專利名稱：具有脂肪酶活性的酯酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脂肪酶和酯酶在生物轉(zhuǎn)化過程中作為催化劑的應(yīng)用。它特別涉及在這些過程中昆蟲酯酶和脂肪酶，及其突變體的應(yīng)用。本發(fā)明可以應(yīng)用于包括水解、酯化、酯基轉(zhuǎn)移(transesterification)、酯交換(interesterification)或?；磻?yīng)的任意過程中。本發(fā)明還可以應(yīng)用于化合物的酶分解反應(yīng)從而得到旋光化合物，并且特別的，但不是唯一的用于具有疏水部分如擬除蟲菊酯和脂肪酸酯的底物。
背景技術(shù)：
脂肪酶和酯酶的工業(yè)上的潛力包括它們的水解、酯化、酯基轉(zhuǎn)移以及酰化活性。Kazlauskas和Bornscheuer(1998)，Phythian(1998)，Anderson et al.(1998)，Jaeger和Reetz(1998)，Pandey et al.(1999)以及Villeneuve et al.(2000)中綜述了脂肪酶和酯酶所催化的工業(yè)反應(yīng)，這些參考文獻(xiàn)每一篇所公開的內(nèi)容在此以其全文并入?yún)⒖肌?br> 主要涉及脂肪酶和酯酶水解活性的應(yīng)用包括許多底物，如甘油三酯，脂肪族的、酯環(huán)族的、二環(huán)的和芳香族的酯以及甚至是基于有機(jī)金屬夾心(organometallic sandwich)化合物的酯。傳統(tǒng)應(yīng)用包括家用和工業(yè)用洗滌劑。其它工業(yè)應(yīng)用包括制革(leather tanning)、食品加工(包括果汁、焙烤食品、蔬菜發(fā)酵和強(qiáng)化奶(dairy enrichment))以及清除造紙工業(yè)所生產(chǎn)出的紙漿中的樹脂(pitch)?，F(xiàn)在也應(yīng)用于制藥和類藥劑營養(yǎng)品(neutraceuticai)部門，包括多種肥胖病的治療。也應(yīng)用于生物傳感器，特別是用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域以及食品和飲料工業(yè)中確定三酰甘油特別值得關(guān)注的是近來在多種生物轉(zhuǎn)化中利用脂肪酶或酯酶的水解能力獲得用于精細(xì)化工、制藥工業(yè)和農(nóng)用化學(xué)品工業(yè)的新的和/或手性的結(jié)構(gòu)單元或產(chǎn)品。在這些工業(yè)產(chǎn)品中，對區(qū)域(regio)純度和手性純度的要求日益增加。在1995年，治療總的銷售額估計(jì)達(dá)到1500億美元，其中的600億美元來自手性化合物。銷售額超過10億美元的手性藥物包括羥氨芐青霉素(一種抗生素)、卡托普利(captopril)(一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑)和促紅細(xì)胞生成素(造血生長因子)。通常，在所給的藥物或農(nóng)業(yè)化學(xué)化合物中，僅有一種對映體具有所需要的作用，但是管理權(quán)威機(jī)構(gòu)對所有有潛力新藥物中兩種/所有手性形態(tài)的評價的關(guān)注正日益增加。有時可選擇的形態(tài)實(shí)際上可能具有非所需的副作用，就象現(xiàn)在已經(jīng)出現(xiàn)的薩力多胺(thalidomide)的例子。在20世紀(jì)90年代，只有大約25％的醫(yī)藥品是對映體純的(enantiomerically pure)，但是在下一個十年，半數(shù)以上的新產(chǎn)品的工業(yè)設(shè)計(jì)都需要是手性純的。
在考慮這些酶水解活性下的一個應(yīng)用實(shí)例是包括擬除蟲菊酯殺蟲劑的農(nóng)用化學(xué)品的手性生物轉(zhuǎn)化，其中這些羧酸酯殺蟲劑中必需數(shù)量的醇和酸結(jié)構(gòu)單元可以通過對映體特異性水解從外消旋起始原料以高產(chǎn)率和高純度產(chǎn)生(Hirohara和Nishizawa，1998；Liese和Filho，1999)。這種應(yīng)用實(shí)例在美國專利No’s 5,180,671、4,985,364和6,207,429中也有描述。精細(xì)化學(xué)或制藥工業(yè)中酯酶和脂肪酶能夠用于酯外消旋物的動力學(xué)拆分的其它實(shí)例包括苯基縮水甘油酯(地爾硫卓(diltiazem)，一種心血管藥物的前體)，縮水甘油丁酸酯，和用于合成Trinems型β-內(nèi)酰胺抗生素的(1S-2S)-反-2-甲氧基環(huán)己醇。美國專利No.6,187,936中記載了一種通過酶催化的氨基醇酯交換反應(yīng)而進(jìn)行的3-苯基縮水甘油酸酯酶動力學(xué)拆分的方法，所述公開內(nèi)容并入交叉參考。美國專利No.5,571,704公開的內(nèi)容并入?yún)⒖?，其描述了在一種動物或微生物來源的脂肪酶以及一種與使酸酯化的醇不同的醇存在的條件下，通過將一種酯的對映體混合物進(jìn)行對映體酶酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)而制備(2R，3S)-3-(4-甲氧苯基)-環(huán)氧丙酸的酯。美國專利No.5,750,382，它所公開的內(nèi)容也并入?yún)⒖?，其描述了一種在?；w存在的條件下，利用脂肪酶對一種醇的外消旋混合物進(jìn)行處理而生產(chǎn)旋光2-烷氧基環(huán)己醇衍生物的方法。
值得關(guān)注的是水解作用的手性特異性能夠通過改變例如有機(jī)溶劑的使用和其它反應(yīng)條件而被改變。因此，一種特定的脂肪酶可以被用在完全不同手性特異性的反應(yīng)中(Rubio et al.(1991)；Kazlauskas和Bornscheuer，(1998)；Villeneuve et al.(2000)，以及Berglund(2001))。
此外，對有機(jī)溶劑的條件進(jìn)行適當(dāng)處理，正向的水解反應(yīng)被抑制，同時逆向的酯化反應(yīng)占主導(dǎo)(參見，Villeneuve et al.，2000；Berglund2001)。根據(jù)酶和反應(yīng)條件，這種逆向反應(yīng)可能會也可能不會是區(qū)域-或手性特異的，并且對于選擇性的和非選擇性的酯化反應(yīng)有著重要應(yīng)用。
作為非區(qū)域-選擇性酯化的例子，白色念珠菌(Candida albicans)β-脂肪酶(CALB)用于制備均相(homogeneous)甘油三酯特別有效。這是因?yàn)樗軌蝓；视偷闹倭u基和伯羥基從而得到例如長鏈ω-3型多不飽和脂肪酸甘油三酯。另一種需要純系產(chǎn)物的應(yīng)用包括通過多種短鏈醇與多種脂肪酸進(jìn)行酯化反應(yīng)而生成生物柴油(biodiesel)。見例如，專利No’s5,697,986和5,288,619，其內(nèi)容并入作為交叉參考。
然而，最近大多數(shù)注意集中在脂肪酶和酯酶在化學(xué)、區(qū)域和立體選擇性酯化反應(yīng)中的應(yīng)用。這種選擇性合成對于制藥和類藥劑營養(yǎng)品精細(xì)化學(xué)以及農(nóng)用化學(xué)品工業(yè)的重要性記載在上述關(guān)于酯酶和脂肪酶介導(dǎo)的水解反應(yīng)的討論中。對于它們的酯化反應(yīng)是同樣正確的。對映體選擇性酯化對于使用手性底物和動力學(xué)拆分外消旋體都很重要。值得注意的是，盡管在酯化和水解反應(yīng)中單獨(dú)的酶類物質(zhì)通常傾向相同的前手性基團(tuán)，但是這兩種反應(yīng)能夠用來生成相反的對映體。例如，通過一些脂肪酶進(jìn)行2-芐甲基甘油的乙酰化反應(yīng)生成(S)-一乙酸酯，而通過相同的酶進(jìn)行雙乙酸酯的水解反應(yīng)生成(R)-一乙酸酯，即使在這兩種情況下它們均在前-R位發(fā)生反應(yīng)(Kazlauskas和Bornscheuer(1998)及其參考文獻(xiàn))。
使用正反應(yīng)或逆反應(yīng)動力學(xué)拆分外消旋體的主要局限性在于最大可能的轉(zhuǎn)化率為50％。然而，這些方法的效率正在逐步提高。在下面的內(nèi)容中將描述基于誘變改善選擇性的改進(jìn)以及用于增強(qiáng)有機(jī)溶劑中的活性和穩(wěn)定性的新固定技術(shù)。另一個改良包括動態(tài)動力學(xué)拆分在，其中使用第二催化劑以誘導(dǎo)不被酶接受的對映體的外消旋化。在一些情形中，使用了必須與脂肪酶/酯酶相容的過渡金屬催化劑。
酯基轉(zhuǎn)移是指在酯和酸(酸解)，酯和另一種酯(酯交換)，或酯和醇(醇解)之間交換?；倪^程。在商業(yè)上相當(dāng)值得關(guān)注的是酯酶和脂肪酶催化的酯基轉(zhuǎn)移生產(chǎn)，例如貴重的食品。一個例子包括讓濃縮的牛奶和奶油產(chǎn)生奶香味。另一個例子包括利用酯的交換改進(jìn)蔬菜油使其達(dá)到高工業(yè)品質(zhì)。Lever/Unilever已經(jīng)就脂肪和甘油酯的酯交換獲得了一系列的專利，例如美國專利No’s 4,275,081和4,863,860，其內(nèi)容并入?yún)⒖?。這種方法所生成的酯交換的脂肪適合用于乳狀液和其它基于脂肪的食品如人造黃油、人造奶油和冰淇淋。
涉及聚合物的生產(chǎn)的脂肪酶/酯酶的一系列值得關(guān)注的應(yīng)用是開發(fā)它們的水解、酯化或酯基轉(zhuǎn)移的能力。例如，聚酯可以通過連續(xù)的雙官能酯和醇的酯化和酯基轉(zhuǎn)移、雙官能單體的自縮合以及內(nèi)酯的開環(huán)聚合生產(chǎn)(Chaudhary et al.1997及其參考文獻(xiàn))。美國專利No.5,478,910，其全文并入?yún)⒖?，它描述了一種生產(chǎn)聚酯的方法，所述方法包括一種有機(jī)二醇與有機(jī)二酯或有機(jī)二羧酸在超臨界流體和固體酯酶(優(yōu)選脂肪酶)存在的條件下發(fā)生反應(yīng)。并入?yún)⒖嫉拿绹鴮＠鸑o.5,962,624描述了一種通過多羥基化合物在有效量的脂肪酶存在的條件下反應(yīng)來制備線性聚酯的方法，所述多羥基化合物包括至少兩個伯醇基及至少一個仲醇或氨基基團(tuán)和一個二羧酸或一個二羧酸酯。多羥基化合物部分的二級OH或氨基未發(fā)生反應(yīng)。
酯酶和脂肪酶作為?；瘎┑臐摿碜杂谒鼈兊膬刹缴婕耙环N酰化酶中間體的反應(yīng)機(jī)制。在正反應(yīng)(水解)中，反應(yīng)僅是水?；?。對于逆反應(yīng)(酯化)，它是一種醇的?；?。然而許多酶在不必含氧的情況下?；H核體而不是水，或者酯化酰基供體而不是醇。然而過去的焦點(diǎn)一直集中在作為?；w的前手性醇，現(xiàn)在所關(guān)注的是更大范圍的化合物包括二醇、α-和β-羥基酸以及許多其它化合物。
白色念珠菌β-脂肪酶說明了許多關(guān)于交替?；?alternativeacylation)的潛力。因而，它接受氨基、過氧羥基和硫醇基團(tuán)作為親核體，而不是水或醇，并且它能夠用于制備旋光酰胺或溶解手性胺。使用這種酶的方法已經(jīng)被描述用于制備純β-氨基酸和R-胺。該酶催化羧基酯、甘油三酯、芳香酯、β-酮酸酯、α-β不飽和酯和丙烯酸酯(acryl ester)的氨解。已經(jīng)制備了N-酰基氨基酸和N-?；被狨０罚乙灿袠O大的可能制備出碳酸鹽和氨基甲酸鹽。特別是后者對制藥工業(yè)具有極大價值。然而當(dāng)前的化學(xué)合成包含一些明顯毒性的試劑，脂肪酶介導(dǎo)的合成使用，例如乙烯基碳酸鹽或碳酸肟。
?；椒ǖ睦邮敲绹鴮＠鸑o.5,210,030，其描述了通過使用固定化脂肪酶、?；w和干燥的非羥基有機(jī)溶劑進(jìn)行免疫霉菌素(immunomycin)的選擇性?；?；美國專利No.5,387,514，其描述了通過使用乙烯酯和一種固定在聚苯乙烯樹脂上的脂肪酶對醇進(jìn)行酰化的方法；美國專利6,261,813，其描述了一種衍生具有羥基基團(tuán)的化合物的方法，所述方法是使用雙官能?；w在脂肪酶存在的條件下通過背對背(back to back)?；瘉硇纬苫罨孽；セ蛱妓猁}，隨后其在脂肪酶存在的條件下來被用于酰化一種親核體；以及美國專利No.5,902,738，其描述了在?；瘎?、有機(jī)溶劑和脂肪酶存在的條件下通過?；环N化合物來制造用于生產(chǎn)維生素A的前體的方法。
許多關(guān)于酶的有用的反應(yīng)特別依賴于使用有機(jī)溶劑，在這些溶劑中催化速度能夠被減慢。對此問題的解決包括在無機(jī)基質(zhì)如硅膠上的固定。它能夠通過吸附或共價交聯(lián)來完成。用于固定的另外方案包括交聯(lián)的酶晶體、逆膠束和脂質(zhì)或表面活性物質(zhì)包被的酶。多種可選方案記載在(Kazlauskas和Bornscheuer，1998；Villeneuve et al.2000；以及Berglund 2001)。
除了操縱處理反應(yīng)條件(’溶劑工程’(solvent engineering))，還可能通過遺傳工程來改變對映選擇性。兩種不同的方法已經(jīng)被測試；定點(diǎn)誘變和體外進(jìn)化。前者依賴于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和底物的交互作用的現(xiàn)有經(jīng)驗(yàn)或推論知識從而得到預(yù)知效果的突變。這通常稱為推理方案(rationaldesign)，而且在酯酶和脂肪酶的方案中，超過一打的相關(guān)羧基/膽堿酯酶和脂肪酶的三級結(jié)構(gòu)的經(jīng)驗(yàn)信息很有幫助。后者不必使用這樣的現(xiàn)有信息，但是需要通過多種突變的選擇積累來提高所需要的效果，無論在靶基因/酶系統(tǒng)或其區(qū)域中?，F(xiàn)在有一些新的影響酯酶/脂肪酶對映特異性(enantiospecificity)的兩種方法的實(shí)例(參見Villeneuve et al.2000；Svendsen 2000；以及Berglund 2001作為回顧)。
通過推理方案改變對映特異性的最好的證據(jù)包括在sn-1(3)區(qū)域選擇性米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶(ROL)的活性位點(diǎn)之內(nèi)的一個底物結(jié)合位點(diǎn)(Scheib et al.1998)。容納sn2取代基的ROL疏水部分(hydrophobic patch)中的258殘基被證實(shí)對于triradylglycerols水解的立體專一性非常重要，而在同樣疏水部分的254殘基的作用很小。在這個例子中，突變體的經(jīng)驗(yàn)行為與經(jīng)過推理方案原理的預(yù)知行為十分一致。然而在另一個定點(diǎn)誘變的實(shí)例中，經(jīng)驗(yàn)行為與預(yù)知的不同。在包括來源于洋蔥伯克霍爾德氏菌(Pseudomonas cepacia)脂肪酶PS的例子中(Hirose et al.1995)，盡管沒有一個單獨(dú)突變有顯著的作用，但是1，4-二氫吡啶水解的立體專一性在一種221、266和287位點(diǎn)的三元突變體中發(fā)生反轉(zhuǎn)。
通過體外進(jìn)化來改變對映特異性的進(jìn)一步證據(jù)包括一種銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)脂肪酶(PAL)，其與上述的脂肪酶PS十分相關(guān)(Liebeton et al.2000)。經(jīng)過四輪進(jìn)化之后，突變體被挑選出來，其已經(jīng)為模型底物2-甲基癸酸p-硝基苯酚酯的水解而充分改變了對映特異性。突變體酶具有五種不同的突變，所有突變均遠(yuǎn)離酶的底物結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合的底物的立構(gòu)中心。相反，它們位于、或接近環(huán)，該環(huán)參與位于活性位點(diǎn)邊緣的從“關(guān)閉的”到開放“蓋(lid)”構(gòu)型的酶的轉(zhuǎn)換。
現(xiàn)在，一些酯酶和較多的脂肪酶應(yīng)用在工業(yè)上，然而直到本發(fā)明問世，它們沒有一個涉及昆蟲酯酶或脂肪酶的這種應(yīng)用。
雙翅目昆蟲α-羧基酯酶簇(carboxyl esterase cluster)是羧基/膽堿酯酶多基因家族中的一組系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)基因，其還通常在基因組中物理的緊密連接(Oakeshott et al.，1999)。來自果蠅(Drosophila)，綠蠅(Lucilia)和蒼蠅(Musca)屬的更高級的雙翅目物種中的這個簇的分子特征已經(jīng)明確。由于突變帶來了簇對OP殺蟲劑的抗性圖譜，所以它在過去十年倍受關(guān)注(Newcomb et al.，1997；Campbell et al.，1998；Claudianos et al.，1999)。它在羧基/膽堿酯酶多基因家族(附圖1)系統(tǒng)發(fā)育分析中形成了一種不同的副進(jìn)化枝(sub-clade)。至今為止的鑒定的進(jìn)化枝上僅有的其它成員是其它昆蟲羧酸酯酶突變體，這些突變體也暗示具有OP抗性中(附圖1)。這些包括了低等雙翅目(蚊)、半翅目(蚜蟲)和膜翅目(黃蜂)的基因/酶類。因此，很有可能這種與果蠅α-酯酶簇具有至少大約30％同一性的羧酸酯酶的進(jìn)化枝存在于整個昆蟲綱除了被廣泛用作判斷羧酸酯酶活性的能夠在體外水解簡單的、水溶性的、合成的酯如丁酸甲酯和乙酸萘酯，人們很少知道這些羧酸酯酶的天然(即非OP殺蟲劑)底物。它們的羧酸酯酶活性在已經(jīng)獲得OP水解酶活性的突變體中被嚴(yán)重破壞。
本發(fā)明已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，昆蟲酯酶和脂肪酶如α-羧酸酯酶進(jìn)化枝中的那些及其突變體，也具有抗包括脂肪酸酯，例如4-甲基傘形酮棕櫚酸酯(4-methyl umbelliferyl palmitate)以及非脂肪酸疏水分子例如擬除蟲菊酯的多種大的和疏水的羧酸酯的活性。
發(fā)明概述第一方面，本發(fā)明提供了一種基于酶的生物催化方法，其中酶是一種昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體。
