專利名稱：在單一樣本中檢測和定量多種靶核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及遺傳分析的領(lǐng)域，特別涉及使用雜交和滾動-循環(huán)擴增技術(shù)，在單一樣本中對包括突變核酸的核酸進行精確的檢測和敏感的定量。本發(fā)明的組合物和方法學(xué)對于研究領(lǐng)域、個體鑒定和臨床診斷及其它目的在檢測單一樣本中多種核酸的存在和拷貝數(shù)量時特別有用。
背景技術(shù)：
對樣本中核酸的精確檢測和定量是多種應(yīng)用中非常有價值的手段之一，包括實驗研究、醫(yī)學(xué)診斷、新藥發(fā)明和生命科學(xué)及生物醫(yī)學(xué)的其它方面。同時，核酸檢測技術(shù)也存在于許多其它的實踐中，這些包括以證明個體身份為目的的親子鑒定，司法鑒定，器官移植時供體和配體的匹配及產(chǎn)前咨詢服務(wù)等。
基因突變引起大量疾病的發(fā)生，其中包括各種形式的癌癥，血管性疾病，神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。已經(jīng)鑒定了許多這樣的基因突變，包括核酸序列變化，引起的囊狀纖維化疾病，肌肉萎縮癥，Tay-Sachs疾病，血友病，苯丙酮酸尿癥和鐮刀狀細(xì)胞貧血癥等。由于遺傳變異關(guān)系到疾病的狀態(tài)，因此在癥狀出現(xiàn)前后準(zhǔn)確檢測標(biāo)本中核酸序列對于正確的臨床診斷、預(yù)防和治療就至關(guān)重要。
遺傳變異既可以是小到基因中單個堿基對的改變，也可以是若干堿基對的改變、插入、缺失和易位。在已知的500多種遺傳疾病中，有很多由單個堿基對突變引起。單個堿基對突變導(dǎo)致異常細(xì)胞活動和疾病的突出例子是鐮刀狀細(xì)胞貧血癥。由于從樣本的大量靶核苷酸酸序列中識別一個堿基對的差別具有科學(xué)上的挑戰(zhàn)意義，所以檢測單堿基對變異最為困難。因此，一種能夠從眾多核酸序列中檢測出單個堿基對差異的方法，對于研究和改善遺傳疾病的影響就顯得至關(guān)重要了。
遺傳密碼中的其它變化也可以改變生命中某些方面的功能，并引起疾病。由遺傳密碼的改變而引起基因產(chǎn)物的改變或基因自身在表達(dá)水平上的變化可能是功能改變和疾病發(fā)生的決定因素?；虮磉_(dá)的改變可以通過遺傳物質(zhì)DNA拷貝數(shù)量的改變而引起(例如通過始發(fā)階段的控制，RNA前體的改變，異常RNA的剪接等等)。所以，核酸表達(dá)水平或拷貝數(shù)量的定量應(yīng)該是臨床診斷的基礎(chǔ)。
在大量基因中識別單個堿基對改變的能力是遺傳物質(zhì)分析和定量的基礎(chǔ)，而定量識別的能力具有更廣泛地應(yīng)用前景。
美國專利(專利號6,268,147)已經(jīng)廣泛和清晰的描述了各種用于在含有大量核酸序列的單一標(biāo)本中同時分析多種核酸序列的技術(shù)方法和策略。其中，最常用的分析方法是依賴于核酸捕獲和標(biāo)記的雜交技術(shù)。
這樣的雜交技術(shù)之一利用與靶核酸互補的核酸探針定位和雜交樣本中的靶核酸。探針或靶核酸用可檢測的報告分子，如熒光物質(zhì)或放射性同位素預(yù)先標(biāo)記。雜交和沖洗步驟后，標(biāo)記物的存留表明樣本中存在靶DNA。點印跡和狹逢印跡方法就是利用這種簡單的雜交檢測技術(shù)。此類膜雜交形式的技術(shù)及其派生技術(shù)，利用凝膠電泳將混合的DNA片段分開，然后再將凝膠中的DNA片段轉(zhuǎn)移并固定于膜上。通過固定于膜上的DNA片段與一個或多個標(biāo)記探針在特定雜交條件下的反應(yīng)而識別相關(guān)核酸的存在與否。這樣的膜技術(shù)包括了單核苷酸酸多態(tài)性檢測(SNP)、RNA印跡和DNA印跡雜交技術(shù)。
上述技術(shù)的局限性之一是需要額外的步驟將標(biāo)記物整合入靶探針或檢測探針。雖然直接和廣泛使用標(biāo)記，但畢竟需要額外的步驟。并且，當(dāng)檢測大量標(biāo)本時，這些額外步驟將消耗大量的時間和費用。更重要的是，如要用標(biāo)記的核酸探針檢測陽性信號，樣本中必須至少包含有10萬至100萬個拷貝的靶核酸，才能達(dá)到有效的、用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)能檢測到的濃度。因此，這些方法對低拷貝數(shù)的核酸是不敏感的，并且不能用于靶物數(shù)量少于10萬至100萬個的樣本檢測。但是，存在于細(xì)胞基因組中的大部分基因拷貝數(shù)介于1至數(shù)個之間，因此，單獨使用這一方法，不足以確定大多數(shù)核酸的存在或缺失。
雜交技術(shù)的另一個局限性是不能用于監(jiān)測或確定基因的表達(dá)水平和拷貝數(shù)量。雜交方法僅僅能夠用于確定相關(guān)基因序列的存在與否而不能對其進行定量分析。此外，核酸序列中單個堿基對的差異不是任何情況下都可以被識別的，這是因為只有一個不同堿基對時，只有靠很小的結(jié)合能量差別來區(qū)分靶和非靶探針。為了使靈敏度能達(dá)到足以鑒別匹配的探針和單個核苷酸酸不匹配的探針，就必須非常仔細(xì)的控制雜交、孵化和沖洗步驟的嚴(yán)緊度。最佳的反應(yīng)條件很大程度上取決于所檢測的對象。由于每一個反應(yīng)必須是特異于靶和探針之間的作用，以至使自動化和/或高通量的同時進行一個以上的核酸篩選變得十分困難。
一般而言，這種技術(shù)達(dá)不到檢測低數(shù)目核酸序列的靈敏度，如僅有幾個細(xì)胞可供樣本分析的臨床樣本檢測。并且，這種方法也不適合單獨用于確定大量核酸序列中僅有很少部分序列改變(突變)的存在，而這些很少部分改變直接導(dǎo)致疾病的發(fā)生。
