本發(fā)明屬于生物分析領(lǐng)域，具體涉及基于納米模擬酶的可視化快速檢測生物酶、蛋白質(zhì)及其抑制劑的方法。

背景技術(shù)：

生物體內(nèi)一系列的生化反應(yīng)中無不具有相應(yīng)的生物酶的參與。正是這些具有高選擇性、高催化活性的生物酶的調(diào)節(jié)，生物體才能完成復(fù)雜的高級生命活動(dòng)。例如，乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AChE)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中非常重要的一種生物酶，能夠催化腦內(nèi)的乙酰膽堿水解生成醋酸和膽堿。研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶的活性過低會導(dǎo)致乙酰膽堿的大量累積，從而造成器官損傷甚至死亡。而乙酰膽堿酯酶的活性如果過高，又會造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)乙酰膽堿含量過低，容易引起阿爾茨海默病以及腦硬化。因此，檢測乙酰膽堿酯酶在生理學(xué)上和醫(yī)學(xué)上有著極為重要的意義。此外，有機(jī)磷類的農(nóng)藥是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中常用的一種高毒性的農(nóng)藥試劑，它們雖然能夠有效殺滅農(nóng)業(yè)害蟲，但是同樣對人體有著劇烈的毒性，因此檢測殘留在果蔬中的有機(jī)磷類的農(nóng)藥對于人們健康極為重要。研究表明，有機(jī)磷類農(nóng)藥是乙酰膽堿酯酶的抑制劑，它們能夠高效地抑制其活性，因此，對乙酰膽堿酯酶活性的檢測也能被用于有機(jī)磷類農(nóng)藥的檢測。除了能夠產(chǎn)生H⁺的生物酶，還有一些酶能夠在生物催化過程中消耗H⁺。例如脲酶(urease)，它通過催化尿素水解產(chǎn)生氨氣和二氧化碳。在臨床上，細(xì)菌導(dǎo)致的脲酶活性上升往往是許多疾病的發(fā)病機(jī)制，如肝炎、肝昏迷，感染性結(jié)石和消化性潰瘍等。因此，檢測脲酶的活性在臨床上同樣具有極為重要的生理意義。而脲酶的許多抑制劑多是具有環(huán)境毒性的物質(zhì)，對人體健康亦有傷害，因此對脲酶活性的檢測方法同樣可以用于這些高毒性物質(zhì)的檢測。綜上所述，對生物酶/蛋白質(zhì)的檢測不僅可以幫助人們對于從分子水平探索某些生理病理過程、信號傳導(dǎo)過程以及某些疾病的發(fā)病機(jī)制，而且對于治療相關(guān)疾病的藥物研究和開發(fā)也極具指導(dǎo)和參考價(jià)值，也為某些具有環(huán)境毒性的物質(zhì)的檢測提供了新的方法和平臺。

傳統(tǒng)檢測生物酶/蛋白質(zhì)活性的方法主要集中在高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)、毛細(xì)管電泳(Capillary electrophoresis，CE)、質(zhì)譜(mass spectrum)、熒光成像(Fluorescence imaging,FI)等。然而這些經(jīng)典方法在檢測生物酶/蛋白質(zhì)活性時(shí)存在許多不足之處。首先，這些方法大多需要昂貴而復(fù)雜的儀器，需要專業(yè)化的儀器操作員進(jìn)行操作，因此難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場分析。其次，生物樣品需要復(fù)雜的前處理、預(yù)富集和分離等步驟，分析時(shí)間長，無法實(shí)現(xiàn)生物樣品中待測物的快速分析，時(shí)間分辨率也較差。此外，生理環(huán)境異常復(fù)雜，許多生物酶/蛋白質(zhì)在體內(nèi)的濃度又很低，許多常規(guī)檢測手段難以實(shí)現(xiàn)其快速測定。因此，十分需要發(fā)展一種新型的檢測技術(shù)用于生物酶/蛋白質(zhì)活性的快速、高靈敏、高選擇性檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明針對目前一些生物酶/蛋白質(zhì)活性檢測方法存在的操作復(fù)雜、耗時(shí)長、靈敏度較差等現(xiàn)狀，通過利用某些可以模擬天然酶活性的納米材料，發(fā)展新原理實(shí)現(xiàn)對相關(guān)生物酶/蛋白質(zhì)活性的快速、高選擇性、高靈敏性檢測。