脂肪酶通常被認(rèn)為通過簡單酸部分(simple acid moieties)和復(fù)合醇部分親近(favour)底物，而酯酶通常被認(rèn)為是通過復(fù)合酸和簡單醇(simple alcohol moieties)部分來親近底物(參見，例如，Phythian，1998)。昆蟲酯酶或脂肪酶如α-羧酸酯酶進(jìn)化枝中的那些及其突變體在容納簡單或復(fù)合酸或醇部分時是與眾不同的。因此，上述的昆蟲酯酶和其突變體可以被認(rèn)為是酯酶或脂肪酶。
此外，象一些其它的脂肪酶和酯酶，這些昆蟲酯酶和脂肪酶顯示出高度的區(qū)域和立體特異性。而且，它們的區(qū)域和立體特異性能夠通過簡單的氨基酸變化而在性質(zhì)上發(fā)生改變。這些突變能夠改變其酸和醇基團(tuán)的立體特異性。因此它們有潛在的廣泛用途，現(xiàn)在正在開發(fā)用于基于脂肪酶或酯酶的生物催化作用。
在第一方面優(yōu)選的實(shí)施方案中，昆蟲酯酶或脂肪酶是酶的羧基/膽堿酯酶多基因家族中的一員。更優(yōu)選地，昆蟲酯酶或脂肪酶來源于這個多基因家族中的α-羧酸酯酶進(jìn)化枝(Oakeshott et al.，1999)。甚至更優(yōu)選地，昆蟲酯酶或脂肪酶是在這個多基因家族中形成副進(jìn)化枝的α-羧酸酯酶簇中的一員(Oakeshott et al.，1999)(圖1)。形成這種副進(jìn)化枝的酯酶或脂肪酶至少包括可以分離自雙翅目、半翅目和膜翅目種類的α-羧酸酯酶。在這種副進(jìn)化枝中發(fā)現(xiàn)的特定的酶包括，但不限于，E3、EST23或E4酯酶或脂肪酶。然而，來自于其它昆蟲種類的E3、EST23或E4的定向同源物(orthologous)也可以用于本發(fā)明的方法中。
優(yōu)選地，α-羧酸酯酶可以從雙翅目中分離得到。更優(yōu)選地，a-羧酸酯酶簇來自包括果蠅、綠蠅和蒼蠅屬的更高級的雙翅目(Oakeshott etal.，1999)。因此，用于本發(fā)明的優(yōu)選的α-羧酸酯酶是E3酯酶(SEQ IDNO1)，其分離自銅綠蠅(Lucilia cuprina)，或EST23酯酶(SEQ ID NO2)，其分離自黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體昆蟲酯酶或脂肪酶具有發(fā)生在活性位點(diǎn)的氧離子空穴(oxyanion hole)、酰基結(jié)合口袋(acyl binding pocket)或陰離子位點(diǎn)區(qū)域或其組合的突變。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變體α-羧酸酯酶選自由E3G137R，E3G137H，E3W251L，E3W251S，E3W251G，E3W251T，E3W251A，E3W251L/F309L，E3W251L/G137D，E3W251L/P250S，E3F309L，E3Y148F，E3E217M，E3F354W，E3F354L和EST23W251L組成的組中。優(yōu)選地，突變體α-羧酸酯酶是E3W251L，E3F309L，E3W251L/F309L或EST23W251L。
在第一方面另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，a-羧酸酯酶，或其突變體，具有選自由下列序列組成的組中的序列i)如SEQ ID NO1所示的序列，ii)如SEQ ID NO2所示的序列，iii)如SEQ ID NO3所示的序列，及iv)一種序列，其與與i)至iii)的任意一種至少40％相同，其能夠水解疏水酯。更優(yōu)選地，該多肽與與i)至iii)中任意一種至少50％相同，更優(yōu)選至少60％相同，更優(yōu)選至少70％相同，更優(yōu)選至少80％相同，更優(yōu)選至少90％相同，更優(yōu)選至少95％相同，甚至更優(yōu)選至少97％相同本發(fā)明的生物催化方法由下列反應(yīng)式組成或包括下列反應(yīng)式 其中
R，R2和R3是相同的部分Z，或R是部分Z的立體異構(gòu)體的混合物，R2是部分Z的立體異構(gòu)體，R3是富含另一種部分Z的立體異構(gòu)體的立體異構(gòu)體的混合物；R1，R4和R5是相同的部分Y，或R1是部分Y的立體異構(gòu)體的混合物，R5是該部分的一種立體異構(gòu)體及R4是富含另一種部分Y的立體異構(gòu)體的立體異構(gòu)體的混合物；Z和Y，可以相同也可以不同，可以是任何烴部分；和X是一種親核基團(tuán)。
Z和Y可以選自由下列組成的組中取代的或未取代的，飽和的或不飽和的直鏈或有支鏈的無環(huán)烴或任意被一個或多個雜原子阻斷的無環(huán)烴；取代的或未取代的，飽和的或不飽和的稠合多環(huán)烴；取代的或未取代的，飽和的或不飽和的橋烴；取代的或未取代的，飽和的或不飽和的螺環(huán)烴；取代的或未取代的，飽和的或不飽和的集合環(huán)；取代的或未取代的，飽和的或不飽和的，橋或非橋雜環(huán)系統(tǒng)；和取代的或未取代的，飽和的或不飽和的，螺環(huán)或非螺環(huán)，橋或非橋的稠合雜環(huán)系統(tǒng)。
Z和Y非限制實(shí)例是αβ不飽和羰基、酮、醛、酸、芳香基、酚、氰基-s環(huán)氧化物、α羥基酸、氨基、多羥基化合物和氨基酸。
因?yàn)榇嬖谝粋€平衡，因此可以選擇其中正反應(yīng)或逆反應(yīng)占主導(dǎo)的條件。
本發(fā)明的方法可以在正反應(yīng)占主導(dǎo)的條件下進(jìn)行。
在此情況下，本發(fā)明的方法可以用于化學(xué)的-、區(qū)域的或立體的選擇性水解反應(yīng)。例如，本方法可以用于從羧酸酯立體異構(gòu)體混合物中拆分一種立體異構(gòu)體。這些立體異構(gòu)體可以是對映體或位置立體異構(gòu)體。
在一個特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以用于旋光拆分一種(R)-酯化合物和一種(S)-酯化合物的混合物，包括以下步驟
(a)將一種昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體，與該混合物接觸以通過立體選擇性水解(R)酯化合物和(S)酯化合物中的一種而獲得一種旋光化合物或一種旋光醇化合物；以及(b)回收一種旋光化合物，該化合物選自由未被水解的旋光酸化合物、旋光醇化合物和旋光酯組成的組中。
該方法可以在逆反應(yīng)占主導(dǎo)的情況下進(jìn)行，在此情況下，本發(fā)明的方法可以用于?；环N化合物R5XH，其中R5和X如上述。
在這種情況下，本發(fā)明的方法可以用于化學(xué)的-、區(qū)域的-或立體選擇性的酯化反應(yīng)。例如，它可以利用純的起始化合物或起始化合物的外消旋混合物，即酯和R5XH來生產(chǎn)一種旋光酯。該立體異構(gòu)體可以是對映體或位置立體異構(gòu)體。
本發(fā)明的方法還可以是酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，例如，一般表述如下 或 本發(fā)明的方法可以是酯交換反應(yīng)(酯基互換(ester interchange))，例如，一般表述如下
該方法可以在底物上進(jìn)行，該底物是一種具有親水和/或疏水部分的酯。該酯可以是一種疏水羧基酯。疏水部分可以在酯中的酸和/或醇?xì)埢小Ｊ杷糠挚梢允?，例如C3到C36或更多的烴。疏水部分可以是包含疏水環(huán)基如一個或多個碳環(huán)的部分，其可以是飽和的或不飽和的。這種疏水部分可以是擬除蟲菊酯醇的殘基。
本發(fā)明的方法可以用于從一種光學(xué)異構(gòu)體混合物中生產(chǎn)一種旋光酸或醇。在酸的旋光拆分的情況下，底物可以是酸的單酯，如酸的C1-C4烷基酯。在醇的旋光拆分的情況下，底物可以是醇的單酯，如醇的C1-C4烷基酯。酸可以是一種取代的或未取代的環(huán)丙烷羧酸。醇可以是取代或未取代的苯氧芐醇。例如，本發(fā)明的方法可以用于生產(chǎn)用于合成擬除蟲菊酯殺蟲劑的擬除蟲菊酯酸或擬除蟲菊酯醇的旋光異構(gòu)體。擬除蟲菊酯是產(chǎn)自除蟲菊(Tanacetum cinerariifolium)的花的天然除蟲菊酯的合成類似物。對它們結(jié)構(gòu)的修飾所得到的化合物保留了天然產(chǎn)物本身的適度的脊椎動物毒性，同時成為更穩(wěn)定及更有效的殺蟲劑。擬除蟲菊酯可以是I型擬除蟲菊酯或II型擬除蟲菊酯，I型擬除蟲菊酯化合物(如芐氯菊酯(permethrin))不同于II型擬除蟲菊酯化合物，因?yàn)镮I型化合物在苯氧芐基部分的α-碳原子上有一個氰基。
擬除蟲菊酯的例子包括，但不局限于這些化合物；芐氯菊酯，cyloprothrin，，氰戊菊酯，順式氰戊菊酯，氟氰戊菊酯，氟胺氰菊酯，甲氰菊酯，d-fenothrin，cyfenothrin，丙烯菊酯，氯氰菊酯，溴氰菊酯，四溴菊酯，胺菊酯，芐呋菊酯和氟氯氰菊酯。
本發(fā)明的方法具有廣泛的應(yīng)用，這些應(yīng)用在前面的“發(fā)明背景”中已經(jīng)描述過，其中昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體用作催化劑。
因此使用酯酶或脂肪酶的本發(fā)明方法的應(yīng)用包括家用或工業(yè)用洗滌劑；制革；食品加工(包括果汁，焙烤食品，蔬菜發(fā)酵和強(qiáng)化奶)；清除造紙工業(yè)所生產(chǎn)出的紙漿中的樹脂；制藥和類藥劑營養(yǎng)品部門以及在生物傳感器方面的應(yīng)用也顯現(xiàn)出來，特別是用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域以及食品和飲料工業(yè)確定三酰甘油；在精細(xì)化工、制藥和農(nóng)用化學(xué)品工業(yè)中，利用生物轉(zhuǎn)化獲得新的和/或手性的結(jié)構(gòu)單元或產(chǎn)品，特別是那些基于區(qū)域-和手性純度的產(chǎn)品；農(nóng)用化學(xué)品工業(yè)的手性生物轉(zhuǎn)化，包括擬除蟲菊酯殺蟲劑，其中需要一定數(shù)量的這些羧基酯殺蟲劑的醇和酸的結(jié)構(gòu)單元；酯酶和脂肪酶催化的酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，用于生產(chǎn)例如貴重的食品，包括濃縮的牛奶和奶油中的乳品香料；利用酯交換(ester exchange)去修飾蔬菜油使其達(dá)到高工業(yè)品質(zhì)，包括適合用于乳劑和其它基于脂肪的食品如人造黃油、人造奶油和冰淇淋的酯交換的脂肪；聚合物的生產(chǎn)，例如，聚酯可以通過連續(xù)的雙官能酯和醇的酯化和酯基轉(zhuǎn)移、雙官能單體的自縮合作用以及內(nèi)酯的開環(huán)聚合生產(chǎn)；生產(chǎn)包括生物柴油的生物燃料；和?；磻?yīng)。
優(yōu)選的是，該方法是在含有液體的環(huán)境中進(jìn)行。
昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體，可以通過任何適宜的方式提供。這包括在有或沒有載體或賦形劑等的情況下直接提供昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體。昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體，也可以以宿主細(xì)胞的形式提供，如轉(zhuǎn)化的原核生物或真核生物細(xì)胞，典型的是微生物如細(xì)菌或真菌，該宿主細(xì)胞表達(dá)了一種編碼昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體的多核苷酸。
昆蟲酯酶或脂肪酶或其突變體也可以以在一種聚合海綿體或泡沫的形式提供，該泡沫或海綿體包含被固定在一種聚合的多孔載體上的昆蟲酯酶或脂肪酶或其突變體。
優(yōu)選的多孔載體包含聚氨基甲酸酯。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，海綿體或泡沫進(jìn)一步包含植入多孔載體或與多孔載體整合成一體的碳。
值得注意的是，在本發(fā)明的方法中使用表面活性劑可以釋放出潛在的底物，特別是那些來源于任何例如樣品沉積物的疏水性物質(zhì)。從而提高本發(fā)明方法的效率。因此在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包含表面活性劑。更優(yōu)選的是，該表面活性劑是生物表面活性劑。
在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于生成和選擇能夠水解疏水酯的酶的方法，該方法包括(i)將一種或多種突變引入到昆蟲酯酶或脂肪酶，或者已經(jīng)發(fā)生了突變的昆蟲酯酶或脂肪酶中，并且(ii)確定突變體昆蟲酯酶或脂肪酶水解疏水酯的能力。
優(yōu)選地，疏水酯是一種脂肪酸酯。
優(yōu)選地，一種或多種突變能夠提高酯酶或脂肪酶的水解活性和/或改變酯酶或脂肪酶的立體專一性。
優(yōu)選地，昆蟲酯酶或脂肪酶是一種α-羧酸酯酶。
優(yōu)選的，α-羧酸酯酶具有一種序列，所述序列選自由下列序列組成的組中i)如SEQ ID NO1所示的序列，ii)如SEQ ID NO2所示的序列，iii)如SEQ ID NO3所示的序列，和iv)一種序列，其與i)至iii)的任意一種至少40％相同。更優(yōu)選地，該序列與i)至iii)中任意一種至少50％相同，更優(yōu)選至少60％相同，更優(yōu)選至少70％相同，更優(yōu)選至少80％相同，及更優(yōu)選至少90％相同，更優(yōu)選至少95％相同，甚至更優(yōu)選至少97％相同。
優(yōu)選地，一種或多種突變發(fā)生在酯酶或脂肪酶選自由氧離子空穴、?；Y(jié)合口袋和陰離子位點(diǎn)的區(qū)域內(nèi)。
優(yōu)選地，所述突變是點(diǎn)突變。
優(yōu)選地，已經(jīng)被突變的昆蟲酯酶或脂肪酶選自由E3G137R，E3G137H，E3W251L，E3W251S，E3W251G，E3W251T，E3W251A，E3W251L/F309L，E3W251L/G137D，E3W251L/P250S，E3F309L，E3Y148F，E3E217M，E3F354W，E3F354L，和EST23W251L組成的組中。
在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于生成和選擇能夠水解酯的昆蟲α-羧酸酯酶的方法，該方法包括(i)將一種或多種突變引入昆蟲α-羧酸酯酶，或者已經(jīng)發(fā)生了突變的昆蟲α-羧酸酯酶中，并且(ii)確定昆蟲突變體α-羧酸酯酶水解酯的能力。
優(yōu)選地，一種或多種突變提高昆蟲α-羧酸酯酶的水解活性和/或改變昆蟲α-羧酸酯酶的立體專一性。
更進(jìn)一步，本發(fā)明提供一種通過前兩方面所述方法得到的酶。
在下文中，通過非限制性的實(shí)施例以及


描述本發(fā)明。
附圖簡要說明圖1羧基/膽堿酯酶多基因家族的系統(tǒng)發(fā)育(Oakeshott et al.1999)。經(jīng)過分析的140蛋白質(zhì)的大多數(shù)的序列都能夠在Pfam，C.elegans(http://www.sanger.ac.uk/Projects/C_elegans/blast_server.shtml)和COG NCBI數(shù)據(jù)庫中找到。關(guān)鍵性的參考來自O(shè)akeshott et al.(1999)。序列是采用Genetics Computer Group(GCG)的Pileup程序排列的，默認(rèn)設(shè)置為(間隙分量(gap weight)3.0和間隙長度分量(gap length weight)0.1)。通過(●)顯示含有多重旁系同源(multiple paralogous)序列的終端譜系(terminal lineages)。C.elegans數(shù)據(jù)庫中關(guān)于49序列的系統(tǒng)發(fā)育的全部描述在Oakeshott et al.(1999)中也已經(jīng)給出。CE＝羧酸酯酶。脊椎動物CES1-CES4族就是Satoh和Hosokawa(1998)所述的那些。
圖2E3(SEQ ID NO1)和加利福尼亞電鰻(Torpedo californica)乙酰膽堿酯酶(SEQ ID NO4)的氨基酸序列對比。圍繞活性位點(diǎn)絲氨酸和殘基Gly137、Trp251和Phe309的序列為粗體并加了下劃線。
圖3所提出的?；磻?yīng)中LcE3羧酸酯酶的活性位點(diǎn)的構(gòu)型。
圖4在含有桿狀病毒表達(dá)的酯酶的細(xì)胞提取物中進(jìn)行的典型的滴定實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖51R/S順式和反式芐氯菊酯、1R/S順式和反式NRDC157和順式溴氰菊酯的四種立體異構(gòu)體的分子結(jié)構(gòu)。
圖6利用E3W251L水解順式和反式芐氯菊酯(0.5μM)。
序列表索引SEQ ID NO1-銅綠蠅E3α-羧酸酯酶氨基酸序列SEQ ID NO2-黑腹果蠅EST23α-羧酸酯酶氨基酸序列。
SEQ ID NO3-桃蚜(Myzus persicae)E4α-羧酸酯酶氨基酸序列。
SEQ ID NO4-加利福尼亞電鰻乙酰膽堿酯酶的部分氨基酸序列。
發(fā)明詳述普通技術(shù)除非另外說明，本發(fā)明所使用的重組DNA技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)操作。這些技術(shù)在下列文獻(xiàn)中均有描述和解釋，如J.Perbal，APractical Guide to Molecular Cloning，John Wiley和Sons(1984)，J.Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbour Laboratory Press(1989)，T.A.Brown(編者)，Essential Molecular BiologyA Practical Approach，Volumes 1和2，IRL Press(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(編者)，DNA CloningA Practical Approach，Volumes 1-4，IRL Press(1995和1996)，以及F.M.Ausubel et al.(編者)，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括至今為止的所有更新)，并且這些文獻(xiàn)并入?yún)⒖肌?br> 定義在本說明書中，術(shù)語“取代”包括被一種基團(tuán)取代，該基團(tuán)可以被或可以不被一個或多個基團(tuán)進(jìn)一步取代，所述一個或多個基團(tuán)選自烷基，環(huán)烷基，鏈烯基，炔基，芳香基，芳香烴(arylalkyl)，鹵素，鹵烷基，鹵炔基，羥基，烷氧基，鏈烯氧基，鹵代烷氧基，鹵代鏈烯氧基，硝基，氨基，硝基烷基，硝基烯基，硝基炔基，硝基雜環(huán)，烷基氨基，二烷基氨基，烯基胺，炔基氨基，酰基，烯?；?alkenacyl)，炔酰基，酰氨基，二?；被?，酰氧基，烷基磺酰氧基，雜環(huán)，雜環(huán)氧基，雜環(huán)氨基，鹵代雜環(huán)，烷基磺酰基，烷氧羰基，硫代烷基，硫代酰基，含磷基團(tuán)如膦?；脱蹯⒒?。
