專利名稱：一種用于多靶序列pcr檢測(cè)的公共引物及其對(duì)多靶核酸序列進(jìn)行pcr擴(kuò)增的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種采用公共引物進(jìn)行多種靶核酸的PCR擴(kuò)增技術(shù)，主要用于在核酸水平上對(duì)多靶核酸的檢測(cè)。
(2)背景技術(shù)核酸擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用的最廣泛的是PCR技術(shù)，它可在數(shù)小時(shí)內(nèi)將及微量的目的核酸片段擴(kuò)增至幾百萬倍。該技術(shù)自發(fā)明以來已廣泛應(yīng)用于生物和醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。其原理是雙鏈DNA分子經(jīng)高溫變性后成為兩條單鏈DNA，單鏈DNA(模板)在互補(bǔ)寡核苷酸片段(引物)的引導(dǎo)下，可以利用DNA聚合酶(Taq酶)按5’-3’方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA(PCR產(chǎn)物)。PCR反應(yīng)應(yīng)用以上的基本過程，分別在待復(fù)制的已知序列(靶序列)DNA分子兩端各設(shè)計(jì)一條引物，其中在DNA 5’端的引物對(duì)應(yīng)于正鏈DNA單鏈的序列，3’端的引物對(duì)應(yīng)于負(fù)鏈DNA單鏈的序列。在含有引物、Taq酶、DNA合成底物dNTPs(dATP、dCTP、dGTP、dTTP4種脫氧核糖核苷酸等摩爾數(shù)混合物)的緩沖液中，通過高溫變性，使雙鏈DNA變成單鏈DNA模板，降低溫度復(fù)性，使引物與模板DNA配對(duì)，利用DNA聚合酶便可合成產(chǎn)物DNA。在同一反應(yīng)體系中可重復(fù)高溫變性、低溫復(fù)性和DNA合成這一循環(huán)，使產(chǎn)物DNA重復(fù)合成，并且在重復(fù)過程中，前一循環(huán)的產(chǎn)物DNA可作為后一循環(huán)的模板DNA參與DNA的合成，使產(chǎn)物DNA的量按2n方式擴(kuò)增，所以這一反應(yīng)稱為聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)。
常用簡易的PCR產(chǎn)物檢測(cè)方法有核酸電泳、PCR-ELISA、實(shí)時(shí)熒光PCR等。核酸電泳、PCR-ELISA等由于操作煩瑣，需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行后處理，很容易造成PCR產(chǎn)物的污染，導(dǎo)致PCR檢測(cè)結(jié)果假陽性，嚴(yán)重制約PCR檢測(cè)在臨床上的應(yīng)用。實(shí)時(shí)熒光PCR是近幾年發(fā)展起來的新技術(shù)，具有許多優(yōu)點(diǎn)，其采用的閉管檢測(cè)在臨床診斷中的優(yōu)勢(shì)尤其明顯，消除了傳統(tǒng)PCR等核酸檢測(cè)技術(shù)的擴(kuò)增產(chǎn)物污染問題。其原理是在PCR反應(yīng)過程中利用熒光染料在光刺激下釋放的熒光能量的變化直接反映出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，熒光信號(hào)變量與擴(kuò)增產(chǎn)物變量成正比，并通過足夠靈敏的自動(dòng)化儀器實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光的采集和分析以達(dá)到對(duì)原始模板的定量。熒光PCR的原理不同，一般采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理使熒光信號(hào)發(fā)生變化。熒光PCR主要有以下幾類SYBR Green、分子信標(biāo)(Molecular Beacons)、TaqMan探針、ScorpionsTM探針和AmplifluorTM系統(tǒng)等。
對(duì)于多靶核酸序列的檢測(cè)，需要設(shè)計(jì)多對(duì)引物和熒光探針，成本比較高。
(3)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的旨在提供一種設(shè)計(jì)簡單，成本低，可用于多靶序列實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的公共引物及其對(duì)多靶核酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法。
