-[2-環(huán)丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羥基庚-6-烯酸酯類的制備方法進(jìn)行了大量研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離催化作為原料的含羰基化合物的還原反應(yīng)的新型酶，用重組菌表達(dá)該酶，使之作用于作為原料的含羰基化合物，可獲得高光學(xué)純度且高濃度的目的物，由此完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明的要點(diǎn)是(1)包含下述(A)或(B)中任意一項(xiàng)的氨基酸序列的多肽(A)序列號(hào)1中記載的氨基酸序列；
(B)具有羰基還原酶活性的多肽的氨基酸序列，該氨基酸序列是在序列號(hào)1的氨基酸序列中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、添加或取代的氨基酸序列。
(2)包含下列(a)～(e)任意一項(xiàng)的堿基序列的DNA(a)編碼由序列號(hào)1中記載的氨基酸序列構(gòu)成的多肽的堿基序列；(b)編碼由下述氨基酸序列構(gòu)成、且具有羰基還原酶活性的多肽的堿基序列，所述氨基酸序列是在序列號(hào)1的氨基酸序列中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、添加或取代的氨基酸序列；(c)序列號(hào)2中記載的堿基序列；(d)編碼具有羰基還原酶活性的多肽的堿基序列，該堿基序列是在序列號(hào)2記載的堿基序列中有一個(gè)或多個(gè)堿基發(fā)生缺失、添加或取代的堿基序列；(e)編碼具有羰基還原酶活性的多肽的堿基序列，該堿基序列是在嚴(yán)緊條件下與序列號(hào)2中記載的堿基序列或其互補(bǔ)序列或它們的一部分雜交的堿基序列。
(3)一種重組DNA，其通過將(2)所述的DNA重組到載體中而得到。
(4)一種轉(zhuǎn)化體，其包含(3)所述的重組DNA。
(5)一種轉(zhuǎn)化體，其通過將(2)所述的DNA重組到染色體DNA中而得到。
(6)光學(xué)活性醇的制備方法，其特征在于，用權(quán)利要求4或權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞、該轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的培養(yǎng)物或該轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的處理物不對(duì)稱還原含羰基化合物。
(7)(6)所述的制備方法，其特征在于，含羰基化合物為下式(II’)和下式(III’)所示的光學(xué)活性體 (式中R表示氫原子、烷基或芳基)；
(式中R與上述意思相同)。
發(fā)明的最佳實(shí)施方式以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
本發(fā)明的多肽是具有序列號(hào)1中氨基酸序列的多肽或其同源物，且具有羰基還原酶活性。
本說明書中，羰基還原酶活性是指對(duì)含羰基化合物中的羰基進(jìn)行不對(duì)稱還原形成光學(xué)活性醇類的活性。該活性的測(cè)定可以如下進(jìn)行以含羰基化合物為底物，在含有底物、還含有NADPH作為輔酶的反應(yīng)體系中，以目的多肽、轉(zhuǎn)化細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)物或轉(zhuǎn)化細(xì)胞處理物作為酶進(jìn)行作用，測(cè)定NADPH減少初速度。
由于本發(fā)明闡明了其氨基酸序列和編碼該氨基酸序列的堿基序列，因此本發(fā)明的多肽可以如下獲得用以后述以編碼本發(fā)明多肽的部分或全部氨基酸序列的堿基序列為基礎(chǔ)制作的探針，從具有羰基還原活性的任意微生物分離出編碼還原酶的DNA后，以此為基礎(chǔ)，利用常規(guī)的基因工程學(xué)方法獲得本發(fā)明的多肽。另外，為了完成本發(fā)明，也可以從具有羰基還原活性的微生物，即具有編碼羰基還原酶的DNA的微生物中進(jìn)行純化，例如從Ogataea屬酵母的培養(yǎng)物中純化。
作為Ogataea屬酵母，例如Ogataea minuta具有特別好的產(chǎn)生本發(fā)明羰基還原酶的能力，該酵母是以IFO 1473株從財(cái)團(tuán)法人發(fā)酵研究所購(gòu)入的。
作為從微生物的培養(yǎng)物獲得本發(fā)明多肽的方法，可應(yīng)用常規(guī)的酵母純化方法，例如可應(yīng)用以下方法用YM培養(yǎng)基等用于真菌培養(yǎng)的普通培養(yǎng)基培養(yǎng)上述微生物，使之充分增殖后回收，在加入了DTT(二硫蘇糖醇)等還原劑和苯甲基磺酰氟(PMSF)等蛋白酶抑制劑的緩沖液中使之破碎，獲得無細(xì)胞提取液。通過根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度進(jìn)行的級(jí)分分離(用有機(jī)溶劑沉淀和硫酸銨等鹽析等)和陽(yáng)離子交換、陰離子交換、凝膠過濾、疏水性色譜、利用鰲合劑、色素、抗體等的親和層析色譜等的適當(dāng)組合從無細(xì)胞提取液中進(jìn)行純化。例如，經(jīng)過應(yīng)用DEAE-Sepharose的陰離子交換色譜、應(yīng)用辛基-Sepharose的疏水性色譜、應(yīng)用Q-Sepharose的陰離子交換色譜、應(yīng)用Superdex200的凝膠過濾等，可純化成電泳中基本出現(xiàn)單一條帶。
如此純化出的Ogataea minuta來源的本發(fā)明多肽具有以下典型性狀(1)最適pH5.0-6.0(2)分子量用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(以下簡(jiǎn)稱SDS-PAGE)測(cè)定的分子量約27,000Da。該酶還具有以下性狀特征(3)穩(wěn)定的pH范圍 在pH5.5-6.5比較穩(wěn)定。
(4)作用適宜溫度范圍最適溫度為60-70℃。
(5)溫度穩(wěn)定性 40℃或40℃以下比較穩(wěn)定。
(6)抑制該酶受汞(I)離子、鉛(II)離子抑制。
用上述方法分離的本發(fā)明多肽不僅對(duì)含羰基化合物，而且對(duì)二羰基化合物也具有很好的不對(duì)稱還原能力。
本發(fā)明多肽的同源物是指含有在不影響羰基還原酶活性的范圍內(nèi)，在序列號(hào)1的氨基酸序列中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、添加或取代的氨基酸序列的多肽。這里，多個(gè)具體是指20個(gè)或20個(gè)以下，優(yōu)選10個(gè)或10個(gè)以下，更優(yōu)選5個(gè)或5個(gè)以下。
另外，本發(fā)明多肽的同源物是指其氨基酸序列與序列號(hào)1中的氨基酸序列有至少50％、優(yōu)選至少60％或70％，更優(yōu)選80％或80％以上同源性的多肽。
上面所講多肽同源性的檢索可以例如日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù)(DDBJ)為對(duì)象，用FASTA program或BLAST程序等進(jìn)行。用序列號(hào)1中的氨基酸序列以為DDBJ對(duì)象，用BLAST程序進(jìn)行同源性檢索的結(jié)果表明，在已知的蛋白質(zhì)中，顯示同源性最高的為粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的可能的短鏈脫氫酶(T41540)，同源性為37.4％。
另外，本發(fā)明的DNA是編碼上述多肽的DNA或是編碼其具有羰基還原酶活性的同源物的DNA。
作為編碼上述多肽的DNA，具體可以列舉序列號(hào)2中的堿基序列。
編碼本發(fā)明多肽的DNA可通過例如以下方法進(jìn)行分離。
首先，用上述方法等對(duì)本發(fā)明的多肽進(jìn)行純化后，分析其N末端的氨基酸序列，再用賴氨酸殘基肽酶(lysylendopeptidase)、V8蛋白酶等酶進(jìn)行酶切后，通過逆相液體色譜等純化肽片段，然后用蛋白質(zhì)測(cè)序儀分析氨基酸序列，確定多個(gè)氨基酸序列。
以測(cè)定的氨基酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)PCR用的引物，以生產(chǎn)羰基還原酶的微生物株的染色體DNA或cDNA文庫(kù)為模板，應(yīng)用根據(jù)氨基酸序列設(shè)計(jì)的PCR引物進(jìn)行PCR，得到本發(fā)明DNA的一部分。再以所得DNA片斷為探針，利用將生產(chǎn)羰基還原酶的微生物株的染色體DNA的限制性酶消化物導(dǎo)入噬菌體、質(zhì)粒等載體中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌而得到的文庫(kù)和cDNA文庫(kù)，通過集落雜交或蝕斑雜交等，得到本發(fā)明的DNA。另外，可分析通過PCR所得的DNA片段的堿基序列，根據(jù)所得堿基序列設(shè)計(jì)外側(cè)延長(zhǎng)已知DNA用的PCR引物，用適當(dāng)?shù)南拗泼赶a(chǎn)羰基還原酶的微生物株的染色體DNA后，以DNA為模板，通過自身環(huán)化反應(yīng)進(jìn)行逆相PCR(Genetics 120，621-623(1988))，或者通過RACE法(Rapid Amplification of cDNA End，《PCRExperiment Manual》p25-33，HBJ出版社)等獲得本發(fā)明的DNA。
除了用上述方法克隆的基因組DNA或cDNA以外，由于本發(fā)明闡明了其堿基序列，所以可以序列號(hào)2為基礎(chǔ)通過化學(xué)合成等獲得本發(fā)明的DNA。
編碼本發(fā)明多肽的DNA同源物包括編碼包含下述氨基酸序列的多肽的DNA，該氨基酸序列是在不影響羰基還原酶活性的范圍內(nèi)，在序列號(hào)1的氨基酸序列中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、添加或取代的氨基酸序列。作為編碼上述多肽的DNA同源物，具體包括在序列號(hào)2的堿基序列所編碼的多肽中，在不破壞羰基還原酶活性的范圍內(nèi)，序列號(hào)2的堿基序列中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、添加或取代的堿基序列。這里，多個(gè)具體是指60個(gè)或60個(gè)以下，優(yōu)選30個(gè)或30個(gè)以下，更優(yōu)選10個(gè)或10個(gè)以下。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用定點(diǎn)突變導(dǎo)入法(Nucleic Acid Res.10，pp.6487(1982)；Methodsin Enzymol.100，pp.448(1983)；Molecular Cloning 2ndEdt.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)PCR A Practical Approach IRL Presspp.200(1991))等將適宜的取代、缺失、插入和/或附加突變導(dǎo)入序列號(hào)2的DNA中，得到本發(fā)明的DNA同源物。
