本發(fā)明屬于天然芳香單體物質(zhì)制備領(lǐng)域，具體涉及一種青蒿醛雙鍵還原酶dbr1及其重組菌在制備二氫-β-紫羅蘭酮中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

紫羅蘭酮類化合物作為調(diào)香中不可缺少的原香料，大量的使用于幾乎所有的日用香精配方中。據(jù)相關(guān)資料統(tǒng)計(jì)，紫羅蘭酮類香料我國(guó)生產(chǎn)能力相對(duì)較弱，且品種規(guī)格單調(diào)，絕大多數(shù)為紫羅蘭酮和甲基紫羅蘭酮，遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求。二氫-β-紫羅蘭酮，俗稱“桂花王”，是桂花精油中一種主要的香氣物質(zhì)，其香味醇厚、甘甜，具有新鮮柏木香型。目前二氫-β-紫羅蘭酮的生產(chǎn)大多來(lái)自于化學(xué)合成，不僅生產(chǎn)成本較高，效益低，而且不能作為一種天然的產(chǎn)品進(jìn)行銷售，其合成產(chǎn)物的效果和“非天然性”的安全性則難以滿足食品和天然日化行業(yè)的需求。而從芳香植物中提取則存在成本高、缺乏有效的產(chǎn)物分離手段，并且極大的受限于農(nóng)業(yè)種植以及所有能對(duì)農(nóng)業(yè)種植產(chǎn)生影響的諸多因素。通過(guò)現(xiàn)代合成生物學(xué)生產(chǎn)諸如二氫-β-紫羅蘭酮等芳香類物質(zhì)是一個(gè)嶄新的可持續(xù)生產(chǎn)方式。該法是模擬天然植物代謝過(guò)程生產(chǎn)出芳香化合物，這些化合物已被歐洲和美國(guó)定義為“天然的”并被認(rèn)為是生產(chǎn)較安全的、高生物活性的香味化合物及其復(fù)合物最有前途的方法。

以β-紫羅蘭酮為底物，利用現(xiàn)代合成生物學(xué)制備二氫-β-紫羅蘭酮核心的關(guān)鍵技術(shù)就是需要找到高效的轉(zhuǎn)化酶，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有相關(guān)的研究報(bào)導(dǎo)。僅僅是有一些轉(zhuǎn)化不飽和醛酮的相關(guān)酶及其基因方面的研究報(bào)導(dǎo)，但是酶具有專一性，且有些酶屬于絕對(duì)專一性，底物的結(jié)構(gòu)不同，甚至有細(xì)微的差異都會(huì)影響到酶學(xué)的特性及轉(zhuǎn)化的效率。而且，天然產(chǎn)物的合成生物學(xué)或生物催化轉(zhuǎn)化來(lái)源的酶可以打破種的界限，可以來(lái)源于本身植物中酶，也可以來(lái)源于其它植物的酶，甚至是來(lái)源于微生物的酶。二氫-β-紫羅蘭酮俗稱“桂花王”，是植物桂花中的特征的香氣物質(zhì)，桂花植物中存在一種生物酶，可以將β-紫羅蘭酮轉(zhuǎn)化為二氫-β-紫羅蘭酮。但通過(guò)大量的篩選和研究，有望能獲得顯著高于原來(lái)植物中的轉(zhuǎn)化水平。2006年美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校的keasling實(shí)驗(yàn)室將來(lái)源于不同生物的基因進(jìn)行設(shè)計(jì)、組裝，最后在酵母中構(gòu)建了一條非天然的代謝途徑用于大量合成青蒿素的前體—青蒿酸。2010年ajikumar等在大腸桿菌中重建紫杉二烯的合成途徑，成功獲得了這一紫杉醇的中間體。