所說的用于多靶序列PCR檢測(cè)的公共引物為一對(duì)(兩條)寡核苷酸片斷，公共引物的堿基序列及其數(shù)目不限，包括熒光標(biāo)記型和非標(biāo)記型兩種。熒光標(biāo)記型公共引物是由兩條堿基互補(bǔ)配對(duì)寡核苷酸片斷組成，其中一條核酸鏈標(biāo)記熒光供體，另一條核酸鏈標(biāo)記熒光受體。熒光標(biāo)記型公共引物兩條鏈在穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)時(shí)，熒光受體靠近熒光分子，熒光分子的熒光被淬滅，此時(shí)公共引物不發(fā)熒光。當(dāng)在酸、堿、熱等變性條件下公共引物兩條鏈互相分開，熒光受體與熒光分子分開，熒光分子發(fā)出熒光。當(dāng)恢復(fù)到溫和條件時(shí)，兩條鏈復(fù)性為雙鏈狀態(tài)，熒光受體靠近熒光分子，熒光分子的熒光被淬滅。
非標(biāo)記型公共引物的兩條寡核苷酸片斷不需要堿基互補(bǔ)配對(duì)。非標(biāo)記型公共引物設(shè)計(jì)必須符合以下原則1)公共引物的堿基序列應(yīng)選擇與待擴(kuò)增模板序列同源性最小的序列，引物的3’端與模板互補(bǔ)的堿基數(shù)不能超過3個(gè)；2)公共引物的堿基序列及其數(shù)目的設(shè)計(jì)應(yīng)遵守引物設(shè)計(jì)的常用規(guī)則，如堿基數(shù)目不能大于50個(gè)或小于10個(gè)，堿基(G+C)的含量不能太高，退火溫度不能太低或太高、引物內(nèi)或引物間不能形成有利于產(chǎn)生引物二聚體的結(jié)構(gòu)等。
熒光標(biāo)記型公共引物設(shè)計(jì)在遵循非標(biāo)記型設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上還必須符合以下條件1)公共引物采用兩條堿基互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸片斷，在公共引物的一條寡核苷酸鏈上標(biāo)記熒光供體，另一條寡核苷酸鏈上標(biāo)記熒光受體。熒光供體和熒光受體間的距離應(yīng)小于120埃。
2)公共引物兩條鏈間的互補(bǔ)配對(duì)的堿基數(shù)應(yīng)滿足兩條寡核酸鏈復(fù)性時(shí)熒光供體與其受體能產(chǎn)生有實(shí)用價(jià)值的熒光淬滅效果。
利用熒光標(biāo)記型公共引物進(jìn)行多靶序列PCR檢測(cè)方法如下1)根據(jù)熒光標(biāo)記型公共引物設(shè)計(jì)的規(guī)則設(shè)計(jì)公共引物。
2)特異引物的設(shè)計(jì)特異引物由與公共引物序列相同的公共引物部分和與待擴(kuò)增靶序列互補(bǔ)的靶引物部分組成。靶引物位于特異引物的3’端，采用常規(guī)PCR的引物設(shè)計(jì)方法，使堿基序列與所需要的靶序列互補(bǔ)。公共引物部分位于特異引物部分的5’端，與靶引物連接，構(gòu)成同一條寡核苷酸鏈，堿基序列與公共引物相同。
3)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)在常用的PCR反應(yīng)混合體系(PCR緩沖液、Taq酶、dNTP)中，加入熒光公共引物、特異引物、待測(cè)樣品。進(jìn)行復(fù)性、延伸、熱變性三步熱循環(huán)反應(yīng)，在第一個(gè)循環(huán)的熱變性階段，公共引物、特異引物及模板均發(fā)生變性，公共引物中的熒光分子和其受體分離發(fā)出熒光。在復(fù)性階段，由于這時(shí)的反應(yīng)體系中沒有與公共引物序列同源的模板，公共引物兩條鏈發(fā)生復(fù)性，熒光分子靠近其受體，不發(fā)出熒光。特異引物中的靶引物分別和模板中對(duì)應(yīng)的靶序列復(fù)性，Taq酶以它作為擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)公共引物序列信息被導(dǎo)入PCR產(chǎn)物。第二個(gè)PCR反應(yīng)與第一個(gè)PCR反應(yīng)的情況類似，公共引物兩條鏈的序列信息都被導(dǎo)入到同一條PCR產(chǎn)物中。在第三個(gè)循環(huán)的復(fù)性階段，反應(yīng)體系中PCR產(chǎn)物兩端已含公共引物同源序列，公共引物與PCR產(chǎn)物復(fù)性，Taq酶以公共引物作為擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這時(shí)公共引物兩條鏈被分離。熒光分子遠(yuǎn)離熒光受體，發(fā)出熒光。在隨后的反應(yīng)中，通過檢測(cè)復(fù)性階段PCR反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度可知反應(yīng)體系中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量。