另外，本發(fā)明的DNA同源物還可用編碼本發(fā)明多肽的DNA或其一部分作探針，針對(duì)具有羰基還原活性的任意微生物來源的DNA，應(yīng)用集落雜交法、蝕斑雜交法、或Southern印跡雜交法等，在嚴(yán)緊條件下進(jìn)行雜交，獲得雜交的DNA。編碼本發(fā)明多肽的DNA的“一部分”是指，足夠作為探針長(zhǎng)度的DNA，具體是15bp或15bp以上，優(yōu)選50bp或50bp以上，更優(yōu)選100bp或100bp以上的DNA。
各種雜交可參照Molecular CloningA laboratory Mannual，2ndEd.，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY.，1989(以后略作“MolecularCloning，2ndEd”.)記載的方法進(jìn)行。
本說明書中“嚴(yán)緊條件下雜交的堿基序列”是指使用DNA作探針，在嚴(yán)緊條件下，應(yīng)用集落雜交法、蝕斑雜交法、或Southern印跡雜交法等獲得的DNA堿基序列。作為嚴(yán)緊條件包括，例如在集落雜交法和蝕斑雜交法中，用固定了集落或蝕斑來源的DNA或DNA片段的濾膜，在0.7-1.0M氯化鈉的存在下于65℃進(jìn)行雜交，然后用0.1-2×SSC溶液(1×SSC的組成是150mM氯化鈉、15mM枸櫞酸鈉)在65℃的條件下洗滌濾膜。
將如上分離出的編碼本發(fā)明多肽的DNA以可表達(dá)的方式插入到公知表達(dá)載體中，由此提供羰基還原酶表達(dá)載體。另外，通過培養(yǎng)用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體，可從該轉(zhuǎn)化體獲得羰基還原酶。作為表達(dá)載體，只要是可表達(dá)本發(fā)明DNA的載體即可，對(duì)此無特定限制，可根據(jù)所轉(zhuǎn)化的宿主微生物的種類進(jìn)行適當(dāng)選擇?；蛘撸ㄟ^將本發(fā)明的DNA以可表達(dá)的方式整合到公知宿主的染色體DNA中而獲得轉(zhuǎn)化體。
作為轉(zhuǎn)化體的制備方法，具體而言，將本發(fā)明的DNA導(dǎo)入在微生物中穩(wěn)定存在的質(zhì)粒載體或噬菌體載體中，將所構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入該微生物，或者將本發(fā)明的DNA直接導(dǎo)入宿主基因組中，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯。
當(dāng)本發(fā)明的DNA不含有在宿主微生物中可表達(dá)的啟動(dòng)子時(shí)，可將適當(dāng)?shù)膯?dòng)子插入到本發(fā)明DNA鏈的5’端上游，更優(yōu)選將終止子插入到3’端下游。作為啟動(dòng)子和終止子，只要是在作為宿主應(yīng)用的微生物中功能已知的啟動(dòng)子和終止子即可，無特殊限制。關(guān)于各種微生物中可利用的載體、啟動(dòng)子和終止子，例如在《微生物學(xué)基礎(chǔ)講座8遺傳子工學(xué)，共力出版》中有詳細(xì)論述，在Adv.Biochem.Eng.43，75-102(1990)；Yeast 8，423-488(1992)等有特別關(guān)于酵母的論述。
作為能表達(dá)本發(fā)明羰基還原酶的轉(zhuǎn)化對(duì)象的宿主微生物，無特殊限制，只要宿主自身對(duì)本反應(yīng)不帶來負(fù)面影響即可，具體而言，包括如下所示微生物。
屬于大腸桿菌屬(Escherichia)、桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、殺雷氏菌屬(Serratia)、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)等的確立了宿主載體體系的細(xì)菌。
屬于紅球菌屬(Rhodococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)等的確立了宿主載體體系的放線菌。
屬于酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)、Yarrowia屬、毛孢子菌屬(Trichosporon)、紅冬孢酵母(Rhodosporidium)、漢遜酵母屬(Hansenula)、畢赤酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)等的確立了宿主載體體系的酵母。
屬于脈胞菌屬(Neurospora)、曲霉屬(Aspergillus)、頭胞屬(Cephalosporium)、木霉屬(Trichoderma)等的確立了宿主載體體系的霉菌。
作為宿主，上述微生物中優(yōu)選大腸桿菌屬、桿菌屬、短桿菌屬、棒狀桿菌屬，特別優(yōu)選大腸桿菌屬、棒狀桿菌屬。
制備轉(zhuǎn)化體的過程、適于宿主的重組載體的構(gòu)建及宿主的培養(yǎng)方法，可按照分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、基因工程學(xué)領(lǐng)域中常用的技術(shù)手段進(jìn)行(例如，Sambrook等，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory)。
以下，對(duì)優(yōu)選的宿主微生物、各微生物中優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)、載體、啟動(dòng)子、終止子等進(jìn)行具體說明，但本發(fā)明并不限定于這些例子。
大腸桿菌屬，特別是大腸埃希氏菌(Escherichia coli)中，質(zhì)粒載體包括pBR、pUC系質(zhì)粒，lac(β-半乳糖苷酶)、trp(色氨酸操縱子)、tac、trc(lac、trp的融合)、λ噬菌體PL、PR等來源的啟動(dòng)子等。另外，終止子包括trpA來源、噬菌體來源、rrnB核糖體RNA來源的終止子等。
桿菌屬中可應(yīng)用pUB110系質(zhì)粒、pC194系質(zhì)粒等作載體，另外，還可整合到染色體中。作為啟動(dòng)子和終止子可利用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶等酶基因的啟動(dòng)子和終止子等。
假單胞菌屬中，作為載體，可以列舉用惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)、洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)等確立的一般宿主載體系統(tǒng)，或以參與甲苯化合物分解的質(zhì)粒、TOL質(zhì)粒為基礎(chǔ)的廣宿主范圍載體(包含來自RSF1010等的自主復(fù)制所需的基因)pK240(Gene，26，273-82(1983))。
短桿菌屬，特別是乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)中，可例舉pAJ43(Gene 39，281(1985))等質(zhì)粒載體作為載體。作為啟動(dòng)子和終止子，可利用大腸桿菌中所使用的各種啟動(dòng)子和終止子。棒狀桿菌屬，特別是谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)中，作為載體包括pCS11(特開昭57-183799號(hào)公報(bào))、pCB101(Mol.Gen.Genet.196，175(1984)等質(zhì)粒載體。
酵母(Saccharomyces)屬，特別是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，作為載體包括YRp系、YEp系、YCp系、YIp系質(zhì)粒。另外，可利用醇脫氫酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、酸性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇化酶等各種酶基因的啟動(dòng)子和終止子。
裂殖酵母(Schizosaccharomyces)屬中可用Mol.Cell.Biol.6，80(1986)中記載的來自粟酒裂殖酵母的質(zhì)粒載體作載體。
曲霉菌屬中，黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)等是霉菌中研究最多的，可利用質(zhì)粒和與染色體的整合，可利用細(xì)胞外蛋白酶和淀粉酶來源的啟動(dòng)子(Trends in Biotechnology 7，283-287(1989))。
除此之外，可建立與各種微生物相適應(yīng)的宿主載體體系，適當(dāng)使用。此外，除微生物以外可建立植物、動(dòng)物中的各種宿主載體體系，尤其是構(gòu)建在昆蟲蠶等的動(dòng)物中(Nature 315，592-594(1985))、菜種、玉米、馬鈴薯等植物中大量表達(dá)異種蛋白質(zhì)的體系，以及應(yīng)用大腸桿菌無細(xì)胞提取液和小麥胚芽等無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成體系的體系，適當(dāng)應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及制備光學(xué)活性醇的方法，該方法以下列通式(I)、(II)及(III)所示的化合物為反應(yīng)底物，將用上述方法獲得的本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細(xì)胞、該轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)物、該轉(zhuǎn)化細(xì)胞的處理物作用于上述化合物，使該化合物的羰基不對(duì)稱還原。轉(zhuǎn)化細(xì)胞、該轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)物、該轉(zhuǎn)化細(xì)胞的處理物每一種均可單獨(dú)使用，也可聯(lián)合使用。