本發(fā)明提供了一種可以模擬天然氧化酶活性的納米材料。該納米材料可以像某些天然酶一樣，無需額外的氧化劑(如過氧化氫等)直接利用氧氣實(shí)現(xiàn)對某些常用顯色劑的催化氧化，并產(chǎn)生顏色的變化。因此，我們也將該種納米材料稱之為納米模擬酶。利用這類納米模擬酶在模擬天然酶催化氧化顯色劑時(shí)其催化能力對pH依賴的特性，通過待測生物酶/蛋白質(zhì)催化底物反應(yīng)過程中對檢測試劑的pH值產(chǎn)生的變化，影響納米模擬酶的催化活性，從而得到相應(yīng)的輸出信號，并通過合理的手段將這種輸出信號讀出，從而實(shí)現(xiàn)對待測物的分析。我們還發(fā)現(xiàn)在該檢測過程中如果加入某些反應(yīng)促進(jìn)劑，可以加速顯色反應(yīng)的進(jìn)行，并進(jìn)一步提高檢測的靈敏度，減低檢測限。

技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種含有納米模擬酶的檢測試劑，該檢測試劑中包括有納米材料、顯色劑和反應(yīng)促進(jìn)劑。

其中，上述納米材料含有金屬或金屬氧化物中的一種或兩種。

其中，上述顯色劑為具有氧化還原特性的化合物。

其中，上述反應(yīng)促進(jìn)劑為含有高能磷酸鍵的生物分子，包括腺嘌呤核苷三磷酸，鳥嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸、胸腺嘧啶核苷三磷酸、尿嘧啶核苷三磷酸和其類似物中的一種或幾種，優(yōu)選為ATP。

一種基于納米模擬酶的可視化快速檢測生物酶、蛋白質(zhì)活性的方法，包括以下步驟：

1)納米模擬酶的制備：利用濕法化學(xué)制備能夠模擬天然酶的含有金屬或金屬氧化物的納米材料，經(jīng)分離、純化并測定其濃度后備用；

2)檢測試劑緩沖液的制備：配制適合pH值及濃度的緩沖溶液待用；

3)檢測生物酶/蛋白質(zhì)活性的檢測試劑的制備：取一定量的顯色劑、反應(yīng)促進(jìn)劑以及被測生物酶/蛋白質(zhì)的反應(yīng)底物加入到配制好的緩沖液中，混合均勻后待用；對于能夠釋放H⁺的生物酶/蛋白質(zhì)，選用pH為7.0的磷酸緩沖液，而對于能夠消耗H⁺的生物酶/蛋白質(zhì)，則選用pH為4.5的磷酸緩沖液；

4)生物酶/蛋白質(zhì)活性的可視化檢測：將上述檢測試劑與含有待測檢測生物酶/蛋白質(zhì)的樣品以及一定量的納米模擬酶混合后在37℃下孵育反應(yīng)，然后根據(jù)檢測試劑顏色的變化或通過肉眼觀察對待測生物酶/蛋白質(zhì)的活性進(jìn)行半定量的判斷；或通過相應(yīng)的儀器對待測生物酶/蛋白質(zhì)的活性進(jìn)行精確的測定和定量。

其中，上述步驟2)中緩沖溶液為pH為7.0或4.5，濃度為5mM的磷酸緩沖溶液。

其中，上述步驟3)中顯色劑為3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺。

其中，上述生物酶為乙酰膽堿酯酶和脲酶中的一種。

其中，上述反應(yīng)促進(jìn)劑為ATP。

一種基于納米氧化酶可視化生物酶/蛋白質(zhì)抑制劑活性的方法，所述方法包括步驟1)～3)，還包括步驟4)生物酶/蛋白質(zhì)對應(yīng)抑制劑的可視化檢測：將已知活性的生物酶/蛋白質(zhì)與對應(yīng)的抑制劑混合后作用一段時(shí)間得到混合物，然后將該混合物與上述檢測試劑以及一定量的納米模擬酶混合后在37℃下孵育反應(yīng)，最后根據(jù)檢測試劑顏色的變化或通過肉眼觀察對待測生物酶/蛋白質(zhì)的抑制劑進(jìn)行半定量的判斷；或通過相應(yīng)的儀器對待測生物酶/蛋白質(zhì)的抑制劑進(jìn)行精確的測定和定量。

