專利名稱：重組人骨形成蛋白4和7在甲醇酵母中的高效表達的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及應用甲醇酵母(Pichia pastoris)高效表達人骨形成蛋白技術，尤其涉及根據(jù)酵母偏愛密碼子對人骨形成蛋白成熟肽序列進行定點突變技術，屬于生物工程技術領域。
骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)是一類廣譜性的蛋白質(zhì)生長調(diào)節(jié)因子，其全長cDNA約為1.2Kb。在哺乳動物(包括人類)中已發(fā)現(xiàn)的BMPs家族成員至少有16種，它們對骨質(zhì)的生長、神經(jīng)細胞的再生、創(chuàng)口愈合以及神經(jīng)腫瘤的治療等均有明顯的促進作用。就骨質(zhì)生長發(fā)育而言，BMP-2(也稱之為BMP-2A)、BMP-4(也稱之為BMP-2B)及BMP-7具有明顯的促使細胞組織分化形成骨組織的作用，而且這三種BMPs同時具有明顯的促進成體骨組織再生的作用。因此BMPs在骨科臨床及相關的臨床學科上有著極為廣泛的應用前景。然而BMPs在骨組織中的含量只有百萬分之一。提取的步驟煩瑣，存在重復性差、產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本昂貴以及產(chǎn)品純度不高等缺點。因而不能滿足臨床科研和基礎研究的要求。
1988年至今，人BMP 1-13的cDNA序列均已得到克隆，這使得應用基因工程技術生產(chǎn)重組人BMPs成為可能(Proc.Natl.Acad.Sci.USA第87卷，第2220-2224頁，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA第87卷，第9843-9847頁，1990；J.Biol.Chem.第267卷，第25220-25227頁，1992；Mel.Reprod.Dev.第32卷，160-167頁，1992)。對人BMPs基因表達的研究，國外多用CHO、COS、HOS等真核細胞，其活生雖好，但生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量低、無法達到大規(guī)模生產(chǎn)要求。利用人BMP-7和鼠BMP-2的啟動子探測骨相關物質(zhì)的方法已申請專利(CN 1307643 A，WO 97/15305)，然而其獲得的只是小分子量有機化合物，而非重組BMPs。國內(nèi)也有相關研究，構(gòu)建了重組人BMP-2、-3部分或完整成熟肽cDNA片段的表達載體，利用大腸桿菌表達出了有誘導骨活性的人BMP-2、-3肽段(生物工程學報15卷3期，288-292，1999；CN1165189A；生物化學雜志10卷3期，318-324，1994)。大腸桿菌表達體系表達量雖高，但其背景雜蛋白多，純化麻煩，重要的是不能對真核生物蛋白質(zhì)進行翻譯后的修飾和加工，最終影響產(chǎn)物的生物活性。
甲醇酵母表達體系是最近發(fā)展迅速的一種外源蛋白表達系統(tǒng)，與以往的基因表達體系相比，它具有無可匹敵的高表達特性(1)適合高密度發(fā)酵培養(yǎng)。生產(chǎn)成本低，便于工業(yè)化生產(chǎn)；(2)能高效嚴格地調(diào)控外源蛋白的表達，表達的蛋白可分泌至胞外，且自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，利于純化。
統(tǒng)計學分析110個酵母基因使用密碼子的情況表明61個密碼子中有25個為偏愛密碼子，對偏愛密碼子的使用程度和基因表達水平呈正比。如在酵母大量表達的基因中編碼精氨酸的6個密碼子中AGA的使用頻率為86.6％，幾乎不使用CGA和CGG這兩個密碼子。目前利用甲醇酵母表達外源蛋白不乏報道和專利，如表達人血管內(nèi)皮細胞抑制素(CN 1305004A)，魚生長激素(CN 1207415A)及人白細胞介素11(CN 1288062A)等，但利用甲醇酵母高效表達人骨形成蛋白在國內(nèi)外尚屬首例。由于人BMPs是一類磷酸化的二聚體糖蛋白多肽，其磷酸和多糖結(jié)構(gòu)與其生理活性密切相關，因此本發(fā)明中可通過甲醇酵母表達體系對定點突變后的人骨形成蛋白成熟肽cDNA序列進行表達，并對表達蛋白進行結(jié)構(gòu)上的加工修飾，使其生物活性增強。另外修飾后的人骨形成蛋白具較低的糖基化程度，對人體也無明顯的抗原性，適于臨床治療用途。