另一種檢測和定量核酸的方法是利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測樣本中的靶核酸。在PCR方法中，通過熱循環(huán)反應(yīng)，利用相關(guān)靶序列5’和3’端互補引物而擴增相關(guān)的靶序列。擴增后的核酸序列就能夠用各種技術(shù)如凝膠電泳來進行檢測，進而確定樣本中特定序列的存在或缺失。這個方法尤其適用于從含有多種核酸序列的樣本中檢測散在分布的低拷貝靶核酸序列。這種情況下，更多的標(biāo)記物通過指數(shù)級的PCR酶反應(yīng)過程而整合進去，以至能檢測到低拷貝數(shù)量序列的陽性信號。然而，這種技術(shù)在檢測單個樣本中多種目標(biāo)靶序列的拷貝數(shù)和檢測單一堿基對突變時存在缺陷。
PCR方法的檢測過程是一個高靈敏度的酶反應(yīng)過程。在反應(yīng)的過程中，由于鹽濃度和退火溫度的影響導(dǎo)致引物退火速率的不同和聚合酶對每一種核酸序列的增擴速度的差異，直接影響到生成物的產(chǎn)生數(shù)量。由于存在這種樣本與樣本之間的差異性，因此，這種方法不適合用于通過單一反應(yīng)檢測單個樣本中的多種靶序列拷貝數(shù)量的變化。
用PCR方法檢測多種核酸的另一個局限是每一種靶序列所需的PCR引物各不相同。反應(yīng)中每加入一套新的引物，潛在復(fù)制物和引物二聚體的數(shù)量可以呈指數(shù)級增長。在一個PCR反應(yīng)中，多對引物將造成高比率的非特異性擴增和假陽性結(jié)果(參見Sambrook et al，.MolecularCloningA Laboratory Manual(2nd ed.)，pages 14 and 15(ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)。另外，當(dāng)野生型和突變型同時存在時，PCR能使兩者同時擴增而迫使用更多的步驟將突變型從野生型中分離和鑒別出來。
如美國專利(No.6,312,892，)討論的，核酸的檢測也可運用探針連接方法確定已知核酸序列。探針連接方法涉及到跨越目標(biāo)靶區(qū)域的兩個探針。兩個探針與靶序列互補并與之雜交，使上游3’端的探針與下游5’端的探針直接相鄰。只有當(dāng)結(jié)合點精確互補，在鄰接探針的交叉點不存在任何錯配時，探針的鄰接末端就可以通過連接反應(yīng)結(jié)合在一起。連接反應(yīng)將兩條核酸探針鏈共價連接為一條核酸鏈時，對于結(jié)合位點上的單一堿基對的錯配非常敏感，如有一個堿基對的錯配，探針就不能連接。通過檢測連接的探針可以確定特定靶核酸序列的存在或缺失。(參見美國專利No.4,833,750.)這一技術(shù)特異性很強，甚至在靶序列和探針之間存在一個堿基對的不同，連接酶就不能連接DNA鏈。但是單獨使用探針連接方法，不能產(chǎn)生足夠的產(chǎn)物用以檢測和定量小量的靶序列。
因為連接反應(yīng)自身不能提供足夠的產(chǎn)物以供檢測，探針連接技術(shù)需要一個附加的擴增步驟用以檢測連接反應(yīng)陽性結(jié)果的存在。這一領(lǐng)域的文章描述了大量檢測方法。目前使用的許多方法主要依賴于用熒光物質(zhì)或放射物質(zhì)對DNA探針的標(biāo)記(參見美國專利No.4,833,750)。其它的方法運用了PCR擴增的靶物質(zhì)和/或多循環(huán)雜交和連接反應(yīng)。(例如，參見美國專利No.6,312,892)。然而，現(xiàn)有的技術(shù)仍不能對小量目標(biāo)序列檢測和定量。
與上述標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)一樣，利用標(biāo)記探針的探針連接方法的檢測體系同樣受到標(biāo)記密度的限制，且不能檢測出樣本中低拷貝數(shù)的靶序列。因而，單獨使用這些技術(shù)不能為低拷貝數(shù)的核酸提供可以檢測到的信號。
利用PCR和其它擴增反應(yīng)的檢測技術(shù)，如多重雜交和連接反應(yīng)，由于其核酸擴增產(chǎn)物的數(shù)量隨靶核酸的變化而不同，因此受到限制。受此影響，每種不同靶序列的檢測都有特定的反應(yīng)動力學(xué)且其擴增產(chǎn)物的數(shù)量也隨之不同。靶序列的不同及其導(dǎo)致信號的不一致使這一方法不適合用于在單一樣本中精確定量多種核酸序列。
另外，PCR擴增的方法也不太適用于芯片的微矩陣形式。核酸微矩陣的優(yōu)勢在于可同時分析成千上萬種核酸序列。所測試的序列以微米尺度印制在固體表面的特定區(qū)域內(nèi)。核酸不被物理空間分隔。但在PCR擴增的方法中，PCR反應(yīng)擴增的產(chǎn)物游離于溶液中。因此，在放置待測核酸的同一區(qū)域中不能定位發(fā)現(xiàn)任何PCR擴增法擴增的產(chǎn)物。所以，每一PCR擴增反應(yīng)必須有分隔的物理空間，以使每一個PCR擴增產(chǎn)生的陽性信號能與要求的陽性核酸相關(guān)聯(lián)。因為，微矩陣形式在核酸序列之間不存在物理的分隔而PCR反應(yīng)必須有物理分隔，所以，PCR擴增的方法在單一的樣本中就不能有效的檢測識別成千上萬的核酸序列。
鑒于現(xiàn)有分析核酸技術(shù)的明顯缺陷，需要建立一種快速單一的分析形式以從含有多種非靶序列的核酸樣本中，甚至在低豐度的樣本中同時檢測出多種特定的核酸序列的存在與否，并可以進行精確定量。
發(fā)明簡述本發(fā)明滿足了在單一樣本中以單一反應(yīng)靈敏地檢測和定量成千上萬種不同的核酸序列的需要。通過結(jié)合探針連接技術(shù)和滾動循環(huán)擴增技術(shù)，本發(fā)明比雜交方法靈敏，能夠在單一樣本中檢測出少至10個拷貝的靶物質(zhì)。