本文所用的術(shù)語“烷基”的含義是指直鏈烷基如甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，異丁基，仲丁基，叔丁基等等。烷基基團(tuán)可以任意地被一個或多個基團(tuán)取代，所述這些基團(tuán)選自烷基，環(huán)烷基，烯基，炔基，鹵素，鹵代烷基，鹵代炔基，羥基，烷氧基，鏈烯氧基，鹵代烷氧基，鹵代鏈烯氧基，硝基，氨基，硝基烷基，硝基烯基，硝基炔基，硝基雜環(huán)，烷基氨基，二烷基氨基，烯基胺，炔基氨基，酰基，烯?；?alkenoyl)，炔?；０被?，二酰氨基，酰氧基，烷基磺酰氧基，雜環(huán)，雜環(huán)氧基，雜環(huán)氨基，鹵代雜環(huán)，烷基磺?；?，烷氧羰基，硫代烷基，硫代酰基，含磷基團(tuán)如膦酰基和氧膦基。
本文所用的術(shù)語″烷氧基″表示直鏈或有分枝的烷氧基，優(yōu)選C1-10烷氧基。例如包括甲氧基，乙氧基，正-丙氧基，異丙氧基和不同的丁氧基異構(gòu)體。
本文所用的術(shù)語″烯基″表示形成自直鏈，有支鏈的或單-或多環(huán)烯烴和聚烯烴的基團(tuán)。取代基包括如前面所述的單-或聚-不飽和烴基或環(huán)烷基，優(yōu)選C2-10烯基。烯基的例子包括乙烯基，烯丙基，1-甲基乙烯基，丁烯基，異丁烯基，3-甲基-2-丁烯基，1-戊烯基，環(huán)戊烯基，1-甲基-環(huán)戊烯基，1-己烯基，3-己烯基，環(huán)己烯基，1-庚烯基，3-庚烯基，1-辛烯基，環(huán)辛烯基，1-壬烯基，2-壬烯基，3-壬烯基，1-癸烯基，3-癸烯基，1，3-丁間二烯基，1-4，戊二烯基，1，3-環(huán)戊二烯基，1，3-己二烯基，1，4-己二烯基，1，3-環(huán)己二烯基，1，4-環(huán)己二烯基，1，3-環(huán)庚二烯基，1，3，5-環(huán)庚三烯基，或1，3，5，7-環(huán)辛四烯基。
本文所用術(shù)語″鹵素″表示氟，氯，溴或碘，優(yōu)選溴或氟。
本文所用術(shù)語″雜原子″表示O，N或S。
或單獨(dú)或在化合物詞組如″酰氧基″，″酰硫基″，″酰氨基″或“二酰氨基″中使用的術(shù)語″?；灞硎疽环N脂肪族?；鸵环N含有雜環(huán)的被稱作雜環(huán)酰基的?；瑑?yōu)選C1-10烷?；ｕ；睦影ò被柞；?；直鏈或有支鏈的烷酰基，如甲?；?，乙?；；?，丁?；?，2-甲基丙?；祯；?，2，2-二甲基丙?；?，己酰基，庚?；?，辛?；甚；秕；?；烷氧羰基，如甲氧羰基，乙氧羰基，t-丁氧羰基，t-戊氧羰基或庚氧羰基；環(huán)烷羰基如環(huán)丙烷羰基，環(huán)丁烷羰基，環(huán)戊烷羰基或環(huán)己烷羰基；烷基磺?；缂淄榛酋；蛞彝榛酋；?；烷氧磺酰基，如甲氧磺?；蛞已趸酋；?；雜環(huán)烷羰基；雜環(huán)烷?；邕量┩榛阴；量┩榛；量┩榛□；?，吡咯烷基戊酰基，吡咯烷基己?；蜞邕蛲榛阴；?；雜環(huán)鏈烯?；珉s環(huán)丙稀?；?，雜環(huán)丁烯?；?，雜環(huán)戊烯酰基或雜環(huán)己烯?；?；或雜環(huán)乙醛?；玎邕蛲榛胰；蜻量┩榛胰；?。
昆蟲酯酶、脂肪酶及其突變體多肽的相同百分率通過gap creation penalty＝5，和gap extensionpenalty＝0.3的GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析(GCG程序)來確定。被測序列(query sequence)在長度上有至少15個氨基酸，而且GAP分析排列出覆蓋至少15個氨基酸區(qū)域的兩個序列。更優(yōu)選，被測序列在長度上有至少50個氨基酸，而且GAP分析排列出覆蓋至少50個氨基酸區(qū)域的兩個序列。更優(yōu)選，被測序列在長度上有至少100個氨基酸，而且GAP分析排列出覆蓋至少100個氨基酸區(qū)域的兩個序列。更優(yōu)選，被測序列在長度上有至少250個氨基酸，而且GAP分析排列出覆蓋至少250個氨基酸區(qū)域的兩個序列。甚至更優(yōu)選的，被測序列在長度上有至少500個氨基酸，而且GAP分析排列出覆蓋至少500個氨基酸區(qū)域的兩個序列。
本文所用的術(shù)語“其突變體”是指天然昆蟲酯酶或脂肪酶的突變體，與其所來源的天然昆蟲酯酶或脂肪酶相比，它們至少保持了一些能夠?qū)Υ颂幩龅暮セ衔锏乃饣钚?。?yōu)選的是，與其來源的天然昆蟲酯酶或脂肪酶相比，突變體具有增強(qiáng)的活性和/或改變了的立體專一性。
天然昆蟲酯酶或脂肪酶氨基酸序列的突變體能夠通過在本發(fā)明的核酸中引入適當(dāng)核苷酸變化或通過體外合成所需的多肽而制備得到。這些突變體包括，例如，在氨基酸序列中殘基的缺失、插入或取代。假如最終的蛋白質(zhì)產(chǎn)品具有所需要的性質(zhì)，可以結(jié)合使用缺失、插入或取代以得到最終的構(gòu)建體。
在設(shè)計(jì)氨基酸序列突變體中，突變點(diǎn)的定位和突變的性質(zhì)依賴于改進(jìn)的特性。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，天然昆蟲酯酶或脂肪酶發(fā)生突變以增強(qiáng)它們水解如此處所述的含酯化合物的能力。突變點(diǎn)可以單獨(dú)地或連續(xù)地改變，如通過(1)首先用選擇的保守氨基酸取代，然后根據(jù)結(jié)果用更多基本選擇取代，(2)缺失靶殘基，或(3)在鄰近位點(diǎn)插入其它殘基。這些突變體包括E3G137R，E3G137H，E3W251L，E3W251S，E3W251G，E3W251T，E3W251A，E3W251L/F309L，E3W251L/G137D，E3W251L/P250S，E3F309L，E3Y148F，E3E217M，E3F354W，E3F354L，和EST23W251L。
用于本發(fā)明方法的突變體也能夠通過使用DNA改組技術(shù)(DNAshuffling technique)(Patten et al.，1997)得到。DNA改組是一種遞歸(recursive)重組和突變的方法，其首先通過相關(guān)基因庫任意分裂，隨后通過primerless PCR進(jìn)行片段重組而實(shí)現(xiàn)。通常，DNA改組提供了一種產(chǎn)生多核苷酸文庫的方式，在本申請中，此文庫能夠被用于選擇或篩選多核苷酸，這種多核苷酸編碼能夠水解一種如此處所述的含酯化合物的酶。被選擇的酶的立體專一性也能夠被篩選。
通常，氨基酸序列缺失范圍從大約1到30個殘基，更優(yōu)選大約1到10個殘基，典型的大約1到5個相鄰殘基。
取代突變體在多肽分子中至少有一個氨基酸殘基被去掉而在這個位置有一個不同的殘基插入。取代誘變中最感興趣的位點(diǎn)包括被確定為活性或結(jié)合位點(diǎn)的點(diǎn)。其它感興趣的位點(diǎn)是那些在其中能夠從多種菌株或種類中獲得相同的特殊殘基的位點(diǎn)。這些位置可能對生物活性很重要。這些位點(diǎn)，特別是那些落在至少有三個其它相同的保守位點(diǎn)的序列中的那些位點(diǎn)，都能夠以一種相對保守的方式被取代。這種保守取代顯示在表1標(biāo)題為“示范取代”一欄中。
此外，假如需要，非天然的氨基酸或化學(xué)氨基酸相似物也能夠被作為一種取代或添加引入到昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體中。這些氨基酸包括，但不局限在，普同氨基酸的D-異構(gòu)體，2，4-二氨基丁酸，α-氨基異丁酸，4-氨基丁酸，2-氨基丁酸，6-氨基己酸，2-氨基異丁酸，3-氨基丙酸，鳥氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，羥脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，半胱磺酸，t-丁基甘氨酸，t-丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，環(huán)己基丙氨酸，β-丙氨酸，氟-氨基酸，設(shè)計(jì)的氨基酸(designer amino acid)，通常如β-甲基氨基酸，Ca-甲基氨基酸，Na-甲基氨基酸，和氨基酸類似物。
表1
在合成過程中或合成后經(jīng)過差異修飾的昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述修飾例如通過生物素化、芐基化、糖基化、乙?；?、磷酸化、通過已知保護(hù)/阻斷基團(tuán)的衍生化、蛋白酶剪切、與一種抗體分子或其它細(xì)胞配體的連接等來實(shí)現(xiàn)。這些修飾可增加本發(fā)明多肽的穩(wěn)定性和/或生物活性。
昆蟲酯酶，或脂肪酶，或其突變體，能夠通過多種方法制備得到，包括生產(chǎn)和回收天然蛋白質(zhì)、生產(chǎn)和回收重組體蛋白質(zhì)，以及化學(xué)合成蛋白質(zhì)。在一個實(shí)施方案中，編碼昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體的分離多肽通過在可有效的生產(chǎn)此多肽的條件下培養(yǎng)可表達(dá)此多肽的細(xì)胞，并回收此多肽來制備。一種優(yōu)選的用于培養(yǎng)的細(xì)胞是一種本發(fā)明的重組細(xì)胞。有效的培養(yǎng)條件包括，但并不局限于，允許蛋白質(zhì)生產(chǎn)的有效培養(yǎng)基、生物反應(yīng)器、溫度、pH和氧環(huán)境。有效培養(yǎng)基是指任何培養(yǎng)基，在其中細(xì)胞被培養(yǎng)用于生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。這些培養(yǎng)基典型地包含一種含水介質(zhì)，其中含有可同化碳、氮和磷酸鹽源，以及適當(dāng)?shù)柠}、礦質(zhì)、金屬和其它養(yǎng)分，如維生素。生產(chǎn)昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體的細(xì)胞能夠在常規(guī)的發(fā)酵生物反應(yīng)器、搖瓶、試管、微量滴定培養(yǎng)皿和平皿中培養(yǎng)?？梢栽谶m合重組細(xì)胞的溫度、pH和含氧量下進(jìn)行培養(yǎng)。這些培養(yǎng)條件是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的專業(yè)知識范圍內(nèi)的。
重組載體重組載體能夠用于表達(dá)昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體，以用于本發(fā)明的方法。此外，本發(fā)明的另一個實(shí)施方案包括一種重組細(xì)胞載體，它包括至少一個編碼昆蟲酯酶或脂肪酶或其突變體的分離多核苷酸，其被插入到任何可以傳遞多核苷酸分子到宿主細(xì)胞的載體中。這種載體含有異源多核苷酸序列，這種多核苷酸序列并非天然鄰近于編碼昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體的多核苷酸，并且它優(yōu)選來源于不同于酯酶或脂肪酶來源的物種。這種載體既可以是RNA也可以是DNA，既可以是原核的也可以是真核的，典型是病毒或質(zhì)粒。
一種類型的重組載體包含一種編碼昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體、并被可操縱連接到表達(dá)載體上的多核苷酸。短語可操縱連接是指多核苷酸分子以某種方式插入到表達(dá)載體中，因此此分子當(dāng)轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中時能夠被表達(dá)。本文所用的表達(dá)載體是一種DNA或RNA載體，它能夠轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并能夠影響特定的多核苷酸分子的表達(dá)。優(yōu)選地，表達(dá)載體也能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制。表達(dá)載體既可以是原核的也可以是真核的，典型地是病毒或質(zhì)粒。本發(fā)明的表達(dá)載體包括在本發(fā)明的重組細(xì)胞中發(fā)揮功能(即直接的基因表達(dá))的任何載體，包括在細(xì)菌、真菌、內(nèi)寄生物、節(jié)肢動物、其它動物和植物細(xì)胞中。本發(fā)明優(yōu)選的表達(dá)載體能夠在細(xì)菌、酵母、節(jié)肢動物和哺乳動物細(xì)胞中，更優(yōu)選在這里公開的細(xì)胞類型中直接進(jìn)行基因表達(dá)。
本發(fā)明的表達(dá)載體含有調(diào)節(jié)序列，如轉(zhuǎn)錄控制序列、翻譯控制序列、復(fù)制起點(diǎn)，和其它與重組細(xì)胞相容的調(diào)節(jié)序列，以及其它控制本發(fā)明多核苷酸分子表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。特別地，包含編碼昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體的多核苷酸的表達(dá)載體包括轉(zhuǎn)錄控制序列。轉(zhuǎn)錄控制序列是控制轉(zhuǎn)錄的開始、延長和終止的序列。特別重要的轉(zhuǎn)錄控制序列是那些控制轉(zhuǎn)錄開始的序列，如啟動子、增強(qiáng)子、操縱子和抑制子序列。適合的轉(zhuǎn)錄控制序列包括任何能夠在至少一個本發(fā)明重組細(xì)胞中發(fā)揮功能的轉(zhuǎn)錄控制序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知多種這樣的轉(zhuǎn)錄控制序列。優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄控制序列包括在細(xì)菌、酵母、節(jié)肢動物和哺乳動物細(xì)胞中發(fā)揮作用的那些，例如，但不局限于，tac，lac，trp，trc，oxy-pro，omp/lpp，rrnB，噬菌體λ，噬菌體T7，T71ac，噬菌體T3，噬菌體SP6，噬菌體SP01，金屬硫蛋白，α-交配因子，Pichia醇氧化酶，α病毒次基因組啟動子(如辛德比斯病毒(Sindbis virus)次基因組啟動子)，抗生素抗性基因，桿狀病毒，玉米夜蛾(Heliothis zea)昆蟲病毒，牛痘病毒，皰疹病毒，浣熊痘病毒，其它痘病毒，腺病毒，巨細(xì)胞病毒(如中間體早期啟動子)，猿猴病毒40，逆轉(zhuǎn)錄病毒，肌動蛋白，逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)序列，勞氏肉瘤病毒，熱激，磷酸鹽和硝酸鹽轉(zhuǎn)錄控制序列以及其它能夠控制原核或真核細(xì)胞基因表達(dá)的序列。另外適合的轉(zhuǎn)錄控制序列包括組織-特異性啟動子和增強(qiáng)子。
編碼昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體的多核苷酸也可以(a)含有分泌信號(即信號片段核酸序列)從而使被表達(dá)的昆蟲酯酶或脂肪酶或其突變體能夠從生產(chǎn)多肽的細(xì)胞中被分泌出來，和/或(b)含有融合序列。合適的信號片段包括任何能夠指引昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體分泌的信號片段。優(yōu)選的信號片段包括，但不局限于，組織纖溶酶原激活物(t-PA)，干擾素，白細(xì)胞介素，生長激素，組織相容性和病毒包膜糖蛋白信號片段，以及天然信號序列。此外，編碼昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體的多核苷酸可以結(jié)合一種能夠指引編碼的蛋白到達(dá)蛋白體的融合片段，如遍在蛋白融合片段。
宿主細(xì)胞本發(fā)明另一個實(shí)施方案包括一種重組細(xì)胞，該重組細(xì)胞中包含被一個或多個編碼昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體的多核苷酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。多核苷酸分子進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能夠通過任何多核苷酸分子能夠被插入細(xì)胞的方法來實(shí)現(xiàn)。轉(zhuǎn)化技術(shù)包括，但不局限于，轉(zhuǎn)染，電穿孔，顯微注射，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染，吸附和原生質(zhì)體融合。重組細(xì)胞能夠保持單細(xì)胞或可以生長為一種組織，器官或一種多細(xì)胞生物。被轉(zhuǎn)化的編碼昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體的多核苷酸能夠保持位于染色體外，或者能夠整合到轉(zhuǎn)化(即重組體)細(xì)胞染色體中的一個或多個位點(diǎn)上，如此一來，它們被表達(dá)的能力就被保留下來。