式(I)
(式中，R為氫原子、烷基或芳基)；式(II) (式中，R與上述意思相同)；式(III) (式中，R與上述意思相同)。
在本發(fā)明制備方法所用的原料式(I)～(III)所示的化合物中，R表示氫原子、烷基或芳基。
作為烷基，可以是甲基、乙基、異丙基、環(huán)丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、環(huán)己基、芐基、苯乙基等可以被烷基或芳基取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀的烷基。
作為芳基，包括苯基、2，4，6-三甲苯基、萘基等可以被烷基取代的苯基或萘基。
上述R優(yōu)選C1～C4的烷基、芐基或苯基，更優(yōu)選C1～C4的烷基，特別優(yōu)選甲基或乙基。
本發(fā)明的制備方法中，上述式(II)和(III)表示的化合物至少包含下式(II′)和(III′)中表示的光學(xué)活性體。優(yōu)選上述式(II)和(III)表示的化合物中式(II′)和(III′)的含量較多。更優(yōu)選上述式(II)和(III)表示的化合物由下式(II′)和(III′)構(gòu)成。下式(II′)和(III′)表示的化合物中R與上述意思相同。
(式中，R與上述意思相同)； (式中，R與上述意思相同)。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，從式(I)～(III)及(II′)～(III′)所表示的化合物得到的產(chǎn)物可為混合物，但至少包含下式(IV)。下式(IV)表示的化合物中R與上述意思相同。
(式中，R與上述意思相同)。
式(I)～(III)及(II′)～(III′)表示的化合物，可通過將特開平1-279866號(hào)公報(bào)、特開平8-127585號(hào)公報(bào)、特開平5-178841號(hào)公報(bào)等中記載的方法與公知的方法組合任意制備?？墒褂?種或多種上述化合物作為原料。
作為原料，用(I)表示的化合物制備(IV)表示的化合物時(shí)，作為中間體，有時(shí)式(II′)表示的化合物為中間體，有時(shí)式(III′)表示的化合物為中間體。
可從(I)表示的化合物預(yù)先制備式(II′)表示的化合物和式(III′)表示的化合物，將其分離，再衍生成(IV)表示的化合物；也可不分離(II′)表示的化合物和(III′)表示的化合物，而直接制備(IV)表示的化合物。
反應(yīng)底物，通常底物濃度為0.01-90w/v％，優(yōu)選0.1-30w/v％。底物可在反應(yīng)開始時(shí)一次性添加，但從減輕酶底物抑制時(shí)的影響和提高產(chǎn)物的蓄積濃度的觀點(diǎn)來考慮的話，希望連續(xù)或間歇性地添加。
本發(fā)明的制備方法中，將上述轉(zhuǎn)化體作用于含羰基化合物時(shí)，可直接使用該轉(zhuǎn)化體細(xì)胞，或使用該轉(zhuǎn)化體細(xì)胞培養(yǎng)物、或?qū)⒃撧D(zhuǎn)化體細(xì)胞用公知的方法進(jìn)行處理得到的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞處理物，例如，將該轉(zhuǎn)化體細(xì)胞用丙酮、二甲基亞砜(DMSO)、甲苯等有機(jī)溶劑或表面活性劑進(jìn)行處理的處理物，冷凍干燥處理物，用物理或酶進(jìn)行破碎等細(xì)胞處理物，將該轉(zhuǎn)化體細(xì)胞中的本發(fā)明的酶級(jí)分以粗制物或純化物的形式取出，然后將它們固定到以聚丙烯酰胺凝膠、角叉菜膠等為代表的載體上使用。
另外，本發(fā)明的制備方法中，優(yōu)選添加輔酶NADP+或NADPH，通常添加0.001mM～100mM，優(yōu)選0.01～10mM。
添加上述輔酶時(shí)，由于從NADPH生成的NADP+可再生成NADPH，所以可提高生產(chǎn)效率，作為再生方法，包括1)利用宿主微生物自身的NADP+還原能力的方法；2)向反應(yīng)體系中添加具有從NADP+生成NADPH能力的微生物和其處理物，或者添加葡萄糖脫氫酶、蟻酸脫氫酶、醇脫氫酶、氨基酸脫氫酶、有機(jī)酸脫氫酶(蘋果酸脫氫酶等)等可用于NADPH再生的酶(再生酶)的方法；3)在制備轉(zhuǎn)化體時(shí)，將上述可用于NADPH再生的酶(再生酶)的基因與本發(fā)明的DNA同時(shí)導(dǎo)入宿主。
其中，上述1)的方法中，優(yōu)選向反應(yīng)體系中添加葡萄糖、乙醇、蟻酸等的方法。
上述2)的方法中，可應(yīng)用含上述再生酶類的微生物、用丙酮處理該微生物細(xì)胞的產(chǎn)物、冷凍干燥處理物、物理性或用酶進(jìn)行破碎等的細(xì)胞處理物、將該酶級(jí)分以粗提物或純化物的形式取出的產(chǎn)物，再將它們固定到以聚丙烯酰胺、角叉菜膠等為代表的載體上使用。還可應(yīng)用商品化的酶。
此時(shí)，上述再生酶的用量，具體地講，以酶活性計(jì)，為本發(fā)明羰基還原酶的0.01-100倍、優(yōu)選0.5-20倍的量。
另外，有必要添加上述再生酶的底物化合物，例如利用葡萄糖脫氫酶時(shí)添加葡萄糖，利用蟻酸脫氫酶時(shí)添加蟻酸，利用醇脫氫酶時(shí)添加乙醇或異丙醇等。相對(duì)于反應(yīng)原料含羰基化合物，其添加量為0.1-20倍摩爾當(dāng)量，優(yōu)選1-5倍摩爾當(dāng)量。
另外，上面3)的方法中，將本發(fā)明的DNA與上述再生酶類的DNA重組到染色體中的方法，可采用將兩種DNA導(dǎo)入同一載體中轉(zhuǎn)化宿主的方法，以及將兩種DNA分別單獨(dú)導(dǎo)入載體然后轉(zhuǎn)化宿主的方法。當(dāng)采用將兩種DNA分別單獨(dú)導(dǎo)入載體然后轉(zhuǎn)化宿主的方法時(shí)，有必要考慮兩個(gè)載體間的不相容性來選擇載體。
當(dāng)將多個(gè)基因?qū)雴我惠d體中時(shí)，可以采用將啟動(dòng)子和終止子等與表達(dá)調(diào)控相關(guān)的區(qū)域分別連接到各個(gè)基因的方法和以包含例如乳糖操縱子等多個(gè)順反子的操縱子形式進(jìn)行表達(dá)的方法。
本發(fā)明的制備方法在含有反應(yīng)底物與本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞、該轉(zhuǎn)化體細(xì)胞培養(yǎng)物或該轉(zhuǎn)化體細(xì)胞處理物，以及根據(jù)需要添加的各種輔酶及其再生系統(tǒng)的水性介質(zhì)中或該水性介質(zhì)與有機(jī)溶劑的混合物中進(jìn)行。作為上述水性介質(zhì)，可以用使用了磷酸鈉或磷酸鈣等的緩沖液等，該緩沖液中可適當(dāng)添加有機(jī)溶劑或表面活性劑等普通酶反應(yīng)中應(yīng)用的任意成分。作為有機(jī)溶劑，包括二甲基亞砜(DMSO)和四氫呋喃(THF)等水溶性溶劑，或醋酸丁酯、己烷等非水溶性有機(jī)溶劑等，優(yōu)選使用反應(yīng)底物溶解度高的溶劑。表面活性劑包括吐溫Tween 80和糖酯等。
本發(fā)明的方法通常在4-60℃進(jìn)行，優(yōu)選0-45℃的反應(yīng)溫度；通常pH在3-11，優(yōu)選pH為5-8。另外可利用膜反應(yīng)器等進(jìn)行。
通過本發(fā)明方法生成的光學(xué)活性醇可以如下進(jìn)行純化在反應(yīng)終止后，將反應(yīng)液中的細(xì)胞或蛋白質(zhì)離心分離，并通過膜處理分離，然后適當(dāng)組合進(jìn)行利用醋酸乙酯、甲苯等有機(jī)溶劑的提取、蒸餾、柱色譜、晶析等。
實(shí)施例以下列舉實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體說明。但只要不離開其要點(diǎn)，可在本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域中進(jìn)行常規(guī)變更。
另外，(E)-7-[2-環(huán)丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羥基庚-6-烯酸酯除了3R，5S外，作為異構(gòu)體還存在3S，5R體、3R，5R體及3S，5S體，以(E)-7-[2-環(huán)丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羥基庚-6-烯酸酯(以后略作DOLE)為例，其結(jié)構(gòu)式如下。
3S，5R-DOLE與3R，5S-DOLE為DOLE的順式(Syn)異構(gòu)體，3S，5S-DOLE與3R，5R-DOLE為DOLE的反式(anti)異構(gòu)體。
實(shí)施例中，作為目的產(chǎn)物的3R，5S體的純度用對(duì)映體過剩率表示，本實(shí)施例中用(3R，5S體-3S，5R體)/(3R，5S體+3S，5R體)(％e.e.)表示對(duì)映體過剩Syn-DOLE 3S，5R-DOLE 3R，5S-DOLEanti-DOLE 3S，5S-DOLE ·3R，5R-DOLE率。
<制備例1>(E)-7-[2-環(huán)丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二氧代(oxo)庚-6-烯酸酯(以后略作DOXE)的合成往帶有攪拌機(jī)、滴液漏斗和溫度計(jì)的500mL四頸燒瓶中加入(E)-7-[2-環(huán)丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-5-羥基-3-氧代庚-6-烯酸酯(以后略作5-MOLE)5.02g(11.22mmol)和420mL丙酮并攪拌。在0℃用20分鐘滴加配制的Jones氧化劑(濃硫酸3mL和3.35g氧化鉻混和后，用水稀釋到25mL而得到的試劑)10.5mL，在冰冷下攪拌2小時(shí)，然后緩慢加入甲醇10mL終止反應(yīng)。接著在減壓下將丙酮從反應(yīng)混和液中餾去后，加入醋酸乙酯250mL，用飽和碳酸氫鈉水溶液60mL對(duì)所得溶液提取兩次，然后用飽和食鹽水60mL提取兩次，分液后用無水硫酸鎂干燥醋酸乙酯溶液，餾去溶劑后，用硅膠色譜(洗脫溶劑己烷∶醋酸乙酯＝2∶1)進(jìn)行純化，得到標(biāo)題化合物3.03g(收率60.6％)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3，δppm)7.79-7.19(8H，m)，7.71(1H，d)，6.03(1H，d)，5.51(1H，s)，4.21(2H，q)，3.40(2H，s)，2.35-2.40(1H，m)，1.39-1.41(2H，m)，1.28(3H，t)，1.07-1.09(2H，m).
