專利名稱：一種新式核酸聚合酶反應(yīng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)，更具體地說(shuō)涉及一種生物化學(xué)反應(yīng)的方法。
核酸是生物物種的遺傳物質(zhì)，它包括核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)。核酸的基本組成是四種核苷酸(或堿基)，在DNA中它們分別由A、C、G、T代表，在RNA中它們分別由A、C、G、U代表。核苷酸(堿基)在核酸中以串聯(lián)的方式組成鏈狀結(jié)構(gòu)，DNA一般為雙鏈結(jié)構(gòu)，RNA為單鏈結(jié)構(gòu)；DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)可以在適當(dāng)?shù)臈l件下分解成單鏈，單鏈的DNA也可以與單鏈的RNA形成雙鏈結(jié)構(gòu)。在一核酸結(jié)構(gòu)中，一部分可以是單鏈另一部分可以是雙鏈。在雙鏈的核酸結(jié)構(gòu)中堿基A與另一鏈的T(U)通過(guò)氫鍵形成堿基對(duì)，同理G與另一鏈的C形成堿基對(duì)，能形成堿基對(duì)的堿基為互補(bǔ)堿基。如一核酸鏈與另一核酸鏈有完全互補(bǔ)的堿基序列，則這兩條核酸鏈稱為互補(bǔ)核酸鏈，互補(bǔ)的核酸鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，由互補(bǔ)的兩單鏈分子結(jié)構(gòu)形成雙鏈分子結(jié)構(gòu)的過(guò)程稱為分子雜交。非完全互補(bǔ)的核酸鏈(部分互補(bǔ))在特定條件下也會(huì)形成雙鏈分子結(jié)構(gòu)。在生物體及試管中，單鏈的核酸鏈可在酶的作用下復(fù)制出互補(bǔ)的核酸鏈，在復(fù)制過(guò)程中，被復(fù)制的核酸鏈稱為模板分子，所需的酶為聚合酶，聚合酶可分為DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等。DNA聚合酶以DNA為模板合成DNA互補(bǔ)鏈，RNA聚合酶以DNA為模板合成RNA互補(bǔ)鏈，逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成DNA互補(bǔ)鏈。引物為核酸片段，它與模板分子互補(bǔ)并雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)。核酸聚合酶反應(yīng)的始點(diǎn)決定于引物的位置，DNA的聚合反應(yīng)從引物的3’末端開(kāi)始(DDNA及cDNA聚合反應(yīng))。RNA聚合酶反應(yīng)需要有雙鏈的被RNA聚合酶識(shí)別的結(jié)構(gòu)，稱為驅(qū)動(dòng)子。引物核酸片段可以由幾個(gè)或幾十個(gè)堿基(核苷酸)組成，引物可以是DNA，也可以是RNA，它可以是通過(guò)降解自然核酸而取得的片段，也可以通過(guò)人工化學(xué)合成。人工合成的核酸片段可具有非自然的組成單位(結(jié)構(gòu))，非自然的組成單位(結(jié)構(gòu))包括在自然界中不是核酸組分的結(jié)構(gòu)，也包括不存在于自然界的化學(xué)結(jié)構(gòu)。通過(guò)引物與模板分子的雜交，可以控制模板分子的復(fù)制以技模板分子的擴(kuò)增。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是利用兩個(gè)引物分別與DNA的兩條互補(bǔ)鏈雜交，在聚合酶的作用下復(fù)制出相應(yīng)的互補(bǔ)鏈，用同樣的引物對(duì)同樣序列的核酸模板反復(fù)進(jìn)行如上反應(yīng)，即可得到數(shù)量巨大的核酸分子。這一被復(fù)制或被擴(kuò)增的模板序列稱為靶序列。由引物引發(fā)的聚合反應(yīng)或擴(kuò)增反應(yīng)常用于分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究，基因工程，以及遺傳診斷和與分子生物學(xué)相關(guān)的檢測(cè)。在這些應(yīng)用中，反應(yīng)中所需要的試劑(反應(yīng)試劑)要進(jìn)行混合然后在試管或其他反應(yīng)器中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)試劑根據(jù)反應(yīng)性質(zhì)可分為通用試劑如水、緩沖液等；和專一試劑，專一試劑包括引物、酶等。