用于轉(zhuǎn)化的合適的宿主細(xì)胞包括任何可以被編碼昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體的多核苷酸所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞既可以是內(nèi)源性(即天然)產(chǎn)生昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體，也可以是在被至少一個編碼昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體的多核苷酸分子轉(zhuǎn)化之后產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是任何能夠產(chǎn)生至少一種昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體的細(xì)胞，并且包括細(xì)菌、真菌(包括酵母)、寄生物、節(jié)肢動物、動物和植物細(xì)胞。優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、分枝桿菌、酵母、節(jié)肢動物和哺乳動物細(xì)胞。更優(yōu)選的細(xì)胞包括沙門氏菌(Salmonella)，埃希氏菌(Escherichia)，芽孢桿菌(Bacillus)，利斯特氏菌(Listeria)，酵母(Saccharomyces)，夜蛾(Spodoptera)，分枝桿菌(Mycobacteria)，夜蛾(Trichoplusia)，BHK(幼倉鼠腎)細(xì)胞，MDCK細(xì)胞(用于犬科皰疹病毒培養(yǎng)的正常狗腎細(xì)胞系)，CRFK細(xì)胞(用于貓科皰疹病毒培養(yǎng)的正常貓腎細(xì)胞系)，CV-1細(xì)胞(用于例如培養(yǎng)浣熊痘病毒的非洲猴腎細(xì)胞系)，COS(例如COS-7)細(xì)胞和Vero細(xì)胞。特別優(yōu)選的宿主細(xì)胞是大腸桿菌，包括大腸桿菌K-12衍生物；傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)；鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)，包括減毒株；草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)；粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)；BHK細(xì)胞；MDCK細(xì)胞；CRFK細(xì)胞；CV-1細(xì)胞；COS細(xì)胞；Vero細(xì)胞；和非致瘤小鼠成肌細(xì)胞G8細(xì)胞(如，ATCC CRL 1246)。其它適合的哺乳動物細(xì)胞宿主包括其它腎細(xì)胞系，其它成纖維細(xì)胞系(如人，鼠和雞胚成纖維細(xì)胞系)，骨髓瘤細(xì)胞系，中國倉鼠卵巢細(xì)胞，小鼠NIH/3T3細(xì)胞，LMTK細(xì)胞和/或HeLa細(xì)胞。
重組DNA技術(shù)能夠通過操縱，例如，多核苷酸分子在宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)，多核苷酸分子能夠被轉(zhuǎn)錄的功效，所得轉(zhuǎn)錄物被翻譯的功效，以及翻譯后修飾的功效，而用于改進(jìn)被轉(zhuǎn)化的多核苷酸分子的表達(dá)。用于增強(qiáng)編碼昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體的多核苷酸的表達(dá)的重組技術(shù)包括，但并不局限于，將多核苷酸分子可操縱連接到高拷貝數(shù)質(zhì)粒中，將多核苷酸分子整合到一個或多個宿主細(xì)胞染色體中，在質(zhì)粒中加入載體穩(wěn)定序列，取代或修飾轉(zhuǎn)錄控制信號(例如啟動子，操縱子，增強(qiáng)子)，取代或修飾翻譯控制信號(例如，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，Shine-Dalgarno序列)，修飾本發(fā)明多核苷酸分子使其符合宿主細(xì)胞的密碼子選擇，以及刪除使轉(zhuǎn)錄物不穩(wěn)定的序列。
組合物可用于本發(fā)明的方法，或含有昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體的組合物包括本文稱為“可接受載體”的賦形劑。賦形劑可以是任何適合在本發(fā)明方法中使用的物質(zhì)。這些賦形劑包括水，鹽水，林格溶液，葡萄糖溶液，Hank’s溶液和其它含水的生理平衡鹽溶液。也可以使用非水性載體，如固定油，芝麻油，乙基油酸鹽或甘油三酯。其它有用的配方包括含有粘性增強(qiáng)劑的懸浮液，如羧甲基纖維素鈉，山梨糖醇，或葡聚糖。賦形劑也能夠含有少量添加劑，如增強(qiáng)等參性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)。緩沖液包括磷酸鹽緩沖液，碳酸氫鹽緩沖液和Tris緩沖液，同時防腐劑包括乙基汞硫代水楊酸鈉或o-甲酚，福爾馬林和苯甲醇。賦形劑也能夠用于增加組合物的半衰期，例如，但不局限于，聚合的控釋載體(controlledrelease vehicles)，可生物降解的植入體，脂質(zhì)體，細(xì)菌，病毒，其它細(xì)胞，油，酯和二醇。
此外，昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體，能夠用在增加生物催化速度和/或程度，或增加多肽穩(wěn)定性的組合物中。例如，昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體可以被固定在一種聚氨基甲酸酯基質(zhì)上(Gordon et al.，1999)，或包囊在適當(dāng)?shù)闹|(zhì)體中(Petrikovics et al.2000a和b)。昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體，也可以整合到含有一種泡沫的組合物中，所述泡沫如消防中常規(guī)應(yīng)用的那些泡沫(LeJeune et al.，1998)。
令本領(lǐng)域技術(shù)人員贊賞的是，昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體可以很容易的用在WO 00/64539公開的海綿或泡沫中，所述內(nèi)容在此以其全文并入?yún)⒖肌?br> 需要產(chǎn)生有效生物催化的昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體，(或表達(dá)昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體的宿主細(xì)胞)的濃度依賴于許多因素，包括所進(jìn)行的反應(yīng)本身的性質(zhì)，以及組合物的配方。可通過實(shí)驗(yàn)容易地測定組合物中昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體，(或表達(dá)昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體的宿主細(xì)胞)的有效濃度，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的。
表面活性劑值得注意的是，本發(fā)明方法中使用表面活性劑可以自，例如樣品沉積物中釋出潛在的底物，特別是那些疏水的。因此提高本發(fā)明方法的效率。
表面活性劑是既有親水又有疏水部分(通常為烴)的兩性分子，它優(yōu)先在各液相和不同程度極性和氫鍵結(jié)合之間的界面，如油/水或空氣/水界面處分隔開。這些性質(zhì)致使表面活性劑能夠降低表面和界面張力并形成微乳，在此烴能夠溶解在水中或水能夠溶解在烴中。表面活性劑具有許多有用的性質(zhì)，包括分散特性。
生物表面活性劑是一組由微生物合成的結(jié)構(gòu)多樣的表面活性分子。這些分子降低水溶液和烴混合物中表面和界面張力。生物表面活性劑相比于化學(xué)表面活性劑具有多種優(yōu)點(diǎn)，如更低毒性，更高生物可降解性，更好的環(huán)境相容性，更高的起泡性，在極度溫度、pH和鹽度的高選擇性和特異性，以及可以利用可再生資源合成的能力。
在本發(fā)明生物轉(zhuǎn)化方法中有用的生物表面活性劑包括，但不局限于糖脂如鼠李糖脂(來源于，如銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、海藻糖脂(來源于，如紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis))、槐糖脂(來源于，如Torulopsis bombicola)和纖維素二糖脂(cellobiolipids)(來源于，如Ustilago zeae)；脂肽和脂蛋白，如serrawettin(來源于，如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens))、枯草菌表面活性劑(來源于，如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis))、枯草桿菌蛋白酶(來源于，如枯草芽孢桿菌)、短桿菌肽(來源于，如短芽孢桿菌(Bacillus brevis))和多粘菌素(來源于，如多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa))；脂肪酸，中性脂質(zhì)和磷脂；聚合的表面活性劑，如乳化膠(來源于，如乙酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus))、biodispersan(來源于，如乙酸鈣不動桿菌)、甘露聚糖-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)(來源于，如熱帶假絲酵母(Candida tropicalis))、脂乳化劑(來源于，如解脂假絲酵母(Candida lypolytica))、蛋白質(zhì)PA(來源于，如銅綠假單胞菌)；以及微粒生物表面活性劑，如來源于如乙酸鈣不動桿菌的泡囊和菌毛。
實(shí)施例
實(shí)施例1構(gòu)建突變體圖2中給出了E3酶氨基酸序列與一種脊椎動物乙酰膽堿酯酶氨基酸序列(TcAChE，已知三維結(jié)構(gòu)；Sussman et al.，1991)的對比。利用Stratagene的QuickChangeTM定點(diǎn)誘變試劑盒(Site-DirectedMutagenesis Kit)構(gòu)建E3和EST23的突變體，并依照發(fā)生改變的殘基的數(shù)目以及改變的性質(zhì)來命名。例如，突變體E3W251L是一種E3突變體，其中野生型酶(即E3WT)的251位上的Trp殘基突變成Leu。
利用Newcomb et al.(1997)中所描述的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)E3和EST23酶，但使用HyQ SFX昆蟲無血清培養(yǎng)基(HyClone)來進(jìn)行增強(qiáng)表達(dá)。通過在pH為7.0、包含0.05％Triton X-100的0.1M的磷酸鹽緩沖液中，裂解濃度為108細(xì)胞ml-1的細(xì)胞制備細(xì)胞提取物。然后在通過二乙基香豆磷酸鹽(dECP)進(jìn)行酶的磷酸化時，應(yīng)用基于香豆素(一種熒光化合物)初始釋放的熒光測定法，來滴定提取物從而確定酯酶分子的數(shù)目。
圖3說明了在?；磻?yīng)中所提及的E3活性位點(diǎn)的構(gòu)造(基于脊椎動物AchE的三維結(jié)構(gòu))。我們已經(jīng)檢測了在與已知的AchE活性位點(diǎn)的三個明顯的次位點(diǎn)相對應(yīng)的區(qū)域中的7個E3殘基的突變。這些是氧離子空穴(E3殘基137)，陰離子位點(diǎn)(E3殘基148，217和354)和?；Y(jié)合口袋(acyl binding pocket)(E3殘基250，251和309)。陰離子位點(diǎn)和?；Y(jié)合口袋與Jarv(1984)命名中的p1和p2次位點(diǎn)相對應(yīng)。
在氧離子空穴中的突變在TcAChE氧離子空穴中包含Gly118，Gly119和Ala201，其與E3中的Gly136，Gly137和Ala219相對應(yīng)。在整個羰基/膽堿酯酶多基因家族中，這些殘基是高度保護(hù)的(Oakeshott et al.，1999)，并且通過一些膽堿酯酶和脂肪酶的X-射線結(jié)晶研究，已有實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明氧離子空穴結(jié)構(gòu)的保守性(Cygler和Schrag，1997)，雖然在一些脂肪酶的界面活化過程中，此結(jié)構(gòu)發(fā)生改變(Derewenda et al.，1992)。但也有其功能的實(shí)驗(yàn)性結(jié)構(gòu)證據(jù)證明其穩(wěn)定了在催化過程中作為第一過渡態(tài)的羧酸酯底物的羰基氧形成的氧陰離子(Grochulski et al.，1993；Martinez et al.，1994)。通過肽鏈中這三個關(guān)鍵殘基的酰胺基連接形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)而獲得這種穩(wěn)定(Ordentlich et al.，1998)。最近，Koellner et al.(2000)也已經(jīng)顯示AChE氧離子空穴中的兩個Gly殘基與內(nèi)埋的“結(jié)構(gòu)”水分子形成氫鍵，其可以在催化過程中保留，并被認(rèn)為作為潤滑劑促進(jìn)活性位點(diǎn)中底物和產(chǎn)物的交換。
除在OP抗性的銅綠蠅中天然形成的G137D之外，在E3的Gly137上形成三種進(jìn)一步的突變。首先，在G137E位，Glu被其它酸性氨基酸取代。突變體G137H也被構(gòu)建，因?yàn)樵谥行詐H下，His也是非質(zhì)子化的(對于Asp和Glu，pKa大約6.5 cf 4.4)，并且當(dāng)在其氧離子空穴中取代任一Gly時，發(fā)現(xiàn)在人丁酰膽堿酯酶上出現(xiàn)某些OP水解作用(Broomfield etal.，1999)。最后，為測定可能的最強(qiáng)的堿性取代的作用，在137位上取代Arg(pKa約12)。
?；Y(jié)合口袋的突變在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)膽堿酯酶特性的?；Y(jié)合口袋主要通過四個非極性殘基形成，其中的三個通常是芳香基。它們共同產(chǎn)生一種強(qiáng)疏水袋以容納結(jié)合底物的?；糠帧cAChE中的四個殘基是Trp233，Phe288，Phe290和Va1400，對應(yīng)于E3中的Trp251，Val307，Phe309和Phe422。疏水殘基的相似排列在于大多數(shù)羧基/膽堿酯酶的相應(yīng)位點(diǎn)是保守的(Oakeshott et al.，1993；Robin et al.，1996；Yao et al.，1997；Harelet al.，2000)。特別地是，在233/251殘基上，Trp是非常保守的，并且雖然在一些脂肪酶和少數(shù)羧酸酯酶中290/309為Leu或Ile，但在膽堿酯酶和大多數(shù)羧酸酯酶中290/309是Phe。對應(yīng)于TcAChE Phe288的殘基在優(yōu)選長鏈酯如丁酰膽堿的膽堿酯酶中典型地是一種支鏈脂肪族氨基酸。這包括哺乳動物丁酰膽堿酯酶和一些昆蟲乙酰膽堿酯酶，其具有一種類似于丁酰膽堿酯酶的底物特異性。支鏈脂肪族氨基酸在?；Y(jié)合口袋中提供一個更大的空間以容納較大的?；?br> 在一些膽堿酯酶中288/307和290/309突變的研究證實(shí)它們在確定與酰基特異性相關(guān)的底物特異性方面的重要作用。在人類AchE中，在任一位置用一個小的殘基如Ala對Phe進(jìn)行的取代增強(qiáng)了此酶對底物的動力學(xué)，所述底物如丙基-或丁基-(硫代)膽堿，其具有的?；笥谔烊灰阴?硫代)膽堿底物(Ordentlich et al.，1993)。在來源于黑腹果蠅和家蠅，Musca domestica的AchE中，等價于使靶位點(diǎn)具有OP抗性的巨大極性Tyr的290/309的天然突變對乙酰膽堿和OPs反應(yīng)性較低(Fournieret al.，1992；Walsh et al.，2001)。對于黑腹果蠅AchE，用更小的Leu對Phe殘基取代可以預(yù)期增強(qiáng)OP靈敏度，盡管用其它的小殘基如Gly，Ser或Val進(jìn)行取代沒有此作用(Villatte et al.，2000)。
在膽堿酯酶突變研究中盡管很少注意Trp 233/251，但是我們對E3先前的工作顯示再次使用更小的Leu殘基的取代增強(qiáng)了對具有巨大?；糠值聂人狨サ孜锘騉Ps的反應(yīng)性(Campbell et al.，1998a，b；Devonshire et al.，2002)。在黃蜂，Anisopteromalus calandrae的同族體(homologue)中也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了Gly的突變，其顯示出增強(qiáng)的馬拉硫磷羧酸酯酶(MCE)的動力學(xué)(Zhu et al.，1999)，同時在家蠅的同族體中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種可能與馬拉硫磷抗性有關(guān)的Ser(Claudianos et al.，2002)。關(guān)于OP水解酶活性，Devonshire et al.(2002)提出這種突變的特殊意義在于適應(yīng)在反應(yīng)過程中二級水解階段(second hydrolysisstage)必定出現(xiàn)的磷的反轉(zhuǎn)(inversion)。特別是，Devonshire et al.(2002)發(fā)現(xiàn)E3W251L的OP水解酶活性的Kcat比dMUP高一個數(shù)量級，其具有比dECP更小的二甲基磷酸基，其具有一個二乙基磷酸鹽基。這就暗示了甚至在具有較大酰基口袋的突變體中仍存在對反轉(zhuǎn)嚴(yán)格的空間約束。
我們已經(jīng)突變了E3的W251和F309殘基，以及與W251緊鄰的P250。除先前描述的天然W251L突變之外，現(xiàn)在我們已經(jīng)分析了在W251S，W251G，W251T和W251A中用四個其它小氨基酸的取代。一種W251L和P250S的雙重突變體也被分析了，因?yàn)榫哂懈進(jìn)CE活性的家蠅的E3定向同源物(ortholog)的天然變體在250和251位置分別具有Ser和Leu。只有一個F309取代被檢測，F(xiàn)309L，AchE結(jié)果顯示其應(yīng)該能夠增強(qiáng)MCE和OP水解酶活性。單獨(dú)和與W251L一起作為雙重突變體時分析了F309L。