利用熒光標(biāo)記型公共引物進(jìn)行多靶序列PCR檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)1、熒光公共引物設(shè)計(jì)簡單，引物序列設(shè)計(jì)不依賴靶序列，可以根據(jù)需要設(shè)計(jì)出能達(dá)到最佳熒光效果的引物。
2、成本低，由于熒光公共引物在靶序列檢測(cè)時(shí)通用，可以做到制備一對(duì)公共引物能對(duì)多個(gè)靶序列進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)。
3、能與常用的熒光PCR檢測(cè)技術(shù)兼容，可在同一反應(yīng)體系中實(shí)現(xiàn)多種檢測(cè)技術(shù)并用，增加檢測(cè)準(zhǔn)確度。
利用非標(biāo)記型公共引物進(jìn)行多靶序列PCR檢測(cè)方法如下1)根據(jù)非標(biāo)記型公共引物設(shè)計(jì)的規(guī)則設(shè)計(jì)公共引物。
2)特異引物的設(shè)計(jì)特異引物由與公共引物序列相同的公共引物部分和與待擴(kuò)增靶序列互補(bǔ)的靶引物部分組成。靶引物位于特異引物的3’端，采用常規(guī)PCR的引物設(shè)計(jì)方法，使堿基序列與所需要的靶序列互補(bǔ)。公共引物部分位于特異引物部分的5’端，與靶引物連接，構(gòu)成同一條寡核苷酸鏈，堿基序列與公共引物相同。
3)PCR檢測(cè)在常用的PCR反應(yīng)混合體系(PCR緩沖液、Taq酶、dNTP)中，加入公共引物、特異引物、待測(cè)樣品。進(jìn)行復(fù)性、延伸、熱變性三步熱循環(huán)反應(yīng)，在第一個(gè)循環(huán)的熱變性階段，公共引物、特異引物及模板均發(fā)生變性。在退火階段，由于這時(shí)的反應(yīng)體系中沒有與公共引物序列同源的模板，公共引物不引起PCR擴(kuò)增，而靶引物可和模板中的靶序列復(fù)性，Taq酶以它作為擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，公共引物序列信息被導(dǎo)入PCR產(chǎn)物。第二個(gè)PCR反應(yīng)與第一個(gè)PCR反應(yīng)的情況類似，公共引物兩條鏈的序列信息都被導(dǎo)入到同一條PCR產(chǎn)物中。在第三個(gè)循環(huán)的退火階段，反應(yīng)體系中PCR產(chǎn)物已含公共引物同源序列，公共引物的兩條寡核苷酸鏈分別與PCR產(chǎn)物復(fù)性，Taq酶以公共引物作為擴(kuò)增引物，以含有公共引物序列信息的PCR產(chǎn)物為靶序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
4)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)在熒光PCR檢測(cè)上的應(yīng)用，可采用一種熒光嵌入劑，它能嵌入雙鏈DNA發(fā)出特定波長的熒光，常用的熒光嵌入劑是SYBR Green I。在常規(guī)PCR檢測(cè)上的應(yīng)用，可采用電泳、PCR-ELISA等常規(guī)的PCR檢測(cè)方法。
利用非標(biāo)記型公共引物進(jìn)行多靶序列PCR檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)1、公共引物設(shè)計(jì)簡單，引物序列設(shè)計(jì)不依賴靶序列，可以根據(jù)需要設(shè)計(jì)出能達(dá)到最少引物二聚體的引物。
2、成本低，可以做到制備一對(duì)公共引物能對(duì)多個(gè)靶序列進(jìn)行PCR檢測(cè)。
3、能與常用的熒光PCR檢測(cè)技術(shù)兼容，可在同一反應(yīng)體系中實(shí)現(xiàn)多種檢測(cè)技術(shù)并用，增加檢測(cè)準(zhǔn)確度。
(4)


圖1為公共引物結(jié)構(gòu)示意圖。其中1代表公共引物第1條寡核苷酸鏈，2代表公共引物第2條寡核苷酸鏈。
圖2為特異引物結(jié)構(gòu)示意圖。其中1代表特異引物第1條寡核苷酸鏈上的靶引物序列部分與對(duì)應(yīng)的靶序列同源；2代表特異引物第1條寡核苷酸鏈上的公共引物序列部分與公共引物第1條寡核苷酸鏈序列同源；3代表特異引物第2條寡核苷酸鏈上的靶引物序列部分與對(duì)應(yīng)的靶序列同源；4代表特異引物第2條寡核苷酸鏈上的公共引物序列部分與公共引物第2條寡核苷酸鏈序列同源。