本發(fā)明還滿足了用單一反應(yīng)精確檢測和定量成千上萬種不同核酸序列的需要。用此滾動循環(huán)技術(shù)，單個陽性連接反應(yīng)的結(jié)果被擴增一萬倍，該擴增過程嚴(yán)格依賴于靶核酸的拷貝數(shù)并與靶核酸的拷貝數(shù)呈嚴(yán)格成比例。并且，通過使用通用模板和引物，排除了樣本與樣本之間的變異性。因此，該方法能精密準(zhǔn)確地定量樣本中的靶物質(zhì)，甚至低拷貝數(shù)量的靶物質(zhì)。
另外，本發(fā)明可望對樣本中的點突變進行檢測。檢測點突變可識別遺傳變異，用于人類疾病診斷或研究領(lǐng)域。這種方法既靈敏又精確，能夠檢測出靶物和非靶物之間一個堿基對的不同，精確度達(dá)到99.99％以上。
歸結(jié)起來，本發(fā)明的一方面提供核酸分析的方法，這種方法通過將捕獲探針與靶核酸的雜交，將計數(shù)探針與靶核酸的雜交，連接捕獲探針和計數(shù)探針，并將單鏈環(huán)狀DNA雜交到計數(shù)探針上，然后擴增環(huán)狀DNA，其中擴增條件足以能夠檢測靶核酸的存在。
在本發(fā)明另一實施方案中，所述的靶核酸是DNA、RNA或cDNA。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述靶核酸來自于細(xì)菌、病毒、寄生蟲或真菌。
依照本發(fā)明的另一個方面，靶核酸的樣本取自身體的體液、組織或排泄物。
依照本發(fā)明的另一個方面，靶核酸的樣本取自血液、唾液、尿液或痰液。
在本發(fā)明另一個方面中，捕獲探針互補于來自于細(xì)菌、病毒、寄生蟲或真菌的核酸序列。
在本發(fā)明另一個方面中，能夠通過將擴增產(chǎn)物的數(shù)量與至少一個已知量的核酸標(biāo)準(zhǔn)品相比較而確定靶核酸存在的數(shù)量。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中提供了分析靶核酸的方法，這個方法是將靶核酸雜交到捕獲探針上，并將靶核酸又與計數(shù)探針雜交，由此形成一個包含由捕獲探針、計數(shù)探針和靶核酸構(gòu)成的雜交復(fù)合體；并將雜交復(fù)合體暴露于連接酶并將未共價連接捕獲探針的計數(shù)探針和核酸洗去；然后將單鏈環(huán)狀DNA加到捕獲探針中，并加入能擴增單鏈環(huán)狀DNA的核酸聚合酶，以此確定擴增的環(huán)狀DNA的存在與否。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案包括捕獲探針、計數(shù)探針和單鏈環(huán)狀DNA片段的分子裝配體(assemblage)，其中環(huán)狀DNA片段與計數(shù)探針相鄰接。
本發(fā)明的另一個實施方案中所述分子裝配體中的靶核酸是DNA、RNA或cDNA。
依照本發(fā)明的另一實施方案，所述分子裝配體中的靶核酸來自于細(xì)菌、病毒、寄生蟲或真菌。
本發(fā)明的另一實施方案中分子裝配體的捕獲探針與來自于細(xì)菌、病毒、寄生蟲或真菌的特定核酸序列互補。
另外一個實施方案中，分子裝配體的靶核酸來自體液、組織或排泄物。
附圖描述

圖1是在DNA芯片或96孔板上固定捕獲探針的示意圖。
圖2是在混合靶物質(zhì)中用核酸雜交方法捕獲特定靶物質(zhì)的示意圖。靶物質(zhì)B和D特定地分別與捕獲探針B和D雜交。計數(shù)探針B和D分別與靶物質(zhì)B和D退火。結(jié)果，形成一個由捕獲探針、計數(shù)探針和靶分子三種核酸分子組成的分子復(fù)合物。計數(shù)探針的5’端有一個連接反應(yīng)需要的磷酸基團。非特異性的靶物質(zhì)和指示探針仍然是游離的。
圖3顯示了計數(shù)探針B和D在連接反應(yīng)后共價地連接到捕獲探針上，連接反應(yīng)是在ATP存在下由DNA連接酶催化的。多余的計數(shù)探針和非特異性靶物質(zhì)仍然保持游離狀態(tài)。
圖4描述了非相關(guān)靶物質(zhì)分子和游離的計數(shù)探針被清洗掉。清洗前與靶物質(zhì)退火的計數(shù)探針因與捕獲探針共價相連，仍然保留在固體的表面。
圖5表現(xiàn)了單鏈環(huán)狀DNA分子，例如M13單鏈DNA，與計數(shù)探針3’端退火。計數(shù)探針的3’端包含了與單鏈環(huán)狀DNA分子互補的核酸序列。
圖6是一個示意圖，描述了一個線性滾動循環(huán)擴增反應(yīng)和在滾動循環(huán)擴增反應(yīng)結(jié)束時產(chǎn)生大量標(biāo)記的DNA產(chǎn)物。
圖7描述了依照本發(fā)明，在擴增反應(yīng)結(jié)束時產(chǎn)生的DNA產(chǎn)物的定量。
發(fā)明詳述發(fā)明人發(fā)明能夠靈敏和準(zhǔn)確地在單一反應(yīng)中檢測和定量成千上萬種不同核酸序列的方法。本發(fā)明比雜交方法更靈敏，結(jié)合各種探針連接和滾動循環(huán)擴增的方法，能夠在單一的樣本中檢測少至10個拷貝的靶序列。
本發(fā)明提供的方法比現(xiàn)有方法具有更高的準(zhǔn)確性，因為該方法的定量嚴(yán)格依賴于靶核酸的拷貝數(shù)并與靶核酸的拷貝數(shù)呈嚴(yán)格比例，并且，通過使用通用模板和引物，排除了樣本與樣本之間的變異性。加之，采用核酸微矩陣，如DNA芯片，不僅具有能高通量并行分析大量核酸的優(yōu)勢，并且還可高精確度的定量檢測核酸。
簡言之，本發(fā)明的探針-連接涉及使用兩種探針以通過雜交反應(yīng)捕獲靶核酸。這兩種探針在相應(yīng)的互補的靶核酸上相互鄰接時可連接。在此稱作“捕獲探針”和“計數(shù)探針”的這兩種探針在存在互補的靶核酸時連接成單一的探針，這代表存在一個靶核酸序列。