在陰離子位點(diǎn)的突變膽堿酯酶的陰離子位點(diǎn)有時被稱為四價結(jié)合位點(diǎn)(對于乙酰膽堿中四價銨來說)，或在Jarv(1984)原始命名法中稱為p1次位點(diǎn)(subsite)。它主要包括Trp 84，Glu 199和Phe 330，Phe 331和Tyr 130(TcAChE命名)也包括在內(nèi)。因此除Glu 199之外，它是一種高度疏水的位點(diǎn)。Glu 199緊鄰催化性Ser200。在膽堿酯酶中或較小的程度上在許多羧酸酯酶中這些關(guān)鍵殘基高度保守(Oakeshott et al.，1993；Ordentlich etal.，1995；Robin et al.，1996；Claudianos et al.，2002)。除了Trp84(圖2中的序列對比顯示E3丟失了對應(yīng)于AChE殘基74-85的殘基)之外，E3在相應(yīng)位點(diǎn)(分別是217，354和148)具有和TcAChE相同的殘基。有趣的是，在一些脂肪酶和某些羧酸酯酶中Glu 199的等價物是Gln，Phe 330的等價物是Leu，其底物已知具有小的離去基團(tuán)(Thomas et al.，1999；Campbell et al.，2001；Claudianos et al.，2002)。
結(jié)構(gòu)和突變研究已經(jīng)詳述了膽堿酯酶催化中陰離子位點(diǎn)的作用。關(guān)鍵殘基在活性位點(diǎn)底部構(gòu)成氫鍵網(wǎng)絡(luò)的一部分，其中Tyr 130和Glu 199也共同與結(jié)構(gòu)水分子接觸(Ordentlich et al.，1995；Koellner et al.，2000)。當(dāng)?shù)孜镌谖挥诨钚晕稽c(diǎn)峽(active site gorge)的邊緣上與外圍結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合時，此陰離子位點(diǎn)發(fā)生一個構(gòu)象改變，新的構(gòu)象可容納底物的膽堿(離去)基團(tuán)，并促進(jìn)它的羰基碳和催化性Ser 200的相互作用(Shafferman et al.，1992；Ordentlich et al.，1995；1996)。因此，該位點(diǎn)主要在反應(yīng)的第一階段酶?；衅鹱饔?，特別是在非共價過渡態(tài)形成的階段中(Nair et al.，1994)。因此關(guān)鍵殘基的突變主要影響Km，而不是Kcat。與膽堿離去基團(tuán)的相互作用主要由非極性和π-電子相互作用介導(dǎo)，特別包括Trp 84和Phe 330(Ordentlich et al.，1995)OP抑制劑的研究顯示膽堿酯酶陰離子位點(diǎn)也容納它們的離去基團(tuán)，但是有一些證據(jù)提示部分位點(diǎn)(主要是Glu 199和Tyr 130，也可能是Ser226)可能也影響磷酸化酶的反應(yīng)性(Qian和Kovach，1993；并另見Ordentlich et al.，1996；Thomas et al.，1999)。
這里幾乎沒有關(guān)于對應(yīng)于AchE陰離子位點(diǎn)的羧酸酯酶位點(diǎn)的突變分析，但是一個有趣的例外是黑腹果蠅的EST6羧酸酯酶，它在相當(dāng)于Glu199的位點(diǎn)有一個His。其中His被Glu取代的一種突變體對多種羧酸酯底物表現(xiàn)出減弱的活性，但是獲得了一些乙酰硫代膽堿水解活性(Myerset al.，1993)。蚜蟲，桃蚜(Myzus persicae)的E4羧酸酯酶在此位置具有一個Met，而且此酶通常不與OPs反應(yīng)(Devonshive和Moores，1982)。然而，Met是否有助于OP水解酶活性還是未知的。同樣地，Y148F取代是家蠅OP抗性品系(也即G137D)的E3定向同源物中記錄的幾個之一，但是這種變化是否直接有助于OP水解酶活性還是未知的(Claudianoset al.，1999)。
E3中的Y148，E217和F354殘基現(xiàn)在已經(jīng)被突變。E217M和Y148F突變被用于測試上述桃蚜和家蠅酶中相應(yīng)的突變是否直接有助于它們的OP反應(yīng)性。G137D雙重突變體中的Y148F也被檢測，因?yàn)檫@是在抗性家蠅中發(fā)現(xiàn)的組合。F354突變?yōu)檩^小的Leu殘基和較大的Trp，通常在脂肪酶的這個位置上是Leu(見上述)。
實(shí)施例2酶滴定在小平板的1-4列中為每種所表達(dá)的酯酶建立4組100μl的反應(yīng)板孔空白含有0.025％Triton X-100，0.1M磷酸鹽緩沖液pH7.0；底物空白含有于0.025％Triton X-100中的100μM dECP，0.1M磷酸鹽緩沖液pH7.0；
細(xì)胞空白含有以1∶1的比例與0.1M的磷酸鹽緩沖液，pH7.0混合的50μl細(xì)胞提取物；滴定反應(yīng)含有以1∶1的比例與含有200μM dECP的0.1M的磷酸鹽緩沖液，pH7.0混合的50μl細(xì)胞提取物。
出來dECP，將所以組分(新鮮制備的，在緩沖液中濃度為200μM)加入到孔中。在一個板上，幾種酶被同時測定，并且順著一列將dECP同時加入到第二和第四個孔開始反應(yīng)。第一次讀數(shù)的時間間隔(典型的為1分鐘)被記錄下來用于隨后的計(jì)算。
在進(jìn)一步計(jì)算之前，所有讀取的值中均減去板孔空白(A)的均值。多種細(xì)胞提取物的初步實(shí)驗(yàn)顯示在460nm處它們具有熒光，并且將其加入分析產(chǎn)物，7-羥基香豆素溶液時焠滅了39(±7)％的熒光。因此在減去細(xì)胞提取物(c)固有的熒光之后，滴定反應(yīng)(D)中的熒光值被這種焠滅效應(yīng)校正。最后，將底物空白(B)，當(dāng)作取自所有的在一個板上同時測定的均值，減去從而得到校正的由酯酶釋放的香豆素所引起的熒光。這些校正對于在很低水平上(＜1pmol/μl提取物)表達(dá)酯酶的細(xì)胞系很重要。
全部的校正數(shù)據(jù)被繪制成為進(jìn)度曲線(progress curve)，并且平衡斜率被外推回零時間，根據(jù)它與抑制劑(濃度為100μM的dECP，在10-20分鐘內(nèi)使所有酯酶的酯酶催化性位點(diǎn)完全飽和)的化學(xué)計(jì)量的相互作用確定酯酶的量。隨著所有板上的反應(yīng)的進(jìn)行，繪制出7-羥基香豆素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用于計(jì)算酶和形成產(chǎn)物的摩爾濃度。
圖4顯示了在含有桿狀病毒表達(dá)的酯酶的細(xì)胞提取物中進(jìn)行的代表性的滴定實(shí)驗(yàn)的結(jié)果實(shí)施例3芐氯菊酯水解實(shí)驗(yàn)對于酸性標(biāo)記化合物使用放射分配分析(radiometric partitionassay)或?qū)τ谠诖疾糠謽?biāo)記的那些使用基于TLC的分析(Devonshire和Moores，1982)測定被表達(dá)的酶的芐氯菊酯水解活性。這些分析的特征包括保持芐氯菊酯的濃度低于它公開的水溶液中的溶解度(0.5μM)，洗滌劑的濃度(用于從酶被表達(dá)的昆蟲細(xì)胞中提取酶)低于臨界膠束濃度(對于TritonX100，為0.02％)，并且快速地進(jìn)行分析測定(即在10-30分鐘之內(nèi))使粘附于試管壁(使用將粘著減少到最小的玻璃管)的底物減到最少。在這些芐氯菊酯的濃度下，酶不能被底物飽和，因此Km值無法確定。然而，用芐氯菊酯活性可精確地計(jì)算每種酶的特異性常數(shù)(Kcat/Km)，在低底物濃度下，可直接比較它們的效率。通過將芐氯菊酯分離成它的順式和反式異構(gòu)體來增強(qiáng)分析能力。
(a)分離芐氯菊酯的順式和反式異構(gòu)體芐氯菊酯的商業(yè)制品包含四種異構(gòu)體1S順式，1R順式，1S反式，1R反式(圖5)。在硅上使用制備薄層色譜法(TLC)將異構(gòu)體分離成兩個對映體對1S/1R順式和1S/1R反式。不能進(jìn)一步分離這些對映體。然后可以測定酶制劑對每個對映體對的水解。
(b)實(shí)驗(yàn)方案在酸部分中放射性標(biāo)記的擬除蟲菊酯這個方法(Devonshire和Moores，1982)用于芐氯菊酯異構(gòu)體。它依賴于使用放射性標(biāo)記的底物和被表達(dá)的酶的孵育，然后將未改變的底物提取到有機(jī)溶劑中之后，測定水相中的放射性環(huán)丙烷羧酸酯陰離子?；谙惹暗慕?jīng)驗(yàn)，最好的提取方案使用甲醇和氯仿為2∶1(體積比)的混合物。當(dāng)按照適當(dāng)比例混合等份實(shí)驗(yàn)孵育物時，所得到的緩沖液、甲醇和氯仿的混合物是單相的，它用于阻斷酶反應(yīng)并確保擬除蟲菊酯完成溶解。隨后加入過量的氯仿和緩沖液，超過甲醇將這些相保持在一起的容量，這樣有機(jī)相能夠被除去，并測定水相中的產(chǎn)物。詳細(xì)方案如下。
磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH7.0)加到放射性標(biāo)記的芐氯菊酯(在丙酮中50μM)中形成1μM溶液，然后加入等體積的在相同緩沖液中被適當(dāng)稀釋過的被表達(dá)的酯酶開始實(shí)驗(yàn)。初步工作已經(jīng)確定孵育物中的洗滌劑(用于從收獲的細(xì)胞中提取酯酶的Triton X-100)的濃度必須低于它的CMC(臨界膠束濃度，0.02％)從而避免非常親脂性的擬除蟲菊酯分離到膠束中而不能得到此酶。典型地，實(shí)驗(yàn)的終體積是500-1000μl，底物和丙酮濃度分別為0.5μM和1％。在30秒到10分鐘的時間間隔，溫度為30°條件下，100μl等份孵育物被取出，加到含有300μl的2∶1的甲醇氯仿混合物的試管中并渦旋混和。然后在室溫下放置試管直到混合物(abatch)在孵育結(jié)束的時候或長期的采樣間隔中能夠被進(jìn)一步處理。在加入50μl緩沖液和100μl氯仿之后，混合物被渦旋混和，離心以及用500μl Hamilton注射器除去下層的有機(jī)相并丟棄。進(jìn)一步加入100μl氯仿重復(fù)提取，然后取出200μl上層的水相(使用帶細(xì)尖的移液管)用于閃爍計(jì)數(shù)。關(guān)鍵是避免帶有任何有機(jī)相。由于水相最終的體積是260μl(包括一些甲醇)，因此在最初的100μl等份中產(chǎn)生的總的計(jì)數(shù)被相應(yīng)的校正。
在醇部分中放射性標(biāo)記的擬除蟲菊酯i)I型擬除蟲菊酯-芐氯菊酯的二溴類似物(NRDC157)在氯仿甲醇提取過程中，這些酯水解形成的3-苯氧基苯甲醇(3-phenoxbenzyl alcohol)沒有分離到水相中。因此需要從通過硅TLC法從底物中分離這個產(chǎn)物(Devonshire和Mooers，1982)。具體方案如下。
對于這種酸標(biāo)記的底物建立孵育物。在100μl取自孵育物的等分中，通過與200μl丙酮在-79°(固體CO2)立即混合，間斷終止反應(yīng)。然后將100μl這種混合物，連同3μl非放射性的3-苯氧基苯甲醇(在丙酮中2％)一起轉(zhuǎn)移到LinearQ channeled硅F254板的加樣區(qū)(Whatman)。在10∶3的甲苯(蟻酸飽和的)和乙醚的混合物中顯影之后，底物和產(chǎn)品通過放射自顯影術(shù)定位6-7天(確定產(chǎn)品與UV光下顯示的冷卻的標(biāo)準(zhǔn)3-苯氧基苯甲醇遷移率相同)。接著，用Neatan(Merck)浸滲TLC平板的這些區(qū)域，并干燥，然后將它們從玻璃支持物上剝離下來并轉(zhuǎn)移到閃爍計(jì)數(shù)小瓶中。在硅上點(diǎn)樣之前，利用丙酮對最初的100μl進(jìn)行3-倍稀釋液進(jìn)行計(jì)數(shù)校正。
ii)II型擬除蟲菊酯-溴氰菊酯異構(gòu)體進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)，其中孵育物通過上述的TLC分析，主要顯示3-苯氧基苯甲酸的形成，符合文獻(xiàn)中所述的初始的羥睛水解產(chǎn)物被迅速地非酶催化地轉(zhuǎn)變成酸。由于TLC實(shí)驗(yàn)比氯仿-甲醇提取過程時間更長，所以后者如上述酸標(biāo)記的擬除蟲菊酯)被用于測定產(chǎn)自這些底物的3-苯氧基苯甲酸鹽陰離子。
對于所有實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)物的摩爾量通過已知的放射性標(biāo)記底物的比活度(specific activity)來計(jì)算。早期的關(guān)于被表達(dá)的E3WT酯酶的實(shí)驗(yàn)顯示水解速度與分析中密度至多為0.5μM的1RS順式或1RS反式芐氯菊酯的濃度直接成比例，即沒有米氏絡(luò)合物(Michaelis complex)的堆積作用。當(dāng)濃度高于0.5μM，接近已公開的芐氯菊酯的水溶解度時，實(shí)驗(yàn)顯示出了不穩(wěn)定的結(jié)果，因此影響Km和Kcat的測量。此外，應(yīng)用外消旋底物時，一旦已經(jīng)水解的底物接近50％，水解速度就突然變慢，標(biāo)志著兩種對映體(在外消旋混合物中等量的1R或1S)中只有一種易于水解，與早先公開的來自蚜蟲酯酶的數(shù)據(jù)一致(Devonshive和Moores，1982)。因此實(shí)驗(yàn)條件被調(diào)整為測定每一對中更于易被水解的對映體的水解。用來源于OP抗性蚜蟲(桃蚜)勻漿的E3WT和E4的反式芐氯菊酯進(jìn)行連續(xù)孵育證實(shí)兩者都優(yōu)選選擇1S反式對映體。在所有的例子中，由于不可能分離這些動力學(xué)參數(shù)，所以利用在0.5μM下(或外消旋底物的一種對映體為0.25μM)的水解速度，連同dECP滴定確定的酯酶的摩爾量來計(jì)算特異性常數(shù)(Kcat/Km)。關(guān)于底物溶解度和對其濃度反應(yīng)的比例的考慮被假定適用于所有的酶和底物。
(c)特異性常數(shù)的計(jì)算圖6提供了芐氯菊酯的反式和順式異構(gòu)體被E3W251L酶水解的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
由于芐氯菊酯異構(gòu)體的水解速度與所用至多為0.5μM(即沒有明顯的米氏絡(luò)合物形成)的底物的濃度直接成比例，所以不可能將Km和Kcat作為獨(dú)立參數(shù)進(jìn)行測定。當(dāng)溶度恰好低于Km，米-曼氏方程(Michaelis-Mentenequation)反應(yīng)式簡化為V=kcatKm[S][E]]]>因此，特異性常數(shù)(即Kcat/Km)能夠通過上面的方程，利用初始水解速度(pmol/min，通過已知的放射性標(biāo)記底物的比活度計(jì)算得出)和實(shí)驗(yàn)中底物和酶的濃度來計(jì)算得到。特異性常數(shù)有限擴(kuò)散(diffusion-limited maxium value)的最大值為108-109M-1秒-1(Stryer，1981)。
實(shí)施例4E3，EST23和蚜蟲E4變體的芐氯菊酯水解活性表2總結(jié)了用順式和反式芐氯菊酯作為底物所得到的十八個E3，三個EST23和五個MpE4變體的動力學(xué)數(shù)據(jù)。每種情況下，數(shù)據(jù)代表每個1S/1R順式和1S/1R反式異構(gòu)體對中被最快水解的對映體的水解作用(見上)。
從OP易感的大蒼蠅中發(fā)現(xiàn)的E3WT酶，它的EST23黑腹果蠅定向同源物和MpE4WT酶顯示出顯著的芐氯菊酯水解活性水平，它對反式異構(gòu)體是特異的。在E3酶活性位點(diǎn)的酰基結(jié)合口袋或陰離子位點(diǎn)區(qū)域的突變導(dǎo)致芐氯菊酯反式和順式異構(gòu)體活性均顯著增強(qiáng)。
a)氧離子空穴突變E3G1 37D突變是造成綿羊大蒼蠅(sheep blowfly)中二嗪農(nóng)抗性的原因。在這種突變體中，在酶活性點(diǎn)位的氧離子空穴中非常小的，脂肪族的，中性的Gly殘基被酸性的Asp取代，可使結(jié)合的oxon OP分子水解。然而，這種突變體(以及其黑腹果蠅定向同源物和相應(yīng)的MpE4G113D突變體)已經(jīng)降低了反式-芐氯菊酯的活性，特別是與野生型酶相比。這種活性不會通過His或Glu取代Gly-137來增強(qiáng)。然而，用Arg取代Gly-137不會明顯影響順式-或反式-芐氯菊酯的活性。Arg的線性本質(zhì)意味著它容易折疊并且不會影響芐氯菊酯與活性位點(diǎn)的結(jié)合。
b)?；Y(jié)合口袋突變E3W251L突變，它在活性位點(diǎn)的?；幂^小的脂肪族的Leu取代了大的芳香族的Trp殘基，導(dǎo)致反式-芐氯菊酯水解增強(qiáng)7倍并獲得實(shí)質(zhì)性的順式-芐氯菊酯水解。EST23中W251L的作用與對E3的基本相同。但是MpE4中相應(yīng)的W224L突變導(dǎo)致對順式和反式芐氯菊酯的活性實(shí)質(zhì)下降，這大概是由于蛋白主鏈的差異造成的。在E3中甚至用更小殘基(尺寸依次減小的Thr，Ser，Ala和Gly)取代Trp-251也導(dǎo)致芐氯菊酯水解活性的增強(qiáng)，盡管這些突變體的活性不象E3W251L那么高。顯然，在突變體活性中，空間排列因素并不是唯一需要考慮的因素。例如，Thr和Ser都包含羥基而且都是親水的。此外，Ala既是脂肪族的也是疏水的(如Leu)甚至小于Leu，然而這種突變體對于芐氯菊酯的活性和W251L突變體一樣。打開W251L突變體(即E3P250S/W251L)的氧離子空穴也減少它對順式-和反式-芐氯菊酯的活性，盡管該活性依舊高于野生型的活性。有趣的是，與野生型相比，芐氯菊酯對所有E3中的W251突變體以及EST23中的W251L突變體的特異性常數(shù)的增加對于順式異構(gòu)體一律更為顯著。然而野生型酶產(chǎn)生的反式順式的比率至少為20∶1，這些比率對于W251突變體來說僅為2-6∶1。這些突變體提供的?；蓄~外的空間顯然最有利于水解更有疑問的順式異構(gòu)體。