圖3為熒光公共引物結(jié)果示意圖。其中1代表熒光公共引物第1條寡核苷酸鏈；2代表標(biāo)記在第1條鏈上的熒光分子；3代表熒光公共引物第2條寡核苷酸鏈(與第1條寡核苷酸鏈互補(bǔ)配對(duì))；4代表標(biāo)記在第2條寡核苷酸鏈上的熒光受體；5代表公共引物兩條鏈發(fā)生復(fù)性后熒光分子的熒光被淬滅。
圖4為熒光公共引物實(shí)時(shí)熒光PCR多靶序列擴(kuò)增原理圖。
圖5為熒光公共引物實(shí)時(shí)熒光PCR單靶序列擴(kuò)增原理圖。
圖6為非標(biāo)記公共引物多靶序列PCR擴(kuò)增原理圖。
圖7為人檸檬酸脫氫酶實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)圖。
圖8為PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖。其中1代表陰性對(duì)照；2代表多靶序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖，相應(yīng)的片段大小分別為230bp、345bp、564bp；3代表人檸檬酸脫氫酶基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖，相應(yīng)的片段大小為230bp；4代表人CAPN6基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖，相應(yīng)的片段大小為345bp；5代表魚生長激素基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖，相應(yīng)的片段大小為564bp。
圖9為魚生長激素實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)圖。
圖10為魚生長激素實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)定量曲線圖。
圖11為熒光公共引物多靶序列(人檸檬酸脫氫酶基因、人CAPN6基因、魚生長激素基因)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)圖。
(5)具體實(shí)施方式
如圖1所示，所說的用于多靶序列PCR檢測(cè)的公共引物為一對(duì)(兩條)寡核苷酸片斷，公共引物的堿基序列及其數(shù)目不限，包括熒光標(biāo)記型和非標(biāo)記型兩種。熒光標(biāo)記型公共引物是由兩條堿基互補(bǔ)配對(duì)寡核苷酸片斷組成，其中一條核酸鏈標(biāo)記熒光供體，另一條核酸鏈標(biāo)記熒光受體。如圖3所示，熒光標(biāo)記型公共引物兩條鏈在穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)時(shí)，熒光受體靠近熒光分子，熒光分子的熒光被淬滅，此時(shí)公共引物不發(fā)熒光。當(dāng)在酸、堿、熱等變性條件下公共引物兩條鏈互相分開，熒光受體與熒光分子分開，熒光分子發(fā)出熒光。當(dāng)恢復(fù)到溫和條件時(shí)，兩條鏈復(fù)性為雙鏈狀態(tài)，熒光受體靠近熒光分子，熒光分子的熒光被淬滅。
利用熒光標(biāo)記型公共引物進(jìn)行多靶序列PCR檢測(cè)在特異引物的設(shè)計(jì)中特異引物由與公共引物序列相同的公共引物部分和與待擴(kuò)增靶序列互補(bǔ)的靶引物部分組成。靶引物位于特異引物的3’端，采用常規(guī)PCR的引物設(shè)計(jì)方法，使堿基序列與所需要的靶序列互補(bǔ)。公共引物部分位于特異引物部分的5’端，與靶引物連接，構(gòu)成同一條寡核苷酸鏈，堿基序列與公共引物相同，參見圖2，在多靶序列PCR檢測(cè)體系中，同一個(gè)體系需要擴(kuò)增2個(gè)以上靶序列，就需要設(shè)計(jì)多對(duì)特異引物，其中特異引物中的靶引物部分應(yīng)分別設(shè)計(jì)成與所要擴(kuò)增的靶序列互補(bǔ)，公共引物部分的序列與公共引物相同。