<制備例2>5S-(E)-7-[2-環(huán)丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-5-羥基-3-氧-庚-6-烯酸酯(以后略作5S-MOLE)的合成往減壓加熱干燥后充入了氮?dú)獾腟chlenk管中加入(S)-2-[N-3-甲基-5-叔-丁基亞水楊基(サリチデン)氨基]-3-甲基-丁醇0.87g(3.3mol)、二氯甲烷5ml和四乙氧基鈦0.63mL(6.0mmoL)，室溫?cái)嚢?小時(shí)。將該Schlenk管冷卻到-50℃后，將(E)-3-[2-環(huán)丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-丙-2-烯-1-醛0.95g(3.0mmoL)溶于2ml二氯乙烷中并滴下，攪拌5分鐘后，添加雙烯酮(diketene)0.51g(6mmoL)，保持在-50℃，攪拌22小時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。將所得混和液添加到二氯甲烷25ml和0.24M碳酸氫鈉水溶液25mL的混合溶液中，室溫劇烈攪拌2小時(shí)，得到2層溶液。將所得2層溶液分液，用二氯甲烷10ml提取水層2次。合并二氯甲烷層和二氯甲烷提取液，得到二氯甲烷溶液。用無水硫酸鎂干燥，餾去溶劑后，用硅膠色譜(洗脫溶劑己烷∶醋酸乙酯＝3∶2)純化，得到5S-(E)-7-[2-環(huán)丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-5-羥基-3-氧-庚-6-烯酸酯(5S-MOLE)0.75g(光學(xué)純度73％e.e.，相對(duì)(E)-3-[2-環(huán)丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-丙-2-烯-1-醛的回收率為56％)。
<實(shí)施例1>羰基還原酶的分離用20L YM培養(yǎng)基(葡萄糖24g、酵母提取物3g、麥芽提取物3g、蛋白胨5g/L、pH6.0)培養(yǎng)Ogataea minuta var nonfermentans IFO 1473株，通過離心分離制備細(xì)胞。用50mM磷酸鉀緩沖液(PH 7.0、1mM DTT)懸浮所得濕細(xì)胞中的300g，用ダイノ-ミル(DyNO-MILL公司)破碎后，通過離心分離除去細(xì)胞殘?jiān)?，獲得無細(xì)胞提取液。向該無細(xì)胞提取液中加入12％w/v的聚乙二醇(PEG)6000，離心分離獲得上清。將該上清加到用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(10mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)、1mM DTT)平衡過的DEAE Sepharose6FF(2.6cm×28cm)中。用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液洗滌柱子后，再用含0.07M氯化鈉的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液洗滌，用0.07～0.18M氯化鈉進(jìn)行梯度洗脫?；厥障疵摰募?jí)分，測(cè)定羰基還原酶活性。
羰基還原酶活性測(cè)定通過將以下反應(yīng)液在30℃振蕩反應(yīng)一晚上進(jìn)行向200μL酶活測(cè)定級(jí)分中加入含有8mM NADPH的0.1mM氫氧化鉀水溶液10μL、0.1M磷酸緩沖液(pH7.0)25μL、20g/L DOXE(DMSO溶液)10μL。用以下方法進(jìn)行活性檢測(cè)向反應(yīng)終止后的反應(yīng)液中加入0.5mL醋酸乙酯并劇烈混合，通過離心分離分為有機(jī)層和水層。將有機(jī)層移到其它容器中，用濃縮離心機(jī)餾去溶劑，用0.01mL醋酸乙酯溶解干涸的生成物，進(jìn)行薄層層析(TLC)。TLC使用硅膠板(メルク公司silica gel 60 F254)，展開劑為己烷/醋酸乙酯＝1/1。展開后，用紫外燈確認(rèn)生成物?；衔?I)Rf＝0.76～0.86，化合物(II)和化合物(III)Rf＝0.54～0.61，化合物(IV)(式中，R＝乙基的化合物DOLE)Rf＝0.33。
在0.13M氯化鈉附近可看到羰基還原酶活性的峰。回收洗脫出的活性級(jí)分，添加硫酸銨使其終濃度為0.3M，然后將其加到用含0.3M硫酸銨的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(10mM磷酸鉀緩沖液(PH7.0)、1mM DTT))平衡過的辛基-SepharoseCL4B(0.8cm×20cm)柱上，用0.3-0M濃度的硫酸銨進(jìn)行梯度洗脫。在0M硫酸銨附近可可看到羰基還原酶活性的峰。
回收洗脫的峰部分，通過超濾脫鹽、濃縮至標(biāo)準(zhǔn)溶液后，加到用相同緩沖液平衡過的MonoQ HR5/5中，用相同緩沖液及含0.05M氯化鈉的同種緩沖液洗滌后，用0.05M-0.25M的氯化鈉進(jìn)行濃度梯度洗脫。由于在0.17M氯化鈉的洗脫級(jí)分中存在羰基還原酶活性，所以回收該級(jí)分，濃縮。用Superdex200 HR10/30、含0.15M氯化鈉的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液對(duì)濃縮的酶液進(jìn)行凝膠過濾。通過凝膠過濾所得的活性級(jí)分的分子量為10.7萬(wàn)Da。
此外，用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析上述活性級(jí)分，結(jié)果基本上為單一條帶，其分子量約2.7萬(wàn)Da。
此外，通過該酶與多種酮或醛進(jìn)行反應(yīng)測(cè)定其還原活性，具體而言，用0.1M磷酸緩沖液(pH7.0)將100mM底物的異丙醇溶液5μL與包含8mMNADPH和0.1mM氫氧化鉀的水溶液10μL調(diào)配成總量為250μL的反應(yīng)液，測(cè)定其中NADPH的減少初速度。此時(shí)，以2，2，2-三氟苯乙酮的吸光度變化量為100，其比活性如表1所示。
表1


在pH不同的多種緩沖液中測(cè)定2，2，2-三氟苯乙酮還原活性，求出該酶的最適pH。具體而言，準(zhǔn)備多種pH不同的0.1M磷酸鉀緩沖液、醋酸鈉緩沖液和檸檬酸緩沖液，測(cè)定其活性。反應(yīng)的最適pH為5.0-6.5。
另外，僅變化反應(yīng)溫度，測(cè)定2，2，2-三氟苯乙酮還原活性。測(cè)定羰基還原酶的作用最適溫度時(shí)，其最適溫度為60-70℃。
該酶的pH穩(wěn)定性如下測(cè)定準(zhǔn)備多種不同pH的0.1M磷酸鉀緩沖液、醋酸鈉緩沖液和檸檬酸緩沖液，分別在30℃溫育30分鐘，測(cè)定其殘存活性，結(jié)果表明pH為5.5-6.5時(shí)最穩(wěn)定。
在pH7.0的20mM磷酸緩沖液中，于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃的溫度下分別放置10分鐘，然后測(cè)定2，2，2-三氟苯乙酮還原活性，以檢測(cè)該酶的溫度穩(wěn)定性。結(jié)果表明，本發(fā)明的酶在40℃或40℃以下顯示79％以上的殘存活性，在50℃以上時(shí)開始迅速失活，到70℃時(shí)活性全無。
另外，在多種試劑中將該酶于30℃處理10分鐘后，測(cè)定2，2，2-三氟苯乙酮還原活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，在硝酸汞或氯化鉛等的汞(I)離子、鉛(II)離子存在下，該酶的活性顯著受到抑制。
<實(shí)施例2>羰基還原酶的部分氨基酸序列解析將實(shí)施例1中所得含羰基還原酶的級(jí)分脫鹽、濃縮后，用賴氨酸殘基肽酶在30℃整夜處理。用逆相HPLC(アマシヤム-フアルマシア制uRPCC2/C18、46mm×100mm)分析消化的肽，通過在0.1％三氟醋酸(TFA)中的乙腈梯度洗脫將肽分離、分級(jí)。分級(jí)所獲得的3種肽峰為Frac20、27和30，分別用Edman法分析其氨基酸序列。Frac20、27和30的氨基酸序列分別示于序列號(hào)3、4、5中。同樣地，將含羰基還原酶的級(jí)分脫鹽后，用Edman法分析其N末端的氨基酸序列，結(jié)果如序列號(hào)6所示。
<實(shí)施例3>Ogataea minuta var nonfermentans IFO 1473株來源的本發(fā)明DNA的序列分析及轉(zhuǎn)化體的制備用YM培養(yǎng)基培養(yǎng)Ogataea minuta var nonfermentans IFO 1473株，制備細(xì)胞。
應(yīng)用MagExtractor(東洋紡社制)從細(xì)胞中純化總RNA。以純化的RNA為基礎(chǔ)，用SuperScriptII(Life Technology社制)合成第一鏈cDNA。方法分別按照說明書進(jìn)行。
根據(jù)實(shí)施例2中所得N末端氨基酸序列合成正義簡(jiǎn)并引物，根據(jù)序列號(hào)3、4和5的氨基酸序列分別設(shè)計(jì)反義簡(jiǎn)并引物，共4種引物。其堿基序列分別示于序列號(hào)7、8、9、10中。以N末端與3個(gè)部分氨基酸序列的組合(3種)選擇引物。用含引物各400pmoL、dNTP 0.4mmoL、上述合成的Ogataeaminuta var nonfermentans IFO 1473株的cDNA 1μL、TaKaRa Taq用10×緩沖液(寶酒造社制)5μL及耐熱性DNA聚合酶2U(寶酒造社制，商品名“TaKaRa Taq”)的50μL反應(yīng)液，用PTC-200 Peltier Thermal Cycler(MJResearch社制)進(jìn)行變性(94℃、30秒)、退火(50℃、30秒)、延長(zhǎng)(72℃、1分)30個(gè)循環(huán)。取一部分PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果序列號(hào)7的引物與序列號(hào)8的引物、序列號(hào)7的引物與序列號(hào)9的引物、序列號(hào)7的引物與序列號(hào)10的引物組合時(shí)可檢測(cè)出被視為特異性的條帶。
將上面所得3種DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切出目的條帶的一部分，用Gel Extraction試劑盒(QIAGEN社制)純化、回收。用pGEM-T VectorSystem(Promega社制)對(duì)所得DNA片段進(jìn)行TA克隆，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株(東洋紡社制)。向含1％細(xì)菌用胰蛋白胨、0.5％細(xì)菌用酵母提取物和1％氯化鈉的培養(yǎng)基(以下、略作LB培養(yǎng)基)中加入氨芐青霉素(100μg/mL)，用1.5％細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂鋪板，讓轉(zhuǎn)化株在板上生長(zhǎng)，應(yīng)用幾個(gè)集落，以根據(jù)載體序列合成的序列號(hào)11和12作引物，進(jìn)行集落直接(colony direct)PCR，確認(rèn)插入片段的大小。用含100μg/mL氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)認(rèn)為插入了目的DNA片段的集落，用Mini-Prep(QIAGEN制)純化質(zhì)粒。序列號(hào)7的引物與序列號(hào)8的引物、序列號(hào)7的引物與序列號(hào)9的引物、序列號(hào)7的引物與序列號(hào)10的引物組合所得質(zhì)粒分別命名為phir21-23、phir21-25、phir21-27。
用純化質(zhì)粒通過雙終止子法分析插入DNA的堿基序列。所測(cè)定的phir21-23、phir21-25、phir21-27的各插入片段部分的堿基序列分別示于序列號(hào)13、14、15。
用根據(jù)上述堿基序列設(shè)計(jì)的引物，對(duì)從Ogataea minuta var nonfermentansIFO 1473株制備的總RNA進(jìn)行5’RACE法及3’RACE法。