根據(jù)本發(fā)明，計數(shù)探針的3’端是獨特的，因為它包括一個與單鏈環(huán)狀DNA(如M13)的一段序列互補的序列，由此計數(shù)探針能夠與單鏈環(huán)狀DNA雜交，從而充當(dāng)滾動循環(huán)擴增反應(yīng)中單鏈環(huán)狀DNA的引物。本發(fā)明應(yīng)用了線性的滾動循環(huán)擴增，因而與常用的連接技術(shù)不同，如常用的探針和靶物質(zhì)的擴增反應(yīng)，對每一種靶DNA而言各不相同，有的更需進行多重探針-靶物質(zhì)的雜交和連接。
在環(huán)狀DNA、核酸聚合酶和核苷酸存在時，擴增過程將產(chǎn)生一個包含有千千萬萬個環(huán)狀DNA序列拷貝的長鏈核酸分子，其中依據(jù)本發(fā)明，這個長鏈核酸分子仍然連在被固定的DNA探針上。依靠一個單一的引物，滾動循環(huán)擴增幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生數(shù)百個銜接相連的環(huán)狀模板的拷貝。本擴增反應(yīng)在單個連接事件的位點，即檢測到單個靶分子的這個點上能產(chǎn)生單鏈環(huán)狀DNA的多至104個拷貝，這些拷貝共價地連接在被固定的探針DNA上。參見Zhong等人，Proc，Nat’l Acad.Sci.USA 983940-945(2001)。
更具體的是計數(shù)探針有一個5’端和3’端，5’端包含了與靶DNA的3’端互補的區(qū)域；3’端包含與單鏈環(huán)狀DNA序列互補的區(qū)域。環(huán)狀DNA可以是任何不同源于捕獲探針序列的核酸序列，例如M13，并且可由任何已知幾種方法來產(chǎn)生環(huán)狀DNA。計數(shù)探針的3’端一旦與單鏈環(huán)狀DNA雜交就可充當(dāng)擴增反應(yīng)的引物。在這種情況下，加入聚合酶和核苷酸就能生成一個延長的核酸分子，該分子起始于計數(shù)探針3’端，并因此共價連接在計數(shù)探針3’端上。合成的擴增產(chǎn)物通過共價連接到探針而共價地連接到固體載體上。
滾動循環(huán)擴增的產(chǎn)物可以通過多種途徑來檢測和定量，例如放射性核苷酸、熒光標(biāo)記核苷酸或其它標(biāo)記方法。無論如何，本發(fā)明開拓了以“信號-檢測”策略的滾動-循環(huán)擴增技術(shù)，在恒溫下，以線性級數(shù)或指數(shù)級數(shù)復(fù)制了環(huán)狀核酸。參見Lizardi等人，Nature Genet。
與基于PCR的技術(shù)和運用多重雜交及連接的方法不同，本發(fā)明的優(yōu)勢在于在此滾動循環(huán)反應(yīng)中，信號的擴增不因各種樣本的不同而改變。在一個反應(yīng)中，對各種靶物而言，引物是同樣的，被擴增的單鏈環(huán)狀DNA也是同樣的。因此，每一個探針復(fù)性到單鏈環(huán)狀DNA上并啟動滾動循環(huán)檢測反應(yīng)的機會和反應(yīng)動力學(xué)相同。結(jié)果，在檢測的步驟中的變異性非常??；每一個探針被同等地擴增，確保了準(zhǔn)確的定量和一致的結(jié)果，而與靶序列的不同無關(guān)。
此外，依照本發(fā)明，成千上萬個反應(yīng)能夠在同一多孔板或一個DNA芯片或其它微矩陣中進行，這是因為擴增的產(chǎn)物通過探針共價地連接在固體載體上。這也能夠?qū)⑿盘枖U增產(chǎn)物定位于載體上最初含有捕獲探針的同一區(qū)域。(與此不同的是，在PCR技術(shù)中，擴增的產(chǎn)物游離于液相中。)由于能精確定位來自一個連接反應(yīng)的單一信號，本發(fā)明的方法很適于微矩陣的形式。另外，DNA快速和穩(wěn)定的產(chǎn)生能簡單、準(zhǔn)確地檢測信號擴增，能夠從每個樣本中識別出少至10個拷貝的核酸。
這一檢測方法與已被廣為應(yīng)用為改良版本的探針連接方法以檢測靶核酸的存在的技術(shù)方法。參見美國專利6,312,892和4,883,750；Wu等人，Genomics 4560(1989)；Landegren等人，Science 2411077(1988)；和Winn-Deen等人，Clin.Chem.371522(1991)。通常，利用樣本中精確配對核酸的存在，探針連接方法產(chǎn)生了一個可檢測的固定探針。本發(fā)明的方法相對于其它探針連接檢測方法的改進在于計數(shù)探針的3’端包含了與單鏈環(huán)狀DNA分子中的序列互補的序列。只有當(dāng)樣本中存在靶DNA時，同時含有固定的5’端和3’單鏈環(huán)狀DNA互補端的共價連接的探針才產(chǎn)生。另外，當(dāng)探針與樣本中其它非靶核酸(包括只有一個堿基對不同的核酸)雜交時，由于連接酶的特異性，在交叉點上出現(xiàn)的錯配將阻止連接發(fā)生。
具體來說，在這種方法中，第一個核酸探針——捕獲探針固定于固體載體上。捕獲探針的序列被設(shè)計成互補于靶序列的一個保守區(qū)。捕獲探針的5’端構(gòu)建有一個活性化學(xué)基團，如生物素或帶連接臂的氨基基團，便于捕獲探針能固定在載體的表面。從而通過捕獲探針的5’端，將捕獲探針固定在玻璃、塑料載體上或任何其它固體的表面。
第二個核酸探針——計數(shù)探針設(shè)計成探針的5’端互補于靶序列緊位于與捕獲探針退火的上游的一個區(qū)域。計數(shù)探針的3’端是獨特的，被設(shè)計成包含與單鏈環(huán)狀DNA序列(如M13)互補的序列，以至計數(shù)探針能夠充當(dāng)雜交到計數(shù)探針上的單鏈DNA滾動循環(huán)擴增反應(yīng)的引物。計數(shù)探針還含有一個5’端的磷酸基團。
靶核酸是指來自于生物樣本中的任何脫氧核糖核酸或核糖核酸。靶核酸可以由熟悉該專業(yè)的人員按照許多已知方法從樣本中分離出來。核酸的范圍包括但不局限于DNA，mRNA，cDNA和cRNA。一個靶核酸可以是自然的染色體物質(zhì)或RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，或是第二鏈的cDNA，或是由雙鏈中間體轉(zhuǎn)錄的RNA，或是由專業(yè)的人員所熟知的方法產(chǎn)生的核酸。