實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)過程在常用的PCR反應(yīng)混合體系(PCR緩沖液、Taq酶、dNTP)中，加入熒光公共引物、特異引物、待測(cè)樣品。進(jìn)行復(fù)性、延伸、熱變性三步熱循環(huán)反應(yīng)，在第一個(gè)循環(huán)的熱變性階段，公共引物、特異引物及模板均發(fā)生變性，公共引物中的熒光分子和其受體分離發(fā)出熒光。在復(fù)性階段，由于這時(shí)的反應(yīng)體系中沒有與公共引物序列同源的模板，公共引物兩條鏈發(fā)生復(fù)性，熒光分子靠近其受體，不發(fā)出熒光。特異引物中的靶引物分別和模板中對(duì)應(yīng)的靶序列復(fù)性，Taq酶以它作為擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)公共引物序列信息被導(dǎo)入PCR產(chǎn)物。第二個(gè)PCR反應(yīng)與第一個(gè)PCR反應(yīng)的情況類似，公共引物兩條鏈的序列信息都被導(dǎo)入到同一條PCR產(chǎn)物中。在第三個(gè)循環(huán)的復(fù)性階段，反應(yīng)體系中PCR產(chǎn)物兩端已含公共引物同源序列，公共引物與PCR產(chǎn)物復(fù)性，Taq酶以公共引物作為擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這時(shí)公共引物兩條鏈被分離。熒光分子遠(yuǎn)離熒光受體，發(fā)出熒光。在隨后的反應(yīng)中，通過檢測(cè)復(fù)性階段PCR反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度可知反應(yīng)體系中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量，參見圖4，其中，A為PCR反應(yīng)前，B為以特異引物為擴(kuò)增引物，C為以公共引物為擴(kuò)增引物，A1為靶序列1，A2為靶序列2，A3為熒光公共引物，A4為特異引物1，A5為特異引物2，A11，A21分別為靶序列1和靶序列2的PCR擴(kuò)增，B1為第1個(gè)PCR反應(yīng)，B2為第2個(gè)PCR反應(yīng)，C1為第3個(gè)PCR反應(yīng)(發(fā)出熒光)，C2為第4個(gè)PCR反應(yīng)(發(fā)出熒光)。
除了可利用熒光標(biāo)記型公共引物進(jìn)行多靶序列的PCR檢測(cè)外，也可用它對(duì)單靶序列進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，其過程和原理與多靶序列PCR檢測(cè)相同。參見圖5，其中，A為PCR反應(yīng)前，B為以特異引物為擴(kuò)增引物，C為以公共引物為擴(kuò)增引物，A0為靶序列，A3為熒光公共引物，A4為特異引物，B1為第1個(gè)PCR反應(yīng)，B2為第2個(gè)PCR反應(yīng)，C1為第3個(gè)PCR反應(yīng)(發(fā)出熒光)，C2為第4個(gè)PCR反應(yīng)(發(fā)出熒光)。
公共引物和特異引物的設(shè)計(jì)與熒光標(biāo)記型相同。
在常用的PCR反應(yīng)混合體系(PCR緩沖液、Taq酶、dNTP)中，加入公共引物、特異引物、待測(cè)樣品。進(jìn)行復(fù)性、延伸、熱變性三步熱循環(huán)反應(yīng)，在第一個(gè)循環(huán)的熱變性階段，公共引物、特異引物及模板均發(fā)生變性。在退火階段，由于這時(shí)的反應(yīng)體系中沒有與公共引物序列同源的模板，公共引物不引起PCR擴(kuò)增，而靶引物可和模板中的靶序列復(fù)性，Taq酶以它作為擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，公共引物序列信息被導(dǎo)入PCR產(chǎn)物。第二個(gè)PCR反應(yīng)與第一個(gè)PCR反應(yīng)的情況類似，公共引物兩條鏈的序列信息都被導(dǎo)入到同一條PCR產(chǎn)物中。在第三個(gè)循環(huán)的退火階段，反應(yīng)體系中PCR產(chǎn)物已含公共引物同源序列，公共引物的兩條寡核苷酸鏈分別與PCR產(chǎn)物復(fù)性，Taq酶以公共引物作為擴(kuò)增引物，以含有公共引物序列信息的PCR產(chǎn)物為靶序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。參見圖6，其中A為PCR反應(yīng)前，B為以特異引物為擴(kuò)增引物，C為以公共引物為擴(kuò)增引物，A1為靶序列1，A2為靶序列2，A3為公共引物，A4為特異引物1，A5為特異引物2，A11、A21分別為為靶序列1和靶序列2的PCR擴(kuò)增，B1為第1個(gè)PCR反應(yīng)，B2為第2個(gè)PCR反應(yīng)，C1為第3個(gè)PCR反應(yīng)，C2為第4個(gè)PCR反應(yīng)。