5’RACE法是用序列號(hào)16、17中所示堿基序列的引物作為基因特異性引物(以下略作GSP)1、2，用5’RACE System for Rapid Amplificationof cDNA Ends、ver 2.0(Life Technology公司)進(jìn)行后，以此為模板再度用序列號(hào)1 8中所示堿基序列的引物作GSP進(jìn)行5’RACE。
3’RACE是用序列號(hào)19中所示堿基序列的引物作GSP，用3’RACESystem for Rapid Amplification of cDNA Ends、ver 2.0(LifeTechnology公司)進(jìn)行。各RACE法按各自的說明書進(jìn)行。
用pGEM-T Vector System(Promega社制)對(duì)所得DNA片段進(jìn)行TA克隆，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(東洋紡社制)。讓轉(zhuǎn)化株在含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)，用幾個(gè)集落，用從載體序列合成的序列11、12作引物進(jìn)行集落直接PCR，確認(rèn)插入片段的大小。用含100μg/mL氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)認(rèn)為插入了目的DNA片段的集落，用Mini-Prep(QIAGEN)純化質(zhì)粒后，通過雙終止子法分析DNA堿基序列。
用Genetyx(ソフトウエア開發(fā)株式會(huì)社制)對(duì)以通過上述5’RACE和3’RACE所得的phir21-25的5′上游堿基序列和3′下游堿基序列、以及序列號(hào)14中的堿基序列為基礎(chǔ)制備的DNA序列進(jìn)行ORF檢索，本發(fā)明的DNA序列及其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列暫定為序列號(hào)20所示堿基序列及氨基酸序列。
用序列號(hào)20中的氨基酸序列，以DDBJ為對(duì)象，用BLAST program進(jìn)行同源性檢索，結(jié)果在已知蛋白質(zhì)中，顯示最高同源性的是粟酒裂殖酵母的可能的短鏈脫氫酶(T41540)，同源性為37.4％。接下來，以序列號(hào)20中的序列為基礎(chǔ)合成序列號(hào)21和序列號(hào)22的堿基序列作為克隆用的引物，用含上述引物各50pmol、dNTP 200nmol、Ogataea minuta var nonfermentans IFO1473株的cDNA 1μL、KOD-DNA polymerase用10×緩沖液(東洋紡社制)5μL、KOD-DNA polymerase 2.5U(東洋紡社制)的50μL反應(yīng)液，用PTC-200Peltier Thermal Cycler(MJ Research社制)，進(jìn)行變性(96℃、30秒)、退火(54℃、30秒)、延長(zhǎng)(74℃、1分)30個(gè)循環(huán)。取PCR反應(yīng)液的一部分進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果可檢測(cè)出被視為特異性的條帶。
用QIAGEN Gel Extraction試劑盒(キアゲン社制)回收上述檢測(cè)出的條帶部分。用限制酶HindIII和EcoRI消化回收的DNA片段，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切出部分目的條帶，再度用Qiagen Gel Extraction試劑盒(キアゲン社制)純化后回收。用Takara Ligation Kit連接所得DNA片段與用EcoRI和HindIII消化的pKK223-3(Pharmacia公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。
在含氨芐青霉素(50μg/mL)的LB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，用幾個(gè)集落，用從載體序列合成的序列號(hào)23所示的引物序列和序列號(hào)24所示的引物序列進(jìn)行集落直接PCR，確認(rèn)插入片段的大小。
用含氨芐青霉素50μg/mL的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)認(rèn)為插入了目的DNA片段的轉(zhuǎn)化體，用Qiagen 500(QIAGEN社制)純化質(zhì)粒，命名為pKK223-3OCR1。
用雙終止子法分析插入到質(zhì)粒中的DNA的堿基序列，結(jié)果表明，所插入的DNA片段具有由如下堿基序列組成的核苷酸序列其5’上游添加了用于克隆的6個(gè)堿基的序列2所示堿基序列、Ogataea minuta var nonfermentansIFO1473來源的雙終止密碼子(TAGTAAT)以及其3’下游用于克隆的6個(gè)堿基。
插入到PKK233-3OCR1的DNA片段的堿基序列示于序列號(hào)25中，該DNA片段編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號(hào)1中。
<實(shí)施例5>用本發(fā)明DNA轉(zhuǎn)化的大腸桿菌由DOXE制備DOLE用含氨芐青霉素(50μg/mL)、0.1mM異丙醇、β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的LB培養(yǎng)基，在37℃將實(shí)施例4中所得的轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)17小時(shí)，將2mL所得細(xì)胞培養(yǎng)液(cell broth)通過離心分離收集細(xì)胞，然后懸浮到180μL100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中后，通過下述方法，以(E)-7-[2-環(huán)丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二氧代庚-6-烯酸酯(DOXE)為底物，確認(rèn)還原活性。
向上述細(xì)胞懸浮液中添加2g/L NADP+(オリエンタル酵母社制)10μL、甲苯1μL后，用渦流攪拌機(jī)攪拌5分鐘。添加50％葡萄糖10μL、葡萄糖脫氫酶溶液(天野制藥社制；25U/mL)10μL、將上述底物以20g/L溶解到DMSO中的產(chǎn)物50μL(底物1mg的份量)后，在40℃振蕩反應(yīng)20小時(shí)。向反應(yīng)終止后的反應(yīng)混懸液中添加乙腈1.75mL稀釋后離心，用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定上清中的生成物。HPLC的條件如下柱MCIGEL CHP2MGM(三菱化學(xué)社制)洗脫液甲醇/乙腈/水/磷酸＝800/100/100/1流速0.6ml/min檢測(cè)UV254nm溫度60℃結(jié)果收量為319μg，收率為31.9％。
另外，為了測(cè)定光學(xué)純度，向反應(yīng)終止后的反應(yīng)液中添加0.5mL醋酸乙酯并劇烈混合，離心分離成有機(jī)層和水層，將有機(jī)層轉(zhuǎn)移到別的容器中，用濃縮離心機(jī)餾去溶劑，用醋酸乙酯0.01mL溶解干固的生成物，進(jìn)行薄層層析(TLC)。TLC用硅膠板(メルク社制silica gel 60 F254)，展開劑為己烷/醋酸乙酯＝1/1。
展開終止后，用UV燈確認(rèn)生成物?；衔?I)的Rf＝0.76～0.86，化合物(II)和化合物(III)的Rf＝0.54～0.61，化合物(IV)(式中，R＝乙基的化合物以下略作DOLE)的Rf＝0.33。刮取TLC上DOLE的點(diǎn)，用異丙醇0.25mL洗脫，離心分離后用高效液相色譜(HPLC)對(duì)上清進(jìn)行光學(xué)純度和TLC刮取樣品的濃度分析。
HPLC的條件如下柱ダイセルCHIRALCEL AD洗脫液己烷/乙醇/三氟醋酸＝900/100/1流速1ml/min檢測(cè)UV 254nm溫度室溫結(jié)果，光學(xué)純度為100％e.e.，反式體異構(gòu)體為0.6％。
另外，用添加了0.1mM IPTG的LB培養(yǎng)基整夜培養(yǎng)持有不含該基因的質(zhì)粒pKK223-3的大腸桿菌，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行同樣地反應(yīng)，但未見到上述生成物。
<實(shí)施例6>用本發(fā)明DNA轉(zhuǎn)化的大腸桿菌由5S-MOLE制備DOLE用含氨芐青霉素(50μg/mL)、0.1mM異丙醇、β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的LB培養(yǎng)基將實(shí)施例4中所得的轉(zhuǎn)化體在37℃培養(yǎng)17小時(shí)，將2mL所得細(xì)胞培養(yǎng)液通過離心分離收集細(xì)胞后，懸浮到180μL 100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中，然后通過下述方法，以5S-(E)-7-[2-環(huán)丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-5-羥基-3-氧代-庚-6-烯酸酯(5S-MOLE)為底物，確認(rèn)還原活性。
向上述細(xì)胞懸濁液中添加2g/L NADP+(オリエンタル酵母社制)10μL、甲苯1μL后，用渦流攪拌機(jī)攪拌5分鐘。添加50％葡萄糖10μL、葡萄糖脫氫酶溶液(天野制藥社制；25U/mL)10μL、將上述底物以20g/L溶解到DMSO中的產(chǎn)物50μL(底物1mg的份量)后，在40℃振蕩反應(yīng)20小時(shí)。用乙腈稀釋反應(yīng)終止后的反應(yīng)混懸液后離心，用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定上清中的生成物。HPLC的條件如下柱コスモシル 5C18MS-II 4.6×250mm(ナカライ社制)洗脫液甲醇/乙腈/水/磷酸＝350/150/500/1流速0.6ml/min檢測(cè)UV 254nm
溫度60℃結(jié)果收量為807μg，收率為80.7％，反式異構(gòu)體為15.3％。
另外，為了測(cè)定光學(xué)純度，向反應(yīng)終止后的反應(yīng)液中添加0.5mL醋酸乙酯并劇烈混合，離心分離成有機(jī)層和水層。將有機(jī)層轉(zhuǎn)移到別的容器中，用濃縮離心機(jī)餾去溶劑，用醋酸乙酯0.01mL溶解干固的生成物，進(jìn)行薄層層析(TLC)。TLC用硅膠板(メルク社制silica gel 60 F254)，展開劑為己烷/醋酸乙酯＝1/1。
展開終止后，用UV燈確認(rèn)生成物?；衔?I)的Rf＝0.76～0.86，化合物(II)和化合物(III)的Rf＝0.54～0.61，化合物(IV)(式中，R＝乙基的化合物以下略作DOLE)的Rf＝0.33。刮取TLC上的DOLE點(diǎn)，用異丙醇0.25mL洗脫，離心后用高效液相色譜(HPLC)對(duì)上清進(jìn)行光學(xué)純度和TLC刮取樣品的濃度分析。
HPLC的條件如下柱ダイセルCHIRALCEL AD洗脫液己烷/乙醇＝95/5流速1ml/min檢測(cè)UV254nm溫度50℃結(jié)果光學(xué)純度為97％e.e.，反式異構(gòu)體為15.2％。
另外，用添加了0.1mM IPTG的LB培養(yǎng)基整夜培養(yǎng)持有不含該基因的質(zhì)粒pKK223-3的大腸桿菌，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行同樣地反應(yīng)，但未見到上述生成物。
產(chǎn)業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供可高光學(xué)純度且高收率地得到光學(xué)活性醇類的制備方法，該物質(zhì)是作為醫(yī)藥、農(nóng)藥等中間體原料而在產(chǎn)業(yè)上有用的化合物。