本發(fā)明模擬天然植物代謝過(guò)程，在植物體外生物轉(zhuǎn)化β-紫羅蘭酮制備二氫-β-紫羅蘭酮，并首次發(fā)現(xiàn)了一種具有較高轉(zhuǎn)化β-紫羅蘭酮制備二氫-β-紫羅蘭酮能力的非桂花植物來(lái)源的雙鍵還原酶基因，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)基因工程技術(shù)獲得催化性能穩(wěn)定的基因重組菌pet-28a-dbr1。該重組菌及其分泌的酶對(duì)β-紫羅蘭酮環(huán)外雙鍵有較強(qiáng)的催化加氫能力。本發(fā)明建立了一種能在植物體外高效生物轉(zhuǎn)化β-紫羅蘭酮制備二氫-β-紫羅蘭酮的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問(wèn)題：本發(fā)明提供一種青蒿醛雙鍵還原酶dbr1及其重組菌在制備二氫-β-紫羅蘭酮中的應(yīng)用，突破了在植物體外生物轉(zhuǎn)化β-紫羅蘭酮制備二氫-β-紫羅蘭酮技術(shù)瓶頸，從大量的雙鍵還原酶中篩選獲得了一種能高效轉(zhuǎn)化β-紫羅蘭酮制備二氫β-紫羅蘭酮的生物酶。同時(shí)，首次建立了全細(xì)胞轉(zhuǎn)化及酶法轉(zhuǎn)化β-紫羅蘭酮制備二氫β-紫羅蘭酮技術(shù)體系，實(shí)現(xiàn)了體外制備二氫β-紫羅蘭酮的可持續(xù)、低成本、高得率的綠色生產(chǎn)方式。

技術(shù)方案：青蒿醛雙鍵還原酶dbr1或其重組菌在體外轉(zhuǎn)化β-紫羅蘭酮制備二氫-β-紫羅蘭酮中的應(yīng)用。

上述青蒿醛雙鍵還原酶dbr1的核酸序列如seqidno:2所示。

應(yīng)用方案之一，步驟為：稱取0.484gβ-紫羅蘭酮用無(wú)水乙醇定容到10ml，配成250mmol/lβ-紫羅蘭酮溶液；向5mllb培養(yǎng)基中加入50μl50mg/ml卡那霉素，接入500μl含有青蒿醛雙鍵還原酶dbr1基因的工程菌；37℃培養(yǎng)至od600為0.4-2.0，加入50-300μlβ-紫羅蘭酮溶液；加入1mol/liptg0-50μl；在22-42℃下培養(yǎng)6-27小時(shí)；加入1ml氯仿萃取。

應(yīng)用方案之二，步驟為：稱取0.0481gβ-紫羅蘭酮，用無(wú)水乙醇溶解定容到10ml，配成25mmol/lβ-紫羅蘭酮溶液；總反應(yīng)體系500μl，加入20μl25mmol/lβ-紫羅蘭酮，加入360μl50mmol/l20-50℃ph6.5tris-hcl緩沖液，再加入10μl100mmol/ldtt以及10μl50mmol/l還原輔酶nadph，最后加入100μl青蒿醛雙鍵還原酶dbr1酶液，酶添加量為20-50u/mg；45℃反應(yīng)10-60min；1ml氯仿終止反應(yīng)并萃取。

一種體外轉(zhuǎn)化β-紫羅蘭酮制備二氫-β-紫羅蘭酮的方法，制備體系中含有青蒿醛雙鍵還原酶dbr1或其重組菌。

取萃取液進(jìn)行氣相檢測(cè)。氣相條件：美國(guó)安捷倫6890氣相色譜，毛細(xì)管柱hp5，氫火焰離子化檢測(cè)器，進(jìn)樣口溫度250℃，檢測(cè)器溫度250℃。升溫程序：50℃恒溫2min，50到120℃10℃/min。120℃恒溫2min,線性升溫從120-200℃，5℃/min,200℃恒溫5min。