本發(fā)明的目的在于提供甲醇酵母基因工程菌株GS115。該工程菌能夠分別高效表達人BMP-4、BMP-7及BMP-4-BMP-7異型二聚體，為大規(guī)模生產(chǎn)高純度重組人BMP-4、BMP-7及BMP-4-BMP-7異型二聚體以用于骨科及相關臨床治療奠定基礎。
本發(fā)明的另一目的在于提供了構(gòu)建能高效表達重組人BMP-4和BMP-7及BMP-4-BMP-7異型二聚體的甲醇酵母基因工程菌株GS115的方法。
本發(fā)明通過以下技術方案加以實現(xiàn)分別以含人BMP-4和人BMP-7 cDNA序列的質(zhì)粒pBluescript KS-BMP4和pBluescript KS-BMP7為模板，PCR擴增得到人BMP-4和人BMP-7成熟肽cDNA序列。分別克隆到甲醇酵母表達質(zhì)粒pPIC9K中，得到pPIC9K-BMP4和pPIC9K-BMP7。堿性溶菌小量制備法提取質(zhì)粒DNA，分別以pPIC9K-BMP4和pPIC9K-BMP7為模板，利用簡化的重疊PCR技術分別對人骨形成蛋白4和7成熟肽cDNA序列中精氨酸密碼子進行定點突變。其中人骨形成蛋白4和7的成熟肽cDNA序列長度分別為348bp和417bp。改造后的人BMP-4成熟肽cDNA序列特征為第22-24位、第49-51位由CGG突變?yōu)锳GA。人BMP-7成熟肽cDNA序列第66-68位、第400-402位的CGG突變?yōu)锳GA，第142-144位的CGA突變?yōu)锳GA。改造后的基因產(chǎn)物作為模板克隆到甲醇酵母表達質(zhì)粒pPIC9K中。堿性溶菌小量制備法提取質(zhì)粒DNA，內(nèi)切酶SacI酶切線性化重組甲醇酵母表達載體，并采用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到甲醇酵母GS115中。MD平板初篩His4+轉(zhuǎn)化子，然后用不同濃度的G418篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子。利用人BMP-4和人BMP-7成熟肽cDNA序列的上下游引物進行PCR反應復篩多拷貝轉(zhuǎn)化子，篩選能夠獲得正確擴增片段的真陽性轉(zhuǎn)化子，并在MM和MD平板上培養(yǎng)鑒定多拷貝轉(zhuǎn)化子的表型。挑取上述單菌落于BMGY和BMMY培養(yǎng)基中培養(yǎng)，22-30℃，250rpm搖床培養(yǎng)至OD600＝2-6，離心收集細胞，將細胞懸浮于BMMY培養(yǎng)液中，22-30℃振蕩培養(yǎng)，每24小時加入100％甲醇誘導重組蛋白表達，直至甲醇終濃度達到0.5-1.2％。離心收集上清液。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE及Western blot測定重組蛋白表達量，并驗證目的蛋白。本發(fā)明提供甲醇酵母基因工程菌株GS115，利用簡化的重疊PCR技術分別對人骨形成蛋白4和7成熟肽cDNA序列中精氨酸密碼子進行定點突變及體外重組的方法，制備重組人BMP-4、BMP-7及BMP-4-BMP-7異型二聚體，用于骨科及相關臨床治療。
基于上述敘述，本發(fā)明的顯著優(yōu)點是①首次構(gòu)建了高效表達重組人BMP-4、BMP-7及BMP-4-BMP-7異型二聚體的甲醇酵母基因工程菌株。
②自我設計引物，利用簡化的重疊PCR技術對人BMP-4、BMP-7成熟肽cDNA序列進行了定點突變，將其中的哺乳動物細胞使用的精氨酸密碼子全部改變?yōu)榻湍钙珢鄣木彼崦艽a子，使表達量提高了至少5倍，發(fā)酵液上清中重組蛋白含量可達到0.2mg/ml以上。
③構(gòu)建的高效表達重組人骨形成蛋白的甲醇酵母基因工程菌株，可生產(chǎn)重組人骨形成蛋白用于臨床骨缺損、骨折愈合、骨不連等方面的治療。所表達的重組人BMP-4-BMP-7異型二聚體的生理效應可為同型二聚體的10-20倍，提高了促進骨質(zhì)生長的作用。
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例僅是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對發(fā)明的限制。


圖1是本發(fā)明的人BMP-4成熟肽序列及定點突變的位點示意圖。
圖2是本發(fā)明的人BMP-7成熟肽序列及定點突變的位點示意圖。
圖1中，人骨形成蛋白4的成熟肽序列長度為348bp，改造后的人BMP-4成熟肽序列特征為第22-24位、第49-51位由CGG突變?yōu)锳GA。