當(dāng)含有精確靶序列的核酸序列存在時，即當(dāng)該核酸與捕獲探針和計數(shù)探針都互補時，固定的捕獲探針將與靶核酸雜交，而計數(shù)探針也緊鄰捕獲探針與上游靶核酸雜交。只有當(dāng)精確的核酸配對時，捕獲探針和計數(shù)探針之間才發(fā)生連接。再依照本發(fā)明，單鏈環(huán)狀DNA雜交到計數(shù)探針3’端的序列上，然后在滾動循環(huán)擴增中產(chǎn)生很多的DNA拷貝。通過與一套參考靶物質(zhì)及其產(chǎn)生的參照數(shù)學(xué)公式和曲線相比較，就能夠檢測和定量最終的擴增產(chǎn)物了。
對于非特異性的核酸，固定的捕獲探針和計數(shù)探針是不與非特異性的核酸雜交的。因此，捕獲探針的3’端與計數(shù)探針磷酸化的5’端不相鄰，然而連接反應(yīng)發(fā)生必需捕獲探針和計數(shù)探針之間相鄰定位。對非特異性的核酸，由于捕獲探針和計數(shù)探針之間的不適當(dāng)排列，計數(shù)探針未被連接到捕獲探針上。沒有發(fā)生連接，計數(shù)探針將在后續(xù)的清洗步驟中被清除，這樣既不會發(fā)生單鏈環(huán)狀DNA的雜交，也不會發(fā)生單鏈環(huán)狀DNA的擴增。
當(dāng)核酸中含有靶核酸序列，但靶序列中的一個或幾個核苷酸存在改變時，雖然固定的捕獲探針與靶核酸雜交，計數(shù)探針也緊鄰捕獲探針與上游靶核酸雜交。然而，在這種情況下，在核苷酸酸發(fā)生變異的點位上出現(xiàn)錯配。(“錯配”當(dāng)靶核酸的核苷酸不能與一個或多個捕獲探針或計數(shù)探針中的核苷酸形成非共價相互作用時發(fā)生。)如上所述，只有當(dāng)在捕獲探針和計數(shù)探針的鄰接部位有精確的核酸配對時，捕獲探針和計數(shù)探針的連接才能發(fā)生。因此，在捕獲探針5’端或捕獲探針3’端的錯配將干擾連接反應(yīng)。沒有連接反應(yīng)，計數(shù)探針就將在后續(xù)的清洗步驟中被清洗掉，從而既不會發(fā)生單鏈環(huán)狀DNA的雜交，也不會發(fā)生單鏈環(huán)狀DNA的擴增。所以，通過設(shè)計捕獲探針和計數(shù)探針使感興趣的單個核苷酸或多個核苷酸定位在計數(shù)探針與捕獲探針的鄰接部位，人們就可以運用本發(fā)明檢測出小到一個單核苷酸酸的改變。
用本發(fā)明對不同來源的樣本中目的核酸進行檢測、分析和/或定量。靶核酸可來源于任何的生物資源，包括產(chǎn)前的和死后的樣本。生物資源包括但不局限于病毒、細(xì)菌、寄生蟲、真菌、單個細(xì)胞、體液、排泄物、組織。靶核酸可以按照現(xiàn)有的方法從生物資源中提取。由于本發(fā)明適用于各種樣本來源，因此，對于醫(yī)學(xué)診斷、遺傳背景確定、耐藥菌株識別、環(huán)境檢測、司法鑒定、以及基礎(chǔ)和工業(yè)研究等都具有廣泛的應(yīng)用前景。
因此，本發(fā)明能夠通過識別相關(guān)的病原體而用于檢測感染性疾病。所鑒別的病原體包括細(xì)菌、病毒、寄生蟲和真菌及其它各種各樣的病原體，通過提取樣本中的核酸和鑒別樣本中的特定病原體核酸的存在與否，診斷與其相關(guān)的感染性疾病。用該方法能夠檢測到的病原體例證是大腸埃希菌、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、克雷伯氏菌屬、假單胞菌屬、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、結(jié)核分枝桿菌、細(xì)胞內(nèi)鳥分枝桿菌、耶爾森氏菌屬、弗朗西絲氏菌屬、巴斯德氏菌屬、布魯氏菌屬、梭菌屬、百日咳鮑特氏菌、擬桿菌屬、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、B-溶血鏈球菌、棒狀桿菌屬、軍團菌屬、枝原體、脲枝原體、衣原體、淋病奈瑟氏菌屬、腦膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血菌、糞腸球菌、普通變形菌、奇異變形菌、幽門螺旋桿菌、梅毒密螺旋體、布氏疏螺旋體、回歸熱疏螺旋體、立克次氏病原體、諾卡氏菌屬、放線菌、新隱球酵母菌(Cryptococcus neoformans)、皮炎芽生菌、莢膜組織漿菌屬、粗球孢子菌屬、巴西類球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、白色念珠菌屬、煙曲霉、藻菌(酒曲菌屬)、Sporothrix schenckii、著色真菌、足分枝菌、人類免疫缺陷病毒、人類T細(xì)胞親淋巴細(xì)胞性病毒、肝炎病毒(如乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒)、Epstein-Barr病毒、巨細(xì)胞病毒、人類乳頭狀瘤病毒、正粘病毒、副粘病毒、腺病毒、冠狀病毒、rhabdo病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、披膜病毒、布尼病毒、沙粒病毒、風(fēng)疹病毒、呼腸孤病毒、Plasmodium falciparum、Plasmodiummalaria、Plasmodium vivax、Plasmodium ovale、Onchovervavolvulus、利什曼原蟲、錐蟲屬、裂體吸蟲屬、溶組織性腸阿米巴、隱孢菌、梨形鞭毛蟲屬、毛滴蟲屬、Balatidium coll、班氏吳策線蟲、弓漿蟲屬、蠕形住腸線蟲、似引蛔蟲、人鞭蟲、麥地那龍線屬、吸蟲、latum裂頭絳蟲、絳蟲屬、Pneumocystis carinii、和美洲板口線蟲。.