有益效果：篩選獲得一種來(lái)源于青蒿的青蒿醛雙鍵還原酶dbr1，該酶可以高效轉(zhuǎn)化β-紫羅蘭酮制備二氫-β-紫羅蘭酮。在試驗(yàn)最佳條件下，來(lái)源于青蒿的青蒿醛雙鍵還原酶dbr1轉(zhuǎn)化β-紫羅蘭酮制備二氫-β-紫羅蘭酮產(chǎn)量是來(lái)源于青蒿的青蒿醛雙鍵還原酶dbr2的270倍，是來(lái)自于一種芽孢桿菌的雙鍵還原酶產(chǎn)量的770倍，是來(lái)自于桂花并與dbr2有78％相似性的一種還原酶產(chǎn)量的256倍。在加入40μl1mol/liptg，初始o(jì)d600為1.8，加入250μl250mmol/lβ-紫羅蘭酮-乙醇溶液在27℃條件下轉(zhuǎn)化18小時(shí)，二氫-β-紫羅蘭酮產(chǎn)量達(dá)308.3mg/l。酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系為500μl，其中β-紫羅蘭酮濃度為1mmol/l，酶添加量約為30u/mg，反應(yīng)在ph6.5，45℃下反應(yīng)60min，二氫β-紫羅蘭酮濃度為76.49mg/l，底物有效轉(zhuǎn)化率為78.77％。

附圖說(shuō)明

圖1為不同iptg終濃度對(duì)二氫-β-紫羅蘭酮生成量的影響圖；

圖2為考察不同溫度對(duì)二氫-β-紫羅蘭酮生成量的影響圖；

圖3為考察不同初始o(jì)d600對(duì)二氫-β-紫羅蘭酮生成量的影響圖；

圖4為考察不同催化轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)二氫-β-紫羅蘭酮生成量的影響圖；

圖5為考察不同溶劑對(duì)二氫-β-紫羅蘭酮生成量的影響圖；

圖6為考察不同底物加入量對(duì)二氫-β-紫羅蘭酮生成量的影響圖；

圖7為基因工程菌pet-28a-dbr1轉(zhuǎn)化β-紫羅蘭酮?dú)赓|(zhì)檢測(cè)總離子圖；

圖8為基因工程菌pgex-4t1--dbr2轉(zhuǎn)化β-紫羅蘭酮?dú)赓|(zhì)檢測(cè)總離子圖；

圖9為基因工程菌pet-28a-bacoye1轉(zhuǎn)化β-紫羅蘭酮?dú)赓|(zhì)檢測(cè)總離子圖；

圖10為基因工程菌pgex-4t1-2687轉(zhuǎn)化β-紫羅蘭酮?dú)赓|(zhì)檢測(cè)總離子圖；

圖11為空白對(duì)照試驗(yàn)萃取液氣質(zhì)檢測(cè)總離子圖；

圖12為青蒿醛雙鍵還原酶1最適反應(yīng)溫度的測(cè)定圖；

圖13為青蒿醛雙鍵還原酶1最適ph測(cè)定圖；

圖14為青蒿醛雙鍵還原酶1溫度穩(wěn)定性測(cè)定；

圖15為青蒿醛雙鍵還原酶1ph穩(wěn)定性測(cè)定；

圖16為測(cè)定上清液中青蒿醛雙鍵還原酶1活力以及產(chǎn)物二氫β-紫羅蘭酮的產(chǎn)量來(lái)評(píng)價(jià)不同表達(dá)條件的效果圖；

圖17為考察溫度對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)酶活力的影響圖；

圖18為考察初始o(jì)d600對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)酶活力的影響圖；

圖19為考察時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)酶活力的影響圖；

圖20-1為0min的樣品利用gc進(jìn)行成分檢測(cè)圖。

圖20-2為10min的樣品利用gc進(jìn)行成分檢測(cè)圖。

圖20-3為20min的樣品利用gc進(jìn)行成分檢測(cè)圖。

圖20-4為30min的樣品利用gc進(jìn)行成分檢測(cè)圖。

圖20-5為60min的樣品利用gc進(jìn)行成分檢測(cè)圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1、重組質(zhì)粒pet-28a-bacoye1、pet-28a-dbr1、pgex-4t1-dbr2以及pgex-4t1-2687的獲得