序列表<110>三菱化學(xué)株式會(huì)社(Mitsubishi Chemical Corp.)日產(chǎn)化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社(Nissan Chemical Industries，LTD)<120>新型羰基還原酶及其編碼基因、以及利用它們制備光學(xué)活性醇的方法<130>A30120P1525<150>JP 2002-075921<151>2002-03-19<160>25<210>1<211>251<212>PRT<213>Ogataea minuta var nonfermentans<400>1Met Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly1 5 10 15Leu Glu Val Ala Ser Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile20 25 30Ala Ser Tyr Arg Ser Glu Lys Ser Ala Ser Gly Leu Leu Glu Leu Ala35 40 45Lys Lys Asp Asn Val Asp Thr Ile Val Leu Asp Ile Ala Ser Gln Glu50 55 60Ser Ile Asp Ala Val Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp Gly Ile65 70 75 80Asp Val Ala Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Asn Ala Met Cys Pro Ile85 90 95Leu Glu Cys Ser Arg Glu Ser Tyr Thr Asp His Trp Thr Thr Asn Ala100 105 110Leu Gly Pro Ile Met Leu Tyr Gln Ala Ile His Lys Phe Met Leu Gln115 120 125Arg Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Thr Thr Ser Ala Gly Gly Ser Ile130 135 140Gln Ala Lys Ile Pro Val Pro Val Ser Gly Tyr Gly Met Ser Lys Ala145 150 155 160Ala Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ala Asp Glu Cys Tyr Lys Asp165 170 175Asn Phe Thr Ile Val Leu Leu His Pro Gly Phe Val Lys Thr Asp Met180 185 190
Gly Gln Ser Ala Ile Gln Lys Met Ser Asn Gly Asn Ala Glu Leu Leu195 200 205Ala Tyr Ile Asp Ser Met Thr Ile Asp Val Pro Thr Ser Ala Gly Gln210 215 220Ile Val Gly Ala Ile Met Thr Leu Asp Lys Gln Ser Ser Gly Arg Phe225 230 235 240Ile Asn Ala Ala Asp Gln Phe Asp Met Pro Phe245 250<210>2<211>753<212>DNA<213>Ogataea minuta var nonfermentans<220>
<221>CDS<222>(1)..(753)<400>2atg gct aaa act gtt tac ttc atc gca ggt gct tcc aga ggt atc ggt 48Met Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly1 5 10 15ctc gag gtt gct tcc cag ctg agt gca aac cca gac aat tat gtt att 96Leu Glu Val Ala Ser Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile20 25 30gca tcc tat aga tct gaa aag tct gct tca gga ctt ttg gag ctg gca144Ala Ser Tyr Arg Ser Glu Lys Ser Ala Ser Gly Leu Leu Glu Leu Ala35 40 45aag aag gat aat gtc gac aca att gtg ttg gat att gca agc cag gaa192Lys Lys Asp Asn Val Asp Thr Ile Val Leu Asp Ile Ala Ser Gln Glu50 55 60tcg att gat gct gtt cca gca cag att tcc aag ctg act gat gga atc240Ser Ile Asp Ala Val Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp Gly Ile65 70 75 80gat gtt gcc ttg atc aac gct gga att gcc aac gct atg tgt ccg att288Asp Val Ala Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Asn Ala Met Cys Pro Ile85 90 95ctc gaa tgt tct aga gag tcc tac act gat cac tgg aca acc aat gcc336Leu Glu Cys Ser Arg Glu Ser Tyr Thr Asp His Trp Thr Thr Asn Ala100 105 110ttg ggt cca atc atg ctc tac caa gct att cat aag ttc atg ctc cag384Leu Gly Pro Ile Met Leu Tyr Gln Ala Ile His Lys Phe Met Leu Gln115 120 125aga gag acc aga aaa gtg ttc ttt acc acg agt gct ggt ggt tcc att432Arg Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Thr Thr Ser Ala Gly Gly Ser Ile
130 135 140cag gct aag ata ccc gtg cct gtg agt ggt tac ggt atg tcc aag gct480Gln Ala Lys Ile Pro Val Pro Val Ser Gly Tyr Gly Met Ser Lys Ala145 150 155 160gcg ctt aat tat gct gtg aga aaa ctt gct gac gag tgc tac aag gac528Ala Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ala Asp Glu Cys Tyr Lys Asp165 170 175aac ttc act att gtg ttg ctg cat cct ggt ttt gtt aag acg gac atg576Asn Phe Thr Ile Val Leu Leu His Pro Gly Phe Val Lys Thr Asp Met180 185 190ggt caa agc gcc att cag aag atg tca aat gga aat gct gag ctt ctt624Gly Gln Ser Ala Ile Gln Lys Met Ser Asn Gly Asn Ala Glu Leu Leu195 200 205gct tac att gac tca atg act att gat gtt cct acc agt gct ggc caa672Ala Tyr Ile Asp Ser Met Thr Ile Asp Val Pro Thr Ser Ala Gly Gln210 215 220atc gtc ggt gcc att atg acc ttg gac aag cag agc agc ggt aga ttt720Ile Val Gly Ala Ile Met Thr Leu Asp Lys Gln Ser Ser Gly Arg Phe225 230 235 240atc aac gct gct gac cag ttt gac atg cca ttt753Ile Asn Ala Ala Asp Gln Phe Asp Met Pro Phe245 250<210>3<211>14<212>PRT<213>Ogataea minuta var nonfermentans<400>3Val Phe Phe Thr Thr Ser Ala Gly Gly Ser Ile Gln Ala Lys1 5 10<210>4<211>16<212>PRT<213>Ogataea minuta var nonfermentans<400>4Gln Ser Ser Gly Arg Phe Ile Asn Ala Ala Asp Gln Phe Asp Met Pro1 5 10 15<210>5<211>13<212>PRT<213>Ogataea minuta var nonfermentans
<400>5Asp Asn Phe Thr Ile Val Leu Leu His Pro Gly Phe Val1 5 10<210>6<211>20<212>PRT<213>Ogataea minuta var nonfermentans<400>6Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly Leu1 5 10 15Glu Val Ala Ser20<210>7<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<220>
<221>modified_base<222>(3，9，12，24)<223>n＝肌苷<400>7gcnaaracng tntayttyat hgcngg 26<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<220>
<221>modified_base<222>(4，13，16，19，22，25，28)<223>n＝肌苷
<400>8yttngcytgd atnswnccnc cngcnswng29<210>9<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<220>
<221>modified_base<222>(1，19，22)<223>n＝肌苷<400>9nggcatrtcr aaytgrtcng cngcrttdat ra32<210>10<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<220>
<221>modified_base<222>(1，7，10，16，19，22，28)<223>n＝肌苷<400>10nacraanccn ggrtgnarna rnacdatngt raa33<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>11tatttaggtg acactatag19
<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>12taatacgact cactataggg20<210>13<211>438<212>DNA<213>Ogataea minuta var nonfermentans<220>