PCR產(chǎn)物的檢測(cè)在熒光PCR檢測(cè)上的應(yīng)用，可采用一種熒光嵌入劑，它能嵌入雙鏈DNA發(fā)出特定波長的熒光，常用的熒光嵌入劑是SYBR Green I，在PCR檢測(cè)開始時(shí)加入反應(yīng)混合體系。在常規(guī)PCR檢測(cè)上的應(yīng)用，可采用電泳、PCR-ELISA等常規(guī)的PCR檢測(cè)方法。
以下給出幾個(gè)實(shí)施例實(shí)施例1人檸檬酸脫氫酶公共引物實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)1)模板、靶序列及公共引物與特異引物靶序列為人檸檬酸脫氫酶基因，擴(kuò)增片段長230bp；模板為含人檸檬酸脫氫酶基因的質(zhì)粒；公共引物為5’-ACG AAC TCG CAC TTG AX(X為dT-FAM)G ACA-3’5’-CCC AX(X為dT-DABCYL)C AAG TGC GAG TTC TAA-3’特異引物為5’-ACG AAC TCG CAC TTG ATG ACA TAA TAC GAC TCA CTA TAG G-3’5’-CCC ATC AAG TGC GAG TTC TAA TCA CAT GGA CTA CGT TGG CA-3’2)PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)總體積為25μL，內(nèi)含10mM Tris-HCL，pH8.3，50mM KCL，2.0U Taq酶，200μM dNTP，2.0mM MgCL2，0.01μM特異引物，0.5μM公共引物，模板1μL。
PCR反應(yīng)條件95℃，5分鐘預(yù)變性后進(jìn)入PCR循環(huán)95℃35秒，55℃40秒，72℃30秒，共40個(gè)循環(huán)。熒光數(shù)據(jù)采集在退火階段55℃時(shí)采集。實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)結(jié)果見圖7(橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)(cycle)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度(Fluorescence)。PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖見圖8。
實(shí)施例2魚生長激素公共引物實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)1)模板、靶序列及公共引物與特異引物靶序列為魚生長激素基因，擴(kuò)增片段長564bp；模板為含魚生長激素CDNA的質(zhì)粒；公共引物為5’-ACG AAC TCG CAC TTG AX(X為dT-FAM)G ACA-3’5’-CCC AX(X為dT-DABCYL)C AAG TGC GAG TTC TAA-3’特異引物為5’-ACG AAC TCG CAC TTG ATG ACA TAC GTA TCA GAA AAC CAA CGG CTC TTCA-3’5’-CCC ATC AAG TGC GAG TTC TAA GCG GCC GCC TAC AGG GTG CAG TTG GAATCC-3’2)PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)總體積為25μL，內(nèi)含10mM Tris-HCL，pH8.3，50mM KCL，2.0U Taq酶，200μM dNTP，2.0mM MgCL2，0.01μM特異引物，0.5μM公共引物，梯度模板各1μL。
PCR反應(yīng)條件95℃，5分鐘預(yù)變性后進(jìn)入PCR循環(huán)95℃35秒，55℃45秒，72℃40秒，共60個(gè)循環(huán)。熒光數(shù)據(jù)采集在退火階段55℃時(shí)采集。實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析見圖9(橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)(cycle)；縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度(Fluorescence))、圖10(橫坐標(biāo)為模板濃度(concentration)，縱坐標(biāo)為CT值)，PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖見圖8。