一種反應(yīng)試劑在某個(gè)反應(yīng)中可能是專一試劑，在另一反應(yīng)中可能是通用試劑。一般來(lái)說(shuō)通用試劑指的是同一批的多個(gè)反應(yīng)中的共同試劑，專一試劑是多個(gè)反應(yīng)中，個(gè)別反應(yīng)所需的試劑。另外反應(yīng)中可以加入添加劑，添加劑在反應(yīng)中不參與反應(yīng)。常用的添加劑包括蛋白質(zhì)(如牛血清蛋白、明膠)、多糖類(lèi)化合物(如淀粉、藻膠)等，另外有些人工合成的化合物也可以用作添加劑(如線形聚丙烯酰胺)。添加劑一般為水溶性的，在低溶度下(＜10％)不會(huì)影響酶反應(yīng)。添加劑的特性包括溶于水后會(huì)膨脹并可形成膠狀物態(tài)，可起到膠合劑作用；去水后會(huì)收縮、結(jié)塊，也可以固化，形成固化物。反應(yīng)器一般由塑料制成，有管狀、槽狀、盤(pán)狀等，反應(yīng)器可以是單獨(dú)的反應(yīng)空間也可以是多個(gè)反應(yīng)空間反應(yīng)器組。條件化反應(yīng)器是指預(yù)先置有專一試劑的反應(yīng)器(即置有專一試劑的反應(yīng)器稱為條件化反應(yīng)器)。當(dāng)對(duì)一個(gè)樣品中核酸的多個(gè)靶片段進(jìn)行聚合酶反應(yīng)時(shí)，要有多個(gè)專一的反應(yīng)引物或其他相應(yīng)的專一試劑。已有的常用的反應(yīng)方法是在反應(yīng)前把相應(yīng)的專一試劑和通用試劑混合，然后分配到指定的容器中，這種方法是要將多個(gè)(種)專一試劑與通用試劑分別進(jìn)行混合，這需要大量的工作量，很容易出現(xiàn)差錯(cuò)。另外還有一種方法是將專一試劑預(yù)先放入到反應(yīng)器中，但專一試劑干后成散粉狀態(tài)，影響專一試劑的可靠性、穩(wěn)定性，并容易造成污染，不利于保存、運(yùn)輸。
本發(fā)明的目的是提供一種新式聚合酶反應(yīng)方法，它能克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足。
一種新式核酸聚合酶反應(yīng)方法，包括預(yù)先制備條件化反應(yīng)器，把液相試劑分配到多個(gè)條件化反應(yīng)器中，然后對(duì)多個(gè)不同的核酸靶分子進(jìn)行復(fù)制或擴(kuò)增，其特征是一種液相試劑與多個(gè)條件化反應(yīng)器中置有的固化試劑進(jìn)行聚合酶反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)液相試劑與多個(gè)固化試劑接觸，并使固化試劑溶解釋放出各自的反應(yīng)試劑共同參與反應(yīng)。
實(shí)施一種新式核酸聚合酶反應(yīng)方法的裝置，包括條件化反應(yīng)器2，其特征是條件化反應(yīng)器2內(nèi)裝置有固化試劑3。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是在進(jìn)行重復(fù)性多的聚合酶反應(yīng)時(shí)，只須在條件化反應(yīng)器中加入通用試劑，反應(yīng)后可得到專一的反應(yīng)結(jié)果。這一方法可以大量減少聚合酶反應(yīng)(包括PCR)的操作，因而能降低成本，在醫(yī)療診斷中減少差錯(cuò)，并可防止產(chǎn)物污染。
下面通過(guò)實(shí)施例和


本發(fā)明。
附圖為本發(fā)明裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。
本發(fā)明的裝置有反應(yīng)容器1，其內(nèi)側(cè)底面有條件化反應(yīng)器2，條件化反應(yīng)器2內(nèi)裝置有固化試劑3。