<221>CDS<222>(1)..(438)<400>13gcg aaa acg gtg tat ttc atc gcg ggt gct tcc aga ggt atc ggt ctc 48Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly Leu1 5 10 15gag gtt gct tcc cag ctg agt gca aac cca gac aat tat gtt att gca 96Glu Val Ala Ser Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile Ala20 25 30tcc tat aga tct gaa aag tct gct tca gga ctt ttg gag ctg gca aag144Ser Tyr Arg Ser Glu Lys Ser Ala Ser Gly Leu Leu Glu Leu Ala Lys35 40 45aag gat aat gtc gac aca att gtg ttg gat att gca agc cag gaa tcg192Lys Asp Asn Val Asp Thr Ile Val Leu Asp Ile Ala Ser Gln Glu Ser50 55 60att gat gct gtt cca gca cag att tcc aag ctg act gat gga atc gat240Ile Asp Ala Val Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp Gly Ile Asp65 70 75 80gtt gcc ttg atc aac gct gga att gcc aac gct atg tgt ccg att ctc288Val Ala Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Asn Ala Met Cys Pro Ile Leu85 90 95gaa tgt tct aga gag tcc tac act gat cac tgg aca acc aat gcc ttg336Glu Cys Ser Arg Glu Ser Tyr Thr Asp His Trp Thr Thr Asn Ala Leu100 105 110ggt cca atc atg ctc tac caa gct att cat aag ttc atg ctc cag aga384Gly Pro Ile Met Leu Tyr Gln Ala Ile His Lys Phe Met Leu Gln Arg
115 120 125gag acc aga aaa gtg ttc ttt acc acc acc gcc ggc ggc acc att cag432Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Thr Thr Thr Ala Gly Gly Thr Ile Gln130 135 140gcc aag438Ala Lys145<210>14<211>747<212>DNA<213>Ogataea minuta var nonfermentans<220>
<221>CDS<222>(1)..(747)<400>14gcg aaa acg gtg tat ttc atc gcg ggt gct tcc aga ggt atc ggt ctc 48Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly Leu1 5 10 15gag gtt gct tcc cag ctg agt gca aac cca gac aat tat gtt att gca 96Glu Val Ala Ser Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile Ala20 25 30tcc tat aga tct gaa aag tct gct tca gga ctt ttg gag ctg gca aag144Ser Tyr Arg Ser Glu Lys Ser Ala Ser Gly Leu Leu Glu Leu A1a Lys35 40 45aag gat aat gtc gac aca att gtg ttg gat att gca agc cag gaa tcg192Lys Asp Asn Val Asp Thr Ile Val Leu Asp Ile Ala Ser Gln Glu Ser50 55 60att gat gct gtt cca gca cag att tcc aag ctg act gat gga atc gat240Ile Asp Ala Val Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp Gly Ile Asp65 70 75 80gtt gcc tta atc aac gct gga att gcc aac gct atg tgt ccg att ctc288Val Ala Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Asn Ala Met Cys Pro Ile Leu85 90 95gaa tgt tct aga gag tcc tac act gat cac tgg aca acc aat gcc ttg336Glu Cys Ser Arg Glu Ser Tyr Thr Asp His Trp Thr Thr Asn Ala Leu100 105 110ggt cca atc atg ctc tac caa gct att cat aag ttc atg ctc cag aga384Gly Pro Ile Met Leu Tyr Gln Ala Ile His Lys Phe Met Leu Gln Arg115 120 125gag acc aga aaa gtg ttc ttt acc acg agt gct ggt ggt tcc att cag432Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Thr Thr Ser Ala Gly Gly Ser Ile Gln130 135 140
gct aag ata ccc gtg cct gtg agt ggt tac ggt atg tcc aag gct gcg480Ala Lys Ile Pro Val Pro Val Ser Gly Tyr Gly Met Ser Lys Ala Ala145 150 155 160ctt aat tat gct gtg aga aaa ctt gct gac gag tgc tac aag gac aac528Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ala Asp Glu Cys Tyr Lys Asp Asn165 170 175ttc act att gtg ttg ctg cat cct ggt ttt gtt aag acg gac atg ggt576Phe Thr Ile Val Leu Leu His Pro Gly Phe Val Lys Thr Asp Met Gly180 185 190caa agc gcc att cag aag atg tca aat gga aat gct gag ctt ctt gct624Gln Ser Ala Ile Gln Lys Met Ser Asn Gly Asn Ala Glu Leu Leu Ala195 200 205tac att gac tca atg act att gat gtt cct acc agt gct ggc caa atc672Tyr Ile Asp Ser Met Thr Ile Asp Val Pro Thr Ser Ala Gly Gln Ile210 215 220gtc ggt gcc att atg acc ttg gac aag cag agc agc ggt aga ttc atc720Val Gly Ala Ile Met Thr Leu Asp Lys Gln Ser Ser Gly Arg Phe Ile225 230 235 240aac gcc gcc gac caa ttt gac atg ccc747Asn Ala Ala Asp Gln Phe Asp Met Pro245<210>15<211>561<212>DNA<213>Ogataea minuta var nonfermentans<220>
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<223>PCR引物<400>16agcagggccc ataacgttag caattcctgc30<210>17<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>PCR引物<400>19cttgctgacg agtgctacaa ggac24<210>20<211>1158<212>DNA<213>Ogataea minuta var nonfermentans<220>
<221>CDS<222>(114)..(876)<400>20aactccgtgt aagaattcag atctaggggc ctagaatttg aaatttcttg aaagatcgat 60atgactgaaa tactataaaa gaagctgggt ttccgggtat atctcatagc atc atg 116Met1gct aaa act gtt tac ttc att gct ggt gct tct aga ggt atc ggc ctc 164Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly Leu5 10 15gag gtt gcc acc caa ttg agt tcc aac cct gat aat tat gtt ata gga 212Glu Val Ala Thr Gln Leu Ser Ser Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile Gly20 25 30tcg tac aga tct aaa aag agc gct tcc gct cta atg gaa tta gcc aag 260Ser Tyr Arg Ser Lys Lys Ser Ala Ser Ala Leu Met Glu Leu Ala Lys
35 40 45aag gaa aat gtg gat acg gtc att ctg gac att gcc agc cag gag tca308Lys Glu Asn Val Asp Thr Val Ile Leu Asp Ile Ala Ser Gln Glu Ser50 55 60 65att gag ggt gtg cgt tcc caa atc tcc cag ctg acg gat ggg atc gac356Ile Glu Gly Val Arg Ser Gln Ile Ser Gln Leu Thr Asp Gly Ile Asp70 75 80atc aca ttg atc aat gca gga att gct aac gtt atg ggc cct gct gct404Ile Thr Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Asn Val Met Gly Pro Ala Ala85 90 95acc acc tct aga gaa gat tat gtt act cac tgg acc acc aat gct cta452Thr Thr Ser Arg Glu Asp Tyr Val Thr His Trp Thr Thr Asn Ala Leu100 105 110ggt cca atc atg gtg tac aag gag atc cac gaa ttg atg ttg aag aag500Gly Pro Ile Met Val Tyr Lys Glu Ile His Glu Leu Met Leu Lys Lys115 120 125gat act aga aag gta ttc ttt act acg agt gct ggt ggt tcc att cag548Asp Thr Arg Lys Val Phe Phe Thr Thr Ser Ala Gly Gly Ser Ile Gln130 135 140 145gct aag ata ccc gtg cct gtg agt ggt tac ggt atg tcc aag gct gcg596Ala Lys Ile Pro Val Pro Val Ser Gly Tyr Gly Met Ser Lys Ala Ala150 155 160ctt aat tat gct gtg aga aaa ctt gct gac gag tgc tac aag gac aac644Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ala