本發(fā)明的抑制劑為乙酰膽堿酯酶抑制劑甲基對氧膦和他克林以及脲酶抑制劑F^-。

本發(fā)明對待測生理活性小分子的定量檢測原理：該納米材料即納米模擬酶可以利用氧氣直接實(shí)現(xiàn)對顯色劑的催化氧化，產(chǎn)生顏色的變化。但是該催化氧化的能力在一定pH范圍內(nèi)呈現(xiàn)出pH依賴的特性。一般而言，在pH偏中性時(shí)，催化能力較弱，產(chǎn)生的顏色較淺，而在pH偏酸性時(shí)，催化能力較強(qiáng)，產(chǎn)生的顏色較深。在某些反應(yīng)促進(jìn)劑如ATP的存在下，這種催化能力能夠得到有效增強(qiáng)，因此催化反應(yīng)時(shí)間可以大大縮短。利用該特性，通過待測生物酶/蛋白質(zhì)在催化相應(yīng)底物反應(yīng)過程中對溶液pH值的影響，對所用納米模擬酶活性原位進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)行產(chǎn)生不同程度的顏色變化作為信號輸出，最終實(shí)現(xiàn)待測生物酶/蛋白質(zhì)及其抑制劑的分析。

有益效果：本發(fā)明中該基于模擬天然酶的納米模擬酶的檢測方法所輸出的物理信號對待測體系中生物酶/蛋白質(zhì)活性在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)非常好的線性關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)對待測目標(biāo)的高靈敏檢測。該檢測體系幾乎不受其他常見的生物酶/蛋白質(zhì)的干擾，因此對目標(biāo)待測物的檢測有著高度選擇性。此外該方法儀器簡單、操作簡便、成本低廉、需樣量少，既可以實(shí)現(xiàn)生物體內(nèi)相關(guān)生物酶/蛋白質(zhì)的快速可視化檢測，又能夠用于某些對人體健康具有威脅的有毒、有害物質(zhì)的快速檢測，因此具有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。該技術(shù)用于這些生理物質(zhì)檢測具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)該檢測方法對相應(yīng)生物酶/蛋白質(zhì)的檢測有著很高的靈敏度，可以滿足生物體內(nèi)相關(guān)生物酶/蛋白質(zhì)活性的檢測要求；2)選擇性好，其他生物酶/蛋白質(zhì)活性沒有干擾；3)反應(yīng)快速，僅需5-10分鐘即可通過肉眼觀察到檢測試劑顏色的變化；4)操作簡便，僅憑肉眼就可以實(shí)現(xiàn)對待測物的半定量分析，依靠儀器則可以實(shí)現(xiàn)更加精準(zhǔn)的定量；5)成本低廉，一方面，無需特意設(shè)計(jì)和合成對待測生物酶/蛋白質(zhì)活性有選擇性響應(yīng)的熒光探針分子或者其他生物識別單元，另一方面，所使用的納米材料取代了常用的天然酶試劑，使檢測成本得到了極大的降低；6)需樣量很小，檢測操作簡便，分析速度較快，可以實(shí)現(xiàn)床旁檢測以及臨場檢測。

附圖說明

圖1納米模擬酶nanoceria對乙酰膽堿酯酶檢測的工作曲線；

圖2納米模擬酶nanoceria對乙酰膽堿酯酶抑制劑甲基對氧膦檢測的工作曲線；

圖3納米模擬酶nanoceria對乙酰膽堿酯酶抑制劑他克林檢測的工作曲線；

圖4納米模擬酶nanoceria對脲酶檢測的工作曲線；

圖5納米模擬酶nanoceria對脲酶抑制劑F^-檢測的工作曲線。

具體實(shí)施方式

下面對本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于所述實(shí)施例。

以納米氧化鈰(nanoceria)為所述納米模擬酶的例子，其化學(xué)式為CeO₂。

以乙酰膽堿酯酶及其抑制劑甲基對氧膦(methyl-paraoxon)、他克林(tacrine)和脲酶及其抑制劑氟離子(F^-)所述生物酶/蛋白質(zhì)及其抑制劑的例子。本發(fā)明所用試劑均可通過市售獲得。

所用顯色劑為3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，所用反應(yīng)促進(jìn)劑優(yōu)選為ATP。