全基因合成并通過(guò)大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化芽胞桿菌老黃酶2基因(bacoye1)、青蒿醛雙鍵還原酶1基因(dbr1)以及青蒿醛雙鍵還原酶2基因(dbr2)，以及在桂花轉(zhuǎn)錄組(sraaccessionnumbersrp057917)中所得到的與青蒿醛雙鍵還原酶2有最高78％的相似性的unigene(cl2687.contig2_all)。其核苷酸序列如seqidno:1-4，將其連接到pet-28a以及pgex-4t1質(zhì)粒上，獲得重組質(zhì)粒命名為pet-28a-bacoye1、pet-28a-dbr1、pgex-4t1-dbr2以及pgex-4t1-2687。

sequence1：pet-28a-bacoye1核酸序列

sequence2：pet-28a-dbr1核酸序列

sequence3：pgex-4t1-dbr2核酸序列

sequence4:pgex-4t1-2687核酸序列

2、重組基因工程菌的構(gòu)建

分別將重組質(zhì)粒pgex-4t1-2687、pgex-4t1-dbr2、pet-28a-dbr1以及pet-28a-bacoye1轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)宿主菌(購(gòu)自novagen公司)，分別在含有氨芐霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的lb平板(lb培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl5g/l，瓊脂15g/l)上經(jīng)過(guò)37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑轉(zhuǎn)化子到5ml含有抗性的lb培養(yǎng)基中37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)。

3、基因工程菌轉(zhuǎn)化β-紫羅蘭酮制備二氫-β-紫羅蘭酮系列條件優(yōu)化

(1)適宜的iptg加入量：稱取0.484gβ-紫羅蘭酮用無(wú)水乙醇溶解定容到10ml，配成250mmol/lβ-紫羅蘭酮溶液。向5mllb培養(yǎng)基中加入5μl50mg/ml卡那霉素，分別接入500μl基因工程菌pet-28a-bacoye1、pet-28a-dbr1、pgex-4t1-dbr2以及pgex-4t1-2687，37℃培養(yǎng)至od600為0.6，加入200μlβ-紫羅蘭酮溶液，分別加入終濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mmol/liptg，32℃條件下轉(zhuǎn)化12小時(shí)，加入1ml氯仿萃取，取萃取液進(jìn)行氣相檢測(cè)，考察不同iptg終濃度對(duì)二氫-β-紫羅蘭酮生成量的影響。結(jié)果圖1，iptg終濃度分別為0.6、0.4和0.8和0.8mmol/l時(shí)效果最好。

(2)適宜催化轉(zhuǎn)化溫度。分別按最適的iptg添加量加入iptg誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化12小時(shí)，加入1ml氯仿萃取，取萃取液進(jìn)行氣相檢測(cè)，溫度設(shè)置分別為22、27、32、37和42℃，考察不同溫度對(duì)二氫-β-紫羅蘭酮生成量的影響。結(jié)果見(jiàn)圖2，pet-28a-bacoye1、pet-28a-dbr1、pgex-4t1-dbr2以及pgex-4t1-2687最適轉(zhuǎn)化溫度分別是32、27、37和37℃。

(3)適宜初始o(jì)d600濃度。分別按最適的iptg添加量、最適的催化轉(zhuǎn)化溫度等最優(yōu)條件誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化12小時(shí)，加入1ml氯仿萃取，取萃取液進(jìn)行氣相檢測(cè)，考察不同初始o(jì)d600對(duì)二氫-β-紫羅蘭酮生成量的影響。結(jié)果見(jiàn)圖3，pet-28a-bacoye1、pet-28a-dbr1、pgex-4t1-dbr2以及pgex-4t1-2687最適初始o(jì)d600分別是1.4、1.8、1.6和0.6。

(4)適宜催化轉(zhuǎn)化時(shí)間。分別按最優(yōu)條件誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后加入1ml氯仿萃取，取萃取液進(jìn)行氣相檢測(cè)，考察不同時(shí)間對(duì)二氫-β-紫羅蘭酮生成量的影響。結(jié)果見(jiàn)圖4，pet-28a-bacoye1、pet-28a-dbr1、pgex-4t1-dbr2以及pgex-4t1-2687最適時(shí)間分別是12、18、15和21h。

(5)適宜的溶劑。按最優(yōu)條件誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后加入1ml氯仿萃取，取萃取液進(jìn)行氣相檢測(cè)，考察不同溶劑的影響。結(jié)果見(jiàn)圖5，當(dāng)?shù)孜镉脽o(wú)水乙醇作為溶劑時(shí)效果最好。