在同一E3分子上的W251L和G137D的組合突變使此酶對順式芐氯菊酯的活性增加超過野生型水平，但是減弱了對于反式芐氯菊酯的活性。然而，雙重突變體的活性并不如只有E3W251L突變的突變體的活性強(qiáng)(即突變沒有產(chǎn)生加合作用)。
已知在一些脂肪酶對應(yīng)于銅綠蠅E3中Phe 309的位置上含有Leu殘基。因此E3F309L突變體的構(gòu)建就是為了產(chǎn)生對親脂性的底物如擬除蟲菊酯的活性。如表2中所示，對于兩種異構(gòu)體，E3F309L突變體更優(yōu)于E3WT。對于反式-芐氯菊酯，它比E3W251L更具活性，雖然它對順式異構(gòu)體沒有如此的活性。在同一E3分子上，F(xiàn)309L和W251L的組合突變增強(qiáng)了對于順式芐氯菊酯的活性，但是對于反式芐氯菊酯的活性減弱到E3W251L的水平。換句話說，F(xiàn)309L突變對于W251L突變體對芐氯菊酯的活性幾乎沒有影響。
c)陰離子位點(diǎn)突變已知在一些脂肪酶對應(yīng)于銅綠蠅E3中Phe 354的位置上具有Leu殘基。然而，E3中Phe 354被取代為Leu不會明顯增加它對芐氯菊酯的活性。另一方面，Phe 354被取代為更大的芳香族殘基Trp，使對順式和反式芐氯菊酯的活性增強(qiáng)3-4倍。令人驚訝的是，F(xiàn)354W，而非F354L對于親脂性的芐氯菊酯的活性應(yīng)該增強(qiáng)，由此可知在一些天然脂肪酶中是Leu取代了Phe。
Y148F突變對于芐氯菊酯動力學(xué)產(chǎn)生了巨大的影響并且這種影響與依賴于遺傳背景的方向相反。與野生型相比，單突變體(single mutant)對于順式和反式芐氯菊酯的活性增強(qiáng)了5-6倍。具有G137D的雙重突變體(單個突變體的值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于野生型)，對反式芐氯菊酯的活性減少了大于兩倍，并且?guī)缀鯁适Я藢樖狡S氯菊酯活性。后面的結(jié)果清楚的顯示出在芐氯菊酯水解方面，Y148和氧離子空穴之間存在較強(qiáng)的相互作用。
Glu-217是緊鄰催化性絲氨酸的殘基，它被認(rèn)為在水解反應(yīng)中對于穩(wěn)定過渡態(tài)中間體很重要。然而，將此殘基突變?yōu)镸et(E3E217M)，就象在蚜蟲桃蚜酯酶E4中天然存在的那樣，它對芐氯菊酯的活性幾乎沒有影響。然而，在MpE4的逆向突變(即MpE4M190E)中將MpE4酶對反式和順式芐氯菊酯的活性降低了大約一半。這種突變與氧離子空穴突變組合(MpE4G113D/M190E)導(dǎo)致芐氯菊酯水解活性進(jìn)一步實(shí)質(zhì)性的降低(即兩種突變對芐氯菊酯的活性的作用是加合的)。
表2銅綠蠅酯酶E3，黑腹果蠅EST23和蚜蟲E4天然的和合成的變體對于芐氯菊酯順式-和反式-異構(gòu)體，以及芐氯菊酯的兩種順式-二溴乙烯類似物(NRDC157)的特異性常數(shù)。還顯示對反式和順式芐氯菊酯，以及1S順式和1R順式NRDC157的特異性常數(shù)的比率。
酶 特異性常數(shù)(Kcat/KmM-1sec-1)1S/1R反式 1S/1R順式芐氯NRDC157 NRDC157 1R芐氯菊酯 菊酯(反式順1S順式 順式(1S∶1R比率式比率) )E3WT 900003400(27∶1) 4700630(8∶1)氧離子空穴突變體E3G137D 9600 1800(5∶1) ND1NDE3G137R 850003900(22∶1) ND NDE3G137H 260001600(16∶1) ND NDE3G137E 2400 280(9∶1)ND ND?；Y(jié)合口袋突變體E3W251L 900000 460000(2∶1) 370000 5400(68∶1)E3W251S 140000 36000(4∶1) 35000 2900(12∶1)E3W251G 9500024000(4∶1) 27000 1700(16∶1)E3W251T 150000 24000(6∶1) 24000 900(26∶1)E3W251A 300000 72000(4∶1) 67000 1200(56∶1)E3F309L 1200000 48000(25∶1) 5700 8000(0.7∶1)E3W251L 810000 430000(2∶1) 26000 69100(0.4∶1)/F309LE3W251L 2400011000(2∶1) 12000 1100(11∶1)/G137DE3P250S 340000 110000(3∶1) ND ND/W251L陰離子位點(diǎn)突變體
E3Y148F 580000 17000(34∶1) ND NDE3Y148F 4100 47(87∶1)ND ND/G137DE3E217M 930004400(21∶1) ND NDE3F354W 350000 8800(40∶1) ND NDE3F354L 104400 2700(38∶1) ND NDEST23酶EST23WT 21000890(24∶1) 990330(3∶1)EST23W251L 260000 160000(2∶1) 72000 1200(60∶1)EST23G137D 2500 ND ND ND桃蚜E4酶MpE4WT 270000 2400(113∶1) ND NDMpE4G113D12000830(14∶1) ND NDMpE4W224L230001100(21∶1) ND NDMpE4M190E120000 1200(100∶1) ND NDMpE4G113D/ 6300 210(30∶1) ND NDM190E1、未確定的2、與對照細(xì)胞提取物獲得的值沒有實(shí)質(zhì)性差別實(shí)施例5溴代芐氯菊酯類似物的水解表2中還概括了使用芐氯菊酯的兩種順式-二溴乙烯基類似物(NRDC157)獲得的E3和EST23變體的動力學(xué)數(shù)據(jù)。芐氯菊酯二溴類似物的1S順式異構(gòu)體被除E3F309L和F309L/W251L之外的所有的酶水解，其效率與1R/1S順式芐氯菊酯相似。這表明更大的溴原子未實(shí)質(zhì)性阻斷這種底物進(jìn)入催化中心。盡管E3WT和EST23WT酶的活性對于異構(gòu)體間進(jìn)行顯著性比較來說是太低了，但除了E3F309L和F309L/W251L，所有其它酶的水解示出1S異構(gòu)體的10-100倍快的速度。在環(huán)丙烷環(huán)的C1位置的這種構(gòu)型與先前在桃蚜中對1S反式芐氯菊酯發(fā)現(xiàn)的具有相同的傾向性(Devonshire和Moores，1982)。
F309L對NRDC157的動力學(xué)具有明顯影響。單突變體與野生型對1S順式的作用幾乎沒有差別，并且對于此異構(gòu)體，具有W251L的雙重突變體比單獨(dú)的W251L顯示更少的活性。然而，1S/1R優(yōu)選倒置，在單突變體中的值為0.7∶1，在雙重突變體中的值為0.4∶1。在所有數(shù)據(jù)集中，對1R順式活性的結(jié)果是兩個最高的值。實(shí)際上雙重突變體的值約為任一單獨(dú)突變體的10倍。
實(shí)施例6已表達(dá)的酶對II型擬除蟲菊酯的水解表3概括了使用四種溴氰菊酯順式異構(gòu)體獲得的E3和EST23變體的子集的動力學(xué)數(shù)據(jù)。除了E3W251L和E3F309L，溴氰菊酯的1R順式異構(gòu)體(αS或αR)的水解效率與1R順式NRDC157相似(它能夠被認(rèn)為在特征上是芐氯菊酯和溴氰菊酯之間的中間體，因?yàn)樗哂卸逡蚁┗〈侨狈Ζ燎杌?。對1R順式異構(gòu)體的活性，αR構(gòu)象總是大于αS構(gòu)象。E3W251L和E3F309L對溴氰菊酯1R順式異構(gòu)體的效率明顯小于對NRDG157相應(yīng)異構(gòu)體的效率。
表3四種溴氰菊酯順式異構(gòu)體的特異性常數(shù)
1、與對照細(xì)胞提取物獲得的值沒有實(shí)質(zhì)性差別2、未確定的值得注意的是，具有最大溴氰菊酯活性的251突變體是W251S，然而五種251突變體中W251L(對于其它兩種擬除蟲菊酯最高)，和W251G給出最小的溴氰菊酯活性。它暗示對于有效的溴氰菊酯的水解，離去基團(tuán)的α-氰基部分的存在可能是主要的阻礙，它足以阻止野生型E3產(chǎn)生的任何顯著的水解。與其它底物相比，容納底物需要明顯不同的應(yīng)用活性位點(diǎn)空間，這樣較小殘基在酰基袋中對W251的取代提供了有用的容納，特別是對αR異構(gòu)體來說。然而，重要的是，對空間要求的細(xì)節(jié)以及因此最有效地突變體與其它擬除蟲菊酯的突變體不同。
所有的酶對溴氰菊酯1S順式異構(gòu)體的活性明顯小于對缺少α-氰基的NRDC157的相應(yīng)異構(gòu)體的活性。α氰基的這種顯著影響似乎是通過環(huán)丙烷基中C1位置的1S構(gòu)象表現(xiàn)的。除了一些最小的活性突變體外，對1S順式異構(gòu)體的活性來說，αR構(gòu)象的活性總是大于αS構(gòu)象的活性。
實(shí)施例7 擬除蟲菊酯實(shí)驗(yàn)的一般性討論251系列突變體對芐氯菊酯和NRDC157的結(jié)果一起可有力而簡單地推斷出E3/EST23中的?；Y(jié)合的約束。總的說，251取代應(yīng)該產(chǎn)生更大的酰基袋，它有利于這些底物的大?；娜菁{/穩(wěn)定。這種取代有利于所有異構(gòu)體的水解，這些異構(gòu)體由環(huán)丙烷環(huán)的兩個立構(gòu)中心產(chǎn)生。反式異構(gòu)體優(yōu)選用野生型酶水解，而突變體也可水解至少混合相當(dāng)好的部分順式異構(gòu)體。然而，在順式異構(gòu)體中，突變體的改進(jìn)對1S順式異構(gòu)體更顯著。對于所有野生型酶，1R順式異構(gòu)體是所有構(gòu)型中最有問題的，它對突變體也是最有問題的。在突變體系列中，改良的動力學(xué)不能通過側(cè)鏈尺寸的縮小進(jìn)行簡單的解釋；最小的取代沒有產(chǎn)生最大的活性。實(shí)際上，最好的動力學(xué)來自于W251L，盡管所有試驗(yàn)的取代物中Leu具有最大的側(cè)鏈尺寸，這就暗示了親脂性發(fā)揮重要作用。
和芐氯菊酯及NRDC157中相對簡單和一致的模式相反，溴氰菊酯對251系列突變體的結(jié)果就十分復(fù)雜和難以解釋。如預(yù)期它們增強(qiáng)其它底物的動力學(xué)那樣，對于四種順式溴氰菊酯異構(gòu)體，它們顯示出的活性全部好于野生型，盡管在用野生型時，它們絕對低于對其它底物的活性。然而，對于NRDC157，優(yōu)選1S異構(gòu)體甚于1R異構(gòu)體，而在溴氰菊酯數(shù)據(jù)中這種優(yōu)選最多是弱的。另一方面，所有突變體有一種明顯的傾向，優(yōu)選αR異構(gòu)體甚于αS異構(gòu)體。通常它僅約為2∶1，但是它與野生型EST23的傾向明顯相反。首先不能預(yù)料到這些假定的酰基結(jié)合口袋取代將影響αR/αS立體優(yōu)選性(stereopreferences)，因?yàn)楹笳哂糜诘孜?醇)離去基團(tuán)中的α-氰基部分。
所有F309L的數(shù)據(jù)清楚的顯示這個殘基對于擬除蟲菊酯水解動力學(xué)的主要影響。它與W251系列突變體的結(jié)果在一個平行的水平上，兩個數(shù)據(jù)集均顯示動力學(xué)得到提高，這與根據(jù)?；Y(jié)合口袋中提供更大的空間而期望的相一致。然而，也存在重要的不同，W251系列對芐氯菊酯順式與反式異構(gòu)體的活性不成比例，以及F309L對順式NRDG157的1R與1S異構(gòu)體的活性也不成比例。在這兩個位點(diǎn)的取代也顯示出較強(qiáng)的相互作用，這與它們賦予?；Y(jié)合口袋中共同的結(jié)構(gòu)和功能相一致。例如，W251突變體對于順式芐氯菊酯的不成比例的增加和F309L對于1R順式NRDC157的不成比例的增加在雙重突變體中均表現(xiàn)為顯性特征。251和309突變體對于溴氰菊酯水解的活性和相同的立體專一性具有數(shù)量上相似的增強(qiáng)效果，而未觀察到在更小的擬除蟲菊酯中發(fā)現(xiàn)的立體專一的差別。然而，我們認(rèn)為，它的離去基團(tuán)中另外大多數(shù)α氰基部分需要活性位點(diǎn)上這種基團(tuán)的空間再分配，以便掩蓋(override)在較小的擬除蟲菊酯中明顯的立體專一性。
實(shí)施例8用熒光鑒定法確定脂肪酶活性脂肪酶活性實(shí)驗(yàn)應(yīng)用熒光鑒定法測定昆蟲酯酶或脂肪酶，和其突變體的脂肪酶活性。熒光底物提供了快速可再生測定酶活性的方法。4-甲基傘形酮熒光團(tuán)的脂肪酸酯(?；?被用作鑒別脂肪酶活性的底物。這種方法采用熒光團(tuán)4-甲基傘形酮棕櫚酸酯(4-MU-棕櫚酸酯)(結(jié)構(gòu)如下)并且是用于分枝桿菌的快速定性和鑒別的Devonshire et al.(2002)的熒光法酯酶滴定實(shí)驗(yàn)和Hamid et al.(1994)方法的改良。
4-甲基傘形酮棕櫚酸酯4-MU-棕櫚酸酯被一種脂肪酶水解從而釋放熒光4-甲基傘形酮(4-MU)，它能用熒光計(jì)測定。
隨著滴定，繪制每個平板的4-MU的標(biāo)準(zhǔn)曲線。用2.475ml(3×825μl)乙醇稀釋25μl 10-2M的dMU儲存液(19.8mg/10ml，在100％乙醇中)，從而得到10-4M的溶液。這種10-4M的溶液被用于繪制在0.1M pH7.0磷酸鹽緩沖溶液(假如存在于細(xì)胞提取物中，加0.05％或0.5％超純TritonX-100(TX100))中從0到1.0μM的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在試管中分配25μl，20μl，15μl，10μl，5μl，0μl(加乙醇到25μl)并加入2.475ml磷酸鹽緩沖液(或是含有TX100的磷酸鹽緩沖液，假如需要的話)，然后每個孔中加入100μl。這樣獲得在0.25％TX100中的0.2、0.4、0.6、0.8和1.0μM的樣品。
隨著下面的滴定反應(yīng)的進(jìn)行，在Fluorostar熒光計(jì)(BMGLabTechnologies)上讀取這些樣品，該方法中所采用的基本設(shè)定為激發(fā)-355nm，發(fā)射-460nm，放大-0，每180秒10個循環(huán)，每一次循環(huán)前均振蕩。
對于這個實(shí)驗(yàn)，將20μl 5×10-44-MU-棕櫚酸酯(在100％丙酮中)加入需要底物的孔中(按下面表4中定義的II和III)，并風(fēng)干。對于每一種要測定的酶來說，進(jìn)行4組反應(yīng)，首先分配緩沖液然后是細(xì)胞樣品。細(xì)胞提取物是50μl細(xì)胞提取物或細(xì)胞上清液以及50μl磷酸鹽緩沖液(0.1M)0.05％TX-100。在實(shí)驗(yàn)中，4-MU-棕櫚酸酯的終濃度是10-4M。應(yīng)該在讀數(shù)開始前立即加入細(xì)胞提取物。
表4
通過下面的方程計(jì)算校正的熒光(Fcorrected)。
對于磷酸鹽pH7.0Fcorrected＝[(FII-FI)/0.7]-FIII+2*FIV]對于pH7.0的磷酸鹽中含0.05-0.5％TX100Fcorrected＝[(FII-FI)/0.6]-FIII+2*FIV]其中0.6和0.7是分別含有或不含TX100的108細(xì)胞/ml的細(xì)胞提取物的淬滅校正因子。
結(jié)果脂肪酶活性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在表5中。從這些數(shù)據(jù)中無法計(jì)算形式動力參數(shù)(formal kinetic parameters)，因?yàn)榈孜锏娜芙舛仁遣淮_定的。簡言之，數(shù)據(jù)最容易與Kcat進(jìn)行比較。這樣，所得到的這些值顯示出所測試的酶具有良好的脂肪酶活性。
在4UMP活性中，這些酶至少有兩個數(shù)量級的變化。然而，4UMP活性與多種酶的乙酸萘酯，馬拉硫磷或任何擬除蟲菊酯的水解活性之間沒有明顯的相關(guān)性。因此，數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明酶作為一個基團(tuán)為不同范圍的底物提供有用的活性的多功能性。
同綠蠅E3和果蠅EST23一樣，兩種野生型酶，蚜蟲E4和果蠅αE2具有出相當(dāng)高的4UMP活性。因此α羧酸酯酶副進(jìn)化枝中廣泛具有水解4UMP的能力。
在E3突變體的三個活性位點(diǎn)亞區(qū)的每一個亞區(qū)中至少有一個數(shù)量級差異，并且在所有三個亞區(qū)中，都存在突變體，它們明顯好于野生型。對于其它的底物，在所有三個亞區(qū)的突變都具有改善脂肪酶活性的潛能。
顯然，在蚜蟲E4和果蠅EST23中，W251L取代明顯具有較高的4UMP活性，但是有趣的是在綠蠅E3中沒有。然而，在后者中，W251T是一種明顯的改進(jìn)。F309L，也在?；盗兄校恢苽涑鰜硎且?yàn)榘l(fā)現(xiàn)Leu處于一些脂肪酶的等效位置，同時它也明顯優(yōu)于野生型。
F354L，處于陰離子位點(diǎn)，它被制備出來是因?yàn)樵谝恍┲久钢幸簿哂兴⑶宜诧@示出較高的4UMP活性。對于設(shè)計(jì)增強(qiáng)脂肪酶活性的酶來說，比較基因組法(comparative genomics)似乎是一種有前景的方法。一些優(yōu)選變化的組合可實(shí)質(zhì)性改變酯酶/脂肪酶水解疏水性(或相反，親水性)底物的能力。
表5銅綠蠅酯酶E3，黑腹果蠅EST23，桃蚜E4以及額外的果蠅羧酸酯酶的天然和合成的變體的酯酶和脂肪酶活性，分別用α-乙酸萘酯和4-甲基傘形酮棕櫚酸酯測定。 (使用家庭用微波爐的加熱預(yù)備試驗(yàn))使用的裝置 松下電器產(chǎn)業(yè)公司制NE-8500額定電壓 100V額定消耗電力 990W額定高頻輸出 500W微波頻率數(shù)2450MHz爐腔尺寸 寬300mm深305mm高195mm試驗(yàn)方法按質(zhì)量比相對于廢小瓶片100％添加聚丙二醇48.7％，再加入作為催化劑的氧化二丁錫0.3％，使用擠出機(jī)在260℃-290℃下進(jìn)行解聚，得到廢小瓶片低聚物。另外，把該廢小瓶片低聚物350g與450g分別加到500mL玻璃燒杯中，使用上述裝置進(jìn)行微波照射。由此得到下述表4表示的升溫?cái)?shù)據(jù)。采用該方法的微波加熱效率如下，說明作為上述反應(yīng)物質(zhì)體系的直接加熱方法有效。即，作為加熱效率，由初期呈現(xiàn)80％以上、升溫后也呈現(xiàn)40％水平的值確認(rèn)加熱效率充分。此外，加熱效率由下式定義。