圖2中，人骨形成蛋白7的成熟肽序列長度為417bp，改造后的人BMP-7成熟肽序列第66-68位、第400-402位的CGG突變?yōu)锳GA，第142-144位的CGA突變?yōu)锳GA。
實施例11、人骨形成蛋白成熟肽cDNA序列的亞克隆根據(jù)已知的人BMP-4和人BMP-7的cDNA序列，設計并合成引物如下人BMP-4 cDNA序列5’端引物5’-AGCCCTAAGCATCACTCACAG-3’3’端引物5’-TCAGCGGCACCCACATC-3’人BMP-7 cDNA序列5’端引物5’-TCCACGGGGAGCAAACAG-3’3’端引物5’-CTAGTGGCAGCCACAGGC-3’分別以含人BMP-4和人BMP-7cDNA序列的質(zhì)粒pBluescript KS BMP-4和pBluescript KS BMP-7為模板，PCR擴增得到348bp的人BMP-4的成熟肽cDNA序列和417bp的人BMP-7的成熟肽cDNA序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA膠回收試劑盒(Promega產(chǎn)品)進行純化后分別與經(jīng)SnaBI內(nèi)切酶消化的酵母表達質(zhì)粒pPIC9K連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10F’。酶切、PCR、測序分析篩選得到含正確的人BMP-4成熟肽cDNA序列的質(zhì)粒pPIC9K-BMP4和含正確的人BMP-7成熟肽cDNA序列的質(zhì)粒pPIC9K-BMP7。堿性溶菌小量制備法提取質(zhì)粒DNA。
2、利用簡化的重疊PCR技術進行定點突變，構(gòu)建含突變后人BMP成熟肽cDNA序列的甲醇酵母表達載體①.人BMP-4成熟肽cDNA序列的定點突變首先設計人BMP-4成熟肽cDNA序列5’端引物，其中載體引物A(5’-ATAATTGCGACTGGTTCC-3’)位于質(zhì)粒pPIC9K BamH1位點的上游，載體引物B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’)位于質(zhì)粒pPIC9K EcoIRI位點的下游。其余為突變位點引物，每對突變引物有部分序列重疊。
引物序列和退火溫度以載體引物A(5’-ATAATTGCGACTGGTTCC-3’)和B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’)擴增pPIC9K-BMP-4，PCR反應溫度條件95℃4min；94℃1min，53℃2min，72℃90sec(30個循環(huán))；72℃10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA膠回收試劑盒(Promega產(chǎn)品)進行純化。
第一步以上述PCR產(chǎn)物為模板，分別用三對引物進行PCR擴增反應引物A(5’-ATAATTGCGACTGGTTCC-3’)和突變位點1的反鏈引物(antisense mutagenicprimer)C(5’-GCTCTCTGTGAGTGATGC-3’)，引物B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’)和突變位點1正鏈引物(sense mutagenic primer)D(5’-CACAGAGAGCAGGAAG-3’)，引物B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’)與突變位點2正鏈引物F(5’-CAGACGCCACTCGT-3’)。得到三個PCR產(chǎn)物片斷，分別用符號AC(AC為引物A與引物C擴增的產(chǎn)物)、BD(BD為引物B與引物D擴增的產(chǎn)物)和BF(BF為引物B與引物F擴增的產(chǎn)物)表示，經(jīng)DNA膠回收試劑盒(Promega產(chǎn)品)進行純化。
第二步重疊PCR反應先使產(chǎn)物片斷AC與BD退火，形成互補。反應溫度條件95℃4min；94℃1min，50℃2min，72℃90sec(5個循環(huán))。然后加入引物A和突變位點2的反鏈引物E(5’-GGCGTCTGCAGTTCTTAT-3’)，使終濃度達到20pM，繼續(xù)進行PCR擴增。反應溫度條件94℃1min，52℃2min，72℃90sec(25個循環(huán))；72℃10min。擴增產(chǎn)物AE(AE為引物A與引物E擴增的產(chǎn)物)經(jīng)DNA膠回收試劑盒(Promega產(chǎn)品)進行純化。產(chǎn)物AE含兩個突變位點。