(6)適宜的底物加入量。按最優(yōu)條件誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后加入1ml氯仿萃取，取萃取液進(jìn)行氣相檢測(cè)，考察不同底物加入量的影響。結(jié)果見(jiàn)圖6，當(dāng)用無(wú)水乙醇作為溶劑時(shí)，pet-28a-bacoye1、pet-28a-dbr1、pgex-4t1-dbr2以及pgex-4t1-2687的最適底物加入量分別為150、250、250和200μl。

上述催化轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物經(jīng)用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀tracedsq檢測(cè)確證。色譜條件：tr-5ms毛細(xì)管色譜柱，柱長(zhǎng)30m，內(nèi)徑0.25mm，膜厚0.25μm，載氣為高純度氦氣(he)，氦氣流速為1ml/min，進(jìn)樣口溫度250℃。升溫程序：起始溫度為50℃，保持2min，以10℃/min升至120℃，保持2min。以5℃/min升至200℃，保持5min。質(zhì)譜條件：接口溫度250℃，電離方式ei，離子電離能量70ev，質(zhì)量掃描范圍(m/z)50-450。轉(zhuǎn)化β-紫羅蘭酮?dú)赓|(zhì)檢測(cè)總離子圖如下：

(1)基因工程菌pet-28a-dbr1轉(zhuǎn)化β-紫羅蘭酮?dú)赓|(zhì)檢測(cè)總離子圖7；

(2)基因工程菌pgex-4t1-dbr2轉(zhuǎn)化β-紫羅蘭酮?dú)赓|(zhì)檢測(cè)總離子圖8；

(3)基因工程菌pet-28a-bacoye1轉(zhuǎn)化β-紫羅蘭酮?dú)赓|(zhì)檢測(cè)總離子圖9；

(4)基因工程菌pgex-4t1-2687轉(zhuǎn)化β-紫羅蘭酮?dú)赓|(zhì)檢測(cè)總離子圖10；

(5)空白對(duì)照試驗(yàn)萃取液氣質(zhì)檢測(cè)總離子圖11。

4、本發(fā)明所述青蒿醛雙鍵還原酶1的定性測(cè)定

(1)酶活的測(cè)定方法

反應(yīng)體系500μl，20μl25mmol/lβ-紫羅蘭酮中加入360μl50mmol/ltris-hcl緩沖液(ph6.5)，45℃預(yù)保溫3min，再加入10μl100mmol/ldtt以及10μl50mmol/l還原輔酶nadph，最后加入100μl酶液(稀釋到合適的倍數(shù))45℃反應(yīng)10min。1ml氯仿終止反應(yīng)并萃取。萃取液用氣相色譜檢測(cè)。酶活力單位(u)定義為：在測(cè)定條件下，每分鐘產(chǎn)生1nmol二氫β-紫羅蘭酮所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位。

(2)最適反應(yīng)溫度的測(cè)定

在20-55℃范圍內(nèi)，每隔5℃，分別測(cè)定酶活。緩沖為50mmol/ltris-hcl緩沖液，ph7.5，結(jié)果如圖12所示。結(jié)果表明，本發(fā)明所述青蒿醛雙鍵還原酶1的最適反應(yīng)溫度為45℃。

(3)最適ph測(cè)定

在不同的ph(5.0-9.0，50mmol/ltris-hcl緩沖液)條件下，分別測(cè)定酶活(反應(yīng)溫度45℃)，結(jié)果如圖13所示。結(jié)果表明，本發(fā)明所述青蒿醛雙鍵還原酶1的最適反應(yīng)ph為6.5。

(4)溫度穩(wěn)定性測(cè)定

在ph6.5下，使酶在40℃，45℃，50℃溫度下分別保溫不同的時(shí)間(0，20，40，60，80，100，120min)，再測(cè)定相對(duì)酶活，以未保溫(4℃保存)的酶活性為100％，結(jié)果如圖14所示。結(jié)果表明，本發(fā)明所述本發(fā)明所述青蒿醛雙鍵還原酶1在40℃下保溫2h殘余酶活力高于75％。

