專利名稱：一種固定化膽堿酯酶片的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種固定化膽堿酯酶片的制備方法，適用于批量制備用于生物測定的酶試劑，屬于生物試劑制備技術(shù)領(lǐng)域。
酶的固定化方法主要有吸附法、包埋法、共價鍵合法和交聯(lián)法。吸附法和包埋法對酶的失活作用小，但酶固定得不牢，易流失，壽命短。共價鍵合法反應(yīng)條件不易控制，固定化酶的重現(xiàn)性差。交聯(lián)法是采用雙功能團試劑(如戊二醛)將酶固定到電極表面或合適的載體上。目前文獻報道的酶的固定化方法，大都從實驗室研究的角度出發(fā)制備酶片，未涉及商品生產(chǎn)，若用于批量制備，酶片的重現(xiàn)性難以保證。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的這種固定化膽堿酯酶片的制備方法，包括
(1)、載體處理將載體制成直徑5-15mm的圓片，置于磷酸鹽緩沖溶液中活化，備用；(2)、固定化在冰浴4℃以下將乙酰膽堿酯酶、磷酸鹽緩沖溶液、戊二醛溶液、牛血清白蛋白(BSA)混合，加入預(yù)處理的載體，于3-5℃保溫2-12小時；(3)、洗滌及保存取出固定好的酶片，用含有甘氨酸的磷酸鹽緩沖溶液沖洗數(shù)次，最后將酶片浸泡在磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCL緩沖溶液中3-5℃保存。
所述的固定化膽堿酯酶片的制備方法中制作酶片的載體包括尼龍膜、硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜。
所述的固定化膽堿酯酶片的制備方法中步驟(1)用于載體活化的緩沖溶液pH為7-8.5。
所述的固定化膽堿酯酶片的制備方法步驟(1)中用于載體活化還包括用甲醇、乙二醇、高碘酸鈉溶液進行預(yù)處理。
所述的固定化膽堿酯酶片的制備方法步驟(2)中加入乙酰膽堿酯酶與載體的比例為5-10u/片。
所述的固定化膽堿酯酶片的制備方法步驟(2)中加入戊二醛與載體的比例為0.5-1.0μL/片。
所述的固定化膽堿酯酶片的制備方法步驟(2)中加入牛血清白蛋白與載體的比例為3-5μL/片。
本發(fā)明提供的固定化膽堿酯酶片的批量制備方法制備的酶片活力重現(xiàn)性好，使酶片的商品化生產(chǎn)成為可能，有利于有機磷農(nóng)藥測定的自動化、規(guī)范化；本發(fā)明制備的酶片由于在冰浴上操作，酶失活少；采用旋渦混勻器混合，酶液混合快速、均勻，因此制備的酶片活性高、壽命長；本發(fā)明涉及的酶片保存方法只需浸泡在溶液中，操作簡便。
具體實施例方式
實施例1以尼龍膜作載體制備酶片(1)載體預(yù)處理將商品尼龍膜裁成直徑為5-15mm的圓片，置于無水甲醇中浸泡30分鐘活化，取出，用0.1mol/L pH8.0的磷酸鹽緩沖溶液沖洗5分鐘，晾干備用。(2)固定化用微量移液器準(zhǔn)確移取20U乙酰膽堿酯酶于1mL塑料離心管中，離心管置于冰浴中，4℃下操作，加入130uL0.1mol/L pH7.0～8.5的磷酸鹽緩沖溶液，在旋渦混勻器上混合10秒，放回冰浴。再加入10uL5％的戊二醛及40uL1％的牛血清白蛋白，在旋渦混勻器上混合20秒，放回冰浴。向上述酶溶液中放入5片預(yù)活化的載體。注意各載體間不要疊合，于3℃～5℃下保持2小時。(3)洗滌及保存取出固定好的載體片(酶片)，放入盛有1％甘氨酸的0.1mol/LpH8.0的磷酸鹽緩沖溶液中沖洗數(shù)次。最后將酶片浸泡在pH7.0～8.5的0.1mol/L的磷酸鹽緩中溶液中3℃～5℃保存。實施例2以硝酸纖維素膜作載體制備酶片(1)載體預(yù)處理將商品硝酸纖維素薄膜裁成直徑為5-15mm的圓片，將載體片置于0.01mol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，3℃下浸泡36小時以上。(2)固定化用微量移液器準(zhǔn)確移取50U乙酰膽堿酯酶于2mL塑料離心管中，離心管置于冰浴中，4℃下操作，加入390uL0.1mol/L pH7.0～8.5的磷酸鹽緩沖溶液，在旋渦混勻器上混合10秒，放回冰浴。再加入10uL5％的戊二醛及50uL1％的牛血清白蛋白，在旋渦混勻器上混合20秒，放回冰浴。向上述酶溶液中放入10片預(yù)活化的載體。注意各載體間不要疊合，于3℃下保持12小時。(3)洗滌及保存取出固定好的載體片(酶片)，放入含有1％甘氨酸的0.1mol/LpH8.0的磷酸鹽緩沖溶液中沖洗數(shù)次。