專利名稱：提高脂肪酶活性穩(wěn)定性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高脂肪酶活性穩(wěn)定性的方法。
背景技術(shù)：
在已有技術(shù)中，美國專利(專利號US5618710，申請日1997年4月8日)公開了一種交聯(lián)酶結(jié)晶，其中的脂肪酶結(jié)晶，是來源于圓柱形假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)生的脂肪酶。其提高酶活性穩(wěn)定性的方法為將凍干的圓柱形假絲酵母脂肪酶溶解于0.5mL去離子水中，濃度為6mg/mL，將此酶溶液在低濃度鹽緩沖溶液中進行透析。透析可以在多種緩沖液存在的條件下進行。如以5mM磷酸鈉為緩沖液，在pH分別為6、7、8時透析；以20mM三羥甲基氨基甲烷和HCl為混合緩沖液，在pH為6.8時透析；以20mM三羥甲基氨基甲烷、HCl、1mMCaCl2、1mMMgCl2為混合緩沖液，在pH為6.8時透析。透析后經(jīng)過6小時結(jié)晶得到0.05～0.1mm薄方板狀結(jié)晶，用離心機分離出結(jié)晶后再用20mM緩沖液在pH為6.8下洗滌10次，離心得到的結(jié)晶再在7.5％戊二醛和20mM三羥甲基氨基甲烷和HCl為混合緩沖液，在pH為6.8、室溫下交聯(lián)30分鐘，此結(jié)晶用20mM三羥甲基氨基甲烷和HCl為混合緩沖液，在pH為6.8下洗滌，得到最終產(chǎn)品。但該方法在進一步純化原酶及工藝中如何防止結(jié)晶再溶解等方面還有待研究。
美國Vertex醫(yī)藥公司將交聯(lián)酶結(jié)晶生物催化劑商業(yè)化專門設(shè)立了ALTUS Biologics公司。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高生物催化劑脂肪酶活性穩(wěn)定性的方法，采用本發(fā)明的方法可以得到酶活性穩(wěn)定性好的生物催化劑——酶微晶。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的。本發(fā)明的一種提高脂肪酶活性穩(wěn)定性的方法包括如下操作步驟(1)脂肪酶溶解于磷酸鹽緩沖液中，離心除去雜質(zhì)得到上清液，然后通入超濾裝置超濾，得到超濾濃縮液，(2)將步驟(1)得到的超濾濃縮液轉(zhuǎn)入透析袋，浸入緩沖液中透析，使酶液進一步濃縮，(3)向步驟(2)中得到的酶液濃縮液中加入結(jié)晶沉淀劑使脂肪酶結(jié)晶，離心后得到脂肪酶晶體，(4)脂肪酶晶體和交聯(lián)劑混合進行交聯(lián)，交聯(lián)結(jié)束后離心得到提高酶活性穩(wěn)定性的脂肪酶。
本發(fā)明所述的方法，透析時透析袋浸入的緩沖液是硫酸銨緩沖液、磷酸鹽緩沖液、分子量為6000～8000的聚乙烯醇緩沖液、2(N-嗎啉代)丙烷磺酸緩沖液。
本發(fā)明所述的方法，所述的結(jié)晶沉淀劑是分子量為4000～8000的聚乙烯醇、2-丙酮、2-甲基-2，4-戊二醇、CaCl2。
本發(fā)明所述的方法，結(jié)晶時可加入微細脂肪酶晶種誘導(dǎo)結(jié)晶，誘導(dǎo)結(jié)晶時，微細脂肪酶晶種的加入量是微細脂肪酶晶種占總液體量中的0.01～0.25％(體積百分數(shù))。
本發(fā)明所述的方法，脂肪酶晶體和交聯(lián)劑交聯(lián)時，交聯(lián)劑加入量是交聯(lián)劑占總液體量中的1～10％(體積百分數(shù))，交聯(lián)時間是30～200分鐘，交聯(lián)溫度是10～50℃。
本發(fā)明所述的方法，脂肪酶晶體交聯(lián)時加入的交聯(lián)劑是溴化氰、聚乙烯亞胺、戊二醛、碳化二亞胺。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點1.本發(fā)明的提高脂肪酶活性穩(wěn)定性的方法采用超濾除雜質(zhì)、透析增濃的純化方法可提高酶的有效組份含量。