另外，本發(fā)明還能用于鑒別特定病原體的特殊菌株。對特殊菌株或某一菌株的變種的鑒別廣泛應(yīng)用于包括耐藥菌株的確定，以便合理有效的制定抗菌素療程。例如可用以確定萬古霉素抗性的結(jié)核桿菌、新青霉素抗性的金葡菌、青霉素抗性的肺炎鏈球菌、和AZT抗性的人類免疫缺陷病毒。
本發(fā)明也可滿足確定遺傳性易患病體質(zhì)和/或確認(rèn)臨床診斷遺傳疾病的需要。通過設(shè)計與相關(guān)靶核酸雜交的捕獲探針和計數(shù)探針，在一個含有病人的整個基因組的核酸池中，可以檢測到小至一個單核苷酸突變的存在與否。突變包括插入、刪除、單堿基對的改變、和異位。這樣的遺傳性疾病實例是21羥化酶缺失、囊性纖維化癥、易脆性X染色體綜合癥、Turner綜合癥、杜興肌肉萎縮營養(yǎng)不良癥、Down綜合癥或其它的三性體、心臟的疾病、單基因疾病、人體白細(xì)胞抗原分型、苯丙酮尿酸癥、鐮狀細(xì)胞貧血癥、Tay-Sachs疾病、地中海貧血、克蘭費爾德(Klinefelter)綜合癥、Huntington疾病、自體免疫性疾病、脂沉積癥、肥胖缺陷、血友病、先天性代謝紊亂和糖尿病。
本發(fā)明的另一個應(yīng)用領(lǐng)域涉及檢測疾病相關(guān)的靶核酸中是否存在增長量的序列，例如與囊腫性纖維化癥相關(guān)的突變序列。在檢測遺傳性易患病體質(zhì)和/或確認(rèn)這種疾病的診斷中，最理想檢測是通過單個測定對個體基因組中所有可能的突變進行分析。本發(fā)明具備這樣的能力，例如在單一的樣本中，通過單個反應(yīng)對每種已知的囊狀纖維癥的基因突變進行分析。
另外，本發(fā)明提供了在單一反應(yīng)中同步監(jiān)測眾多基因的多樣性表達(dá)水平的方法。同步監(jiān)測可準(zhǔn)確比較基因表達(dá)水平和識別改變基因表達(dá)的生物條件。在表達(dá)監(jiān)測中特別重要的基因包括在乳腺癌病例中的HER2(c-erbB-2/neu)原癌基因；關(guān)系大量腫瘤(包括乳腺、肝臟、膀胱和胰腺的惡瘤及神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肉瘤和鱗裝惡瘤)發(fā)病的受體酪氨酸激酶(RTK)；腫瘤抑制基因如P53基因和其它的“標(biāo)志”基因如RAS，MSH2，MLH1，和BRCA1。另外在表達(dá)監(jiān)測中特別重要的基因涉及免疫反應(yīng)如白介素基因和涉及到細(xì)胞粘附的基因(包括整合素和選擇素)，凋亡和信號傳遞基因(包括酪氨酸激酶)。
而且，本發(fā)明適用于檢測引起腫瘤形成的突變基因。特定將捕獲探針和計數(shù)探針設(shè)計成能與已知的引起異常細(xì)胞增長的核酸序列雜交。典型涉及腫瘤形成的可檢測基因如BRCA1基因、p53基因、APC基因、Her2/Neu擴增，Bcr/Ab1，K-ras基因，和16和18型人類乳頭狀瘤病毒。
本發(fā)明也可以用于個體遺傳鑒定。用單一的樣本，在單一的反應(yīng)中檢測不同個體所特有的核酸序列多樣性的存在與否。結(jié)果可應(yīng)用于司法鑒定、親子鑒定和其它與個體鑒定有關(guān)的應(yīng)用。
另外，本發(fā)明也可用于確定特定基因的變異以在器官移植前確定免疫相容的供體器官、組織和體液。
本發(fā)明在食品、飼料和農(nóng)業(yè)方面有廣泛地應(yīng)用前景，包括檢測和識別植物特有的病原體和牲畜的傳染病，識別植物或動物繁殖的遺傳背景，識別影響植物或動物生長、健康和/或品質(zhì)的生物體或基因。因此，一般而言，本發(fā)明可用于臨床、工業(yè)和研究領(lǐng)域。
下面用舉例的形式對于本發(fā)明的進一步描述實施例1A.材料1.用于本發(fā)明方法中的固體表面可以是玻璃、塑料或其它任何能將捕獲探針固定于上面的材料。
2.捕獲探針是人工合成的DNA寡核苷酸，它被設(shè)計成能捕獲特定的靶物質(zhì)。捕獲探針的5’端修飾有活性化學(xué)基團，如生物素或帶連接臂的伯氨基基團。捕獲寡核苷酸的大小范圍約20至100個核苷酸。捕獲探針優(yōu)選大小約60至75個核苷酸。選擇捕獲探針的序列使其能與靶序列的一個保守區(qū)互補。探針的熔點溫度(Tm)在50至80攝氏度左右。
3.計數(shù)探針也是合成的DNA寡核苷酸，它被設(shè)計成能計數(shù)靶分子。該寡核苷酸5’端被磷酸化，以至捕獲探針和計數(shù)探針之間能夠發(fā)生連接。計數(shù)探針包含了兩個主要的部分5’端和3’端，其5’端與靶序列上的一個區(qū)域互補，該區(qū)域在上游緊鄰靶序列與捕獲探針退火區(qū)域。5’端的大小范圍在50至70個核苷酸之間。退火的Tm值在50℃至80℃之間。探針的3’端互補于單鏈環(huán)狀DNA的一段序列，該序列的大小范圍在18至30個核苷酸之間，熔點溫度在50℃至70℃之間。該序列在單鏈環(huán)狀DNA的序列中是唯一的。
4.擴增子為單鏈環(huán)狀DNA分子，該分子是信號擴增反應(yīng)中的關(guān)鍵成分。環(huán)狀DNA可以是合成的或從自然中提取的DNA，如M13單鏈DNA或其衍生物。擴增子不應(yīng)該有很強的二級結(jié)構(gòu)，很強的二級機構(gòu)可能干擾DNA擴增反應(yīng)時的效率和精確性；且不應(yīng)該有重復(fù)的序列，重復(fù)的序列能引起模板的折疊而使擴增反應(yīng)降低。擴增反應(yīng)需要環(huán)狀DNA含有與計數(shù)探針3’端互補的序列。
5.聚合酶是擴增反應(yīng)體系作用中的另一個關(guān)鍵成分。酶的高進行性和鏈置換活性對于擴增反應(yīng)是很重要的。大腸桿菌DNA聚合酶I，phi29 DNA聚合酶，和其它具有上述的特性的DNA聚合酶，在擴增反應(yīng)中都優(yōu)選使用。
6.DNA連接酶靶物質(zhì)準(zhǔn)確計數(shù)的一個關(guān)鍵因素。連接酶催化的反應(yīng)使計數(shù)探針共價連接于捕獲探針。與捕獲探針退火的計數(shù)探針的數(shù)量與樣本中靶物質(zhì)的數(shù)量相等。因此，連接效率直接影響到本方法的靈敏度和定量的精確性。DNA連接酶對缺口位點或臨近缺口位點的錯配應(yīng)該是敏感的。此特點提高本方法的特異性。T4 DNA連接酶和其它具備了上述特性的DNA連接酶，在該方法中優(yōu)選使用。