Asp Glu Cys Tyr Lys Asp Asn165 170 175ttc act att gtg ttg ctg cat cct ggt ttt gtt aag acg gac atg ggt692Phe Thr Ile Val Leu Leu His Pro Gly Phe Val Lys Thr Asp Met Gly180 185 190caa agc gcc att cag aag atg tca aat gga aat gct gag ctt ctt gct740Gln Ser Ala Ile Gln Lys Met Ser Asn Gly Asn Ala Glu Leu Leu Ala195 200 205tac att gac tca atg act att gat gtt cct acc agt gct ggc caa atc788Tyr Ile Asp Ser Met Thr Ile Asp Val Pro Thr Ser Ala Gly Gln Ile210 215 220 225gtc ggt gcc att atg acc ttg gac aag cag agc agc ggt aga ttt atc836Val Gly Ala Ile Met Thr Leu Asp Lys Gln Ser Ser Gly Arg Phe Ile230 235 240aac gct gct gac cag ttt gac atg cca ttt tag taa cgaagatcta gggatt 888Asn Ala Ala Asp Gln Phe Asp Met Pro Phe245 250gagcagtcag caggagaatc gaacctcatt gcagatttca gacaagtaga ggctacgcta 948atatggatca gttgtggatt ctctgctcgt ctctactctc ttcggcccta acttggagtt 1008caggttcaga tttaacaaac ttatttcgat gaaggaaaag agacattgac taacataatt 1068ccgaggccga taaaagtctt gatagcttga attacttact tattctatag aaataaaacg 1128cctgcggtgt ggcaaaaaaa aaaaaaaaaa 1158
<210>21<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>21ggggaattca tggctaaaac tgtttacttc a31<210>22<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>22ccccaagctt attactaaaa tggcatgtca aactggtc38<210>23<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>23gagcggataa caatttcaca cagg24<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>24cttctctcat ccgccaaaac20<210>25
<211>772<212>DNA<213>Ogataea minuta var nonfermentans<220>
<221>CDS<222>(7)..(759)<400>25gaattc atg gct aaa act gtt tac ttc atc gca ggt gct tcc aga ggt 48Met Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly1 5 10atc ggt ctc gag gtt gct tcc cag ctg agt gca aac cca gac aat tat96Ile Gly Leu Glu Val Ala Ser Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr15 20 25 30gtt att gca tcc tat aga tct gaa aag tct gct tca gga ctt ttg gag 144Val Ile Ala Ser Tyr Arg Ser Glu Lys Ser Ala Ser Gly Leu Leu Glu35 40 45ctg gca aag aag gat aat gtc gac aca att gtg ttg gat att gca agc 192Leu Ala Lys Lys Asp Asn Val Asp Thr Ile Val Leu Asp Ile Ala Ser50 55 60cag gaa tcg att gat gct gtt cca gca cag att tcc aag ctg act gat 240Gln Glu Ser Ile Asp Ala Val Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp65 70 75gga atc gat gtt gcc ttg atc aac gct gga att gcc aac gct atg tgt 288Gly Ile Asp Val Ala Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Asn Ala Met Cys80 85 90ccg att ctc gaa tgt tct aga gag tcc tac act gat cac tgg aca acc 336Pro Ile Leu Glu Cys Ser Arg Glu Ser Tyr Thr Asp His Trp Thr Thr95 100 105 110aat gcc ttg ggt cca atc atg ctc tac caa gct att cat aag ttc atg 384Asn Ala Leu Gly Pro Ile Met Leu Tyr Gln Ala Ile His Lys Phe Met115 120 125ctc cag aga gag acc aga aaa gtg ttc ttt acc acg agt gct ggt ggt 432Leu Gln Arg Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Thr Thr Ser Ala Gly Gly130 135 140tcc att cag gct aag ata ccc gtg cct gtg agt ggt tac ggt atg tcc 480Ser Ile Gln Ala Lys Ile Pro Val Pro Val Ser Gly Tyr Gly Met Ser145 150 155aag gct gcg ctt aat tat gct gtg aga aaa ctt gct gac gag tgc tac 528Lys Ala Ala Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ala Asp Glu Cys Tyr160 165 170aag gac aac ttc act att gtg ttg ctg cat cct ggt ttt gtt aag acg 576Lys Asp Asn Phe Thr Ile Val Leu Leu His Pro Gly Phe Val Lys Thr175 180 185 190
gac atg ggt caa agc gcc att cag aag atg tca aat gga aat gct gag624Asp Met Gly Gln Ser Ala Ile Gln Lys Met Ser Asn Gly Asn Ala Glu195 200 205ctt ctt gct tac att gac tca atg act att gat gtt cct acc agt gct672Leu Leu Ala Tyr Ile Asp Ser Met Thr Ile Asp Val Pro Thr Ser Ala210 215 220ggc caa atc gtc ggt gcc att atg acc ttg gac aag cag agc agc ggt720Gly Gln Ile Val Gly Ala Ile Met Thr Leu Asp Lys Gln Ser Ser Gly225 230 235aga ttt atc aac gct gct gac cag ttt gac atg cca ttt tag taa taa768Arg Phe Ile Asn Ala Ala Asp Gln Phe Asp Met Pro Phe240 245 250gctt 77權(quán)利要求
1.包含下述(A)或(B)中任意一項(xiàng)的氨基酸序列的多肽(A)序列號(hào)1中記載的氨基酸序列；(B)具有羰基還原酶活性的多肽的氨基酸序列，該氨基酸序列是在序列號(hào)1的氨基酸序列中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、添加或取代的氨基酸序列。
2.包含下列(a)～(e)中任意一項(xiàng)的堿基序列的DNA(a)編碼由序列號(hào)1中記載的氨基酸序列組成的多肽的堿基序列；(b)編碼包含下述氨基酸序列、且具有羰基還原酶活性的多肽的堿基序列，所述氨基酸序列是在序列號(hào)1的氨基酸序列中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、添加或取代的氨基酸序列；(c)序列號(hào)2中記載的堿基序列；(d)編碼具有羰基還原酶活性的多肽的堿基序列，該堿基序列是在序列號(hào)2記載的堿基序列中有一個(gè)或多個(gè)堿基發(fā)生缺失、添加或取代的堿基序列；(e)編碼具有羰基還原酶活性的多肽的堿基序列，該堿基序列是在嚴(yán)緊條件下與序列號(hào)2中記載的堿基序列或其互補(bǔ)序列或它們的一部分雜交的堿基序列。
3.一種重組DNA，其通過將權(quán)利要求2所述的DNA重組到載體中而得到。
4.一種轉(zhuǎn)化體，其包含權(quán)利要求3所述的重組DNA。
5.一種轉(zhuǎn)化體，其通過將權(quán)利要求2所述的DNA重組到染色體DNA中而得到。
6.式(IV)所示化合物的制備方法，其特征在于，使權(quán)利要求4或權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞、該轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的培養(yǎng)物或該轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的處理物作用于選自式(I)所示化合物、式(II)所示化合物或式(III)所示化合物的含羰基化合物，使含羰基化合物進(jìn)行不對(duì)稱還原 (式中R表示氫原子、烷基或芳基)； (式中R與上述意思相同)； (式中R與上述意思相同)； (式中R與上述意思相同)。
7.權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，其中式(II)和(III)所示的化合物分別是下式(II’)和下式(III’)所示的光學(xué)活性體 (式中R與上述意思相同)； (式中R與上述意思相同)。
全文摘要
本發(fā)明提供Ogataea屬微生物來源的新型羰基還原酶和編碼該蛋白的DNA。用該羰基還原酶還原酮，可生產(chǎn)出光學(xué)活性醇，尤其是(E)－7－[2－環(huán)丙基－4－(4－氟苯基)－喹啉－3－基]－3，5－二羥基庚－6－烯酸酯類。本發(fā)明的羰基還原酶是活性和立體選擇性良好的酶。因此，本發(fā)明可提供光學(xué)活性醇類的制備方法，該物質(zhì)是作為醫(yī)藥、農(nóng)藥等中間材料而在產(chǎn)業(yè)上有用的化合物。
文檔編號(hào)C12P17/12GK1656225SQ03811460
公開日2005年8月17日 申請(qǐng)日期2003年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月19日
發(fā)明者平岡宏敏, 上田誠(chéng), 原磨理 申請(qǐng)人:三菱化學(xué)株式會(huì)社, 日產(chǎn)化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社