第三步重疊PCR反應使第二步的產(chǎn)物AE與第一步的產(chǎn)物BD退火，形成互補。反應溫度條件95℃4min；94℃1min，50℃2min，72℃90sec(5個循環(huán))。然后加入引物A和引物B，使終濃度達到20pM，繼續(xù)進行PCR擴增。反應溫度條件94℃1min，52℃2min，72℃90sec(25個循環(huán))；72℃10min。擴增產(chǎn)物AB(AB為引物A與引物B擴增的產(chǎn)物)經(jīng)DNA膠回收試劑盒(Promega產(chǎn)品)進行純化。終產(chǎn)物AB為含兩個突變位點的人BMP-4成熟肽cDNA序列。
②.人BMP-7成熟肽cDNA序列的定點突變本發(fā)明為提高人BMP-7在酵母中的表達量，在分子水平上對人BMP-7成熟肽cDNA序列進行改造，第66-68位、第400-402位的CGG突變?yōu)锳GA，第142-144位的CGA突變?yōu)锳GA。
首先設計引物，其中載體引物A(5’-ATAATTGCGACTGGTTCC-3’)位于質(zhì)粒pPIC9K BamH1位點的上游，載體引物B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’)位于質(zhì)粒pPIC9K EcoIRI位點的下游。其余為突變位點引物。
引物序列及退火溫度以載體引物A(5’-ATAATTGCGACTGGTTCC-3’)和B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’)擴增pPIC9K-BMP-7，反應溫度條件95℃4min；94℃1min，53℃2min，72℃90sec(30個循環(huán))；72℃10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA膠回收試劑盒(Promega產(chǎn)品)進行純化。
第一步以上述PCR產(chǎn)物為模板，分別用四對引物進行PCR擴增反應引物A(5’-ATAATTGCGACTGGTTCC-3’)和突變位點1的反鏈引物I(5’-TTGGCCATTCTCAGGG-3’)，引物B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’)和突變位點1的正鏈引物J(5’-GCCCTGAGAATGGCC-3’)，引物B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’)與突變位點2正鏈引物L(5’-CTTCAGAGACCT GGGCT-3’)，引物B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’’)與突變位點3正鏈引物N(5’-GGTGGTCAGAGCCTGTG-3’)。得到的四個PCR產(chǎn)物片斷，分別用符號AI(AI為引物A與引物I擴增的產(chǎn)物)、BJ(BJ為引物B與引物J擴增的產(chǎn)物)、BL(BL為引物B與引物L擴增的產(chǎn)物)和BN(BN為引物B與引物N擴增的產(chǎn)物)表示。經(jīng)DNA膠回收試劑盒(Promega產(chǎn)品)進行純化。
第二步重疊PCR反應先使產(chǎn)物AI與BJ退火，形成互補。反應溫度條件95℃4min；94℃1min，50℃2min，72℃90sec(5個循環(huán))。然后加入引物A和突變位點2的反鏈引物K(5’-AGCCCAGGTCTCTGAAG-3’)，使終濃度達到20pM，繼續(xù)進行PCR擴增。反應溫度條件94℃1min，52℃2min，72℃90sec(25個循環(huán))；72℃10min。擴增產(chǎn)物AK(AK為引物A與引物K擴增的產(chǎn)物)經(jīng)DNA膠回收試劑盒(Promega產(chǎn)品)進行純化。產(chǎn)物AK含兩個突變位點。
第三步重疊PCR反應使第二步的產(chǎn)物AK與第一步的產(chǎn)物BL退火，形成互補。反應溫度條件95℃4min；94℃1min，50℃2min，72℃90sec(5個循環(huán))。然后加入引物A和突變位點3的反鏈引物M(5’-CAGGCTCTGACCACCAT-3’)，使終濃度達到20pM，繼續(xù)進行PCR擴增。反應溫度條件94℃1min，52℃2min，72℃90sec(25個循環(huán))；72℃10min。擴增產(chǎn)物AM經(jīng)DNA膠回收試劑盒(Promega產(chǎn)品)進行純化。產(chǎn)物AM(AM為引物A與引物M擴增的產(chǎn)物)含三個突變位點。