最后將酶片浸泡在pH7.0～8.5的0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液中3℃～5℃保存。實施例3以醋酸纖維素膜作載體制備酶片(1)載體預(yù)處理將商品醋酸纖維素膜裁成直徑為5-15mm的圓片，置于0.1mol/LNaIO4溶液中攪拌1小時，再放入0.06mol/L的乙二醇溶液中攪拌1小時。取出，用0.01mol/LpH7.0的磷酸鹽緩沖溶液沖洗數(shù)次，于該溶液中3℃保存。(2)固定化用微量移液器準(zhǔn)確移取10U乙酰膽堿酯酶于1mL塑料離心管中，離心管置于冰浴中，4℃下操作，加入50uL0.1mol/L pH7.0～8.5的磷酸鹽緩沖溶液，在旋渦混勻器上混合10秒，放回冰浴。再加入10uL5％的戊二醛及50uL1％的牛血清白蛋白，在旋渦混勻器上混合20秒，放回冰浴。向上述酶溶液中放入2～3片預(yù)活化的載體。注意各載體間不要疊合，于室溫下保持10小時。(3)洗滌及保存取出固定好的載體片(酶片)，放入盛有1％甘氨酸的0.1mol/LpH8.0的磷酸鹽緩沖溶液中沖洗數(shù)次。最后將酶片浸泡在pH7.0～8.5的0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液中3℃～5℃保存。實施例4室溫條件固定酶片固定化溫度采用室溫15～25℃，其他條件同實施例2。實施例5Tris-HCl緩沖溶液4℃保存酶片酶片制備過程同實施例2，最后將酶片浸泡在pH7.0～7.5的0.1mol/L Tris-HCl緩沖溶液中3℃～5℃保存。
權(quán)利要求
1.一種固定化膽堿酯酶片的制備方法，包括(1)、載體處理將載體裁成直徑5-15mm的圓片，置于磷酸鹽緩沖溶液中活化，備用；(2)、固定化在冰浴4℃以下將乙酰膽堿酯酶、磷酸鹽緩沖溶液、戊二醛溶液、牛血清白蛋白混合，加入預(yù)處理的載體，于3-5℃保溫2-12小時；(3)、洗滌及保存取出固定好的酶片，用含有甘氨酸的磷酸鹽緩沖溶液沖洗數(shù)次，最后將酶片浸泡在磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCL緩沖溶液中3-5℃保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化膽堿酯酶片的制備方法，其特征在于制作酶片的載體包括尼龍膜、硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固定化膽堿酯酶片的制備方法，其特征在于步驟(1)用于載體活化的緩沖溶液pH為7-8.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的固定化膽堿酯酶片的制備方法，其特征在于步驟(1)中用于載體活化還包括用甲醇、乙二醇、高碘酸鈉溶液進行預(yù)處理。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化膽堿酯酶片的制備方法，其特征在于步驟(2)中加入乙酰膽堿酯酶與載體的比例為5-10u/片。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化膽堿酯酶片的制備方法，其特征在于步驟(2)中加入戊二醛與載體的比例為0.5-1.0μL/片。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化膽堿酯酶片的制備方法，其特征在于步驟(2)中加入牛血清白蛋白與載體的比例為3-5μL/片。
全文摘要
本發(fā)明提供一種固定化膽堿酯酶片的制備方法，包括(1)、載體處理將載體制成直徑5－15mm的圓片，置于磷酸鹽緩沖溶液中活化，備用；(2)、固定化在冰浴4℃以下將乙酰膽堿酯酶、磷酸鹽緩沖溶液、戊二醛溶液、牛血清白蛋白混合，加入預(yù)處理的載體，于3－5℃保溫2－12小時；(3)、洗滌及保存取出固定好的酶片，用含有甘氨酸的磷酸鹽緩沖溶液沖洗數(shù)次，最后將酶片浸泡在磷酸鹽緩沖溶液或Tris－HCl緩沖溶液中3－5℃保存。本發(fā)明制備的酶片重現(xiàn)性好，活性高、壽命長；酶片保存方法只需浸泡在溶液中，操作簡便，使酶片的商品化生產(chǎn)成為可能。
文檔編號C12N11/12GK1431302SQ0310537
公開日2003年7月23日 申請日期2003年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月27日
發(fā)明者韓菊, 魏福祥, 劉慶洲 申請人:河北科技大學(xué)