(5)ph穩(wěn)定性測(cè)定

將純化的重組酶在不同的ph(5.0-9.0，50mmol/ltris-hcl緩沖液)下40℃處理1h，與不保溫酶的酶相比，結(jié)果如圖15所示。結(jié)果表明，本發(fā)明所述青蒿醛雙鍵還原酶1在ph5-7.5條件下，40℃保溫1h后仍能具有90％以上的殘余酶活力。

5、本發(fā)明所述青蒿醛雙鍵還原酶1優(yōu)選制備方法

將重組質(zhì)粒pet-28a-dbr1轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)宿主菌(購(gòu)自novagen公司)，在含有卡那霉素(50μg/ml)的lb平板(lb培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl5g/l，瓊脂15g/l)上經(jīng)過(guò)37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑轉(zhuǎn)化子到200ml的lb培養(yǎng)基中(50μg/ml卡那霉素)37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)至od600為0.6時(shí)，加入終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8和1mmol/liptg誘導(dǎo)劑，32℃培養(yǎng)18h。用高速冷凍離心機(jī)分別將200ml培養(yǎng)液在4℃下，以13,000rpm離心15min，收集菌體。在菌體中加入一定體積緩沖溶液，重懸后，超聲波破碎細(xì)胞，獲得全細(xì)胞裂解液，取一定體積全細(xì)胞裂解液以13,000rpm離心15min，獲得上清液可溶性蛋白溶液，沉淀即為不溶性蛋白—包涵體。我們通過(guò)測(cè)定上清液中青蒿醛雙鍵還原酶1活力以及產(chǎn)物二氫β-紫羅蘭酮的產(chǎn)量來(lái)評(píng)價(jià)不同表達(dá)條件的效果，結(jié)果如圖16所示。結(jié)果表明，當(dāng)iptg濃度為0.6mmol/l時(shí)，本發(fā)明所述的基因重組菌分泌青蒿醛雙鍵還原酶1的活力最高。

誘導(dǎo)劑終濃度為0.6mmol/l，分別在22、27、32、37、42℃培養(yǎng)18h。考察溫度對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)酶活力的影響，結(jié)果如圖17所示。結(jié)果表明，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為27℃時(shí)，本發(fā)明所述的基因重組菌分泌青蒿醛雙鍵還原酶1的活力最高。

誘導(dǎo)劑終濃度為0.6mmol/l，在27℃培養(yǎng)18h?？疾斐跏紀(jì)d600對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)酶活力的影響，結(jié)果如圖18所示。結(jié)果表明，當(dāng)重組菌od600為1.8時(shí)，本發(fā)明所述的基因重組菌分泌青蒿醛雙鍵還原酶1的活力最高。

od600為1.8，誘導(dǎo)劑終濃度為0.6mmol/l，在27℃分別培養(yǎng)12、15、18、21、24h。考察時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)酶活力的影響，結(jié)果如圖19所示。結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基因重組菌18h時(shí)，本發(fā)明所述的基因重組菌分泌青蒿醛雙鍵還原酶1的活力最高。

6、本發(fā)明所述青蒿醛雙鍵還原酶1轉(zhuǎn)化β-紫羅蘭酮制備二氫β-紫羅蘭酮反應(yīng)歷程

酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系為500μl，其中β-紫羅蘭酮濃度為1mmol/l，酶添加量約為30u/mg，反應(yīng)在ph6.5，45℃下進(jìn)行，分別對(duì)不同反應(yīng)時(shí)間(0，10，20，30，60min)的樣品利用gc進(jìn)行成分檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖20-1～圖20-5。檢測(cè)結(jié)果表明，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化率逐漸提高。在反應(yīng)60min后，二氫β-紫羅蘭酮濃度為76.49mg/l，底物有效轉(zhuǎn)化率為78.77％。

以上僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>南京林業(yè)大學(xué)

<120>青蒿醛雙鍵還原酶dbr1及其重組菌在制備二氫-β-紫羅蘭酮中的應(yīng)用

<130>

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<213>人工序列

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