第四步重疊PCR反應使第三步的產(chǎn)物AM與第一步的產(chǎn)物BN退火，形成互補。反應溫度條件95℃4min；94℃1min，50℃2min，72℃90sec(5個循環(huán))。然后加入引物A和引物B，使終濃度達到20pM，繼續(xù)進行PCR擴增。反應溫度條件94℃1min，52℃2min，72℃90sec(25個循環(huán))；72℃10min。擴增產(chǎn)物AB經(jīng)DNA膠回收試劑盒(Promega產(chǎn)品)進行純化。終產(chǎn)物AB為含三個突變位點的人BMP-7成熟肽序列。
3、突變后的人BMPs成熟肽序列克隆到甲醇酵母表達載體中以EcoRI和BamHI過夜消化上述1和2中獲得的已突變過的成熟肽cDNA片段以及質(zhì)粒pPIC9K，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小無誤，將片段純化回收，將線性質(zhì)粒和已突變的成熟肽cDNA片段進行連接反應，形成帶有突變位點的重組甲醇酵母表達載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10F’，酶切、PCR、測序分析確定得到的重組表達載體中的人BMP-4成熟肽cDNA片段和人BMP-7成熟肽cDNA片段均含有特定的突變位點。堿性溶菌小量制備法提取質(zhì)粒DNA。
4、構(gòu)建及篩選重組人BMP甲醇酵母菌株SacI酶消化處理上述的重組甲醇酵母表達載體使其線性化，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測小部分消化片段，檢驗是否消化完全。用25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶異戊醇抽提消化產(chǎn)物并用乙醇沉淀消化的DNA，將DNA溶解于TE中，-20℃保存?zhèn)滢D(zhuǎn)化用。電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化甲醇酵母菌株GS115(His4-)，MD平板初篩His4+轉(zhuǎn)化子，再從中篩選多拷貝整合轉(zhuǎn)化子105個His+細胞涂布于G418濃度分別為0.5，0.75，1.0，1.5，2.0，3.0和4.0mg/ml的YPD平板。在3.0mg/mlG418的平板上篩選到4個克隆，4.0mg/mlG418的平板上篩選到3個克隆。挑取4.0mg/mlG418耐受菌，純化后用15％甘油冷凍保存。應用PCR方法簡單直接的篩選甲醇酵母克隆，先取10μl酵母液于1.5ml離心管，加5μl的5U/μl溶菌酶，35℃孵育10min，-80℃冰凍樣品10min，建立50μl的PCR體系，以模板即上述酵母液5μ1，10×buffer 5μl；25mM Mg2+，5μl；25mMdNTP，1μl；Taq DNA聚合酶2.5U；5’AOX1引物和3’AOX1引物(10mM)，各1μl；加水至50μl。1％瓊脂糖凝膠電泳分析證明轉(zhuǎn)化子基因組中整合有重組甲醇酵母表達質(zhì)粒中的目的基因片段。將等量多拷貝轉(zhuǎn)化子分別接種于MM和MD平板上，篩選表型是Mut+的轉(zhuǎn)化子。
5、搖瓶中甲醇誘導重組甲醇酵母菌株挑取G418濃度為4.0mg/mlYDP板上的單克隆，接種于內(nèi)含10mlBMGY培養(yǎng)液的50ml離心管中，28-30℃，250rpm搖床培養(yǎng)至OD600＝2-6(大約16小時)，4℃1500g離心9min，去上清，加入10mlBMMY培養(yǎng)液重懸后繼續(xù)培養(yǎng)8小時，4℃1500g離心9min，去上清，再加入10mlBMMY培養(yǎng)液重懸后繼續(xù)培養(yǎng)，每24小時加入100％甲醇誘導重組蛋白表達，直至甲醇終濃度達到0.5％。分別在誘導后0小時、24小時、48小時、72小時、96小時、120小時和144小時取1ml表達上清液，分析其表達水平，確定最佳收獲時間為96小時。取少量上清用15％SDS-PAGE電泳分析，同時用鼠抗人BMP-4抗體、鼠抗人BMP-7抗體以及羊抗鼠IgG-AP對上清液進行Western雜交。結(jié)果表明上清中表達蛋白為人BMP-4和人BMP-7。篩選所得的含突變基因的重組酵母菌株，其表達重組人BMP-4和人BMP-7比未突變基因的菌株分別提高了7倍和10倍，上清液中重組蛋白含量達到0.2mg/ml以上。
權利要求