加熱效率＝被加熱物接受的熱能量/微波加熱能量表4
1、重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)誤差2、沒有進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)3、活性是可檢測的，但太低而無法定量實(shí)施例9昆蟲酯酶的細(xì)菌表達(dá)在GST融合載體pGEX4T-1；his-標(biāo)記融合載體pET146；以及產(chǎn)生未標(biāo)記蛋白質(zhì)的載體pTTQ18和pKK223-3中，已證實(shí)可成功地進(jìn)行E3的細(xì)菌表達(dá)。已在廣泛的大腸桿菌菌株中觀察到成功的表達(dá)，這些菌株包括DH10B，TG1和B121(DE3)。這些表達(dá)系統(tǒng)將被普遍用于所有的昆蟲酯酶或脂肪酶，和其突變體，包括E3的突變體，因?yàn)閷τ谝吧虴3和5突變體已經(jīng)證實(shí)是成功的。
在整個說明書中詞語“包括”，將被理解暗示成包含規(guī)定的成分、整體或步驟，或是成分、整體或步驟組，但不排除任何其它的成分整體或步驟，或是成分、整體或步驟組。
上述所有的公開文獻(xiàn)全部以全文并入?yún)⒖肌?br> 已包括在本說明書中的任何對文獻(xiàn)、作用、材料、裝置、論文等的討論僅是用于本發(fā)明的目的。盡管存在于本申請的優(yōu)先權(quán)日之前，也不應(yīng)該認(rèn)為任何或所有這些內(nèi)容形成了與本發(fā)明相關(guān)的相關(guān)領(lǐng)域的部分現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)或通用知識。
它很容易被本領(lǐng)域技術(shù)人員領(lǐng)會，如特定實(shí)施方案中所顯示的一樣，在廣泛描述的本發(fā)明的指導(dǎo)思想或范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明進(jìn)行多種變化和修改。因此，現(xiàn)在的實(shí)施方案只能認(rèn)為是說明性的而不是限制性的。
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序列表<110>聯(lián)邦科學(xué)技術(shù)研究組織<120>具有脂肪酶活性的酯酶<130>500185<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>570<212>PRT<213>Lucilia cuprina<400>1Met Asn Phe Asn Val Ser Leu Met Glu Lys Leu Lys Trp Lys Ile Lys1 5 10 15Cys Ile Glu Asn Lys Phe Leu Asn Tyr Arg Leu Thr Thr Asn Glu Thr20 25 30Val Val Ala Glu Thr Glu Tyr Gly Lys Val Lys Gly Val Lys Arg Leu35 40 45Thr Val Tyr Asp Asp Ser Tyr Tyr Ser Phe Glu Gly Ile Pro Tyr Ala50 55 60Gln Pro Pro Val Gly Glu Leu Arg Phe Lys Ala Pro Gln Arg Pro Thr65 70 75 80Pro Trp Asp Gly Val Arg Asp Cys Cys Asn His Lys Asp Lys Ser Val85 90 95
Gln Val Asp Phe Ile Thr Gly Lys Val Cys Gly Ser Glu Asp Cys Leu100 105 110Tyr Leu Ser Val Tyr Thr Asn Asn Leu Asn Pro Glu Thr Lys Arg Pro115 120 125Val Leu Val Tyr Ile His Gly Gly Gly Phe Ile Ile Gly Glu Asn His130 135 140Arg Asp Met Tyr Gly Pro Asp Tyr Phe Ile Lys Lys Asp Val Val Leu145 150 155 160Ile Asn Ile Gln Tyr Arg Leu Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ser Leu Asn165 170 175Ser Glu Asp Leu Asn Val Pro Gly Asn Ala Gly Leu Lys Asp Gln Val180 185 190Met Ala Leu Arg Trp Ile Lys Asn Asn Cys Ala Asn Phe Gly Gly Asn195 200 205Pro Asp Asn Ile Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Thr210 215 220His Tyr Met Met Leu Thr Glu Gln Thr Arg Gly Leu Phe His Arg Gly225 230 235 240Ile Leu Met Ser Gly Asn Ala Ile Cys Pro Trp Ala Asn Thr Gln Cys245 250 255Gln His Arg Ala Phe Thr Leu Ala Lys Leu Ala Gly Tyr Lys Gly Glu260 265 270Asp Asn Asp Lys Asp Val Leu Glu Phe Leu Met Lys Ala Lys Pro Gln275 280 285Asp Leu Ile Lys Leu Glu Glu Lys Val Leu Thr Leu Glu Glu Arg Thr290 295 300Asn Lys Val Met Phe Pro Phe Gly Pro Thr Val Glu Pro Tyr Gln Thr305 310 315 320Ala Asp Cys Val Leu Pro Lys His Pro Arg Glu Met Val Lys Thr Ala325 330 335
Trp Gly Asn Ser Ile Pro Thr Met Met Gly Asn Thr Ser Tyr Glu Gly340 345 350Leu Phe Phe Thr Ser Ile Leu Lys Gln Met Pro Met Leu Val Lys Glu355 360 365Leu Glu Thr Cys Val Asn Phe Val Pro Ser Glu Leu Ala Asp Ala Glu370 375 380Arg Thr Ala Pro Glu Thr Leu Glu Met Gly Ala Lys Ile Lys Lys Ala385 390 395 400His Val Thr Gly Glu Thr Pro Thr Ala Asp Asn Phe Met Asp Leu Cys405 410 415Ser His Ile Tyr Phe Trp Phe Pro Met His Arg Leu Leu Gln Leu Arg420 425 430Phe Asn His Thr Ser Gly Thr Pro Val Tyr Leu Tyr Arg Phe Asp Phe435 440 445Asp Ser Glu Asp Leu Ile Asn Pro Tyr Arg Ile Met Arg Ser Gly Arg450 455 460Gly Val Lys Gly Val Ser His Ala Asp Glu Leu Thr Tyr Phe Phe Trp465 470 475 480Asn Gln Leu Ala Lys Arg Met Pro Lys Glu Ser Arg Glu Tyr Lys Thr485 490 495Ile Glu Arg Met Thr Gly Ile Trp Ile Gln Phe Ala Thr Thr Gly Asn500 505 510Pro Tyr Ser Asn Glu Ile Glu Gly Met Glu Asn Val Ser Trp Asp Pro515 520 525Ile Lys Lys Ser Asp Glu Val Tyr Lys Cys Leu Asn Ile Ser Asp Glu530 535 540Leu Lys Met Ile Asp Val Pro Glu Met Asp Lys Ile Lys Gln Trp Glu545 550 555 560Ser Met Phe Glu Lys His Arg Asp Leu Phe565 570
<210>2<211>572<212>PRT<213>Drosophila melanogaster<400>2Met Asn Lys Asn Leu Gly Phe Val Glu Arg Leu Arg Gly Arg Leu Lys1 5 10 15Thr Ile Glu His Lys Val Gln Gln Tyr Arg Gln Ser Thr Asn Glu Thr20 25 30Val Val Ala Asp Thr Glu Tyr Gly Gln Val Arg Gly Ile Lys Arg Leu35 40 45Ser Leu Tyr Asp Val Pro Tyr Phe Ser Phe Glu Gly Ile Pro Tyr Ala50 55 60Gln Pro Pro Val Gly Glu Leu Arg Phe Lys Ala Pro Gln Arg Pro Ile65 70 75 80Pro Trp Glu Gly Val Arg Asp Cys Ser Gln Pro Lys Asp Lys Ala Val85 90 95Gln Val Gln Phe Val Phe Asp Lys Val Glu Gly Ser Glu Asp Cys Leu100 105 110Tyr Leu Asn Val Tyr Thr Asn Asn Val Lys Pro Asp Lys Ala Arg Pro115 120 125Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Gly Phe Ile Ile Gly Glu Ala Asn130 135 140Arg Glu Trp Tyr Gly Pro Asp Tyr Phe Met Lys Glu Asp Val Val Leu145 150 155 160Val Thr Ile Gln Tyr Arg Leu Gly Ala Leu Gly Phe Met Ser Leu Lys165 170 175Ser Pro Glu Leu Asn Val Pro Gly Asn Ala Gly Leu Lys Asp Gln Val180 185 190
Leu Ala Leu Lys Trp Ile Lys Asn Asn Cys Ala Ser Phe Gly Gly Asp195 200 205Pro Asn Cys Ile Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Thr210 215 220His Tyr Met Met Leu Thr Asp Gln Thr Gln Gly Leu Phe His Arg Gly225 230 235 240Ile Leu Gln Ser Gly Ser Ala Ile Cys Pro Trp Ala Tyr Asn Gly Asp245 250 255Ile Thr His Asn Pro Tyr Arg Ile Ala Lys Leu Val Gly Tyr Lys Gly260 265 270Glu Asp Asn Asp Lys Asp Val Leu Glu Phe Leu Gln Asn Val Lys Ala275 280 285Lys Asp Leu Ile Arg Val Glu Glu Asn Val Leu Thr Leu Glu Glu Arg290 295 300Met Asn Lys Ile Met Phe Arg Phe Gly Pro Ser Leu Glu Pro Phe Ser305 310 315 320Thr Pro Glu Cys Val Ile Ser Lys Pro Pro Lys Glu Met Met Lys Thr325 330 335Ala Trp Ser Asn Ser Ile Pro Met Phe Ile Gly Asn Thr Ser Tyr Glu340 345 350Gly Leu Leu Trp Val Pro Glu Val Lys Leu Met Pro Gln Val Leu Gln355 360 365Gln Leu Asp Ala Gly Thr Pro Phe Ile Pro Lys Glu Leu Leu Ala Thr370 375 380Glu Pro Ser Lys Glu Lys Leu Asp Ser Trp Ser Ala Gln Ile Arg Asp385 390 395 400Val His Arg Thr Gly Ser Glu Ser Thr Pro Asp Asn Tyr Met Asp Leu405 410 415Cys Ser Ile Tyr Tyr Phe Val Phe Pro Ala Leu Arg Val Val His Ser420 425 430
Arg His Ala Tyr Ala Ala Gly Ala Pro Val Tyr Phe Tyr Arg Tyr Asp435 440 445Phe Asp Ser Glu Glu Leu Ile Phe Pro Tyr Arg Ile Met Arg Met Gly450 455 460Arg Gly Val Lys Gly Val Ser His Ala Asp Asp Leu Ser Tyr Gln Phe465 470 475 480Ser Ser Leu Leu Ala Arg Arg Leu Pro Lys Glu Ser Arg Glu Tyr Arg485 490 495Asn Ile Glu Arg Thr Val Gly Ile Trp Thr Gln Phe Ala Ala Thr Gly500 505 510Asn Pro Tyr Ser Glu Lys Ile Asn Gly Met Asp Thr Leu Thr Ile Asp515 520 525Pro Val Arg Lys Ser Asp Glu Val Ile Lys Cys Leu Asn Ile Ser Asp530 535 540Asp Leu Lys Phe Ile Asp Leu Pro Glu Trp Pro Lys Leu Lys Val Trp545 550 555 560Glu Ser Leu Tyr Asp Asp Asn Lys Asp Leu Leu Phe565 570<210>3<211>552<212>PRT<213>Myzus persicae<400>3Met Lys Asn Thr Cys Gly Ile Leu Leu Asn Leu Phe Leu Phe Ile Gly1 5 10 15Cys Phe Leu Thr Cys Ser Ala Ser Asn Thr Pro Lys Val Gln Val His20 25 30Ser Gly Glu Ile Ala Gly Gly Phe Glu Tyr Thr Tyr Asn Gly Arg Lys35 40 45
Ile Tyr Ser Phe Leu Gly Ile Pro Tyr Ala Ser Pro Pro Val Gln Asn50 55 60Asn Arg Phe Lys Glu Pro Gln Pro Val Gln Pro Trp Leu Gly Val Trp65 70 75 80Asn Ala Thr Val Pro Gly Ser Ala Cys Leu Gly Ile Glu Phe Gly Ser85 90 95Gly Ser Lys Ile Ile Gly Gln Glu Asp Cys Leu Phe Leu Asn Val Tyr100 105 110Thr Pro Lys Leu Pro Gln Glu Asn Ser Ala Gly Asp Leu Met Asn Val115 120 125Ile Val His Ile His Gly Gly Gly Tyr Tyr Phe Gly Glu Gly Ile Leu130 135 140Tyr Gly Pro His Tyr Leu Leu Asp Asn Asn Asp Phe Val Tyr Val Ser145 150 155 160Ile Asn Tyr Arg Leu Gly Val Leu Gly Phe Ala Ser Thr Gly Asp Gly165 170 175Val Leu Thr Gly Asn Asn Gly Leu Lys Asp Gln Val Ala Ala Leu Lys180 185 190Trp Ile Gln Gln Asn Ile Val Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Ser Val195 200 205Thr Ile Thr Gly Met Ser Ala Gly Ala Ser Ser Val His Asn His Leu210 215 220Ile Ser Pro Met Ser Lys Gly Leu Phe Asn Arg Ala Ile Ile Gln Ser225 230 235 240Gly Ser Ala Phe Cys His Trp Ser Thr Ala Glu Asn Val Ala Gln Lys245 250 255Thr Lys Tyr Ile Ala Asn Leu Met Gly Cys Pro Thr Asn Asn Ser Val260 265 270Glu Ile Val Glu Cys Leu Arg Ser Arg Pro Ala Lys Ala Ile Ala Lys275 280 285