7.單鏈核酸結(jié)合蛋白和其它核酸伴侶蛋白(nucleicacid-chaperone proteins)促進了擴增反應(yīng)，因而提高了本方法的靈敏度。這些蛋白還增加了退火反應(yīng)的速度和幫助形成最穩(wěn)定的核酸雜交體，進一步提高了特異性。
8.任何常規(guī)的核苷酸標(biāo)記物、核苷酸類似物及其配體或檢測試劑。這些試劑用作檢測和定量擴增反應(yīng)結(jié)束時合成的DNA量。標(biāo)記的數(shù)量與連接后的捕獲探針和計數(shù)探針的數(shù)量成比例，它們共同反映了樣本中靶物質(zhì)的數(shù)量。檢測系統(tǒng)的靈敏度是關(guān)鍵因素。但是任何檢測系統(tǒng)都可用于檢測和定量標(biāo)記物。
9.四種脫氧核糖核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP以及DTT、鹽和反應(yīng)緩沖液。
10.定量參照品。定量參照品包括捕獲探針、計數(shù)探針、參考靶物和上述的其它材料。捕獲探針和計數(shù)探針的特性與上面描述的相同。參考靶物是一組化學(xué)和/或酶合成DNA和/或RNA寡核苷酸酸。寡核苷酸的長度范圍在40至100個核苷酸之間或更長。典型的寡核苷酸的長度是在60至80個核苷酸。寡核苷酸的Tm值應(yīng)該在上述樣本測試探針的同一范圍內(nèi)。
B.程序1.在固體表面固定捕獲探針a.將捕獲探針印制在玻片或其它固體表面。用帶有7碳連接臂的伯氨基基團修飾捕獲探針的5’端。用DNA芯片制作儀將修飾后的捕獲探針印制到玻片上。印制誤差應(yīng)小于5％。
b.捕獲探針固定在96或384孔板的孔中。在板孔中覆蓋有抗生物素蛋白或鏈酶抗生物素蛋白，或其它的配體。用生物素或其它的配體修飾捕獲探針的5’端。點樣誤差最好小于2-5％。每一樣本孔中點有一種捕獲探針或多種捕獲探針。
2.從樣本中分離靶物質(zhì)從血液、組織液、培養(yǎng)上清液、組織、細(xì)胞群和任何其它樣本中分離靶DNA或RNA。
3.捕獲探針和計數(shù)探針與分離的靶物質(zhì)雜交將分離出的靶物質(zhì)在混合液中與捕獲探針和計數(shù)探針孵育，溫度約37℃至80℃，混合液的組成是鹽、酸堿緩沖液和可選的退火促進劑如精胺、核酸伴侶蛋白。下例是一個典型的退火過程混合液在65至70℃孵育5至10分鐘，然后，在15到30分鐘內(nèi)梯度冷卻混合液至25℃。此過程中捕獲探針捕捉到特異的靶物質(zhì)，并且使計數(shù)探針發(fā)現(xiàn)和雜交到靶物質(zhì)上。計數(shù)探針與靶物質(zhì)的退火比例為一比一。一個靶物質(zhì)只能與一個計數(shù)探針退火。從而保證了定量測定的精確性。
4.連接在反應(yīng)中加入一個連接酶和ATP。然后在約25至37℃之間孵育5至30分鐘。
5.漂洗連接反應(yīng)之后，進行漂洗。充分漂洗以確保多余的計數(shù)探針、非特異的靶物質(zhì)以及靶物質(zhì)本身被漂洗掉。漂洗末，只有與捕獲探針共價結(jié)合的計數(shù)探針被保存下來。
6.DNA聚合反應(yīng)的組裝漂洗后，在反應(yīng)混合物中加入單鏈環(huán)狀DNA，在約65至70℃孵育5至10分鐘，然后，在15至30分鐘內(nèi)梯度冷卻至25℃。此過程使在計數(shù)探針3’端的引物與單鏈環(huán)狀DNA退火。此退火反應(yīng)組裝了DNA擴增機器。
7.DNA擴增在反應(yīng)中加入DNA聚合酶和含dNTPs的反應(yīng)緩沖液，組成DNA擴增反應(yīng)混合液。在混合液中包括可檢測的dNTP或連接可檢測分子的dNTP，這樣在擴增反應(yīng)結(jié)束時生成的DNA產(chǎn)物能夠被檢測和定量。反應(yīng)混合物在37℃孵育約2至6小時。
8.檢測基于擴增反應(yīng)中使用的標(biāo)記類型，進行DNA產(chǎn)物檢測和定量步驟。
C.結(jié)果的定量和解釋1.建立參照性數(shù)學(xué)公式和曲線。十種不同的靶物質(zhì)，如“材料”部分中描述的，也是合成的DNA或RNA探針，被加入到在程序A3的退火混合液中。由于十種探針的每一種都已預(yù)定量，因此，每種靶物質(zhì)的拷貝數(shù)量已知。所以，可以產(chǎn)生檢測讀數(shù)與拷貝數(shù)量的參考曲線和數(shù)學(xué)公式。由此可以從每一個樣本的讀數(shù)得出靶物質(zhì)的拷貝數(shù)。
2.由于在DNA模板和RNA模板上連接的效率是不同的，如果靶物質(zhì)對應(yīng)的參考曲線是DNA，而樣本中靶物質(zhì)是RNA或靶物質(zhì)是RNA和DNA的混合物，這里就會產(chǎn)生測量上的誤差。然而，因為可以通過用已知拷貝數(shù)量的RNA或DNA模板預(yù)先測量連接效率，所以可以校準(zhǔn)這種誤差。
實施例2微矩陣制備1.寡核苷酸探針的合成寡核苷酸探針由MWG Biotechnologies Inc.合成，將氨基連接基團共價連接到捕獲寡核苷酸5’端，將計數(shù)寡核苷酸5’端磷酸化[insert*What is“MWG”]。
2.微矩陣制作a)將氨基修飾的寡核苷酸以200pmol/μl重懸于蒸餾水中。
b)(可選擇的)用6×SSC或DMSO點樣液1∶1稀釋各探針。
c)取稀釋液每份10μl加入384孔板中；d)在25℃室溫，70％相對濕度下，以微矩陣點樣針，用Cartesian PS5500點樣儀將樣本印制到玻片上(CSS-100硅化玻片，來自于TeleChemInternational Inc.公司，通過席夫堿醛基-氨基化學(xué)，硅化玻片共價結(jié)合單鏈DNA或雙鏈DNA在高質(zhì)量的顯微鏡載玻片的表面)，然后在上述相同條件下孵育1小時。點的直徑為200μm，點中心到點中心的距離為500μm。
e)將玻片放在室溫(25℃)，相對濕度＜30％，約12小時晾干。
3.將氨基修飾的寡核苷酸固定到載體上的后處理過程a)用0.1％SDS溶液在室溫下振搖清洗載玻片一次，2分鐘，以除去未結(jié)合的DNA。
b)在室溫下用蒸餾水振搖清洗載玻片2次，每次2分鐘。