2.本發(fā)明的方法采用加入微細脂肪酶晶體誘導(dǎo)結(jié)晶，便于得到脂肪酶微晶。
3.本發(fā)明的方法采用的交聯(lián)工藝，可防止脂肪酶結(jié)晶晶體自身再溶解，增加了產(chǎn)品的穩(wěn)定性。
4.本發(fā)明采用的方法可得到酶活性穩(wěn)定性更好的微細結(jié)晶，同時可提高總酶的回收率。
具體實施例方式
下面通過對本發(fā)明的具體實施例的詳細描述來進一步說明本發(fā)明，但實施例不是對本發(fā)明的限制。
實施例1(1)將0.8g脂肪酶溶解于250mL磷酸鹽緩沖液中，離心除去雜質(zhì)得到上清液，上清液通過超濾裝置超濾得到超濾濃縮液，此時酶的截留率為100％。
(2)將超濾濃縮液轉(zhuǎn)入透析袋中，用磷酸鹽作為緩沖液，在pH＝7.5下透析12小時使溶液平衡，得到進一步濃縮的酶液。
(3)取濃縮的脂肪酶酶液40mL，加入磷酸緩沖液40mL，磷酸緩沖液pH＝7.5，同時加入沉淀劑2-甲基-2，4-戊二醇40mL、CaCl20.03g，再加入占總液體量中0.05％(體積百分數(shù))的脂肪酶微細結(jié)晶，在攪拌下進行誘導(dǎo)結(jié)晶，結(jié)晶結(jié)束后離心得到脂肪酶晶體。
(4)將所得到的脂肪酶晶體與50mL磷酸鹽緩沖液混合，加入CaCl20.03g和2-甲基-2，4-戊二醇使2-甲基-2，4-戊二醇占總液體量的30％(體積百分數(shù))，再加入交聯(lián)劑戊二醛，其加入量是戊二醛占總液體量的3.5％(體積百分數(shù))。脂肪酶晶體和交聯(lián)劑在攪拌下進行交聯(lián)，交聯(lián)溫度是25℃，交聯(lián)時間是3小時。交聯(lián)結(jié)束后離心分離出脂肪酶微晶，用磷酸鹽緩沖液洗滌、分離脂肪酶微晶兩次得最終產(chǎn)品。
實施例2除透析袋浸入的緩沖液是硫酸銨緩沖液，透析時間是16小時；加入的沉淀劑是2-丙酮40mL、CaCl20.03g，不加脂肪酶微細結(jié)晶；加入CaCl20.005g和2-甲基-2，4-戊二醇使2-甲基-2，4-戊二醇占總液體量的25％(體積百分數(shù))，交聯(lián)劑是溴化氰，占總液體量的1％(體積百分數(shù))，交聯(lián)時間是200分鐘，交聯(lián)溫度是45℃，其余操作同實施例1。
實施例3除透析袋浸入的緩沖液是分子量為6000的聚乙烯醇緩沖液，透析時間是24小時；加入的沉淀劑是6000的聚乙烯醇40mL、CaCl20.03g，加入占總液體量中0.1％(體積百分數(shù))的脂肪酶微細結(jié)晶；加入CaCl20.009g和2-甲基-2，4-戊二醇使2-甲基-2，4-戊二醇占總液體量的40％(體積百分數(shù))，交聯(lián)劑是聚乙烯亞胺，占總液體量的10％(體積百分數(shù))，交聯(lián)時間是30分鐘，交聯(lián)溫度是30℃，其余操作同實施例1。
實施例4除透析袋浸入的緩沖液是分子量為8000的聚乙烯醇緩沖液，透析時間是18小時；加入的沉淀劑是分子量為8000的聚乙烯醇40mL、CaCl20.03g，加入占總液體量中0.2％(體積百分數(shù))的脂肪酶微細結(jié)晶；加入CaCl20.05g和2-甲基-2，4-戊二醇使2-甲基-2，4-戊二醇占總液體量的60％(體積百分數(shù))，交聯(lián)劑是碳化二亞胺，占總液體量的5％(體積百分數(shù))，交聯(lián)時間是120分鐘，交聯(lián)溫度是10℃，其余操作同實施例1。
實施例5除透析袋浸入的緩沖液是2(N-嗎啉代)丙烷磺酸緩沖液，透析時間是8小時；加入的沉淀劑是分子量為6000的聚乙烯醇40mL、CaCl20.03g，加入占總液體量中0.25％(體積百分數(shù))的脂肪酶微細結(jié)晶；加入CaCl20.015g和2-甲基-2，4-戊二醇使2-甲基-2，4-戊二醇占總液體量的50％(體積百分數(shù))，交聯(lián)劑是戊二醛，占總液體量的4％(體積百分數(shù))，交聯(lián)時間是150分鐘，交聯(lián)溫度是20℃，其余操作同實施例1。