對(duì)病人的血樣品進(jìn)行甲、乙、丙肝炎病毒的檢驗(yàn)，首先按已知的病毒核酸序列設(shè)計(jì)出擴(kuò)增核酸所需的6個(gè)引物(PCR引物)共3對(duì)(專一試劑)，它們分別與相應(yīng)的病毒核酸序列有專一性。用化學(xué)方法合成這些引物并測(cè)定其濃度，用水配制10％的淀粉液添加劑加熱溶解后分成三份，每份1毫升，這三份淀粉液分別與三對(duì)引物混合形成復(fù)合物，使引物的濃度為5微摩爾濃度(5μM)，淀粉濃度為5％，然后把10微升與甲型肝炎相對(duì)應(yīng)的混合物分配到標(biāo)有“甲”的條件化反應(yīng)器2中，用同樣方法分別把10微升與乙型和丙型肝炎相關(guān)的復(fù)合物分別分配到標(biāo)有“乙”和“丙”的條件化反應(yīng)器2中，復(fù)合物在條件化反應(yīng)器2中固化形成固化試劑，最后得到標(biāo)有甲、乙、丙的三種含有固化試劑的條件化反應(yīng)器2。對(duì)病人進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，從病人體中抽取血樣，分別提取核酸(RNA和DNA)，提取的核酸(核酸樣品)與一液相試劑混合，液相試劑的成分包括聚合酶(具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性和DNA聚合酶活性)、三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)、緩沖液等。把病人的核酸樣品、液相試劑分配到各條件化反應(yīng)器2中，條件化反應(yīng)器2中的固化試劑溶解并釋放出專一試劑(專一引物)，專一引物與核酸樣品的核酸雜交，在聚合酶的作用下，對(duì)病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后對(duì)DNA、cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有聚合酶反應(yīng)在定量PCR儀中進(jìn)行，擴(kuò)增的結(jié)果可直接從儀器中取得。根據(jù)反應(yīng)結(jié)果可以對(duì)病人的病情做出判斷。
根據(jù)本發(fā)明方法所生產(chǎn)的固化試劑可以制成小顆粒狀，可具不同形狀(如圓、矩形等)。小顆粒狀的固化試劑是在一個(gè)較大的反應(yīng)器中混合制成后，然后壓(拉)長(zhǎng)再分割成許多微小的顆粒，顆粒的形狀與大小可用機(jī)械加工；小顆粒狀的固化試劑外表包裹著一層添加劑制成的保護(hù)膜。在使用時(shí)可將多種(個(gè))不同的小顆粒狀的固化試劑固定在反應(yīng)器內(nèi)，然后再加入液相試劑進(jìn)行反應(yīng)。小顆粒狀的固化試劑的體積≤8mm3。
本發(fā)明方法所述的液相試劑是溶于水和緩沖液的通用試劑；或者是溶于水和緩沖液的專一試劑；或者是溶于水和緩沖液的通用試劑和專一試劑的復(fù)合物。
本發(fā)明方法所述的固化試劑是專一試劑和添加劑的復(fù)合物，其中添加劑的含量≤99.996；或者是通用試劑和添加劑的復(fù)合物，其中添加劑的含量≤99.9％。固化試劑基本不含水分。
本發(fā)明方法所述的固化試劑是在條件化反應(yīng)器2內(nèi)混合合成；也可以先混合合成再加入到條件化反應(yīng)器2內(nèi)。
本發(fā)明方法所述的條件化反應(yīng)器，是含有一反應(yīng)空間的反應(yīng)器；可以是含有多個(gè)反應(yīng)空間的反應(yīng)器組；也可以是一形狀各異的反應(yīng)器；也可以是一平面反應(yīng)器；也可以是生物芯片，即將生物芯片做為一反應(yīng)器。
根據(jù)本發(fā)明方法可以生產(chǎn)一種新型的生物芯片，一種方法是在生物芯片基板上制作多個(gè)小孔(不透孔)每個(gè)小孔都是一個(gè)反應(yīng)器，在小孔內(nèi)加入專一試劑的復(fù)合物并使之固化形成固化試劑；二是將已制作好的多種(個(gè))小顆粒狀的固化試劑固定在生物芯片上。
根據(jù)本發(fā)明方法可以生產(chǎn)試劑盒，試劑盒內(nèi)包括含有條件化反應(yīng)器2或者小顆粒狀的固化試劑，包括反應(yīng)所需的酶、溶液、沖洗液以及用于信號(hào)檢測(cè)的熒光材料。
用此方法進(jìn)行的聚合酶反應(yīng)是在定量PCR進(jìn)行，定量PCR儀能在PCR反應(yīng)過(guò)程中通過(guò)光學(xué)系統(tǒng)觀測(cè)反應(yīng)的進(jìn)行程度。
此方法可用于RNA靶分子，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)然后進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。用反應(yīng)結(jié)果判斷基因表達(dá)或測(cè)定RNA病毒(微生物)的種類(lèi)和數(shù)量。