1.一種高效表達重組人骨形成蛋白的基因工程甲醇酵母菌株，其特征在于在甲醇酵母Pichia pastoris的基因組DNA中整合了人骨形成蛋白成熟肽序列，并能在胞外高效表達重組人骨形成蛋白。
2.根據(jù)權利要求1所述的基因工程甲醇酵母菌株，其特征在于表達的人骨形成蛋可以是人骨形成蛋白4、人骨形成蛋白7及人骨形成蛋白4和7異型二聚體。
3.根據(jù)權利要求1所述的基因工程甲醇酵母菌株，其特征在于甲醇酵母菌株為GS115/pPIC9K-BMP4，GS115/pPIC9K-BMP7和GS115/pPIC9K-BMP4-BMP7。
4.一種高效表達人骨形成蛋白基因工程甲醇酵母菌株的構(gòu)建方法，其特征在于構(gòu)建方法包括以下步驟(1)將已克隆到質(zhì)粒pBluescript KS中的人骨形成蛋白基因亞克隆到表達載體中；(2)利用簡化的重疊PCR方法對表達載體中的人骨形成蛋白成熟肽序列進行定點突變，以酵母偏愛的精氨酸密碼子取代原來的精氨酸密碼子，構(gòu)建重組人骨形成蛋白表達載體；(3)重組人骨形成蛋白甲醇酵母菌株的構(gòu)建和篩選；(4)重組人骨形成蛋白甲醇酵母菌株的培養(yǎng)及蛋白的誘導表達、產(chǎn)物驗證。
5.根據(jù)權利要求4所述的高效表達人骨形成蛋白的基因工程甲醇酵母菌株的構(gòu)建方法，其特征在于其中所說的酵母表達載體為甲醇酵母的分泌型表達載體pPIC9K。
6.根據(jù)權利要求4所述的高效表達人骨形成蛋白的基因工程甲醇酵母菌株的構(gòu)建方法，其特征在于所述的經(jīng)精氨酸密碼子進行定點突變后，人骨形成蛋白4和7的突變株成熟肽序列長度分別為348bp和417bp。
7.根據(jù)權利要求6所述的高效表達人骨形成蛋白的基因工程甲醇酵母菌株的構(gòu)建方法，其特征在于所述突變株重組序列特征為人骨形成蛋白4成熟肽序列第22-24位、第49-51位由CGG突變?yōu)锳GA，人骨形成蛋白7成熟肽序列第66-68位、第400-402位的CGG突變?yōu)锳GA，第142-144位的CGA突變?yōu)锳GA。
8.根據(jù)權利要求4所述的一種高效表達人骨形成蛋白的基因工程甲醇酵母菌株的構(gòu)建方法，其特征在于所說的重組人骨形成蛋白甲醇酵母菌株的構(gòu)建及篩選包括以下步驟(1)重組酵母表達載體用內(nèi)切酶SacI進行酶切線生化；(2)重組酵母表達載體電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到甲醇酵母中；(3)MD平板初篩轉(zhuǎn)化子，并用G418篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子；(4)PCR方法復篩多拷貝轉(zhuǎn)化子；(5)MM和MD平板上鑒定多拷貝轉(zhuǎn)化子的表型。
9.根據(jù)權利要求4所述的一種高效表達人骨形成蛋白的基因工程甲醇酵母菌株的構(gòu)建方法，其特征在于其中所說的重組人骨形成蛋白甲醇酵母菌株為構(gòu)瓶過夜培養(yǎng)，至OD600＝2-6，離心收集菌種，每天加入甲醇誘導蛋白，直至甲醇終濃度達到0.5％。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE及Western blot測定蛋白表達量，并驗證目的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及應用甲醇酵母高效表達人骨形成蛋白技術，尤其涉及根據(jù)酵母偏愛密碼子對人骨形成蛋白成熟肽序列進行定點突變技術。其特征是用含人BMP4和7cDNA序列的質(zhì)粒pBluescript KS－BMP4和pBluescript KS－BMP7為模板，PCR擴增得到人BMP4和7成熟肽cDNA序列。利用簡化的重疊PCR技術分別對人BMP4和7成熟肽cDNA序列中精氨酸密碼子進行定點突變。突變后的序列作為模板克隆到甲醇酵母表達質(zhì)粒pPIC9K中并轉(zhuǎn)化到甲醇酵母GS115內(nèi)。通過篩選并獲得陽性克隆。構(gòu)建好的工程菌在BMGY和BMMY培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)甲醇誘導后，高效表達重組人骨形成蛋白。本發(fā)明方法可高效表達分泌型重組人BMPs。通過定點突變，表達量提高了至少5倍，達到0.2mg/ml以上。重組人BMPs可用于骨科及相關臨床治療。
文檔編號C12N15/81GK1513979SQ0313658
公開日2004年7月21日 申請日期2003年5月20日 優(yōu)先權日2003年5月20日
發(fā)明者張彥定, 陳一平, 黃義德 申請人:福建師范大學