實(shí)施例3多靶序列公共引物實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)1)模板、靶序列及公共引物與特異引物靶序列1為魚生長激素基因，擴(kuò)增片段長564bp；靶序列2為人檸檬酸脫氫酶基因，擴(kuò)增片段長230bp；靶序列3為人CAPN6基因，擴(kuò)增片段長345bp；模板分別為含魚生長激素CDNA的質(zhì)粒、含人檸檬酸脫氫酶基因的質(zhì)粒、含人CAPN6基因的質(zhì)粒；公共引物為5’-ACG AAC TCG CAC TTG A X(X為dT-FAM)G ACA-3’5’-CCC AX(X為dT-DABCYL)C AAG TGC GAG TTC TAA-3’特異引物為1、魚生長激素基因特異引物5’-ACG AAC TCG CAC TTG ATG ACA TAC GTA TCA GAA AAC CAA CGG CTC TTCA-3’5’-CCC ATC AAG TGC GAG TTC TAA GCG GCC GCC TAC AGG GTG CAG TTG GAATCC-3’2、人檸檬酸脫氫酶基因特異引物5’-ACG AAC TCG CAC TTG ATG ACA TAA TAC GAC TCA CTA TAG G-3’5’-CCC ATC AAG TGC GAG TTC TAA TCA CAT GGA CTA CGT TGG CA-3’3、人CAPN6基因特異引物5’-ACG AAC TCG CAC TTG ATG ACA TAA TAC GAC TCA CTA TAG G-3’5’-CCC ATC AAG TGC GAG TTC TAA CCA GAA ACG AAA GTG AAA-3’2)PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)總體積為25μL，內(nèi)含10mM Tris-HCL，pH8.3，50mM KCL，2.0U Taq酶，200μM dNTP，2.0mM MgCL2，3種特異引物各0.01μM混合，0.5μM公共引物，模板1μL分別為含魚生長激素CDNA的質(zhì)粒、含人檸檬酸脫氫酶基因的質(zhì)粒、含人CAPN6基因的質(zhì)粒、三種質(zhì)粒的混合物。
PCR反應(yīng)條件95℃，5分鐘預(yù)變性后進(jìn)入PCR循環(huán)95℃35秒，55℃45秒，72℃40秒，共60個(gè)循環(huán)。熒光數(shù)據(jù)采集在退火階段55℃時(shí)采集，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖11(橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)(cycle)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度(Fluorescence))，PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖見圖8。
權(quán)利要求
1.一種用于多靶序列PCR檢測(cè)的公共引物，其特征在于用于多靶序列PCR檢測(cè)的公共引物為一對(duì)寡核苷酸片斷，公共引物的堿基序列及其數(shù)目不限，包括熒光標(biāo)記型和非標(biāo)記型兩種。
2.如權(quán)利要求1所述的一種用于多靶序列PCR檢測(cè)的公共引物，其特征在于熒光標(biāo)記型公共引物由兩條堿基互補(bǔ)配對(duì)寡核苷酸片斷組成，其中一條核酸鏈標(biāo)記熒光供體，另一條核酸鏈標(biāo)記熒光受體。
3.如權(quán)利要求1所述的一種用于多靶序列PCR檢測(cè)的公共引物，其特征在于非標(biāo)記型公共引物的兩條寡核苷酸片斷不需要堿基互補(bǔ)配對(duì)，非標(biāo)記型公共引物設(shè)計(jì)必須符合以下原則1)公共引物的堿基序列應(yīng)選擇與待擴(kuò)增模板序列同源性最小的序列，引物的3’端與模板互補(bǔ)的堿基數(shù)不能超過3個(gè)；2)公共引物的堿基序列及其數(shù)目的設(shè)計(jì)應(yīng)遵守引物設(shè)計(jì)的常用規(guī)則，如堿基數(shù)目不能大于50個(gè)或小于10個(gè)，堿基(G+C)的含量不能太高，退火溫度不能太低或太高、引物內(nèi)或引物間不能形成有利于產(chǎn)生引物二聚體的結(jié)構(gòu)。