c)在室溫下用硼氫化鈉溶液處理載玻片5分鐘，以減少游離的醛基。(硼氫化鈉液溶解0.5g NaBH4于150ml PBS中，然后，加50ml100％乙醇以減少泡沫。使用前配置。)d)用蒸餾水清洗載玻片2次，每次1分鐘，溫度37℃；e)在空氣中涼干載玻片。
4.質(zhì)量控制用熒光核酸染料(二聚氰染料TOTO-3購自分子探針公司)，按說明書染色，檢測點樣斑的一致性a)用TE緩沖液(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)10,000倍稀釋染料原液；b)用稀釋后的染料液覆蓋微矩陣并在室溫中孵育3分鐘。
c)用TE緩沖液清洗微矩陣3次。
d)甩干微矩陣。
e)用ScanArray 4000B型掃描儀掃描微矩陣(Axon Inc.)。
雜交和信號擴增1.將靶DNA(片段)與計數(shù)探針和捕獲探針退火a)將計數(shù)探針(以終濃度約1pm/μl)和靶DNA加入退火緩沖液中(50mM Tris.HCl pH7.5，75mM KCl)配制成雜交混合液；b)用10μl雜交混合液覆蓋微矩陣；c)將載玻片放入雜交倉內(nèi)(CMT雜交倉來自于Corning Inc.)。在雜交倉內(nèi)孔中加入50μl退火液以保持倉內(nèi)濕度。然后關(guān)閉雜交倉；
d)在82℃水浴中孵化雜交倉2分鐘，然后將雜交倉轉(zhuǎn)移到53℃水浴中孵育30分鐘；e)在30分鐘內(nèi)水浴梯度冷卻雜交倉至25℃。
2.連接a)打開雜交倉蓋，吸去退火混合液；b)加入10μl的連接混合液(2單位/微升Promega T4 DNA連接酶，1×酶緩沖液)到微矩陣中；在25℃室溫下孵育15分鐘至2小時(按不批次酶的用法而定)以連接捕獲探針和計數(shù)探針；c)在室溫下用1×退火緩沖液清洗載玻片5次，每次1分鐘；3.將單鏈環(huán)狀DNA與計數(shù)探針退火a)用退火緩沖液稀釋單鏈環(huán)狀DNA(M13mp 19單鏈DNA來自于Invitrogen)，終濃度為0.025μg/μl；b)用10μl稀釋液覆蓋微矩陣，然后將載玻片放入雜交倉；c)在53℃水浴中孵育雜交30分鐘，然后在30分鐘內(nèi)梯度冷卻至25℃；d)用清洗液(50mM Tris.HCl pH7.5，10mM MgCl2，2mM DTT)清洗載玻片5次，每次1分鐘；4.擴增反應(yīng)a)用10μl擴增反應(yīng)混合液覆蓋微矩陣；b)將載玻片放入雜交倉內(nèi)，在37℃下孵育～4小時；c)在25℃室溫下，用30mlTE緩沖液清洗載玻片3次，每次5分鐘，涼干后掃描。
擴增反應(yīng)混合液10x緩沖液(隨酶提供) 1.0μlDNA聚合酶I(9.2μg/μl，Promega M2051) 1.0μl100mM dATP 0.2μl100mM dGTP 0.2μl100mM dTTP 0.2μl
10mM dCTP 0.2μl花菁3-dCTP(25nM/25μl，NEN)2.0μl蒸餾水 5.2μl圖象檢測和數(shù)據(jù)分析用Axon Inc公司的ScanArray 4000B激光掃描儀以5μm解析度，300v PMT，檢測整合的Cy3-dCTP信號密度。用GenePix Pro 3.0Microarray Acquisition & Analysis軟件進行數(shù)據(jù)分析。
權(quán)利要求
1.核酸分析的方法，包括(a)將靶核酸雜交到捕獲探針上，(b)將計數(shù)探針雜交到靶核酸上，(c)將捕獲探針與計數(shù)探針連接，及(d)將單鏈環(huán)狀DNA雜交到計數(shù)探針上，及然后(e)擴增所述環(huán)狀DNA，其中該擴增足以檢測靶核酸的存在。
2.依照權(quán)利要求1的方法，其中該靶核酸是DNA，RNA，或cDNA。
3.依照權(quán)利要求1的方法，其中該靶核酸來自細(xì)菌、病毒、寄生蟲或真菌。
4.依照權(quán)利要求1的方法，其中該靶核酸取自體液、組織或糞便。
5.依照權(quán)利要求4的方法，其中該靶核酸取自血液、唾液、尿液或痰液。
6.依照權(quán)利要求1的方法，其中該捕獲探針與來自細(xì)菌、病毒、寄生蟲或真菌的核酸序列互補。
7.依照權(quán)利要求1的方法，還包括將來自于(e)步驟中的擴增產(chǎn)物的量與至少一個已知量的核酸標(biāo)準(zhǔn)品比較而確定靶核酸存在的量。
8.分析靶核酸的方法，該方法包括(a)將靶核酸雜交到捕獲探針上和(b)將計數(shù)探針雜交到靶核酸上，形成由捕獲探針、計數(shù)探針和目標(biāo)探針組成的雜交體；(c)將所述的雜交體與連接酶作用，且然后(d)清洗掉未共價連接所述捕獲探針的計數(shù)探針和核酸；然后(e)加入單鏈環(huán)狀DNA到所述捕獲探針中；(f)向所述捕獲探針中加入能夠擴增單鏈環(huán)狀DNA的核酸聚合酶；及然后(g)確認(rèn)擴增的環(huán)狀DNA存在與否。
9.分子裝配體，由(i)捕獲探針，(ii)計數(shù)探針，和(iii)單鏈環(huán)狀DNA片段組成，其中所述環(huán)狀DNA片段鄰接所述計數(shù)探針。
10.依照權(quán)利要求9的分子裝配體，其中所述靶核酸是DNA、RNA或cDNA。
11.依照權(quán)利要求9的分子裝配體，其中所述靶核酸來自細(xì)菌、病毒、寄生蟲或真菌。
12.依照權(quán)利要求9的分子裝配體，其中所述捕獲探針與來自細(xì)菌、病毒、寄生蟲或真菌的核酸序列互補。
13.依照權(quán)利要求9的分子裝配體，其中所述靶核酸取自體液、組織或糞便。
全文摘要
用特殊的雜交與滾動循環(huán)擴增結(jié)合的方法能以靈敏度達(dá)到每一樣本中10個拷貝靶物的水平在單一反應(yīng)中對成千上萬個核酸序列進行檢測和定量。由于在擴增結(jié)束時反應(yīng)產(chǎn)物的數(shù)量嚴(yán)格與靶核酸量成比例并依賴于靶核酸量，并且通過使用通用模板和引物排除了不同樣本之間的差異性，該方法大大提高了精確性。該方法能夠分別適用于為研究和診斷目的的點突變的檢測和基因突變的鑒別。
文檔編號C12Q1/68GK1617936SQ02827645
公開日2005年5月18日 申請日期2002年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月29日
發(fā)明者萬強 申請人:美國大西洋生物實驗室, 成都愛特科生物技術(shù)有限公司