本發(fā)明實(shí)施例中的U為酶活力單位，mU＝10^-3U。

實(shí)施例1

1)納米模擬酶nanoceria制備：

將2.52g Ce(NO₃)₃溶解于100mL水和乙二醇的1:1混合溶液中，并加熱攪拌至60℃。然后在攪拌的條件下快速加入16mL新鮮氨水，在60℃下繼續(xù)攪拌3小時(shí)。將產(chǎn)物離心，并依次用水洗滌并離心3次后得到nanoceria粗產(chǎn)品。將該nanoceria粗產(chǎn)品分散于100mL濃度為15mg/mL的檸檬酸鈉溶液中，超聲30分鐘，待nanoceria與檸檬酸鈉充分作用之后，加入100mL乙醇，攪拌后離心分離，所得產(chǎn)物依次用1:1水和乙醇的混合液洗滌并離心3次后，分散于純水中。待計(jì)算、測量得到該分散液中nanoceria的濃度為14mg/mL，將得到的濃度為14mg/mL nanoceria分散液進(jìn)行稀釋得到濃度為2.5mg/mL的nanoceria儲備液后保存，待用。

2)配制磷酸緩沖液：配制pH分別為7.0和4.5，濃度為5mM的磷酸緩沖溶液待用。

3)配制檢測生物酶/蛋白質(zhì)活性的檢測試劑：將4μL TMB溶液(25mM)，2μL ATP溶液(100mM)，10μL乙酰膽堿溶液(1.0M)加入180μL所制備的pH為7.0的濃度為5mM的磷酸緩沖溶液中，混合均勻后加入不同濃度的乙酰膽堿酯酶(0、7、14、35、70、175、350、700、1400mU)以及1.5μL nanoceria儲備液(14mg/mL)，混合均勻后得到檢測試劑，將該檢測試劑置于37℃的水浴中反應(yīng)，并利用紫外-可見分光光度計(jì)實(shí)時(shí)記錄652nm處吸光度值的變化。

由圖1可見，在存在乙酰膽堿酯酶的情況下，652nm處的吸光度值不斷上升，說明所用TMB顯色劑被不斷氧化而顯色。其顯色速度隨著乙酰膽堿酯酶的濃度上升而上升，說明隨著乙酰膽堿酯酶濃度的提高，溶液pH的變化加快，TMB被納米模擬酶催化氧化的速度也隨之加快。以檢測時(shí)間為600s時(shí)，溶液在652nm處的吸光度值作為信號響應(yīng)輸出(A₆₅₂)，并將其對乙酰膽堿酯酶的濃度作圖，其結(jié)果如圖1B所示。該檢測試劑在652nm處的吸光度值與所加入的乙酰膽堿酯酶濃度在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出非常好的線性關(guān)系(A₆₅₂＝0.0024×[AChE]mU^-1+0.137)，線性范圍為7mU～135mU，其最低檢測限為3.5mU(在該濃度下，其信號響應(yīng)為噪音的3倍)。此外，通過對照實(shí)驗(yàn)我們也同樣看到在不加入ATP的情況下，該方法對乙酰膽堿酯酶的檢測靈敏度下降了一半(0.0012vs.0.0024)，檢測限也較高(25mU)，證明了反應(yīng)促進(jìn)劑ATP的加入可以顯著提高該方法的檢測性能。

實(shí)施例2納米模擬酶技術(shù)在乙酰膽堿酯酶抑制劑甲基對氧膦和他克林檢測中的應(yīng)用

先將1.5U乙酰膽堿酯酶與不同濃度的甲基對氧膦(0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10μM)或他克林(0、0.5、5、50μM)混合后用濃度為5mM的磷酸緩沖液(pH 7.0)定容至50μL，在室溫下反應(yīng)30分鐘。待酶活性被充分抑制后，用濃度為5mM的磷酸緩沖液(pH 7.0)稀釋該混合液至180μL，隨后加入4μL TMB溶液(25mM)，2μL ATP溶液(100mM)，10μL乙酰膽堿溶液(1.0M)以及1.5μL nanoceria儲備液(14mg/mL)?；旌暇鶆蚝髮⒃撛噭┲糜?7℃的水浴中反應(yīng)，并利用紫外-可見分光光度計(jì)實(shí)時(shí)記錄652nm處吸光度值的變化。