4.如權(quán)利要求1所述的一種用于多靶序列PCR檢測(cè)的公共引物，其特征在于熒光標(biāo)記型公共引物設(shè)計(jì)在遵循非標(biāo)記型設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上必須符合以下條件1)公共引物的堿基序列應(yīng)選擇與待擴(kuò)增模板序列同源性最小的序列，引物的3’端與模板互補(bǔ)的堿基數(shù)不能超過3個(gè)；2)公共引物的堿基序列及其數(shù)目的設(shè)計(jì)應(yīng)遵守引物設(shè)計(jì)的常用規(guī)則，如堿基數(shù)目不能大于50個(gè)或小于10個(gè)，堿基(G+C)的含量不能太高，退火溫度不能太低或太高、引物內(nèi)或引物間不能形成有利于產(chǎn)生引物二聚體的結(jié)構(gòu)；3)公共引物采用兩條堿基互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸片斷，在公共引物的一條寡核苷酸鏈上標(biāo)記熒光供體，另一條寡核苷酸鏈上標(biāo)記熒光受體，熒光供體和熒光受體間的距離應(yīng)小于120埃；4)公共引物兩條鏈間的互補(bǔ)配對(duì)的堿基數(shù)應(yīng)滿足兩條寡核酸鏈復(fù)性時(shí)熒光供體與其受體能產(chǎn)生有實(shí)用價(jià)值的熒光淬滅效果。
5.如權(quán)利要求1所述的一種用于多靶序列PCR檢測(cè)的公共引物，其特征在于所說的公共引物為5’-ACG AAC TCG CAC TTG A X(X為dT-FAM)GACA-3’5’-CCC A X(X為dT-DABCYL)C AAG TGC GAG TTC TAA-3’。
6.利用熒光標(biāo)記型公共引物進(jìn)行多靶序列PCR檢測(cè)方法，其特征在于步驟為1)根據(jù)熒光標(biāo)記型公共引物設(shè)計(jì)的規(guī)則設(shè)計(jì)公共引物；2)特異引物的設(shè)計(jì)特異引物由與公共引物序列相同的公共引物部分和與待擴(kuò)增靶序列互補(bǔ)的靶引物部分組成，靶引物位于特異引物的3’端，采用常規(guī)PCR的引物設(shè)計(jì)方法，使堿基序列與所需要的靶序列互補(bǔ)；公共引物部分位于特異引物部分的5’端，與靶引物連接，構(gòu)成同一條寡核苷酸鏈，堿基序列與公共引物相同；3)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)在常用的PCR反應(yīng)混合體系中，加入熒光公共引物、特異引物、待測(cè)樣品，進(jìn)行復(fù)性、延伸、熱變性三步熱循環(huán)反應(yīng)。
7.利用非標(biāo)記型公共引物進(jìn)行多靶序列PCR檢測(cè)方法，其特征在于步驟為1)根據(jù)非標(biāo)記型公共引物設(shè)計(jì)的規(guī)則設(shè)計(jì)公共引物；2)特異引物的設(shè)計(jì)特異引物由與公共引物序列相同的公共引物部分和與待擴(kuò)增靶序列互補(bǔ)的靶引物部分組成，靶引物位于特異引物的3’端，采用常規(guī)PCR的引物設(shè)計(jì)方法，使堿基序列與所需要的靶序列互補(bǔ)；公共引物部分位于特異引物部分的5’端，與靶引物連接，構(gòu)成同一條寡核苷酸鏈，堿基序列與公共引物相同；3)PCR檢測(cè)在常用的PCR反應(yīng)混合體系中，加入公共引物、特異引物、待測(cè)樣品，進(jìn)行復(fù)性、延伸、熱變性三步熱循環(huán)反應(yīng)；4)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)。
全文摘要
涉及一種采用公共引物進(jìn)行多種靶核酸的PCR擴(kuò)增技術(shù)，主要用于在核酸水平上對(duì)多靶核酸的檢測(cè)。用于多靶序列PCR檢測(cè)的公共引物為一對(duì)寡核苷酸片斷，公共引物的堿基序列及其數(shù)目不限，包括熒光標(biāo)記型和非標(biāo)記型兩種。利用公共引物進(jìn)行多靶序列PCR檢測(cè)的方法為設(shè)計(jì)公共引物、特異引物、實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。公共引物設(shè)計(jì)簡單，引物序列設(shè)計(jì)不依賴靶序列，可以根據(jù)需要設(shè)計(jì)出能達(dá)到最少引物二聚體的引物。成本低，可以做到制備一對(duì)公共引物能對(duì)多個(gè)靶序列進(jìn)行PCR檢測(cè)。能與常用的熒光PCR檢測(cè)技術(shù)兼容，可在同一反應(yīng)體系中實(shí)現(xiàn)多種檢測(cè)技術(shù)并用，增加檢測(cè)準(zhǔn)確度。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1548545SQ0313610
公開日2004年11月24日 申請(qǐng)日期2003年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月14日
發(fā)明者王宇, 馮玉榮, 王 宇 申請(qǐng)人:王宇, 馮玉榮, 王 宇