Ser Tyr Leu Asn Phe Met Pro Trp Arg Asn Phe Pro Phe Thr Pro Phe290 295 300Gly Pro Thr Val Glu Val Ala Gly Tyr Glu Lys Phe Leu Pro Asp Ile305 310 315 320Pro Glu Lys Leu Val Pro His Asp Ile Pro Val Leu Ile Ser Ile Ala325 330 335Gln Asp Glu Gly Leu Ile Phe Ser Thr Phe Leu Gly Leu Glu Asn Gly340 345 350Phe Asn Glu Leu Asn Asn Asn Trp Asn Glu His Leu Pro His Ile Leu355 360 365Asp Tyr Asn Tyr Thr Ile Ser Asn Glu Asn Leu Arg Phe Lys Thr Ala370 375 380Gln Asp Ile Lys Glu Phe Tyr Phe Gly Asp Lys Pro Ile Ser Lys Glu385 390 395 400Thr Lys Ser Asn Leu Ser Lys Met Ile Ser Asp Arg Ser Phe Gly Tyr405 410 415Gly Thr Ser Lys Ala Ala Gln His Ile Ala Ala Lys Asn Thr Ala Pro420 425 430Val Tyr Phe Tyr Glu Phe Gly Tyr Ser Gly Asn Tyr Ser Tyr Val Ala435 440 445Phe Phe Asp Pro Lys Ser Tyr Ser Arg Gly Ser Ser Pro Thr His Gly450 455 460Asp Glu Thr Ser Tyr Val Leu Lys Met Asp Gly Phe Tyr Val Tyr Asp465 470 475 480Asn Glu Glu Asp Arg Lys Met Ile Lys Thr Met Val Asn Ile Trp Ala485 490 495Thr Phe Ile Lys Ser Gly Val Pro Asp Thr Glu Asn Ser Glu Ile Trp500 505 510Leu Pro Val Ser Lys Asn Leu Ala Asp Pro Phe Arg Phe Thr Lys Ile515 520 525
Thr Gln Gln Gln Thr Phe Glu Ala Arg Glu Gln Ser Thr Thr Gly Ile530 535 540Met Asn Phe Gly Val Ala Tyr His545 550<210>4<211>576<212>PRT<213>Torpedo californica<400>4Ala Asp Asp Asp Ser Glu Leu Leu Val Asn Thr Lys Ser Gly Lys Val1 5 10 15Met Arg Thr Arg Ile Pro Val Leu Ser Ser His Ile Ser Ala Phe Leu20 25 30Gly Ile Pro Phe Ala Glu Pro Pro Val Gly Asn Met Arg Phe Arg Arg35 40 45Pro Glu Pro Lys Lys Pro Trp Ser Gly Val Trp Asn Ala Ser Thr Tyr50 55 60Pro Asn Asn Cys Gln Gln Tyr Val Asp Glu Gln Phe Pro Gly Phe Pro65 70 75 80Gly Ser Glu Met Trp Asn Pro Asn Arg Glu Met Ser Glu Asp Cys Leu85 90 95Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Ser Pro Arg Pro Lys Ser Ala Thr Val100 105 110Met Leu Trp Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Tyr Ser Gly Ser Ser Thr Leu115 120 125Asp Val Tyr Asn Gly Lys Tyr Leu Ala Tyr Thr Glu Glu Val Val Leu130 135 140Val Ser Leu Ser Tyr Arg Val Gly Ala Phe Gly Phe Leu Ala Leu His145 150 155 160
Gly Ser Gln Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Leu Asp Gln Arg Met165 170 175Ala Leu Gln Trp Val His Asp Asn Ile Gln Phe Phe Gly Gly Asp Pro180 185 190Lys Thr Val Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Arg Ala Ser Val Gly195 200 205Met His Ile Leu Ser Pro Gly Ser Arg Asp Leu Phe Arg Arg Ala Ile210 215 220Leu Gln Ser Gly Ser Pro Asn Cys Pro Trp Ala Ser Val Ser Val Ala225 230 235 240Glu Gly Arg Arg Arg Ala Val Glu Leu Arg Arg Asn Leu Asn Cys Asn245 250 255Leu Asn Ser Asp Glu Asp Leu Ile Gln Cys Leu Arg Glu Lys Lys Pro260 265 270Gln Glu Leu Ile Asp Val Glu Trp Asn Val Leu Pro Phe Asp Ser Ile275 280 285Phe Arg Phe Ser Phe Val Pro Val Ile Asp Gly Glu Phe Phe Pro Thr290 295 300Ser Leu Glu Ser Met Leu Asn Ala Gly Asn Phe Lys Lys Thr Gln Ile305 310 315 320Leu Leu Gly Val Asn Lys Asp Glu Gly Ser Phe Phe Leu Leu Tyr Gly325 330 335Ala Pro Gly Phe Ser Lys Asp Ser Glu Ser Lys Ile Ser Arg Glu Asp340 345 350Phe Met Ser Gly Val Lys Leu Ser Val Pro His Ala Asn Asp Leu Gly355 360 365Leu Asp Ala Val Thr Leu Gln Tyr Thr Asp Trp Met Asp Asp Asn Asn370 375 380Gly Ile Lys Asn Arg Asp Gly Leu Asp Asp Ile Val Gly Asn His Asn385 390 395 400
Val Ile Cys Pro Leu Met His Phe Val Asn Lys Tyr Thr Lys Phe Gly405 410 415Asn Gly Thr Tyr Leu Tyr Phe Phe Asn His Arg Ala Ser Asn Leu Val420 425 430Trp Pro Glu Trp Met Gly Val Ile His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val435 440 445Phe Gly Leu Pro Leu Val Lys Glu Leu Asn Tyr Thr Ala Glu Glu Glu450 455 460Ala Leu Ser Arg Arg Ile Met His Tyr Trp Ala Thr Phe Ala Lys Thr465 470 475 480Gly Asn Pro Asn Glu Pro His Ser Gln Glu Ser Lys Trp Pro Leu Phe485 490 495Thr Thr Lys Glu Gln Lys Phe Ile Asp Leu Asn Thr Glu Pro Ile Lys500 505 510Val His Gln Arg Leu Arg Val Gln Met Cys Val Phe Trp Asn Gln Phe515 520 525Leu Pro Lys Leu Leu Asn Ala Thr Glu Thr Ile Asp Glu Ala Glu Arg530 535 540Gln Trp Lys Thr Glu Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Met His Trp545 550 555 560Lys Asn Gln Phe Asp Gln Tyr Ser Arg His Glu Asn Cys Ala Glu Leu565 570 57權(quán)利要求
1.一種基于酶的生物催化方法，其中酶是一種昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中基于酯酶或脂肪酶的生物催化包含或包括下列反應(yīng)式 其中R，R2和R3是相同的部分Z，或R是部分Z的立體異構(gòu)體的混合物，R2是部分Z的立體異構(gòu)體及R3是富含Z部分的另一種立體異構(gòu)體的立體異構(gòu)體的混合物；R1，R4和R5是相同部分Y，或R1是部分Y的立體異構(gòu)體的混合物，R5是該部分的一種立體異構(gòu)體及R4是富含部分Y的另一種立體異構(gòu)體的對映異構(gòu)體的混合物；部分Z和Y可以分別選自任選地由多個雜原子之一間斷的取代或未取代的烴部分；和X是一種親核基團(tuán)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中立體異構(gòu)體是對映異構(gòu)體或位置立體異構(gòu)體。
4.權(quán)利要求2的方法，在正向反應(yīng)占優(yōu)勢的條件下進(jìn)行。
5.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，用于至少一種酸性酯的化學(xué)、區(qū)域或立體選擇性水解。
6.權(quán)利要求5的方法，其中酯是一種含有酯基團(tuán)的殺蟲劑。
7.權(quán)利要求6的方法，其中酯是擬除蟲菊酯。
8.權(quán)利要求7的方法，其中擬除蟲菊酯選自由芐氯菊酯，cyloprothrin，氰戊菊酯，順式氰戊菊酯，氰戊菊酯，氟胺氰菊酯，甲氰菊酯，d-fenothrin，cyfenothrin，丙烯菊酯，氯氰菊酯，溴氰菊酯，四溴菊酯，胺菊酯，芐呋菊酯和氟氯氰菊酯組成的組中。
9.權(quán)利要求5的方法，其中酯是脂肪酸酯。
10.權(quán)利要求5至9任一項(xiàng)的方法，用于從羧酸酯立體異構(gòu)體的混合物中分離立體異構(gòu)體。
11.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的用于旋光分離(R)-酯化合物和(S)-酯化合物的混合物的方法，包含以下步驟(a)將昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體與該混合物接觸，通過立體選擇性水解(R)-酯化合物和(S)-酯化合物中的一種而獲得一種旋光酸化合物或一種旋旋光醇化合物；以及(b)回收一種旋光化合物，該化合物選自由未被水解的旋光酸化合物、旋光醇化合物和旋光酯組成的組中。
12.權(quán)利要求1或2的方法，用于生產(chǎn)旋光酸。
13.權(quán)利要求12的方法，其中旋光酸是擬除蟲菊酯酸。
14.權(quán)利要求13的方法，其中擬除蟲菊酯酸選自由芐氯菊酯，cyloprothrin，氰戊菊酯，順式氰戊菊酯S，氰戊菊酯，氟胺氰菊酯，甲氰菊酯，d-fenothrin，cyfenothrin，丙烯菊酯，氯氰菊酯，溴氰菊酯，四溴菊酯，胺菊酯，芐呋菊酯和氟氯氰菊酯組成的組中。
15.權(quán)利要求1或2的方法，其中旋光酸是環(huán)丙烷羧酸。
16.權(quán)利要求1或2的方法，用于生產(chǎn)一種旋光醇。
17.權(quán)利要求16的方法，其中旋光醇是擬除蟲菊酯醇。
18.權(quán)利要求17的方法，其中擬除蟲菊酯醇是一種選自由芐氯菊酯，cyloprothrin，氰戊菊酯，順式氰戊菊酯，氰戊菊酯，氟胺氰菊酯，甲氰菊酯，d-fenothrin，cyfenothrin，丙烯菊酯，氯氰菊酯，溴氰菊酯，四溴菊酯，胺菊酯，芐呋菊酯和氟氯氰菊酯組成的組中的擬除蟲菊酯的醇。
19.權(quán)利要求1或2的方法，其是一種酯基轉(zhuǎn)移或酯交換反應(yīng)。
20.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，用于改變植物油或脂肪從而適合用于乳劑和其它基于脂肪的食品。
21.權(quán)利要求20的方法，其中食品選自由人造黃油、人造奶油和冰淇淋組成的組中。
22.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，用于生產(chǎn)一種聚合物。
23.權(quán)利要求22的方法，其中聚合物是一種聚酯。
24.權(quán)利要求23的方法，其中聚酯通過雙官能的酯和醇的相繼酯化和酯交換，雙官能單體的自縮合作用以及內(nèi)酯的開環(huán)聚合而得到。
25.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，在逆反應(yīng)主導(dǎo)的條件下進(jìn)行。
26.權(quán)利要求25的方法，用于底物的酰化。
27.權(quán)利要求1至26任一項(xiàng)的方法，其中昆蟲酯酶或脂肪酶是α-羧酸酯酶。
28.權(quán)利要求27的方法，其中突變體昆蟲酯酶或脂肪酶是α-羧酸酯酶，并且在該酯酶或脂肪酶的活性位點(diǎn)的氧離子空穴、?；Y(jié)合口袋或陰離子位點(diǎn)區(qū)域，或其任意組合處具有突變。
29.權(quán)利要求28的方法，其中突變體昆蟲酯酶或脂肪酶選自由E3G137R，E3G137H，E3W251L，E3W251S，E3W251G，E3W251T，E3W251A，E3W251L/F309L，E3W251L/G137D，E3W251L/P250S，E3F309L，E3Y148F，E3E217M，E3F354W，E3F354L，和EST23W251L組成的組中。
30.權(quán)利要求27或權(quán)利要求28的方法，其中α-羧酸酯酶，或其突變體，包含一種序列，該序列選自由下列序列組成的組中i)如SEQ ID NO1所示的序列，ii)如SEQ ID NO2所示的序列，iii)如SEQ ID NO3所示的序列，iii)一種與i)至iii)的任意一種至少40％相同的能夠水解疏水酯的序列。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述序列與i)或ii)至少80％相同。
32.權(quán)利要求30的方法，其中所述序列與i)或ii)至少90％相同。
33.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體通過一種重組宿主細(xì)胞表達(dá)。
34.權(quán)利要求33的方法，其中宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
35.權(quán)利要求33的方法，其中宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。
36.一種用于生成和選擇水解疏水酯的酶的方法，該方法包括(i)將一種或多種突變引入昆蟲酯酶或脂肪酶，或者已經(jīng)被突變的昆蟲酯酶或脂肪酶中，并且(ii)確定突變體昆蟲酯酶或脂肪酶水解疏水酯的能力。
37.權(quán)利要求36的方法，其中疏水酯是脂肪酸酯。
38.權(quán)利要求36或權(quán)利要求37的方法，其中一種或多種突變能夠提高酯酶或脂肪酶的水解活性和/或改變立體專一性。
39.權(quán)利要求36至38任意一項(xiàng)的方法，其中昆蟲酯酶或脂肪酶是α-羧酸酯酶。
40.權(quán)利要求39的方法，其中α-羧酸酯酶具有一種序列，所述序列選自由下列序列組成的組中i)如SEQ ID NO1所示的序列，ii)如SEQ ID NO2所示的序列，iii)如SEQ ID NO3所示的序列，和iv)與i)至iii)的任意一種序列至少40％相同的序列。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述序列與i)至iii)的任意一種序列至少80％相同。
42.權(quán)利要求40的方法，其中所述序列與i)至iii)的任意一種序列至少90％相同。
43.權(quán)利要求36至42任意一項(xiàng)的方法，其中一種或多種突變位于酯酶或脂肪酶的選自以下一組的區(qū)域內(nèi)氧離子空穴、?；Y(jié)合口袋和陰離子位點(diǎn)。
44.權(quán)利要求36至43任意一項(xiàng)的方法，其中突變是點(diǎn)突變。
45.權(quán)利要求44的方法，其中已經(jīng)發(fā)生突變的昆蟲酯酶或脂肪酶選自由E3G137R，E3G137H，E3W251L，E3W251S，E3W251G，E3W251T，E3W251A，E3W251L/F309L，E3W251L/G137D，E3W251L/P250S，E3F309L，E3Y148F，E3E217M，E3F354W，E3F354L，和EST23W251L組成的組中。
46.一種用于生成和選擇能夠水解酯的昆蟲α-羧酸酯酶的方法，該方法包括(i)將一種或多種突變引入昆蟲α-羧酸酯酶，或者已經(jīng)被突變的昆蟲α-羧酸酯酶中，并且(ii)確定突變體昆蟲α-羧酸酯酶水解酯的能力。
47.通過權(quán)利要求36至46任意一項(xiàng)的方法獲得的酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及昆蟲酯酶或脂肪酶，或其突變體在生物轉(zhuǎn)化過程中作為催化劑的應(yīng)用。本發(fā)明可以應(yīng)用于包括水解、酯化、酯基轉(zhuǎn)移、酯交換或?；磻?yīng)的任意方法中。本發(fā)明還可以應(yīng)用于化合物的酶分解反應(yīng)以得到旋光化合物，并且特別的，但不是唯一的應(yīng)用于具有疏水部分如擬除蟲菊酯和脂肪酸酯的底物。
文檔編號C12N9/20GK1617931SQ02827889
公開日2005年5月18日 申請日期2002年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月6日
發(fā)明者約翰·格雷厄姆·奧克肖特, 艾倫·德文希爾, 克里斯托弗·韋恩·科平, 拉瑪·黑達(dá)里, 蘇珊·簡·多里安, 羅賓·喬伊絲·拉塞爾 申請人:聯(lián)邦科學(xué)技術(shù)研究組織