實施例6除透析袋浸入的緩沖液是磷酸鹽緩沖液，透析時間是15小時；加入的沉淀劑是2-丙酮40mL、CaCl20.03g，加入占總液體量中0.01％(體積百分數(shù))的脂肪酶微細結(jié)晶；加入CaCl20.01g和2-甲基-2，4-戊二醇使2-甲基-2，4-戊二醇占總液體量的45％(體積百分數(shù))，交聯(lián)劑是溴化氰，占總液體量的1％(體積百分數(shù))，交聯(lián)時間是200分鐘，交聯(lián)溫度是45℃，其余操作同實施例1。
實施例7酶活性穩(wěn)定性的測定以上實施例中得到的脂肪酶微晶在50％四氫呋喃溶液中，經(jīng)過5天后測得酶活性仍保持90％以上。與未處理的脂肪酶相比較，其酶活性的半衰期時間延長了近百倍。
權(quán)利要求
1.一種提高脂肪酶活性穩(wěn)定性的方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)脂肪酶溶解于磷酸鹽緩沖液中，離心除去雜質(zhì)得到上清液，然后通入超濾裝置超濾，得到超濾濃縮液，(2)將步驟(1)得到的超濾濃縮液轉(zhuǎn)入透析袋，浸入緩沖液中透析，使酶液進一步濃縮，(3)向步驟(2)中得到的酶液濃縮液中加入結(jié)晶沉淀劑使脂肪酶結(jié)晶，離心后得到脂肪酶晶體，(4)脂肪酶晶體和交聯(lián)劑混合進行交聯(lián)，交聯(lián)結(jié)束后離心得到提高酶活性穩(wěn)定性的脂肪酶。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于透析時透析袋浸入的緩沖液是硫酸銨緩沖液、磷酸鹽緩沖液、分子量為6000～8000的聚乙烯醇緩沖液、2(N-嗎啉代)丙烷磺酸緩沖液。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的結(jié)晶沉淀劑分子量為4000～8000的聚乙烯醇、2-丙酮、2-甲基-2，4-戊二醇、CaCl2。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于結(jié)晶時可加入微細脂肪酶晶種誘導(dǎo)結(jié)晶。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于誘導(dǎo)結(jié)晶時，微細脂肪酶晶種的加入量是微細脂肪酶晶種占總液體量中的0.01～0.25％(體積百分數(shù))。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于脂肪酶晶體和交聯(lián)劑交聯(lián)時，交聯(lián)劑加入量是交聯(lián)劑占總液體量中的1～10％(體積百分數(shù))，交聯(lián)時間是30～200分鐘，交聯(lián)溫度是10～50℃。
7.如權(quán)利要求1或6所述的方法，其特征在于脂肪酶晶體交聯(lián)時加入的交聯(lián)劑是溴化氰、聚乙烯亞胺、戊二醛、碳化二亞胺。
全文摘要
一種提高脂肪酶活性穩(wěn)定性的方法，將脂肪酶溶解于磷酸鹽緩沖液中，離心除去雜質(zhì)，上清液進入超濾裝置超濾，得到的超濾濃縮液用透析方法使酶液進一步濃縮，然后向酶液濃縮液中加入結(jié)晶沉淀劑使脂肪酶結(jié)晶，離心后得到脂肪酶晶體，脂肪酶晶體和交聯(lián)劑交聯(lián)后得到提高酶活性穩(wěn)定性的脂肪酶。本發(fā)明的方法增加了結(jié)晶前的兩步純化以及對交聯(lián)工藝的控制，使酶活性穩(wěn)定性大大提高，并可防止結(jié)晶再溶解，增加了產(chǎn)品得率。
文檔編號C12N9/18GK1408855SQ0112680
公開日2003年4月9日 申請日期2001年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月19日
發(fā)明者童海寶, 羅鳳山, 蔡揚, 徐靜安 申請人:上?；ぱ芯吭?br>