從圖2A中我們可以看到，隨著有機(jī)磷農(nóng)藥甲基對氧膦濃度的上升，溶液的顏色也越淺，說明乙酰膽堿酯酶的活性被甲基對氧膦所抑制，難以催化乙酰膽堿的水解。以檢測時(shí)間為600s時(shí)，溶液在652nm處的吸光度值作為信號響應(yīng)輸出(A₆₅₂)，并將其與不加抑制劑時(shí)所記錄得到的A₆₅₂的比值對甲基對氧膦的濃度作圖，其結(jié)果如圖2B所示。通過A₆₅₂吸光度值的記錄，我們可以得到甲基對氧膦的準(zhǔn)確濃度。利用該方法，如圖2B所示，即使10nM的甲基對氧膦也可以產(chǎn)生明顯的吸光度值的變化，說明該方法對甲基對氧膦的檢測有著很高的靈敏度。

他克林是另一種乙酰膽堿酯酶的抑制劑，用于阿爾茨海默病的臨床治療。從圖3中我們同樣可以看到，隨著他克林濃度的上升，檢測試劑的顏色依次變淺，652nm處的吸光度值也隨之下降，說明該方法還能用于相關(guān)疾病藥物的篩選。

實(shí)施例3納米模擬酶技術(shù)在脲酶檢測中的應(yīng)用

將4μL TMB溶液(25mM)，2μL ATP溶液(100mM)，10μL尿素(1.0M)加入180μL所制備的濃度為5mM的pH為4.5的磷酸緩沖溶液中，混合均勻后加入不同量的脲酶(0、7.5、15、37、5、75、187.5、375、750、1500mU)以及3μL nanoceria儲備液(2.5mg/mL)，混合均勻后將該試劑置于37℃的水浴中反應(yīng)，并利用紫外-可見分光光度計(jì)實(shí)時(shí)記錄652nm處吸光度值的變化。

從圖4中可以看到，在存在脲酶的情況下，檢測溶液652nm處的吸光度值不斷下降。這是因?yàn)殡迕杆饽蛩禺a(chǎn)生氨而消耗H⁺，溶液體系pH逐漸升高，納米模擬酶nanoceria的催化氧化能力被逐漸抑制，TMB被催化氧化的速度也隨之減弱。同樣，652nm處的吸光度值與所加入的脲酶濃度在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出非常好的線性關(guān)系。以檢測時(shí)間為600s時(shí)，溶液在652nm處的吸光度值作為信號響應(yīng)輸出(A₆₅₂)，并將其對脲酶的濃度作圖，其結(jié)果如圖4B所示，其線性范圍為0～750mU。此外，比較圖4B以及圖4D我們還發(fā)現(xiàn)，不使用ATP時(shí)所記錄得到的A₆₅₂僅為使用ATP時(shí)的十分之一，顯示該方法對脲酶的檢測靈敏度下降至原來的十分之一，線性范圍也很窄(0～75mU)，證明了反應(yīng)促進(jìn)劑ATP的加入可以顯著提高該方法的檢測性能。

實(shí)施例4納米模擬酶技術(shù)在脲酶抑制劑F^-檢測中的應(yīng)用

先將1.5U脲酶與不同濃度的F^-(0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5mM)混合后用濃度為5mM的磷酸緩沖液(pH 4.5)定容至50μL，在室溫下反應(yīng)30分鐘。待酶活性被充分抑制后，用濃度為5mM的磷酸緩沖液(pH 4.5)稀釋該混合液至180μL，隨后加入4μL TMB溶液(25mM)，2μL ATP溶液(100mM)，10μL尿素(1.0M)以及3μL nanoceria儲備液(2.5mg/mL)?；旌暇鶆蚝髮⒃撛噭┲糜?7℃的水浴中反應(yīng)，并利用紫外-可見分光光度計(jì)實(shí)時(shí)記錄652nm處吸光度值的變化。

從圖5中我們可以看到，隨著有F^-濃度的上升，檢測溶液的顏色逐漸上升，說明脲酶的活性被F^-所抑制，難以催化尿素的水解，檢測體系的pH變化也當(dāng)然隨之減弱。以檢測時(shí)間為600s時(shí)，溶液在652nm處的吸光度值作為信號響應(yīng)輸出(A₆₅₂)，并將其與不加F^-時(shí)的A₆₅₂的比值對F^-的濃度作圖，其結(jié)果如圖5B所示。利用該比值，我們可以得到F^-的準(zhǔn)確濃度。由圖5B所示，我們檢測得到F^-能夠?qū)?.5U脲酶的活力抑制一半的濃度約為750μM。這種方法也可以用于其他脲酶抑制劑的篩選。