此方法可用于DNA靶分子進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，或由逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、DNA聚合反應(yīng)、RNA聚合反應(yīng)等組成的恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。通過(guò)擴(kuò)增的結(jié)果判定靶片段的存在或判斷靶片段的基因型，以及判斷相關(guān)物種的數(shù)量。
此方法可對(duì)病毒和微生物進(jìn)行檢測(cè)，用于商檢、環(huán)保、醫(yī)療、食品衛(wèi)生等。
此方法可對(duì)人類(lèi)、動(dòng)物、植物進(jìn)行檢測(cè)，用于防病治病、藥物開(kāi)發(fā)、遺傳育種、物種鑒定、刑偵等。
權(quán)利要求
1.一種新式核酸聚合酶反應(yīng)方法，包括預(yù)先制備條件化反應(yīng)器，把液相試劑分配到多個(gè)條件化反應(yīng)器中，然后對(duì)多個(gè)不同的核酸靶分子進(jìn)行復(fù)制或擴(kuò)增，其特征是一種液相試劑與多個(gè)條件化反應(yīng)器中置有的固化試劑進(jìn)行聚合酶反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)液相試劑與多個(gè)固化試劑接觸，并使固化試劑溶解釋放出各自的反應(yīng)試劑共同參與反應(yīng)。
2.實(shí)施一種新式核酸聚合酶反應(yīng)方法的裝置，包括條件化反應(yīng)器2，其特征是條件化反應(yīng)器2內(nèi)裝置有固化試劑3。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是固化試劑是專一試劑和添加劑的復(fù)合物，其中添加劑的含量≤99.9％。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是固化試劑是通用試劑和添加劑的復(fù)合物，其中添加劑的含量≤99.9％。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是固化試劑是在條件化反應(yīng)器2內(nèi)混合合成。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是固化試劑是先混合合成再加入到條件化反應(yīng)器2內(nèi)。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是一種成小顆粒狀的固化試劑，小顆粒狀的固化試劑的體積≤8mm3。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是固定多個(gè)小顆粒狀的固化試劑在反應(yīng)容器內(nèi)，然后再加入液相試劑進(jìn)行反應(yīng)。
9.如權(quán)利要求2所述的裝置，其特征是所述的條件化反應(yīng)器是具有多孔結(jié)構(gòu)的生物芯片。
10.如權(quán)利要求2所述的裝置，其特征是所述的條件化反應(yīng)器是一生物芯片，在生物芯片基板上固定多個(gè)小顆粒狀的固化試劑。
全文摘要
一種新式核酸聚合酶反應(yīng)方法，其特征是一種液相試劑與多個(gè)條件化反應(yīng)器中置有的固化試劑進(jìn)行聚合酶反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)液相試劑與多個(gè)固化試劑接觸，并使固化試劑溶解釋放出各自的反應(yīng)試劑共同參與反應(yīng)。所用的裝置包括條件化反應(yīng)器內(nèi)裝置有固化試劑。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是在進(jìn)行重復(fù)性多的聚合酶反應(yīng)時(shí)，只須在條件化反應(yīng)器中加入通用試劑，反應(yīng)后可得到專一的反應(yīng)結(jié)果。這一方法可以大量減少聚合酶反應(yīng)(包括PCR)的操作，因而能降低成本，在醫(yī)療診斷中減少差錯(cuò)，并可防止產(chǎn)物污染。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1490412SQ0311205
公開(kāi)日2004年4月21日 申請(qǐng)日期2003年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月28日
發(fā)明者吳昌, 吳 昌 申請(qǐng)人:吳昌, 吳 昌